NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH...

MÉu b×a luËn v¨n th¹c sÜ cã in ch÷ nhò khæ 210x297mm ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hoàng Anh Thắng NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƢỜNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH COLLAGENASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ĐÃ PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ KHU VỰC QUẢNG TRƢỜNG BA ĐÌNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hoàng Anh Thắng NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƢỜNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH[.]

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Hoàng Anh Thắng

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH COLLAGENASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ KHU VỰC QUẢNG TRƯỜNG BA ĐÌNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2014

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Hoàng Anh Thắng

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH COLLAGENASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ KHU VỰC QUẢNG TRƯỜNG BA ĐÌNH

Chuyên ngành : Vi sinh vâ ̣t ho ̣c

Mã số : 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lại Văn Hòa

PGS TS Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - Năm 2014

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới

TS Lại Văn Hòa, PGS TS Bùi Thị Việt Hà, đã chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn tôi

trong suốt quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành

khóa luận tốt nghiệp, cũng như đã chỉ bảo cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý

báu trong cuộc sống

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô và các cán bộ trong bộ môn Vi

sinh vật học; các thầy cô, cán bộ trong Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học

Tự Nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong

suốt những năm học vừa qua

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ths Phùng Công Thưởng và các đồng chí

thuộc Khoa Vi sinh vật & Môi trường, Viện 69 đã luôn chia sẻ, giúp đỡ và tạo điều

kiện rất lớn để tôi có thể hoàn thành đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã

luôn ở bên tôi, động viên và giúp đỡ tôi cả về mặt vật chất lẫn tinh thần trong suốt

thời gian vừa qua

Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2014

Học viên

Hoàng Anh Thắng

Trang 4

MỤC LỤC

1.1 Sơ lược về cơ chất collagen 1.2 Sơ lược về vi nấm và quá trình sản sinh các enzyme ngoại bào 1.3 Nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng tới sự phân hủy collagen của vi nấm

1.3.1 Quá trình sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase vi nấm 1.3.2 Nghiên cứu về sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nấm

1.3.3 Nghiên cứu về sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase, protease của vi nấm trong công tác bảo quản lâu dài thi thể ướp 1.4 Bộ sưu tập vi nấm phân hủy các cơ chất sinh học tại Viện 69

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Dụng cụ, trang bị

2.2.2 Môi trường nuôi cấy, cơ chất, hóa chất 2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phục hồi, lựa chọn các chủng vi nấm nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp kiểm tra mức độ thuần khiết các chủng vi nấm sau phục hồi trên kính hiển vi quang học

2.3.3 Phương pháp làm mẫu nấm nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) JSM-5410LV

2.3.4 Tiến hành xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

Trang 5

collagenase theo phương pháp của Laster Hankin, S.L

Anagnistakis 2.3.5 Phương pháp nghiên cứu xác định một số điều kiện môi trường ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm

2.3.5.1 Nghiên cứu xác định các giá trị pH ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm 2.3.5.2 Nghiên cứu xác định các giá trị nhiệt độ môi trường

ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm

2.3.5.3 Nghiên cứu xác định các giá trị hoạt độ nước môi trường nuôi cấy ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm

2.3.5.4 Nghiên cứu xác định các giá trị độ ẩm không khí ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm

2.3.5.5 Nghiên cứu xác định tổ hợp các điều kiện môi trường

2.3.6 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu

3.1 Kết quả phục hồi và lựa chọn các chủng nấm sợi nghiên cứu 3.2 Kết quả nghiên cứu xác định các giá trị pH ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm 3.2.1 Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị pH8

3.2.2 Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị pH8,5 3.2.3 Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị pH9 3.2.4 Xác định mối tương quan giữa điều kiện pH môi trường nuôi cấy với khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của

Trang 6

các chủng vi nấm nghiên cứu

3.3 Kết quả nghiên cứu xác định các giá trị nhiệt độ môi trường ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm

3.3.1 Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị nhiệt độ 140C 3.3.2 Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị nhiệt độ 160C 3.3.3 Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị nhiệt độ 180

C 3.3.4 Xác định mối tương quan giữa ba điều kiện nhiệt độ môi trường nuôi cấy với khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của 15 chủng vi nấm

3.4 Kết quả nghiên cứu xác định các giá trị hoạt độ nước môi trường nuôi cấy ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm

3.4.1 Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị hoạt độ nước môi trường 0,6aw

3.5 Kết quả nghiên cứu xác định các giá trị độ ẩm không khí

3.5.1 Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị độ ẩm môi trường 60%

3.5.4 Xác định mối tương quan giữa ba điều kiện độ ẩm môi trường không khí với khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của 15 chủng vi nấm

