xác định đặc điểm sinh hóa và khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh mủ gan edwardsiella ictaluri trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở một số tỉnh đồng bằng sông cửu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN PHẠM THỊ NGỌC XUÂN XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH MỦ GAN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA Pangasianodo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

PHẠM THỊ NGỌC XUÂN

XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA

VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN

GÂY BỆNH MỦ GAN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI THÂM CANH

Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

Năm 2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

PHẠM THỊ NGỌC XUÂN

XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA

VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN

GÂY BỆNH MỦ GAN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI THÂM CANH

Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

NGUYỄN THỊ THU HẰNG ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

Năm 2009

LỜI CẢM TẠ

Hôm nay, để có thể hoàn thành được luận văn này, tôi đã phải trải qua một quá trình dài học tập và rèn luyện tại trường Tuy nhiên gia đình là nhân tố quan trọng nhất giúp tôi hoàn thành mọi việc Bên cạnh đó, thầy cô và bạn bè cũng góp phần không nhỏ trong sự thành công của tôi Vì vậy hôm nay tôi xin gửi lòng biết ơn đến:

- Ba Mẹ và toàn thể gia đình tôi-những người luôn ở bên tôi, động viên và chăm sóc tôi từ vật chất đến tinh thần, giúp tôi có đủ sức mạnh vượt qua tất cả!

- Lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng và cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt luận văn này!

- Xin gửi lòng biết ơn chân thành đến cô Trần Thị Tuyết Hoa, cô Đặng Thụy Mai Thy và cô Bùi Thị Bích Hằng đã quan tâm, động viên tôi trong suốt thời gian làm cố vấn học tập!

- Xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Hà Giang, anh Lê Hữu Thôi cùng tất

cả các thầy cô và các anh chị trong khoa Thủy Sản đã động viên và giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài!

- Lòng chân thành biết ơn tôi xin gửi đến các cô chú và anh chị ở các địa phương đã nhiệt tình giúp tôi trong quá trình thu m ẫu!

- Lòng tri ân tôi xin gửi đến tất cả các Thầy Cô đã từng dạy dỗ tôi trong suốt thời gian tôi theo học tại trường tiểu học Trương Định, trường trung học cơ sở cấp II Thanh Đức A, trường trung học phổ thông Lưu Văn Liệt-tỉnh Vĩnh Long và trường Đại học Cần Thơ!

- Đồng thời, tôi cũng xin gửi lòng biết ơn đến tập thể các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản khoá 31 và tất cả những người bạn đã luôn ở bên cạnh tôi với sự chia sẻ, những lời động viên và lời khuyên chân thành!

Và một lần nữa tôi xin gửi đến tất cả những người thân yêu, thầy cô, bạn bè…những người đã góp phần mang đến cho tôi sự thành công cùng những hương vị của cuộc sống này lời cảm ơn chân thành nhất!!!

Tác giả Xin chân thành cảm ơn!!!

TÓM TẮT

Với mục tiêu nghiên cứu của đề tài là tìm hiểu mức độ xuất hiện và tính kháng

thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra bệnh mủ gan nuôi thâm canh ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Kết quả cho thấy vi khuẩn E

ictaluri xuất hiện hầu hết ở các vùng nuôi Kết quả phân lập từ mẫu cá đã xác

định được 84 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Edwardsiella Qua kiểm tra các chỉ

tiêu cơ bản như nhuộm gram, tính di động, oxydase, catalase chọn ra 10 chủng

để tiến hành định danh theo phương pháp truyền thống và kit API 20E được cả

10 chủng đều là E ictaluri Tuy nhiên kết quả kiểm tra API lại sai khác đối

với một số chỉ tiêu (citrate, indole)

Kết quả chạy PCR một lần nữa khẳng định cả 10 chủng vi khuẩn đều là E

ictaluri khi tất cả đều hiện vạch sáng ở 407 bp

Kháng sinh đồ được thực hiện trên cả 10 chủng vi khuẩn E ictaluri với 8 loại

thuốc kháng sinh Kết quả là 100% vi khuẩn kháng hoàn toàn với S (streptomycin) và OA (oxolinic acid), 100% vi khuẩn kháng với FFC (florfenicol), vi khuẩn nhạy nhất với AMX (amoxycillin) Riêng với DO (doxycycline) có 80% số chủng nhạy, 10% số chủng trung bình nhạy và 10%

số chủng kháng Nhìn chung trong tất cả 10 chủng thì chỉ có chủng CA4.4G

đa kháng với cả S, OA, FFC và DO

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên kháng sinh streptomycin đối với 2 chủng

vi khuẩn đã phân lập ở trên, kết quả cho thấy vi khuẩn E ictaluri kháng với

streptomycin ở mức thấp (2-4 µg/ml)

MỤC LỤC

PHẦN I: GIỚI THIỆU 1

PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình nuôi cá tra 3

2.2 Bệnh vi khuẩn trên cá 3

2.3 Bệnh do vi khuẩn E ictaluri 4

2.3.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E ictaluri trên thế giới 4

2.3.2 Tình hình bệnh do vi khuẩn E ictaluri ở Việt Nam 5

2.3.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn E ictaluri 6

2.3.4 Một số cơ quan thường bị E ictaluri tấn công 6

2.4 Một số nghiên cứu khác trên vi khuẩn E ictaluri 7

2.5 Tình hình sử dụng thuốc thú y thủy sản 7

2.6 Phương pháp PCR 9

2.6.1 Các nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 9

2.6.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR 10

2.7 Các nghiên cứu về nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 10

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 12

3.1.1 Thời gian nghiên cứu 12

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 12

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 12

3.2 Vật liệu nghiên cứu 12

3.2.1 Dụng cụ thí nghiệm 12

3.2.2 Hóa chất và môi trường 12

3.2.2.1 Hóa chất 12

3.2.2.2 Môi trường 12

3.3 Phương pháp nghiên cứu 13

3.3.1 Phương pháp thu mẫu 13

3.3.2 Phương pháp lấy mẫu vi sinh 13

3.3.3 Tách ròng mẻ cấy 14

3.3.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống 14

3.3.5 Định danh vi khuẩn bằng bộ Kit API 20E 14

3.3.6 Phương pháp PCR 14

3.3.7 Phương pháp lập kháng sinh đồ 16

3.3.8 Phương pháp xác định MIC 16

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 17

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

4.1 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn 18

4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 18

4.1.2 Kết quả định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống 18

4.1.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng bộ Kit API 20E 20

4.2 Kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR 22

4.3 Kết quả kháng sinh đồ 23

4.4 Kết quả MIC 25

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 27

5.1 Kết luận 27

5.2 Đề xuất 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO 28

PHỤ LỤC 33

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui

trình phát hiện vi khuẩn E ictaluri 15

Bảng 3.2: Giới hạn xác định mức độ kháng, trung bình nhạy và nhạy của các loại kháng sinh theo đường kính chuẩn trung bình của công ty Bio-rad 16

