các phương pháp chuyển gene ở dộng vật

KHÁI NIỆM: - Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmix tái t

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN

GENE Ở ĐỘNG VẬT

THÀNH VIÊN NHÓM 7:

1 THÁI MINH TÂM

2 THÁI VIẾT HIẾU

3 DƯƠNG THỊ THANH BÌNH

4 PHẠM ĐÌNH THẢO GVHD:

TS NGUYỄN VĂN DUY

I KHÁI QUÁT CHUNG:

1 KHÁI NIỆM:

- Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmix tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào

chủ Trong tế bào chủ,các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen.

- Đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen

được xem là thành công khi gen chuyển vào được tổ hợp vào genome của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp được duy trì ổn định qua các thế hệ con cháu.

2 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN:

- 1977 Gurdon chuyển mRNA và DNA vào phôi Xenopus

(ếch) và quan sát thấy biểu hiện chức năng của chúng

- 1980 Brinster và cộng sự nhận được kết quả tương tự

ở chuột

- 1981 Wagner và cộng sự đã cấy chuyển thành công gen

β-globulin của thỏ vào phôi chuột

- Từ năm 1985 nhiều tác giả thành công trong tạo

thỏ,cừu, lợn, bò chuyển gen và các vật nuôi tăng trưởng nhanh được

- Ngày nay, động vật chuyển gene đã được ứng dụng rất

nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như y học, dược phẩm, nông nghiệp,…

4 ĐỐI TƯỢNG CHUYỂN GENE:

- Hầu hết các phương pháp chuyển gen đều được phát triển trên mô hình chuột và sau đó chúng được ứng dụng trên gia súc, gia cầm.

- Việc chuyển gen thường được thao tác trên:

+ Tế bào trứng đã thụ tinh.

+ Tế bào tinh trùng.

+ Mô phôi ở giai đoạn sớm.

+ Tế bào gốc phôi.

II CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT CHUYỂN GENE:

Gồm các bước cơ bản sau:

-Tách chiết, phân lập gene mong muốn.

-Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật.

-Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gene.

-Biến nạp gene tạo phôi đông vật.

-Nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử ( đối với ĐV bậc cao) -Phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gene

lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gene gốc một cách liên tục.

-Sản xuất động vật chuyển gene.

Bước 1: Tách chiết, phân lập gene mong muốn:

-Gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào

vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập

QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, PHÂN LẬP :

-Cắt DNA mẫu và plasmid

được cắt bởi cùng một enzyme hạn chế.

-Chèn gene mong muốn vào

plasmid Tạo plasmid tái

tổ hợp.

-Biến nạp plasmid tái tổ

hợp vào tế bào vật chủ.

-Tạo điều kiện thuận lợi

cho vật chủ sinh trưởng phát triển.

Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ sản phẩm biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein

+ Từ mRNA dưới tác động của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch đơn (single strand

complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA DNA bổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không chứa các intron mà chỉ bao gồm các exon (Hình 4.2)

+ Từ sản phẩm protein,có thể suy ra trình tự

nucleotid của gen cấu trúc trên cơ sở trình tự các axit amin trong phân tử protein.Sau đó có thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn

Hình 4.2: So sánh hai dạng gen chuyển

Dạng genome bao gồm tất cả các đoạn exon và intron xuất hiện một cách tự nhiên Các đoạn intron liên quan đến việc cắt ghép mRNA và biểu hiện của gen Dạng cDNA

là một trình tự chỉ bao gồm các đoạn exon mã hoá

protein của gen

Bước 2 : Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật:

-Các vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các

loài khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase.

-Bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận

biết các enzyme hạn chế khác nhau

-Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có

vai trò điều hoà sự biểu hiện của gen Các yếu tố điều hoà cũng có thể nằm ở trong đoạn intron Yếu tố điều hoà

ở gần đầu 5’ của gen là promoter, có vai trò quyết định trong việc điều hoà sự biểu hiện của gen

SƠ ĐỒ CẤU TRÚC BIỂU HIỆN GENE

Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động vật như methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin, amylase, insulin, ß-lactoglobulin, adiposite P2 hoặc từ virus động vật như Simian virus(SV40),Rous sarcoma virus (RSV)

Enhancer: gen tăng cường ATG: vị trí khởi đầu phiên mã SIG: trình tự tín hiệu AAA: đuôi polyA

Bước 3:Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen

- Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus).