3.6 Kết quả nghiên cứu xác định tổ hợp các điều kiện môi

Trang 7

trường ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm

Trang 8

MỤC LỤC HÌNH VÀ BẢNG

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của hydroxyproline 7

Hình 1.2 Trình tự sắp xếp các acid amỉn trong phân tử Collagen 8

Hình 1.3 Nghiên cứu hoạt tính collagenase của 12 chủng Coccidioides

immitis trên thạch Czapek có 0,5% collagen gân bò type I

12

Hình 3.1 Aspergillus clavato - nanica Batista (T38) 27

Hình 3.2 Aspergillus silvaticus Fennell and Raper (T65) 28

Hình 3.4 Aspergillus ustus Thom and Church (D45) 30

Hình 3.5 Acremonium ochraceum Gams (T104) 31

Hình 3.6 Cladosporium cladosporioides(Fres.) de Vries (T44) 32

Hình 3.9 Nectria inventa Pethybridge (D94) 35

Hình 3.10 Penicillium cyaneo - fulvum Biourge (T72) 36

Hình 3.11 Penicillium chrysogenum Thom (T142) 37

Hình 3.13 Penicillium italicum Wehmer (D100) 39

Hình 3.14 Penicillium citrinum Thom (D148) 40

Hình 3.15 Scopulariopsis chartarum Morton and Smith (D162) 41

Bảng 1.1 Các loại collagen và các gen cấu trúc 5

Bảng 1.2 So sánh thành phần các acid amin trong collagen và các loại protein khác 6

Bảng 1.3 Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide 9

Bảng 3.1 Danh sách 15 chủng vi nấm lựa chọn nghiên cứu 26

Bảng 3.2 Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

collagenase 15 chủng vi nấm ở pH8

42

Bảng 3.3 Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính 43

Trang 9

collagenase 15 chủng vi nấm ở pH8,5

collagenase 15 chủng vi nấm ở pH9

44

Bảng 3.5 Mối tương quan giữa pH ở vùng kiềm với khả năng sinh tổng hợp

và hoạt tính collagenase của 15 chủng vi nấm

45

collagenase 15 chủng vi nấm ở điều kiện 14 0

collagenase 15 chủng vi nấm ở điều kiện hoạt độ nước môi trường 0,65aw

Trang 10

tính collagenase 15 chủng vi nấm ở ĐKTH

Bảng 3.18 Giá trị hệ số phân giải collagen của 15 chủng vi nấm ở các điều kiện độc lập tương ứng với ĐKTH

66

Trang 11

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Aw : Activity water : Hoạt độ nước môi trường nuôi cấy

RH : Relative humidity: Độ ẩm tương đối môi trường không khí

IpH8: Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện pH 8,0

IpH8,5: Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện pH 8,5

IpH9: Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện pH 9,0

Inđ14: Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện nhiệt độ 140C

Ihd0,6: Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện hoạt độ nước môi trường nuôi

Trang 12

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi nấm trong tự nhiên rất phong phú đa dạng Chúng có khả năng thích nghi mạnh mẽ với điều kiện sống, có thể tồn tại và phát triển trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, nghèo chất dinh dưỡng, có các chất ức chế, dưới các điều kiện nhiệt độ,

độ ẩm, pH khác nhau Có được khả năng đó là do vi nấm có khả năng thích nghi, từ

đó có thể sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào giúp chúng phân huỷ các cơ chất sinh học, sử dụng để tồn tại, phát triển, sinh sản Trong các cơ chất sinh học có collagen,

là một loại protein của động vật

Collagen chiếm tới 25% lượng protein ở động vật có vú Nó bao gồm 29 loại khác nhau và là thành phần chủ yếu của mô liên kết ở động vật có vú, giúp cho các

cơ quan có được bộ khung của mình, đồng thời tạo độ bền đàn hồi cho mô, cơ quan

tổ chức Collagen là thành phần cơ bản của da và cũng có ở các tổ chức như gân, sụn, xương [20]

Các nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính các enzyme phân huỷ các cơ chất sinh học của vi nấm nói chung cũng như phân hủy collagen cho thấy, tính chất này của chúng có thể thay đổi theo các điều kiện môi trường như: nhiệt độ,

độ ẩm, pH, hoạt độ nước cơ chất, [14-17]

Kết quả nghiên cứu tại Viện 69 cho thấy vẫn tồn tại loài vi nấm có khả năng phát triển và gây hư hỏng một số vật liệu đã được xử lý bằng hóa chất bảo quản Nghiên cứu về độ bền vững của da ướp bảo quản dưới tác động của các vi nấm có khả năng sinh proteinase thấy rằng, khi thoát ly khỏi môi trường bảo quản, các yếu

tố về nhiệt độ, độ ẩm, pH thay đổi, xuất hiện các loài vi nấm Aspergillus, Penicillium, Cladosporum phát triển trên bề mặt da ướp, làm thay đổi màu sắc da

ướp, thậm chí phát triển sâu xuống lớp dưới, gây hư hại cấu trúc da [12] Các nghiên cứu khác tại Viện 69 cũng cho thấy khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính các enzyme phân hủy cơ chất sinh học phụ thuộc vào các điều kiện môi trường như, nhiệt độ, độ ẩm không khí, pH, hoạt độ nước cơ chất [1,2,8,9,11]