Bảng 4.1 Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn E ictaluri

bằng phương pháp truyền thống 19 Bảng 4.2 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hoá của các chủng vi khuẩn bằng bộ Kit API 20E 21 Bảng 4.3 Hàm lượng DNA chiết tách 22

Bảng 4.4 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn E ictaluri 24

Bảng 4.5 Giá trị MIC của thuốc kháng sinh streptomycin trên 2 chủng vi

khuẩn E ictaluri 25

Bảng 3.3 Bảng kiểm tra kết quả test O/F 34

Bảng 3.4 Các chỉ tiêu định danh E ictaluri bằng phương pháp sinh hóa truyền

thống 37 Bảng 3.5 Cách đọc kết quả bộ Kit API 20E 39 Bảng 4.5 Dấu hiệu bên trong và bên ngoài của các mẫu cá 40

DANH SÁCH HÌNH

Hình 4.1 Đĩa cấy thuần (A), Vi khuẩn E ictaluri Gram âm, hình que ngắn (B)

18

Hình 4.2 Khả năng sử dụng các loại đường (A), Các chỉ tiêu sinh hóa thuyền thống (B) 19

Hình 4.3 Kết quả kiểm tra vi khuẩn E ictaluri trên Kit API 20E 20

Hình 4.4 Kết quả chạy PCR phát hiện E ictaluri 23

Hình 4.5 Kết quả kháng sinh đồ trên vi khuẩn E ictaluri 24

Hình 4.6 Kết quả MIC của vi khuẩn E ictaluri 25

PHẦN I GIỚI THIỆU

Đồng Bằng Sông Cửu Long là một trong 7 vùng kinh tế trọng điểm nằm ở phía Nam của đất nước, có diện tích gần 4 triệu ha, chiếm khoảng 12% tổng diện tích cả nước Đây là vùng hạ lưu châu thổ sông Mekong, được xem là vùng trù phú nhất, không chỉ của Việt Nam mà của cả khu vực Đông Nam Á Đồng thời đây cũng là vùng nuôi trồng thủy sản lớn nhất của cả nước, diện tích nuôi trồng thủy sản chiếm khoảng 60% với sản lượng chiếm khoảng 65%

và giá trị xuất khẩu thủy sản chiếm 51% (Dương Nhựt Long, 2003) Mười tháng đầu năm 2008, xuất khẩu thủy sản của cả nước đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3.828 tỷ USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị so với cùng kỳ năm

2007 Trong đó mặt hàng chủ lực là cá tra và cá basa đạt mức tăng trưởng cao nhất (http://www.fistenet.gov.vn/)

Để đạt được những kết quả như thế đòi hỏi sự gia tăng cả về số lượng lẫn chất lượng của sản phẩm vì vậy diện tích cũng như mật độ nuôi ngày càng được nâng cao, kết quả là những năm gần đây, tình hình bệnh xuất hiện trên động vật thủy sản ngày càng nhiều đã đến mức báo động Một trong số những bệnh đang được quan tâm hàng đầu đó là bệnh mủ gan đã gây thiệt hại không nhỏ

về kinh tế cho nhiều hộ nuôi Ngày nay bệnh mủ gan vẫn đang là mối quan tâm hàng đầu cho những ai đang và sẽ nuôi cá tra thâm canh ở khu vực

ĐBSCL Theo Hawke (1981), Từ Thanh Dung (2004) cho rằng vi khuẩn E

ictaluri thuộc họ Enterobacteriaceae, là vi khuẩn Gram âm, hình que, phản

ứng âm tính với oxidase và dương tính với catalase, không có khả năng sinh

H2S và Indole Trên môi trường TSA ở 28oC sau 48 giờ vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu trắng, có rìa không đồng nhất

Nhiều nghiên cứu trước đây đã xác định tác nhân gây bệnh mủ gan là do vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, bệnh thường xảy ra trên cá tra nuôi thâm

canh ở tất cả các giai đoạn, tỉ lệ hao hụt từ 10% cao nhất có thể lên đến 90%

(Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003; Crumlish, 2001; Từ Thanh Dung, 2004; Shotts et al., 1986)

Cùng với sự xuất hiện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan thì nhiều nghiên cứu về kháng sinh phòng trị bệnh do Edwardsiella ictaluri cũng

được tiến hành để góp phần khắc phục tình hình dịch bệnh do vi khuẩn gây ra

trên cá tra Theo nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv (2005) đã nghiên cứu

và cho rằng bệnh này có thể khống chế bằng nhóm kháng sinh quinolon (flumequin, oxolinic acid, enrofloxacin) nhưng ngày nay nhóm kháng sinh này

đã bị cấm sử dụng Mặc khác, theo kết quả điều tra của Nguyễn Quốc Thịnh (2006) đa số người dân nuôi cá thường sử dụng kháng sinh để phòng trị bệnh Tuy nhiên, một bộ phận không nhỏ người nuôi chưa nắm bắt tốt kỹ thuật nuôi

và việc quản lý sức khỏe của động vật thủy sản trong ao nuôi cũng như những hiểu biết về thuốc kháng sinh còn nhiều hạn chế, liều lượng và thời gian sử dụng không phù hợp dẫn đến sự gia tăng hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của một số giống loài vi khuẩn nên việc phòng trị kém hiệu quả gây nhiều tổn thất to lớn về kinh tế và ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường sinh thái cũng như sức khỏe con người

Vì vậy, đề tài “Xác định đặc điểm sinh hoá và khả năng kháng thuốc của

vi khuẩn gây bệnh mủ gan Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở một số tỉnh Đồng

Bằng Sông Cửu Long” được thực hiện nhằm đánh giá tình hình bệnh mủ gan

ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long cũng như sự kháng thuốc của các chủng vi khuẩn này để có biện pháp hợp lý trong quá trình nuôi cũng như quản lý dịch bệnh trong khu vực góp phần bảo vệ môi trường sinh thái

Mục tiêu của đề tài:

Tìm hiểu mức độ xuất hiện và tính kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri trên cá tra bệnh mủ gan

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

Phân lập vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra

Định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp truyền thống và

phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri với một số loại thuốc kháng sinh

PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi cá tra

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus ), trước đây còn có tên là Pangasius

hypophthalmus, P micronemus hay P Sutchi (Nguyễn Văn Kiểm, 2004), là

loài cá được nuôi hầu hết ở các nước Đông Nam Á và là loài cá nuôi quan trọng nhất trong khu vực này Ở Campuchia, sản lượng nuôi cá tra chiếm bằng một nửa sản lượng các loài cá nuôi, trong đó tỷ lệ cá tra chiếm 98% trong 3 loài thuộc họ cá tra, chỉ có 2% là cá basa và cá vồ đém Tại Thái Lan, nước đầu tiên thành công trong việc sinh sản nhân tạo cá tra vào năm 1966 có sản lượng cá tra nuôi chỉ đứng sau cá rô phi, đến năm 1970 đã chủ động cung cấp giống cho nghề nuôi cá tra trong nước

Cá tra là một loài cá nuôi truyền thống trong ao của nông dân các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) Ngoài tự nhiên, cá tra phân bố ở lưu vực sông MeKong, có mặt ở cả 4 nước: Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan (Nguyễn Văn Kiểm, 2004) Cá sống đựơc ở mọi tầng nước, thường sống được

ở các thủy vực nước tĩnh, nước chảy, chịu đựng được điều kiện khắc nghiệt của môi trường Cá sống chủ yếu ở môi trường nước ngọt tuy nhiên cá vẫn có thể sống và phát triển ở môi trường nước lợ (ao nuôi tôm sú vào mùa mưa) (http://www.bentre.gov.vn/)

Khi ngành nuôi trồng thủy sản đã phát triển, nhiều đối tượng có giá trị kinh tế được đưa vào nuôi, các hình thức nuôi công nghiệp như thâm canh, siêu thâm canh được áp dụng phổ biến Sự đầu tư lớn về giống, thức ăn và năng suất cao luôn là điều kiện tiềm ẩn nguy cơ bùng nổ dịch bệnh Do vậy, khi nuôi trồng thủy sản càng phát triển thì vấn đề dịch bệnh càng trở nên thường xuyên, đe dọa ngành nuôi trồng thủy sản, gây những thiệt hại lớn và đôi khi bệnh đã trở thành nhân tố quyết định thắng thua trong một đợt sản xuất (Đỗ Thị Hòa và

ctv, 2004)

2.2 Bệnh vi khuẩn trên cá

Bệnh là những biến đổi bất thường của cơ thể sinh vật với những biến đổi xấu của môi trường xung quanh, cơ thể nào thích ứng được thì tồn tại, không thích ứng được thì chết Hay nói cách khác bất cứ một sự thay đổi trạng thái nào đó của cơ thể hoặc một cơ quan nào ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của cơ thể sinh vật gọi là bệnh (Từ Thanh Dung, 2005) Bệnh cá luôn được xem là một trong những tác nhân gây hao hụt trong nghề nuôi thủy sản trên thế giới và Việt Nam Tác nhân gây bệnh và mức độ gây thiệt hại cũng rất đa dạng và phụ thuộc vào đối tượng nuôi khác nhau Bệnh nấm, ký sinh trùng, vi khuẩn,…là những tác nhân gây bệnh thường gặp trong nghề nuôi cá nước ngọt (Bùi Quang Tề, 1993)

Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) thì khi động vật thủy sản bị bệnh thường có

những biểu hiện như: trạng thái hoạt động không bình thường, không giữ

được thăng bằng, nổi đầu, dạt vào bờ, quay vòng trên mặt nước, kén hoặc bỏ

ăn, có sự biến đổi màu sắc một bộ phận hay toàn bộ cơ thể kèm theo những dấu hiệu chậm lớn, yếu và chết Nếu các hoạt động sống bị rối loạn phá hủy một hay nhiều cơ quan quan trọng như hô hấp, tiêu hóa, tuần hoàn, thần kinh…thì bệnh xảy ra nặng và động vật bị bệnh có thể chết

Qua thống kê của Lê Xuân Sinh (2006) cho thấy bệnh mủ gan trên cá tra xuất hiện nhiều nhất (82,1%), bệnh xuất huyết (63,4%), bệnh do ký sinh trùng (32,0%) Ngoài ra, còn có một số bệnh nguy hiểm khác nhưng xuất hiện với tần số thấp hơn như: bệnh vàng da (12,2%), bệnh đường ruột (11,5%), bệnh lồi mắt (11,4%), bệnh tuột nhớt (10,0%), bệnh lở loét (3,1%),…

Gần đây, theo điều tra của Nguyễn Tấn Duy Phong (2008) cho thấy bệnh gan thận mủ xuất hiện với tần số cao nhất (93,8%), tiếp theo đó là bệnh xuất huyết (75%), bệnh trắng gan trắng mang (68,8%) Như vậy, thấy rằng bệnh gan thận

mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra đang là mối đe dọa lớn nhất cho

người nuôi cá tra hiện nay

2.3 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.3.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn E ictaluri trên thế giới

Vi khuẩn E ictaluri gây bệnh xuất huyết được phân lập lần đầu tiên trên cá nheo Mỹ (Ictalurus puntatus) bởi Hawke (1979) với tên gọi là ESC (Enteric

Septicaemia of Catfish)

Vi khuẩn E ictaluri kén chọn vật chủ nhạy cảm hơn nhiều so với E tarda và gây thiệt hại đáng kể trên cá trơn Bệnh do vi khuẩn E ictaluri gây ra được tìm thấy ở loài Ictalurus punctatus (Hawke, 1979) còn có hai loài khác như

Ictalurus purcatus và Ictalurus catus (Plumb and Sanchez, 1983), Clarias batrachus (Kasornchandra et al., 1987) ở Thái Lan

Năm 1985, Boonyaratpalin cũng đã phát hiện E ictaluri gây bệnh trên cá trê trắng (Clarias batrachus) và trong môi trường nước ở Thái Lan (Trích dẫn bởi

Từ Thanh Dung, 2004) Ngoài ra, mầm bệnh này cũng được công bố ở hầu hết Bắc Mỹ và các tiểu

bang khác như Indiana, Idaho, California, Arizona và New Mexico (Inglis et

al., 1994) Năm 1976, Hawke đã phân lập được vi khuẩn E ictaluri trên cá

nheo sông nâu (Ictalurus nebulosus) Bên cạnh đó vi khuẩn E ictaluri còn được báo cáo trên cá dao xanh (Eigemannia virens) (Kent & Lyons, 1982), cá nheo xanh (Ictalurus furcatus) (Plumb & Sanchez, 1983), cá trê trắng (Clarias

batrachus) (Kasornchandra, 1987) Vi khuẩn này cũng được Crumlish (2001)

và Bùi Quang Tề (2003) phân lập được trên cá tra nuôi (Pangasius

hypophthalmus)

2.3.2 Tình hình bệnh do vi khuẩn E ictaluri ở Việt Nam

Bệnh trắng gan hay còn gọi là bệnh mủ gan được ghi nhận lần đầu tiên xuất hiện trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 với tên gọi BNP (Bacillary

