BÀI 19 NGUYÊN tắc một số kỹ THUẬT SHPT ỨNG DỤNG TRONG y học

NGUYÊN TẮC CỦA MỘT SỐ KỸ THUẬT SHPT CƠ BẢN ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC BÀI 19 1 Ths Nguyễn Huỳnh Bích Liễu 1 Nắm được nguyên tắc các bước tiến hành chính trong chiết tách DNA 2 Nắm được nguyên tắc và ứng dụng của kỹ thuật cắt, nối, lai DNA 3 Trình bày được cơ sở của phương pháp hoá học và phương pháp enzym học dùng xác định trình tự acid nucleic (SV tự đọc) 4 Nêu được nguyên tắc của kỹ thuật PCR, các bước cơ bản để tiến hành và các ứng dụng MỤC TIÊU CHIẾT TÁCH DNA Các bước trong quá trình chiết tách DN.

NGUYÊN TẮC CỦA MỘT SỐ KỸ THUẬT SHPT

1 Nắm được nguyên tắc các bước tiến hành chính trong chiết tách DNA.

2 Nắm được nguyên tắc và ứng dụng của kỹ thuật cắt, nối, lai DNA

3 Trình bày được cơ sở của phương pháp hoá học và phương pháp enzymhọc dùng xác định trình tự acid nucleic (SV tự đọc)

4 Nêu được nguyên tắc của kỹ thuật PCR, các bước cơ bản để tiến hành vàcác ứng dụng

MỤC TIÊU

CHIẾT TÁCH DNA

Các bước trong quá trình chiết tách DNA

Bảo quản DNA 4OC hay -20-8 O COC đến

TINH CHẾ

1 Quang phổ

OD 260nm: Hấp thụ base base purine và pyrimidine

OD 280nm: Hấp thụ protein

OD260nm OD280nm

CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG DNA

= 1.8 -2.0

- Nguyên tắc: Dựa vào tính tích điện âm của DNA

+ Trong pH trung tính DNA mang điện tích âm

+ Trong điện trường, DNA sẽ chạy về cực dương

+ Điện di có thể tách các đọan DNA có kích thước khác nhau

- Dụng cụ: giá đỡ đổ gel, hộp điện di có nguồn điện, máy chụpảnh gel

- Hóa chất: gel polyacrylamid hoặc agarose, ethdium bromide, dung dịch đệm, hóa chất khác

2 Phương pháp điện di

9

II PCR (polymerase chain reaction)

Do Kary Mullis phát minh (1985)

Khuyếch đại một đọan DNA in vitro (trong ống nghiệm)

Đây là phản ứng tổng hợp phân tử ADN mới bằng enzymeADN polymerase chịu nhiệt (thường là Taq polymerase).Thành phần phản ứng:

Các giai đoạn của phản ứng PCR

- Giai đoạn biến tính: tách chuỗi DNA từ mạch đôi thành dạng mạch đơn

nguyên tắc bổ sung

mới giống DNA gốc

13

DNA fingerprinting

17

- Qui trình:

• Phân tách DNA load mẫu DNA  chạy điện di  nhuộm với ethidiumbromide  phát hiện dưới tia UV

18

4 Giải trình tự

- Xác định trình tự ADN định danh loài

19

5 Tin sinh học (Bioinformatics)

- Là lĩnh vực khoa học ứng dụng công nghệ máy tính (tinhọc) để phân tích các dữ liệu sinh học trong cơ thể sinhvật

- Công cụ phân tích: Trang web NCBI

20

Ví dụ: 3 giống nghệ giống nhau về hình thái nhưng kiểm tradược tính khác nhau

Có thể do gen quy định dược tính của loài khác nhau

Sử dụng sinh học phân tử để xác địnhPhương pháp

tgtatctgaa ttgttaaaga aatgtagcaa taccctgaaa taacaatacc ccatatctcg cttaagcgag atatggggta ttgttatttt gtttgatgta atgtaatagt attttcattt tttgcgtata gcatacatat ttatttatat tgtataacat atttagatat ttagattgta tatatgtata ttaaatacaa atacataagt

Curcuma sichuanensis

ttgttgagag agcatagcat gaatgatgg atgattgcga acgtgtgaac gtgacccttt cgtcgcccat cccatgttgg tgggcgattg accgtagctc ggtgcgatcg gcactaagga acaacgaact tggaagcaga gggccccctt

Curcuma amada

gaacaaccgc ggagcccgcg tcctggttgt ctgctccgaa atgacggcgg cgagcttccg cgggccttcc gactcgcacc tcgacagcat ggtggggcag gttctgttcg gcgacggcgc cggcgcgatc atcgtcggcg cggacccaga

Curcuma caesia

22

a Hiện tượng giới hạn

- Enzyme giới hạn cắt ADN của phage (thực khuẩn thể) tại

- Enzyme cắt giới hạn: cắt DNA ở một trình tự xác định endonuclease hay exonuclease

“Đầu bằng - đầu tà” (blunt end) hay “đầu dính - đầu so le” (sticky end)

- Vị trí cắt được xác định bởi trình tự 4-6 bp (DNA ngoại lai)

- Luôn là trình tự đối xứng song song

- Hơn 800 loại enzyme cắt giới hạn được tìm thấy

24

- Là quá trình bắt cặp bổ sung giữa các base của 2 mạch đơn polynucleotide

- Sử dụng phát hiện trình tự gen từ bệnh phẩm (mẫu tế bào, mẫu NST bệnh nhân)

- Kỹ thuật: Southern blot, Northern blot, Dot blot, Microarray, FISH

LAI (hybridization)

LAI TẠI CHỖ PHÁT HUỲNH QUANG

(Fluorescence In Situ Hybridization – FISH)

- Mẫu tế bào mang DNA mục tiêu trên NST được xử lý trên lam kính và lai với probe.

- Probe và DNA biến tính (ủ ở nhiệt độ cao)

- Lai với trình tự mục tiêu

- Quan sát phân tích

- Phát hiện các bệnh liên quan đến NST

- Ứng dụng trong di truyền tế bào ung thư

- Tầm soát trước sinh

Ứng dụng lâm sàng

Ứng dụng trong y học

Humulin, human insulin Sản xuất vaccine

31

Chop up with restriction enzyme Chromosome

Sequence fragments DNA fragments

Align fragments

Reassemble full sequence

32

Giải mã bộ gen người