Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPRCas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ raffinose trong hạt.

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPRCas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ raffinose trong hạt.Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPRCas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ raffinose trong hạt.Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPRCas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ raffinose trong hạt.Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPRCas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ raffinose trong hạt.Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPRCas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ raffinose trong hạt.Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPRCas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ raffinose trong hạt.Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPRCas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ raffinose trong hạt.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-LÊ THỊ NHƯ THẢO

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/CAS9 TRONG

TẠO ĐỘT BIẾN GEN GmGOLS03, GmGOLS19 TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) NHẰM GIẢM LƯỢNG

ĐƯỜNG HỌ RAFFINOSE TRONG HẠT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-LÊ THỊ NHƯ THẢO

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/CAS9 TRONG

TẠO ĐỘT BIẾN GEN GmGOLS03, GmGOLS19 TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) NHẰM GIẢM LƯỢNG

ĐƯỜNG HỌ RAFFINOSE TRONG HẠT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã sỗ: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS ĐỖ TIẾN PHÁT

2 PGS TS PHẠM BÍCH NGỌC

Hà Nội – 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quảnêu trong luận án là trung thực và ngoài một số kết quả nhóm nghiên cứu đã công

bố, chưa có ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn trong luận án

đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

LÊ THỊ NHƯ THẢO

LỜI CẢM ƠN

Luận án của nghiên cứu sinh được hoàn thành với sự giúp đỡ, hỗ trợnhiệt tình của các cơ quan nghiên cứu trong nước, các cơ quan đoàn thể, quíđồng nghiệp, bạn bè và gia đình Tác giả xin trân trọng gửi lời cảm ơn và tri

ân đến:

- PGS.TS Phạm Bích Ngọc và TS Đỗ Tiến Phát với cương vị giáo viênhướng dẫn khoa học, đã tận tình hướng dẫn đóng góp trong nghiên cứu cũng nhưluận án của nghiên cứu sinh

- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cấp kinh phí để thựchiện đề tài

- Quí Lãnh Đạo Viện Công nghệ sinh học cùng Quí Thầy – Cô của Viện vàcác cán bộ nghiên cứu của phòng Công nghệ tế bào thực vật, đã quan tâm giúp đỡ,định hướng, tạo điều kiện tốt cho nghiên cứu sinh thực hiện các thí nghiệm và hoànthành luận án

- Ban Lãnh Đạo và cán bộ phòng Đào tạo Học Viện Khoa học và Công nghệViệt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện để nghiên cứu sinh hoàn thành luận án

Tôi xin bày tỏ sự biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Cao đẳng Nông nghiệpNam Bộ, Khoa Trồng trọt – Bảo vệ Thực vật và các Anh chị em đồng nghiệpnhà trường đã tạo điều kiện, hỗ trợ cho tôi hoàn thành khoá học

- Cuối cùng, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, ngườithân, Quí Anh/chị/em, bạn bè đã luôn bên tôi, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điềukiện thuận lợi để tôi an tâm, hoàn thành tốt luận án!

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

LÊ THỊ NHƯ THẢO

MỤC LỤC

Trang LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ x

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

4 Những đóng góp mới của luận án 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Tình hình sản xuất và chọn tạo giống đậu tương 4

1.1.1 Tình hình sản xuất 4

1.1.2 Các phương pháp phổ biến sử dụng trong chọn tạo giống đậu tương 7

1.2 Sinh tổng hợp đường khó tiêu raffinose (raffinose family oligosaccharide) trong cây đậu tương 10

1.2.1 Nhóm đường khó tiêu raffinose trong thành phần hạt đậu tương 10

1.2.2 Con đường sinh tổng hợp RFOs trong cây đậu tương và các enzymes tham gia 14

1.2.3 Gen mã hóa cho Galactinol synthase (GOLS) trong đậu tương 16

1.2.4 Nghiên cứu thay đổi hàm lượng RFOs trên cây đậu tương 17

1.3 Chỉnh sửa hệ gen thông qua hệ thống CRISRP/Cas9 17

1.3.1 Nguyên lý hoạt động của hệ thống CRISRP/Cas 18

1.3.2 Cơ chế hoạt động của hệ thống chỉnh sửa gen CRISRP/Cas9 19

1.3.3 Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trong chọn tạo giống ở đậu tương 22

1.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt động của cấu trúc chỉnh sửa hệ gen 24

1.4 Hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ và ứng dụng trong nghiên cứu biểu hiện gen và chỉnh sửa hệ gen trên đậu tương 25

1.4.1 Hệ thống cảm ứng rễ tơ ở thực vật 25

1.4.2 Nghiên cứu biểu hiện gen và chỉnh sửa hệ gen trên đậu tương 27

1.5 Những nghiên cứu trong và ngoài nước có liên quan trực tiếp đến luận án 28

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Vật liệu nghiên cứu 29

2.2 Nội dung nghiên cứu 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Thiết kế vector chuyển gen mang hệ thống CRISPR/Cas9 30