Necrosis of Pangasius) và trở nên trầm trọng vào năm 1999 (Ferguson et al.,

2001) Theo Brown và Cratzek (1980) bệnh do vi khuẩn thường xuất hiện vào mùa nước ấm và sốc giữ vai trò quan trọng trong các bệnh do vi khuẩn, ký sinh trùng Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể ký chủ tạo nên sự nhiễm khuẩn hay không còn tùy thuộc vào khả năng gây bệnh của vi khuẩn Như vậy, tùy thuộc vào số lượng vi khuẩn và độc lực của vi khuẩn Cũng theo tác giả, mật độ ương nuôi cao sẽ làm tăng khả năng tiếp xúc giữa ký chủ và mầm bệnh Đồng thời, cũng tạo điều kiện cho mầm bệnh tăng nhanh trong một nhóm cá Do đó tình hình dịch bệnh ngày càng tăng với nhiều dạng bệnh khác nhau và nguyên nhân gây bệnh ngày càng phức tạp hơn

Theo Từ Thanh Dung (2004) khi cá nhiễm bệnh, tỉ lệ chết tăng cao từ 10-90% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi Đồng thời trên gan, thận và tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3 mm, bên trong chứa dịch màu trắng đục nên người dân thường gọi là bệnh mủ gan, không có những biểu hiện bất thường bên ngoài

Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn bắt mồi Tuy nhiên, một số trường hợp cá

có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn Bệnh thường xuất hiện vào mùa lũ cao điểm là vào tháng 7 và tháng

8 Những khu vực bị ảnh hưởng chủ yếu là những vùng có nghề nuôi cá tra phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ (huyện Thốt Nốt, Phụng Hiệp) và sau đó lan dần ra các tỉnh lân cận như Trà Vinh, Bến tre, Vĩnh Long, Tiền Giang, (Từ Thanh Dung, 2004)

Bệnh gây ảnh hưởng đáng kể trên cá tra ở giai đoạn cá giống và cá lứa với tỉ

lệ chết rất cao (60-80%) và nó còn kéo dài đến giai đoạn cá thịt với tỷ lệ chết thấp hơn (Lê Thị Bé Năm, 2002)

Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) đã tiến hành thí nghiệm một số yếu tố ảnh hưởng

đến bệnh mủ gan do vi khuẩn E ictaluri gây ra trên cá tra ở ĐBSCL đã đưa ra

kết luận rằng mật độ vi khuẩn khác nhau sẽ ảnh hưởng khác nhau đến khả năng nhiễm bệnh mủ gan trên cá tra Khi ngâm cá với mật độ vi khuẩn là 1,5

x 102 và 1,5 x 103 CFU/ml thì tỉ lệ chết dao động từ 56,6-56,7%

Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) ở Việt Nam, bệnh mủ gan chủ yếu xuất

hiện trên cá tra (ở tất cả các giai đoạn phát triển) Thỉnh thoảng xuất hiện trên

cá basa Tỉ lệ hao hụt lớn ở cá tra giống, nhưng gây thiệt hại về kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500 g

Bệnh mủ gan xuất hiện phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ Ở Việt Nam, nhiệt

độ nước dao động từ 26-28o

C (Trương Quốc Phú, 2004) là điều kiện thích hợp cho vi khuẩn mủ gan phát triển Sự thay đổi của môi trường và nguồn nước ô nhiễm có ảnh hưởng lớn đến tần số xuất hiện của bệnh Thường đến mùa lũ nước mang nhiều phù sa, chất lượng nước thay đổi làm sức khỏe cá giảm dẫn

đến sức đề kháng của chúng kém tạo điều kiện cho mầm bệnh dễ dàng xâm nhập và nhanh chóng bộc phát thành bệnh Trong một vụ nuôi bệnh mủ gan

có thể xuất hiện 3-4 lần

Tuy nhiên, tác động từ việc nuôi cá tra và cá basa đến môi trường nước và hệ sinh thái đang ngày càng trở nên nghiêm trọng, đe dọa sự phát triển bền vững của nghề nuôi cá Thức ăn dư thừa trong quá trình nuôi, các hóa chất vệ sinh cải tạo ao nuôi, chế phẩm sinh học, thuốc kháng sinh,…là nguyên nhân chính gây ô nhiễm môi trường Đồng thời, việc lạm dụng kháng sinh và thuốc thú y thủy sản làm cho sản phẩm cá tra và cá basa gặp khá nhiều khó khăn trong vấn đề xuất khẩu, ngoài ra còn gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người

2.3.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn E ictaluri

Vi khuẩn E ictaluri được mô tả đầu tiên bởi Hawke et al., (1981) là vi khuẩn

thuộc họ Enterobacteriaceae, vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, kích thước khoảng 0,75x1,5-2,5µm, di động ở 25-30°C và di động yếu hoặc không di động khi nhiệt độ cao hơn 30°C

Năm 1986, Shotts et al., tiếp tục nghiên cứu về đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn E ictaluri, ngoài các đặc điểm trên thì vi khuẩn này còn cho phản ứng

cytochrome, oxidase âm tính, có khả năng lên men glucose và sinh sản phẩm

NO3- từ NO2-

Vi khuẩn E ictaluri phát triển trên môi trường thạch rất chậm, trên môi trường

TSA sau 48 giờ ở 28°C hình thành khuẩn lạc nhỏ, tròn, có màu trắng trong

(Plumb, 1999) Theo Từ Thanh Dung và ctv (2005) E ictaluri là vi khuẩn

thuộc họ Enterobacteriaceae, gram âm hình que ngắn, kích thước biến đổi 0,75x1,5-2,5µm, cho phản ứng oxidase âm tính và catalase dương tính, phản ứng indole và H2S âm tính, di động yếu ở 25-30oC nhưng không di động ở những nhiệt độ cao hơn Loài vi khuẩn này phát triển tốt ở 28oC sau 24-48 giờ tạo thành những khuẩn lạc có kích thước rất nhỏ

Vi khuẩn E ictaluri chỉ thích hợp với điều kiện nhiệt độ khoảng 18-28oC

(Plumb, 1999) Do đó bệnh do vi khuẩn E ictaluri xảy ra trên cá trơn rơi vào

mùa có nhiệt độ thấp Trên cá nheo, bệnh ESC thường xảy ra vào cuối mùa xuân đến đầu mùa hè và trong suốt mùa thu, khi nhiệt độ nước khoảng 18-

28oC (Plumb, 1999) Trong điều kiện thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá nheo giống thì ở 25oC cho tỉ lệ cá chết cao nhất, thấp nhất ở các nghiệm thức có nhiệt độ 23oC và 28oC, không có cá chết ở các nhiệt độ 17oC, 21oC và 32oC