- Trứng chín được thu nhận bằng phương pháp sử dụng kích dục tố theo chương trình đã được xây dựng cho mỗi loài hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống

nghiệm

Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền

nhân.

-Phương pháp chuyển gene trực tiếp:

Chuyển gene nhờ calcium phosphate

Chuyển gene nhờ xung điện

Chuyển gene nhờ vi tiêm

Chuyển gene nhờ liposome,…

-Phương pháp chuyển gene gián tiếp:

Chuyển gene nhờ virus:

+ vector retrovirus ( RNA )

+ vector adenovirus ( DNA sợi kép )

+ vector adeno-associated virus ( DNA sợi đơn )+ vector herpes simplex virus ( DNA sợi kép )

+ vector baculovirus ( DNA vòng kép ),…

Bước 4: Chuyển gen vào động vật :

- Chuyển gene vào tinh trung hoặc trứng khi đã thụ tinh

nhưng chưa kết hợp thành hợp tử lưỡng bội.

- Việc chuyển gene chỉ thành công khi gene chuyển vào di truyền cho các thế hệ sau.

Qui trình:

- Thiết kế cấu trúc gene chuyển, lựa chọn gene thích hợp và tạo dòng

- Thu nhận trứng đã thu tinh

- Chuẩn bị dung dịch DNA cho vi tiêm, nồng độ từ 1-5 µm/ml

- Chuẩn bị tế bào hợp tử

- Vi tiêm DNA vào tiền nhân

- Chuyển phôi vi tiêm vào cơ thể nhận

- Kiểm tra gene chuyển ở con non Lai tạo để củng cố di truyền

b Chuyển gene nhờ xung điện:

- Máy tạo xung điện có công suất ổn định,điện thế từ 500-1500 v/cm

- Sau mỗi lần thực nghiệm thì có 20-50% tế bào còn sống

Chú ý:

- Các DNA duỗi thẳng cho hiệu quả chuyển gene cao hơn, do khả năng dung hợp với genome của tế bào đích

- Tránh để tế bào dính vào nhau, nên thực hiện trong dung dịch huyền phù đơn

- Cần dùng nhiều DNA và tế bào đơn

- Các tế bào khác nhau thì các thông số sử dụng khác nhau

Máy xung điện ( hãng biorad )

Chuyển gene nhờ vector retrovirus:

1 Đặc điểm cấu tạo và di truyền của retrovirus:

- Là loại virus RNA, có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ và gắn bộ gene virus vào genome tế bào chủ

- Cấu trúc gồm :

+ Có cấu tạo vỏ gồm: vỏ ngoài cùng glycoprotein, vỏ trong là lipide kép, vỏ trong cùng là capside

+ Phần lõi RNA gồm 2 sợi đồng

dạng và các enzyme

+ Enzyme phiên mã ngược ( reverse Transcriptase ), enzyme cài xen ( integrase ) giúp cho quá trình cài xen bộ gene của virus với

genome tế bào vật chủ ở những điểm tương đồng

2 Cơ chế hoạt động của vector:

- RNA của virus được loại bỏ các gene gag, pol, env và thay vào đó là gene cần chuyển.

- Vector retrovirus được đưa vào tế bào vật chủ bằng nhiều phương pháp khác nhau.

- Khi vào trong tế bào chất thì phần vỏ của

vector bị phân hủy, giải phóng RNA.

- Enzyme phiên mã ngược xúc tác RNA 

cDNA  vào trong nhân tế bào  enzyme cài xen giúp gắn cDNA vào genome tế bào vật chủ

 các sản phẩm protein của gene mục tiêu

trong tế bào đích.

Bước 5: nuôi cấy phôi trong ống nghiệm

Tế bào trứng tiền nhân  phôi dâu ( morula ) hoặc túi phôi ( blastocyst )  cấy chuyền vào con nhận được gây chữa giả

Bước 6: Các phương pháp đánh giá động vật sau khi sinh ra từ phôi chuyển gene:

Phương pháp ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay )

1 Nguyên tắc:

- Thông qua sự kết hợp của kháng thể và kháng nguyên trong huyết thanh.

- Kháng thể không gắn kháng nguyên sẽ bị rữa trôi.

