Công nghệ di truyền Chuyển gen ở nấm men

Microsoft PowerPoint CNDT 2 Chuyá» n gen á»� tế bÀo nấm men CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2 Chuyển gen ở nấm men Tháng 22015 HẠN CHẾ CỦA HÊ THỐNG CHUYỂN GEN SINH VẬT TIỀN NHÂN Protein được tổng hợp từ vi khuẩn thường không bền hoặckhông có hoạt tính sinh học, do • (1) sự xoắn cuộn protein khác nhau (thể vùi, inclusionbody), tạo cầu nối disulfide không chính xác • (2) ở tế bào nhân sơ không có các biến đổi sau dịch mãqua đó các nhóm hóa học chức năng không được gắn vàovị trí amino acid đặc hiệu • (3).

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2 Chuyển gen ở nấm men

Tháng 2/2015

HẠN CHẾ CỦA HÊ THỐNG CHUYỂN GEN SINH VẬT

vị trí amino acid đặc hiệu

• (3) không tổng hợp được protein gồm nhiều tiểu đơn vị

E coli chưa từng được sử dụng trong lên men công nghiệp như các vi khuẩn Gram +, vd Bacillus (amylase, protease), actinomycetes (kháng sinh) hay coryneforms (amino acid, steroid) Tuy nhiên, việc tạo dòng ở các vi khuẩn này không hiệu quả như ở E coli.

Quá trình phiên mã, dịch mã

Sự hình thành mRNA chức năng ở tế bào nhân chuẩn

Quá trình glycosyl hóa ở nấm men

• Các glycans ở nấm thường chỉ

gồm mannose (S pombe

galactose)

• S cerevisiae là một trường hợp

ngoại lệ tạo nhiều phản ứng

mannose hóa, không diễn ra ở tất

• Liên kết α-1,3-Man ở cuối chuỗi

mang tính miễn dịch với vật thể

lạ ở động vật có vú.

Các hệ thống biểu hiện gen phổ biến ở eukaryote

• Để khắc phục những nhược điểm nói trên, hệ thống biểu hiện nhân chuẩn sử dụng nấm men, côn trùng, và tế bào động vật có

vú đã được phát triển.

• Protein tái tổ hợp từ tế bào nhân chuẩn có tính ổn định và hoạt tính sinh học phù hợp cho các nghiên cứu hóa sinh, lý sinh và cấu trúc, vd các protein tái tổ hợp dùng trong y học

• Tế bào thực vật/ bào quan (organs)

• Bào quan thực vật: lục lạp (chloroplasts)

ƯU ĐIỂM CỦA HỆ THỐNG BIỂU HIỆN NẤM MEN

2 chủng nấm men thường được sử dụng là Saccharomyces cerevisiae và Pichia pastoris

• Sinh vật nhân chuẩn, đơn bào, đường kính khoảng 5 µm,

• Nấm men sinh sản bằng cách này chồi hay phân chia trựctiếp (fission), hoặc có thể phát triển ở dạng sợi khuẩn ty(mycelium)

SINH HỌC NẤM MEN

Tế bào nấm men

Nguồn: www.bbc.co.uk

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở NẤM MEN

• 1978 Hinnen và cs lần đầu tiên chuyển

gen trên nấm men Spheroplast S cerevisiae

(nấm men không có thành tế bào) được hòa

cùng polyethylen glycol (PEG) với DNA và

CaCl2, sau đó được tái tạo thành tế bào trong

môi trường ổn định chứa 3% agar

• Kỹ thuật dùng xung điện (electroporation)

hiện nay thay thế cách dùng spheroplast nấm

men vì dễ thực hiện và nhanh hơn Các tế

bào được biến đổi có thể được chọn lọc trên

bề mặt môi trường rắn

Các phương pháp chuyển gene

• Dùng hạt thủy tinh (glass bead method)

Chọn lọc tế bào biến đổi

• Dựa vào đột biến khuyết dưỡng (auxotrophic mutations)

Chủng mang một đột biến ở 1 trong các gen (ura3, leu2, trp1, his3) tương đương với các gen (URA3, LEU2, TRP1, HIS3) có trong vector.