(Francis-Floy et al., 1987)

2.3.4 Một số cơ quan thường bị E ictaluri tấn công

Mygolomba và Plumb (1992) đã phân lập vi khuẩn E ictaluri trên cá nheo Mỹ

trong máu và tại các cơ quan khác như thận trước, thận sau, não, tỳ tạng, buồng trứng, tuyến tụy và cơ

Ở Việt Nam, Từ Thanh Dung và ctv (2005) đã phân lập được vi khuẩn E

ictaluri trên các cơ quan thận, gan và tỳ tạng của cá tra

Ngoài ra, Lương Trần Thục Đoan (2006) sau khi gây cảm nhiễm thấy rằng vi

khuẩn E ictaluri xuất hiện ở các cơ quan máu, não, cơ tim, gan, mang, thận,

tỳ tạng và bóng hơi

Theo Nguyễn Quốc Thịnh (2002) cho rằng khi cá bệnh mủ gan cấu trúc vi thể của thận bị hủy hoại trầm trọng, xảy ra các phản ứng sưng viêm ở toàn bộ tổ chức Thận sưng to đồng thời bị nhủn do xung huyết một phần có thể do tích

tụ nước trong thận mà không thể đào thải được do hệ thống tiểu cầu thận và ống thận bị hư hại

Theo Từ Thanh Dung & ctv (2004) thì cá bị bệnh thường không có biểu hiện

bất thường bên ngoài ở giai đoạn chớm bệnh Tuy nhiên khi bệnh nặng cá gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, cá có hiện tượng xuất huyết ở da và hậu môn Bên trong, các nội quan gan, thận, tỳ tạng xuất hiện những đóm trắng có đường kính 1-3 mm, các cơ quan này sưng to và có hiện tượng nhủn ở thận, xoang nội quan có dịch lỏng đục màu đỏ, đôi khi có màu vàng

2.4 Một số nghiên cứu khác trên vi khuẩn E ictaluri

Theo Hawke (1981), Plumb và Sanchez (1983) vi khuẩn E ictaluri còn có

khả năng gây bệnh trên một số nhóm cá da trơn khác như cá nheo xanh

(Ictalurus furcatus) và cá nheo (Ictalurus catus)

Những nghiên cứu trước đây ghi nhận rằng bệnh chỉ xuất hiện trên cá tra,

không tìm thấy bệnh trên cá basa Nguyên nhân được Ferguson et al., (2001)

cho rằng đó là kết quả của sự khác biệt về tính nhạy cảm của loài

Vi khuẩn E ictaluri còn gây bệnh trên một số loài cá trong điều kiện thí nghiệm như Chinook salmon Oncarhynchus tshauytscha và Rainbow trout

Oncarhynchus mykiss (Baxa et al., 1990)

Theo Cedric và Zilong (2003) cũng phân lập vi khuẩn E ictaluri trên cá tra

nuôi bè ở Việt Nam, với dấu hiệu có nhiều nốt trắng trên gan Theo Plumb (1999), khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch rất chậm, trên môi trường TSA sau 48 giờ ở 28oC hình thành khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu trắng

đục Môi trường đặc trưng là EIA (Edwardsiella ictaluri agar)

Tuy nhiên, theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) cho rằng vi khuẩn E ictaluri

phân lập từ cá tra có một số đặc điểm khác so với mô tả của Plumb (1993) như

có dạng que và kích thước biến đổi, phát triển tốt ở 28oC và phát triển yếu ở

37oC Dựa vào đó ta có thể giải thích tại sao vi khuẩn E ictaluri cho tới nay

chỉ phát hiện trên cá mà chưa tìm được trên bất kỳ một loài động vật máu nóng nào khác như chim, gia súc, heo, hay động vật hữu nhủ ở biển

2.5 Tình hình sử dụng thuốc thú y thủy sản

Theo Gesamp (2001) thì thuốc hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản bao gồm các loại liên quan đến vật tư công trình, xử lý đất và nước, tác nhân kháng khuẩn, thuốc trị bệnh, thuốc trừ sâu, thuốc gây tê và hormon

Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp, có nguồn gốc sinh học hay

do con người tạo nên, có tác động một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu của sự biến dưỡng của các vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), của các nấm (tác nhân kháng nấm), của các vi rút (tác nhân kháng vi rút) (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Quốc Thịnh, 2006)

Có nhiều phương pháp đưa thuốc và hóa chất vào cơ thể động vật thủy sản không chỉ qua đường miệng bằng cách trộn vào thức ăn mà còn bằng phương pháp ngâm hoặc tắm Theo FAO (2005) sử dụng kháng sinh bằng cách trộn vào thức ăn được sử dụng rộng rãi nhất

Theo Nguyễn Thanh Phương và ctv (2004) thì chi phí thuốc và hoá chất có thể

đến 500-700 đồng cho sản xuất mỗi kg cá thương phẩm Mặc khác dư lượng kháng sinh còn lưu tồn trong sản phẩm sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Dư lượng kháng sinh thải ra môi trường nuôi cũng góp phần gây ô nhiễm môi trường nuôi, ảnh hưởng chất lượng nước sông và sức khỏe cộng đồng

Theo Lê Xuân Sinh và Nguyễn Thị Phương Nga (2005) thì chi phí mà các hộ

sử dụng hoá chất, thuốc thú y thủy sản ương cá bột lên cá giống chiếm bình

quân khoảng 14% tổng chi phí Theo Nguyễn Phú Son và ctv (2003) thì chi

phí hoá chất và thuốc thú y thủy sản chỉ dao động quanh mức 5% (2-10%) tổng chi phí cho nuôi cá thịt trong ao, bè/vụ

Theo Trần Thị Hồng Tơ (2004), giống vi khuẩn Edwardsiella kháng hoàn

toàn với Chloramfenicol (30), tỷ lệ kháng từ 62,5-97,5% với các kháng sinh còn lại Trong đó kháng cao nhất với Tetracycline (30) và thấp nhất với Nitrofurantion

Theo các nghiên cứu cho thấy bệnh mủ gan có thể điều trị bằng kháng sinh khi phát hiện ở giai đoạn sớm, florfenicol là loại kháng sinh được cục quản lý lương thực và dược phẩm (FDA) cho phép sử dụng từ năm 2005 được Từ Thanh Dung (2005) khuyến cáo sử dụng để điều trị bệnh mủ gan là 10 mg/kg

cá hoặc 0,1-0,2g/kg thức ăn, cho cá ăn liên tục từ 5-7 ngày Kết quả kiểm tra

kháng sinh đồ của Từ Thanh Dung và ctv (2004) cho thấy vi khuẩn này kháng

với một số loại kháng sinh như oxytetracycline, oxolinic acid và sulphonamides Vì vậy không nên dùng những loại thuốc này để điều trị bệnh

mủ gan

Hawke (1979) là nhà khoa học đầu tiên đã làm kháng sinh đồ trên 10 chủng vi

khuẩn E ictaluri Sau đó, Shotts and Waltman (1986) kiểm tra sự kháng thuốc trên 118 E ictaluri phân lập được ở Hoa Kỳ với 37 loại thuốc kháng sinh