Trang 13

2

Tuy nhiên, chưa có những nghiên cứu có tính chất hệ thống về các điều kiện môi trường (nhiệt độ, độ ẩm môi trường, pH, hoạt độ nước cơ chất) có tác động ảnh hưởng ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase các chủng loài vi nấm liên quan bảo quản thi thể ướp

Trong thời gian qua, Viện 69 hiện đã lưu giữ được nhiều chủng vi nấm có khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính enzyme phân hủy cao cơ chất khác nhau, trong

đó có những chủng có khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase Đây là nguồn chủng vi nấm phục vụ cho các nghiên cứu về tác hại của vi sinh vật đối với thi thể ướp bảo quản cũng như nghiên cứu tìm ra các biện pháp ngăn ngừa tác hại của chúng

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này với mục tiêu:

- Xác định được thông số các yếu tố pH, hoạt độ nước cơ chất, nhiệt độ, độ ẩm môi trường gây ức chế quá trình sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của 15 chủng vi nấm đã phân lập được trong môi trường khu vực quảng trường Ba Đình

Trang 14

3

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Phục hồi, lựa chọn 15 chủng vi nấm đại diện, có khả năng sinh collagenase và hoạt tính enzyme tốt nhất từ bộ sưu tập tại Viện 69

2 Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình phát triển, sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của 15 chủng vi nấm ở các điều kiện:

- Độ pH môi trường nuôi cấy: 8.0, 8.5, 9.0 (Hoạt độ nước = 0,99 ± 0,1; độ

4 Từ đó xác định được các điều kiện tối ưu gây ức chế quá trình phát triển, sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nấm

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cơ chất collagen

Trang 15

Với da người, collagen có vai trò đặc biệt quan trọng Collagen chiếm 75% trọng lượng khô của da, là thành phần chính trong cấu trúc da Collagen cùng với elastin tạo nên cấu trúc bền vững và dẻo dai cho da, nhờ đó mà da người có thể đàn hồi, săn chắc và giữ được hình dáng cơ thể Theo lứa tuổi, hàm lượng cấu trúc collagen bị thay đổi do khả năng tổng hợp của cơ thể giảm cùng với sự thoái hóa tự nhiên của collagen trong da Từ sau tuổi 25, mỗi năm collagen của cơ thể giảm đi khoảng 1% về khối lượng và cấu trúc, độ dày, độ chặt chẽ giảm dần Chính vì thế

mà da khô dần, nhăn nheo, các nếp nhăn mới xuất hiện, nếp nhăn cũ sâu thêm, chùng xuống, hình dáng cơ thể thay đổi Đó là hậu quả của sự lão hóa, thiếu hụt collagen từ da Cũng từ đây người ta đã nghiên cứu chế tạo các loại sản phẩm bổ sung collagen cho cơ thể bằng các đường uống và dùng ngoài [20]

Đã có nhiều nghiên cứu cơ bản, sâu về collagen ở mức độ tổng quát cũng như ở cấp độ phân tử Hiện nay người ta đã tìm ra 29 loại (type) colagen và cũng đã xác định được các gen quy định từng loại collagen này (Bảng 1.1) Các collagen typ

I, II, III, IV chiếm tới hơn 90% tổng số collagen trong cơ thể Collagen typ I có trong da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương (thành phần chính của xương) Collagen typ II có trong sụn xương, là thành phần chính của sụn Collagen typ III có trong cơ Collagen typ IV là thành phần chính cấu tạo màng tế bào [20]

Collagen có kết cấu rất phức tạp Phân tử collagen (hay Tropocollagen) là một sợi dài khoảng 300 nm có đường kính 1,5 nm, được tạo thành bởi ba chuỗi polypeptit (chuỗi anpha), các chuỗi xoắn với nhau tạo nên cấu trúc xoắn của

Trang 16

IV

COL4A1, COL4A4 COL4A5, COL4A6 COL4A2, COL4A3

IX

COL9A1, COL9A2

Thành phần protein trong collagen có gần đầy đủ các loại acid amin, bao gồm tất cả

20 loại acid amin (Schrieber và Gareis,2007) Thành phần acid amin có thể thay đổi tùy theo nguồn gốc của collagen, nhƣng vẫn tồn tại một vài tính chất chung và duy

Trang 17

6

nhất cho tất cả collagen

Trong thành phần collagen không chứa cystein và trytophan, nhƣng chứa một lƣợng lớn glycine (Gly) chiếm khoảng 33% và proline (Pro) chiếm tỉ lệ 12% và hydroxyproline (Hyp) chiếm tỉ lệ 22% (Theo Balian và Bowes 1977) Collagen là một trong số ít những protein có chứa hydroxylysine (Hyl), ngoài ra trong thành phần collagen còn chứa khoáng chiếm tỉ lệ 1%

Bảng 1.2 So sánh thành phần các acid amin trong collagen và các loại protein khác [19]

Hydroxyproline là một acid amin đặc trƣng của collagen mà các loại protein khác không có Hydroxyproline đƣợc hình thành sau quá trình điều chỉnh proline

Định dạng
Số trang	25
Dung lượng	444,97 KB