• Các marker chọn lọc: kháng G418, cyclohexamide,

formaldehyde, Cu2+

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở NẤM MEN

(a) Yeast cells at stationary phase, (b) yeast cells at logarithmic phase, (c) spheroplasts obtained

by enzymatic treatment of cells, (d) nuclei (arrows) isolated from spheroplasts by osmotic shock for centrifugation onto a silicon chip (shown in e) according to Step 6A In all images, scale bar = 0.5 mm This figure demonstrates Saccharomyces cerevisiae cells In the case of Saccharomyces pombe, the initial cell differs in shape and is more 'rod-shaped'; however, the spheroplasts and isolated nuclei look very similar to S cerevisiae when visualized using the light microscope.

Tế bào Sacchromyces cerevisiae ở các pha khác nhau trong chu

kì tế bào Thanh ngang = 0,5 mm

Bốn loại vector biểu hiện chính ở S cerevisiae:

vector dạng episome nấm men (YEp, yeast episomal plasmid),

Vector mang trình tự ARS (YRp, yeast replicating plasmid),

vector cài nhập (YIp, yeast integration plasmid ),

Vector mang trình tự tâm động (Ycp, yeast

centromere plasmid)

và các nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC).

CÁC VECTOR CHUYỂN GEN CHÍNH Ở NẤM MEN

VECTOR E COLI - NẤM MEN

Điểm khởi đầu tái bản ở nấm men

Các tế bào bị biến đổi có thể được chọn lọc dựa vào đột biến khuyết dưỡng (auxotrophy) và đặc điểm của đoạn gen chèn vào (gen qui định tính nhạy cảm với nhiệt độ, temperature-sensitive gene).

CÁC VECTOR NẤM MEN

MARKER CHỌN LỌC

Các marker được sử dụng ở nấm men bao gồm URA3,HIS3, LEU2, TRP1 và LYS2 và bổ sung cho các chủngnấm men đột biến khuyết dưỡng bao gồm ura3-52,his3-D1, leu2-D1, trp1-D1 and lys2-201

Các thể đột biến khuyết dưỡng ở nấm men đã được chọnbởi tỉ lệ hồi tính thấp của chúng

Ngoài ra, các gen marker URA3, HIS3, LEU2 và TRP1của nấm men có thể bổ trợ cho các đột biến khuyếtdưỡng chuyên biệt ở E coli

YEp plasmid

Có 2 dạng vector thường được sử dụng để xây dựng plasmid chuyển gen ở nấm men

• YEp (Yeast episomal plasmid)

• YCp (Yeast centromeric plasmid)

Cả hai loại vector này đều mang trình tự hỗ trợ tái bản độc lậpcủa nấm men (yếu tố ARS) Sự hiện diện của chúng càng làmtăng tần số biến nạp

YCp mang tâm động của NST – trình tự này quan trọng cho

sự phối hợp giữa plasmid và thoi vô sắc của tế bào Lượng

bản sao plasmid ở mỗi tế bào giới hạn từ 1 - 2

YEp plasmid

YEp được phát triển từ episom plasmid 2 µm của nấm men FLP: mã hóa cho recombinase

REP 1&2: mã hóa protein tham gia tái bản plasmid

D: vị trí phát huy sự tái bản plasmid

• Các vector YEp (Yeast episomal plasmid) tái bản tự do với sự hiện diện của một đoạn plasmid nấm men 2 µm đóng vai trò như vị trí khởi đầu tái bản (2 µm ori).

• Trình tự 2 µm ori giúp YEp vector có tần số chuyển gen cao

và lượng bản sao cao (25 – 100 copies/cell).

• Hầu hết YEp plasmid không bền vững, lượng tế bào mất trung bình thấp nhất 10 -2 nhiều hơn sau mỗi thế hệ Ngay cả khi ở điều kiện tăng trưởng chọn lọc, chỉ từ 60 – 95% tế bào còn mang YEp plasmid.

• Số lượng bản sao/tế bào: ~ 10 – 40 copy Tuy nhiên, plasmid không phân phối đều trong tế bào.

Vector YEp

trong quá trình này chồi

của nấm men. https://benchthumb.s3.amazonaws.com

YCp plasmid

Mang một phần trình tự ARS

và trình tự tâm động của NST

(quan trọng cho sự phối hợp giữa

plasmid và thoi vô sắc của tế bào).