Kết quả nghiên cứu cho thấy đa số vi khuẩn Gram âm nhạy với hầu hết các loại thuốc đã thí nghiệm Tuy nhiên, hơn 90% số chủng vi khuẩn kháng với

colistin và sulfamids Reger et al.,(1993) cùng xác định các chủng E ictaluri

ở Hoa Kỳ đều nhạy với enrofloxacin, gentamicine và doxycycline

2.6 Phương pháp PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật khuếch đại trình tự DNA chuyên biệt trong ống nghiệm một đoạn DNA với sự hiện diện của một hoặc hai đoạn mồi (Oligonucleotides), enzym tổng hợp DNA, các nucleotide

tự do, dung dịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt Kỹ thuật này được phát minh và đặt tên bởi Mullis và các cộng sự (Mỹ) vào tháng 10 năm 1985 Đây

là một kỹ thuật rất nhạy bén và đặc biệt, cho phép tìm ra nhanh chóng, thậm chí chỉ với một tiểu phân vi rút Những vi rút ẩn, không có các biến đổi về mô học cũng có thể tìm thấy bằng kỹ thuật này Hiện nay, kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như để phát hiện và tạo ra đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh,…(Khuất Hữu Thanh, 2006)

Theo Trần Linh Phước (2003) thì PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu

kỳ lặp lại nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ 3 bước là:

- Bước 1: (bước biến tính - denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là 94-95oC trong vòng 30-60 giây Mạch đôi DNA tách đôi thành dạng mạch đơn

- Bước 2: (bước lai – anealation): trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn

Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ dao động trong khoảng 40-70oC, tùy theo Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30-60 giây

- Bước 3: (bước tổng hợp – extension): nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymease hoạt động tổng hợp được tốt nhất Thời gian của các bước này tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài 30 giây đến nhiều phút

Mỗi chu kỳ 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lại tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân Theo tính toán thì sau 30-40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 106 bản sao Sau phản ứng PCR các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và đọc kết quả dưới bàn đọc UV

2.6.1 Các nhân tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

PCR là phương pháp được thực hiện dưới mức độ phân tử nên có nhiều nhân

tố ảnh hưởng Theo Khuất Hữu Thanh (2003) thì PCR chịu ảnh hưởng bởi các nhân tố sau:

Khuôn DNA có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR Phản ứng PCR tối ưu với các đoạn khuôn hoàn toàn tinh sạch, khi các đoạn khuôn không sạch có lẫn các protein, hiệu quả PCR giảm theo tỉ lệ thuận với

độ tinh sạch của DNA khuôn

Enzym DNA polymerase càng mạnh thì phản ứng PCR càng triệt để Tùy các đặc tính của enzym DNA polymerase mà hiệu quả phản ứng khác nhau

Mồi là yếu tố quan trọng nhất quyết định hiệu quả của phản ứng PCR Chọn mồi cần tính toán để đảm bảo Tm của mồi xuôi và mồi ngược không chênh lệch nhau quá lớn, các mồi phải có trình tự nucleotide để chỉ có thể bắt cặp bổ sung ở hai đầu của các mạch khuôn, nếu mồi bắt cặp giữa khuôn PCR không thành công Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại Trình tự DNA cần khuếch đại là trình tự giữa hai mồi không lớn quá 1 kb Nồng độ các loại nucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) khoảng 20-200 µM/mỗi loại, khi nồng độ nucleotide quá thấp giảm hiệu quả PCR, ngược lại nồng độ nucleotide quá cao dễ dẫn đến sự khuếch đại "kí sinh"

Nồng độ Mg++, MgCl2 cũng ảnh hưởng, cần đảm bảo các thành phần dung dịch đệm, nhiệt độ và các chất cần thiết khi thực hiện phản ứng PCR Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase

Ngoài ra, theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998) thì phản ứng PCR còn bị ảnh hưởng bởi số lượng chu kỳ của phản ứng PCR, thông thường không vượt quá

40 chu kỳ cho một phản ứng PCR Bên cạnh đó, thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR cũng góp phần ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng

2.6.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR

Theo Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan (2005) thì phương pháp PCR có các ưu điểm như: thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình tự đáng quan tâm; thực hiện đơn giản và ít tốn kém; yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu cũng không cao

Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm cũng còn nhiều hạn chế như: Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại Để có đoạn mồi này ít nhất phải biết được trình tự nucleotide cần khuếch đại Kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần) Sai sót còn do sử dụng E-Taq-polymerase khoảng 104 (sai sót cho một lần sao chép)

2.7 Các nghiên cứu về nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimal Inhibitory Concentration)

Nồng độ ức chế tối thiểu là nồng độ thuốc nhỏ nhất để có tác dụng với vi khuẩn Với cùng một kháng sinh, nồng độ ức chế tối thiểu thay đổi tuỳ theo vi

khuẩn gây bệnh; vì thế liều thuốc cũng thay đổi (Bùi Kim Tùng và ctv, 2001)

Từ Thanh Dung và ctv (2008) đã kiểm tra giá trị MIC của 64 chủng vi khuẩn

E ictaluri trên 15 loại thuốc kháng sinh bao gồm: chloramphenicol,

nitrophurantion, amoxicillin, amoxicillin+clavilanic, florfenicol, gentamicin, kanamicin, streptomycin, neomycin, enrofloxacin, oxolinic acid, flumiquin, oxytetracycline, trimethoprim và colistin Kết quả không tìm thấy sự kháng thuốc của vi khuẩn đối với kháng sinh chloramphenicol, nitrophurantion,

amoxicillin, amoxicillin + clavilanic, florphenicol, gentamicin, kanamicin, neomycin; có 83% chủng vi khuẩn kháng với streptomycin, 81% chủng vi khuẩn kháng với oxytetracycline, 71% kháng với trimethoprim, flumequin (8%), oxolinic acid (6%) và enrofloxacin (5%)

Ở Thái Lan, Ho et al, (2000) đã xác định giá trị MIC của kháng sinh florfenicol trên E tarda, Aeromonas hydrophyla, Pseudomonas fluorescens,