- Nhận biết sự gắn này bằng một cơ chất đặc biệt làm thay đổi màu

Đĩa plastic sử dụng để tiến hành xét nghiệm

ELISA

CÁ HỒI CHUYỂN GENE HOOCMON SINH TRƯỞNG GH Ở NGƯỜI

cá có tốc độ tăng trưởng cao gấp 10-30 lần

3 Ý nghĩa, thuận lợi và khó khăn :

b.Trong sản xuất:

- Tạo ra vật nuôi có thể sinh trưởng nhanh, cho chất lượng sản phẩm tốt và số lượng dồi dào.

- Đáp ứng được những nhu cầu ngày càng tăng của con người, cả về số lượng và chất lượng

- Đêm lại nguồn thu nhập khổng lồ cho

người nông dân từ chăn nuôi (sản lượng thịt, trứng, sữa… tăng, hàm lượng các chất cần thiết tăng, thêm nhiều chất quý… )

3.2.Thuận lợi :

- Thế kỷ 21 là thế kỷ của công nghệ sinh học

- Kiến thức về kỹ thuật di truyền và công nghệ gene ngày càng phong phú, đầy đủ, sự giao lưu khoa học quốc tế giúp các nhà nghiên cứu tiết kiệm được thời gian, công sức và tiền bạc,

đồng thời thu được hiệu quả thành công cao

hơn.

3.3.Khó khăn:

Mỗi cơ thể sinh vật đều có tính ổn định, do đó việc chuyển những gene mong muốn là không hề đơn giản, các nhà khoa học vẫn chưa bằng lòng với những gì đã có được vì chủ yếu chúng vẫn nằm trong điều kiện phòng thí nghiệm, khó ứng dụng đuợc ra sản xuất

SO SÁNH KỸ THUẬT CHUYỂN GENE

Ở VI KHUẨN, ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT

GiỐNG NHAU

• Mục đích tạo ra những sinh vật chuyển gene mang các đặc tính vượt trội hơn những sinh vật trước đó, phụ thuộc vào mục đích của con người

– Như tăng năng suất.

– Giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

– Tạo ra các sản phẩm sinh học ( sản lượng thịt, trứng…).

• Đều dùng các vector chuyển gene

• Đều cần có sự tham gia của các enzyme.

• Khả năng tiếp nhận DNA (RNA) đều phụ thuộc vào tế bào nhận và gene cần chuyển.

• Sau khi gene được chuyển vào tế bào nhận đều có khả năng phân cắt bởi các enzyme nuclease

• Đều phải tạo dòng gene từ các tế bào cho bằng phương pháp PCR hoặc bằng vi khuẩn.

• Đều phụ thuộc vào hoạt động sinh lý của tế bào.

• Tế bào cho không cho toàn bộ NST.

• Đều phải thực hiện quá trình chọn lọc dòng.

• Đều chịu tác động trực tiếp vào yếu tố con người và các điều kiện chuyển gen.

• Các loài sinh vật gần gũi, có nhiều lợi ích cho con người (gà,

bò, dê, thuốc lá, ngô, bông…)

GiỐNG NHAU

KHÁC NHAU

Các tế bào

-Công nghệ này cho phép chọn và chuyển chỉ riêng đặc tính mong muốn Hợp

lí, hiệu quả và đem lại kết quả rất tốt.

- Điều kiện nuôi cấy đơn giản hơn Tế bào thực vật

do có thành nên chịu ảnh hưởng bất lợi của môi trường trong quá trình chuyển gen.

-Tạo ra các hợp chất quý

do có hệ enzyme rất đa dạng và phức tạp.

những gen tổng hợp nên protein

có cấu tạo đơn giản

-Có thể tạo ra các sản phẩm gây dị ứng.

- thành tế bào

có thể là yếu tố cản trở quá

trình chuyển gen.

-Điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào phức tạp và rất nghiêm ngặt.

- Tế bào động vật chuyên hóa cao.

- thời gian để nhân đôi tế bào dài.

NỘI DUNG VI KHUẨN THỰC VẬT ĐỘNG VẬT

Nhược điểm - Dễ phát

tán ra môi trường.

- Cũng dễ bị nhiễm khuẩn nếu không đảm bảo đúng quy trình kĩ thuật.

- Không có thành tế bào nên rất dễ tổn thương hay chết trong nuôi cấy.

Tài liệu tham khảo:

-Giáo trình môn kĩ thuật di truyền

-Công nghệ chuyển gene ( động vật, thực vật )

– Trần Quốc Dung

Thank you!