Lượng bản sao plasmid ở mỗi

tế bào giới hạn từ 1 - 2

YCp tồn tại ổn định mà không cần xác nhập DNA

như YIp vector, là sự lựa chọn lí tưởng cho vector tạo dòng gen, xây dựng thư viện gen nấm men, và khảo sát chức năng gen được thay đổi in vivo

• YIp thiếu trình tự ARS nhưng mang trình tự cho phépkết hợp (intergrate) vào NST với tần suất cao

(homologous recombination, tái tổ hợp tương đồng)

• Sự kết hợp trình tự DNA vào NST nấm men làm chúng

có thể phát triển trong môi trường giàu dinh dưỡng vàđạt đến mật độ cao mà không mất đi gen mong muốn

• Vì thế ở hệ thống này, sự biểu hiện protein cao phụthuộc vào lựa chọn promoter hơn là lượng bản saoplasmid

YIp (Yeast integrating plasmid)

YIp xác nhập với DNA bộ

gen bởi tái tổ hợp đồng

vững và gia tăng biểu hiện

của các gen chuyên biệt

YIp (Yeast integrating plasmid)

• Các hệ thống tạo dòng YAC dựa trên plasmid mạch thẳng của nấm men, nổi bậc là YLp, chứa các trình

tự DNA có chức năng như telomeres (TEL) in vivo, cũng như mang các đoạn ARS và CEN

• YAC vector có thể mang đoạn DNA lớn (lên đến 2 Mb), nhưng hiệu quả chuyển gen rất thấp.

Các thành phần chủ yếu của YAC:

• Centromeres (CEN), telomeres (TEL) và trình tự tái bản độc lập (ARS)

• Marker: ampr , TRP1 và URA3

• Vị trí nhận biết cắt giới hạn (như là EcoRI và BamHI)

YAC (Yeast artificial chromosome)

CÁC VECTOR NẤM MEN – YAC (Yeast artificial chromosome)

Promoter biểu hiện gen

Thông thường, các promotor

cảm ứng có thể kiểm soát chặt

chẽ việc phiên mã, được sử

dụng để sản xuất một lượng

lớn protein tái tổ hợp vào một

thời điểm nhất định trong nuôi

cấy mô qui mô lớn.

Vacine Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B Protein vỏ bào tử sốt rét

Protein vỏ HIV-1 Chẩn đoán

Protein virus viêm gan C Các kháng nguyên HIV-1 Các tác nhân chữa bệnh ở người Tác nhân tăng sinh biểu bì

Insulin Proinsulin Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi Yếu tố đông máu XIIIa

Hyrudin Albumin huyết thanh người

Promoter biểu hiện gen

TẠO PROTEIN DUNG HỢP HỖ TRỢ QUÁ TRÌNH

GẤP VÀ BÀI TIẾT PROTEIN

CÁC PHƯƠNG PHÁP GIA TĂNG BÀI TIẾT PROTEIN Ở NẤM MEN

1 Phân lập các dòng đột biến siêu bài tiết

Đã được phân lập nhiều

Hầu hết không ảnh hưởng bài tiết

Hầu hết là tính trạng lặn

2 Dung hợp protein tái tổ hợp với một protein nội sinh được bài tiết tốt

Yếu tố Prepro – α, Hsp150

3 Loại bỏ gen kiểm soát chất lượng

CNE (dạng tương đồng calnexin)  protein gấp sa i

4 Biểu hiện vượt mức bộ máy gấp protein mạng lưới nội chất

5 Biểu hiện vượt mức các thành phần của bộ máy bài tiết

6 Tối ưu hóa các điều kiện sản xuất

Yeast media

YPAD medium or Also Called YPD plus Adenine

Yeast Extract - Peptone - Dextrose plus Adenine medium

• 6.0 gm yeast extract (Difco)

12.0 gm Peptone (Difco)

12.0 gm Glucose

60 mg adenine hemisulphate

600 ml distilled water

Bacto-agar (Difco) 10 g (added for agar medium)

• Sterilise by autoclaving at 121°C for 15 min

We always use a 1 liter flask and make 600 mls of media because it gives exactly 20 plates (1 Sleeve of plates) In addition this volume

of liquid is more easily handled when pouring after autoclaving.

http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/media.html

Synthetic Complete drop-out Medium

250 ml plastic bottle Add three or four clean glass marbles and shake vigorously to mix

This quantity will be sufficient for approximately 100 (600 ml) batches

of SC drop-out medium Some recipes call for 20 amino acids in the

SC mixture however most yeast strains do not need all of them In addition some recipes do not use homoserine due to the expense, it can

be replaced by the addition of serine and threonine (2 grams each)

Yeast media