Vibrio cholerae và Salmonella spp, kết quả là các loài vi khuẩn này đã kháng

với florfenicol Điều này được các nhà khoa học giải thích rằng trước đây ở Thái Lan đã sử dụng choloramphenicol cho nên các dòng vi khu ẩn này đã kháng thuốc, florfenicol cũng là thành phần của choloramphenicol nên các dòng vi khuẩn này vẫn kháng với florfenicol

Năm 2007, Nguyễn Thị Tiên đã nghiên cứu và xác định giá trị MIC của

chloramphenicol trên một số loài vi khuẩn Virio gây bệnh phân trắng trên tôm

sú là 2-256 µg/ml

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 01/2009 đến tháng 06/2009

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Mỹ Xương (Đồng Tháp), Chánh An (Vĩnh Long) và Thốt Nốt (Cần Thơ)

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Cá tra có dấu hiệu bệnh mủ gan

3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ thí nghiệm

- Bộ tiểu phẩu, khay nhựa

- Que cấy, đèn cồn, bình xịt cồn, hộp quẹt

- Ống nghiệm, đĩa Petri thủy tinh

- Cốc thủy tinh, chai nấu môi trường 100ml, 250ml, 500ml

- Viết lông dầu, giấy vệ sinh

- Tủ ấm, tủ cấy vi khuẩn, tủ lạnh, nồi autoclave, tủ sấy

- Kính hiển vi

- Bếp nấu môi trường, cân điện tử

- Các vật liệu nghiên cứu khác, v.v…

3.2.2 Hóa chất và môi trường 3.2.2.1 Hóa chất

Dung dịch nhuộm Gram:

- Dung dịch 1: Crystal violet, ethanol 95%, ammonium oxalate, n ước cất

- Dung dịch 2: iodine, potassium iodide, nước cất

- Dung dịch 3: 95% ethanol; 5% acetone

- Dung dịch 4: safranin, ethanol 95%, nước cất Cồn tuyệt đối, cồn đốt, paraffin, …

Các loại đĩa kháng sinh: amoxycillin (AMX-25µg), florfenicol (FFC-30µg), norfloxacin (NOR-10µg), colistin (CS-50µg), ciprofloxacin (CIP-5µg), streptomycin (S-10µg), doxycycline (DO-30µg), oxolinic acid (OA-2µg) Kháng sinh nguyên liệu: streptomycin

3.2.2.2 Môi trường

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: TSA (Tryptone soya agar), EIA (Edwadsiella

ictaluri agar)

Các hóa chất môi trường kiểm tra sinh hóa: O/F test, H2O2, giấy test oxidase,

VP, Nitrate, Citrate, Decarboxylase với các acid amin (Arginine, Lysine và Ornithine), các loại đường (mannitol, sucrose, glucose, arabinose, inositol, sorbitol, rhamnose) cùng các loại dụng cụ và hóa chất cần thiết khác

Các hoá chất cần thiết cho phản ứng PCR

3.3.2 Phương pháp lấy mẫu vi sinh

Theo bài thực hành bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản (Từ Thanh Dung và Nguyễn Thị Như Ngọc, 2006)

Dùng cồn 70% sát trùng mặt ngoài của cơ thể cá, dùng giấy lau sạch chất nhầy trên cá Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng Khi giải phẩu, để tránh các tạp khuẩn bên ngoài thì các dụng cụ sử dụng phải được tiệt trùng bằng đèn cồn và

để nguội trước khi lấy mẫu ở các cơ quan Dùng kéo tiệt trùng mổ cá (tránh làm vỡ các cơ quan nội tạng), kiểm tra đầy đủ các cơ quan nội tạng, ghi nhận tất cả các hiện tượng không bình thường hoặc các dấu hiệu bệnh lý như: màu sắc, hình dạng, các dấu hiệu bất thường trên gan, thận, tỳ tạng Quan sát vị trí các cơ quan, kiểm tra trong xoang có chất dịch không (nếu có thì ghi nhận ít hay nhiều, màu gì, độ đục ra sao) Dùng dao mổ đã tiệt trùng rạch một đường trên gan, dùng que cấy tiệt trùng đặt vào vị trí vừa rạch, xoay nhẹ để lấy mẫu bệnh phẩm và cấy trên mặt thạch TSA hoặc NA Tương tự lấy mẫu bệnh phẩm trên thận và tỳ tạng

Gan, thận và tỳ tạng của từng con cá được cấy trên hai môi trường TSA

(Tryptone Soya Agar), và môi trường E ictaluri agar (EIA) của vi khuẩn E

ictaluri trong điều kiện tiệt trùng Những khuẩn lạc rời và có hình dạng đặc

trưng của Edwardsiella được tách ròng và lưu giữ để định danh

Các thao tác phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng

Ghi nhận các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc sau 24-48 giờ

Hình thái và kích thước của khuẩn lạc trên môi trường TSA/EIA

Khi đã đạt được đĩa cấy thuần, tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản: nhuộm gram, kiểm tra tính di động, phản ứng oxidase, phản ứng catalase, tình di

động, phản ứng O/F, sau đó tiến hành định danh vi khuẩn

3.3.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống

Hình dạng, kích thước, tính ròng và đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp của Barrow và Feltham (1993)

Cách tiến hành, thành phần hóa chất và môi trường cũng như cách pha chế được trình bày trong Phụ lục 1

3.3.5 Định danh vi khuẩn bằng bộ Kit API 20E

Định danh theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux) Các bước chuẩn bị và thực hiện (Phụ lục 2)

3.3.6 Phương pháp PCR

Chiết tách Acid nucleic (Bartie et al, 2006)

- Nuôi tăng sinh vi khuẩn (48 giờ) trong ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường

NB

- Chuyển 1,5 ml dung dịch vi khuẩn sang ống eppendorf và cho vào 100 µl dung dịch TE (10 mM Tris HCl và 1 mM EDTA)

- Ủ ở 95oC trong vòng 15 phút

- Làm lạnh nhanh ống eppendorf trong nước đá

- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút Rút phần dung dịch Đo hàm lượng DNA bằng máy so màu quang phổ (Biomate 5) ở 260nm

- Xác định hàm lượng DNA:

Hàm lượng DNA (ng/µl) = A 260nm x 50 x độ pha loãng

Khuếch đại AND (theo Panangala et al., (2007) có chỉnh sửa bởi Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2008)

- Thành phần cho phản ứng Đoạn mồi xuôi (EiFd-1): GTAGCAGGGAGAAAGCTTGC

Đoạn mồi ngược (EiRs): GAACGCTATTAACGCTCACACC Bảng 3.1: Thành phần hoá chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui

trình phát hiện vi khuẩn E ictaluri (theo Panangala et al., 2007 có chỉnh sửa bởi Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2008)

1 PCR Buffer (10X) 1X 2,5

2 MgCl 2 (25mM) 1,5 mM 1,5

3 dNTPs (10mM) 200 µM 0,5

4 Taq DNA polymerase 5UI/µl 2,5 UI 0,5

5 Đoạn mồi (EiFd-1) (10µM) 0,4 µM 1

6 Đoạn mồi (EiRs) (10µM) 0,4 µM 1

- Chu kỳ nhiệt

1 Giai đoạn tiền biến tính: 95oC trong 4 phút

2 Tiếp theo là 30 chu kỳ gồm:

- Giai đoạn biến tính: 95oC trong 30 giây

- Giai đoạn gắn mồi: 55oC trong 45 giây

- Giai đoạn kéo dài chuỗi: 72oC trong 30 giây

3 Giai đoạn kéo dài chuỗi cuối cùng: 72oC trong 10 phút

Điện di

Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch chứa 1,5% agarose Đun nóng dung dịch agarose tan hoàn toàn Sau đó để dung dịch nguội khoảng 50-60oC cho ethidium bromide vào và đổ agarose vào khay Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ của khay đựng gel Độ dày của gel chỉ cần cao hơn đáy của lược gel khoảng 0,3-0,5 cm và bề dày gel không quá 0,8 cm EtBr được chuẩn bị từ nguyên liệu tinh 10 mg/ml Pha loãng 10 mg/ml nguyên liệu gốc 20.000 lần

Điện di

Cho gel vào bồn điện di Thêm dung dịch điện di cho vừa bao phủ gel Dùng pipet hút 10 µl mẫu cần phân tích trộn với một giọt dung dịch nạp mẫu 6X cho vào từng giếng một Sử dụng thang DNA để xác định khối lượng phân tử của sản phẩm PCR Nối bồn điện di với nguồn điện và sử dụng dòng điện 100 V Ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel

Đọc kết quả

Đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat (Pháp) Căn cứ vào thang DNA 1 kb plus ladder (Invitrogen) để xác định trọng lượng phân tử Trọng lượng phân tử đoạn DNA

của vi khuẩn E ictaluri cần phát hiện là 407 bp

để tạo dung dịch có độ đục tương đương với độ đục dung dịch chuẩn 3,0 McFarland Sau đó lấy 100µl dung dịch vi khuẩn tán đều trên môi trường TSA bằng que thủy tinh đã tiệt trùng Sau 1 phút dùng 8 loại kháng sinh đặt lên mặt thạch và ủ trong tủ ấm 28oC trong 48 giờ Đường kính vòng vô trùng được tính bằng milimet (mm) Đường kính vòng vô trùng đó được phân thành 3 loại là kháng, trung bình nhạy và nhạy Dựa theo Bảng 3.2 để xác định tính nhạy hay kháng của các chủng vi khuẩn

Bảng 3.2: Giới hạn xác định mức độ kháng, trung bình nhạy và nhạy của các loại kháng sinh theo đường kính chuẩn trung bình của công ty Bio-rad

Kháng sinh Kháng (mm) Trung bình nhạy (mm) Nhạy (mm)

AMX-25µg ≤13 14-17 ≥18 FFC-30µg ≤16 17-19 ≥20 NOR-10µg ≤12 13-16 ≥17 CS-50µg ≤8 9-10 ≥11 CIP-5µg ≤15 16-20 ≥21 S-10µg ≤11 12-14 ≥15 DO-30µg ≤12 13-15 ≥16

3.3.8 Phương pháp xác định MIC

Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn dựa trên phương pháp pha loãng môi trường loãng (Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2006)

Các bước tiến hành như sau Chuẩn bị môi trường và hoá chất

Vi khuẩn được lấy từ tủ -80oC sau khi rã đông thì được cấy lên môi trường TSA, ủ trong tủ ấm 28oC trong 48 giờ

Kiểm tra và ghi nhận các đặc điểm hình thái của vi khuẩn, hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc và nhuộm Gram để xác định tính thuần Nếu vi khuẩn chưa thuần thì tiếp tục tách ròng cho đến khi đạt được đĩa cấy thuần Khi vi khuẩn đã thuần, lấy một ít khuẩn lạc trên đĩa TSA cho vào ống nghiệm chứa 5ml NB (Nutrient broth), ủ ở 28oC trong 48 giờ

Chuẩn bị dung dịch thuốc Chuẩn bị dung dịch thuốc gốc: Chuẩn bị hai chai dung dịch thuốc gốc có

nồng độ 1024 và 256 µg/ml bằng dung môi thích hợp cho mỗi loại thuốc kháng sinh

Pha loãng hai lần để có các nồng độ: 0,5; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512;

1024 µg/ml Pha loãng bằng nước muối sinh lý

Chú ý:

Ống nghiệm có nồng độ thuốc 512 và 256 µg/ml sẽ được pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 1024 µg/ml Những ống nghiệm thuốc còn lại 128; 64; 32;…; 0,5 µg/ml được pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 256 µg/ml Cần lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng các dung dịch thuốc tiếp theo Nồng độ thuốc sẽ giảm đi một nữa khi cho dung dịch vi khuẩn vào Ghi tên thuốc và nồng độ trước khi bắt đầu thí nghiệm

Mỗi nồng độ thuốc được lặp lại 3 lần

Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn

Xác định mật số vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm

và điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng NB (không dùng nước cất) ở điểm OD = 0,1 ± 0,02 mật số vi khuẩn khoảng 1x108 CFU/ml) rồi pha loãng xuống 1000 lần để mật độ vi khuẩn còn khoảng 1x105 CFU/ml Sau đó, mỗi chủng vi khuẩn đều được cấy trên môi trường TSA để kiểm tra sự thuần chủng vi khuẩn và được ủ trong điều kiện với các ống MIC

Cho 2ml dung dịch vi khuẩn vào từng ống nghiệm có chứa 2ml dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau: 0,5; 1; 2; ; 512 µg/ml (lắc đều)

Thí nghiệm có 2 đối chứng:

Đối chứng âm: (2ml NB + 2ml nước muối sinh lý) Đối chứng dương: (2ml dung dịch vi khuẩn + 2ml nước muối sinh lý) Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28oC, trong 48 giờ (đến khi thấy vi khuẩn trong đối chứng dương phát triển)

Đọc kết quả

Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn, nếu có tạp khuẩn thì loại bỏ kết quả hoặc loạt ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục thì làm lại thí nghiệm

Đọc kết quả bằng cách so sánh độ đục của ống MIC với ống đối chứng âm và dương

Giá trị nồng độ MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của thuốc kháng sinh, ở đó không có vi khuẩn phát triển

3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Microsoft Word được sử dụng để đánh văn bản và Microsoft exell được dùng

để vẽ biểu đồ và xử lý số liệu