2.3.2 Cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn A Rhizogenes 31

2.3.3 Kiểm tra sự có mặt và biểu hiện của gen chỉ thị và gen chọn lọc trong rễ tơ đậu tương 33

2.3.4 Xác định và phân tích đột biến định hướng trên các gen đích của các dòng rễ tơ đậu tương 33

2.3.5 Chuyển gen tạo cây đậu tương mang cấu trúc CRISPR/Cas9 35

2.3.6 Phương pháp trồng và chăm sóc cây đậu tương trong điều kiện nhà lưới 37 2.3.7 Phân tích sự di truyền của đột biến định hướng và gen chuyển các dòng đậu tương chỉnh sửa gen 37

2.3.8 Kiểm tra độ nảy mầm của hạt 40

2.3.9 Xác định thành phần hạt 40

2.3.10 Phân tích các đột biến ngoài mục tiêu (off target) 41

2.3.11 Phân tích thống kê 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42

3.1 Thiết kế hệ thống chỉnh sửa CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến các gen GmGOLS trên đậu tương 42

3.2 Kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen và chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 thông qua hệ thống cảm ứng rễ tơ 45

3.2.1 Phát triển hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ trong điều kiện in vitro trên một số giống đậu tương 45 3.2.2 Kiểm tra hoạt động của cấu trúc chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 trên các

dòng rễ tơ 51

3.3 Tạo cây đậu tương đột biến gen mã hóa Galactinol synthase 54

3.3.1 Tạo cây đậu tương chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 54

3.3.2 Sàng lọc cây chuyển gen bằng phết thuốc diệt cỏ và PCR 55

3.3.3 Xác định và phân tích các đột biến gen thu được trên cây đậu tương chuyển gen T0 56

3.4 Sàng lọc các dòng đậu tương chỉnh sửa gen qua các thế hệ T1 và T2 59

3.4.1 Dòng DT 1.1 của giống ĐT26 59

3.4.2 Các dòng M3.1 và M4.1 của giống Marverick 63

3.5 Phân tích sinh trưởng phát triển và thành phần hạt của các dòng đậu tương mang đột biến định hướng 71

3.5.1 Phân tích sinh trưởng, phát triển và hình thái của các dòng đậu tương mang đột biến 71

3.5.2 Phân tích khả năng nảy mầm của các dòng đột biến gen 73

3.5.3 Phân tích thành phần của hạt của các dòng đậu tương mang đột biến 74

3.6 Kiểm tra đột biến ngoài định hướng và lựa chọn dòng đột biến tiềm năng không mang gen chuyển 79

3.6.1 Phân tích đột biến ngoài mục tiêu (off target) 79

3.6.2 Xác định các đột biến đồng hợp tử không mang gen chuyển 80

CHƯƠNG 4 THẢO LUẬN 82

4.1 Hiệu quả của hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ trên các giống đậu tương Việt Nam 82

4.2 Chọn trình tự mục tiêu trong thiết kế cấu trúc chỉnh sửa gen trên đậu tương 83

4.3 Khả năng xuất hiện đột biến định hướng muộn thông qua hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 84

4.4 Đột biến gen GmGOLS và sự nảy mầm của hạt đậu tương 85

4.5 Đột biến gen GmGOLS ảnh hướng đến sự thay đổi của hàm lượng cacbohydrat có trong hạt 85

4.6 Tiềm năng trong chọn tạo giống đậu tương thông qua hệ thống chỉnh sửa hệ gen 87

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88

TÀI LIỆU THAM KHẢO 90

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 100

PHỤ LỤC 101

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

-A rhizogenes Agrobacterium rhizogenes

-A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

-AFLP amplified fragment length

polymorphism Sự đa hình về chiều dài các phânđoạn được khuếch đại

cùng 1ocus

Cas9 Crispr associated protein 9 Protein Cas 9

CRISPR Clustered regularly

interspaced short palindromic repeat

Nhóm trình tự ngắn, phân cáchđều đặn, lặp lại và đối ngẫu

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

Gm GOLS03 Glyma.03G222000

Gm GOLS19 Glyma.19G219100

virus Virus gây suy giảm miễn dịch trênngười

HDR Homology directed repair Sửa chữa trực tiếp theo cơ chế

tương đồngHPLC High-performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

NCBI National Center for

Biotechnology Information

Trung tâm quốc gia về thông tinCông nghệ Sinh học Mỹ

PAM Proto-spacer adjacent motif

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng kéo dài chuỗi nhờ

enzyme polymeraseQTL quantitative trait loci Locus liên quan tính trạng số

lượng

polymorphic DNARi-plasmid Root-inducing

plasmid RFOs raffinose family

oligosacharides

Đa hình phân đoạn DNA đượckhuếch đại ngẫu nhiên

Nhóm đường họ raffinose

RS2 Raffinose synthase 2 Enzyme raffinose synthase 2

fragment length polymorphismRNase III Ribonuclease III

Đa hình chiều các dài đoạn cắt bởienzyme giới hạn

SSR Simple sequence repeat Đoạn trình tự lặp lại đơn giản

nucleotide polymorphismtracrRNA Trans-acting crispr RNA

Đa hình đơn nucleotide

không chỉnh sửa gen

YEP Yeast extract peptone Môi trường Yeast extract peptone

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần các loại môi trường trong nuôi cấy tạo rễ tơ

in vitro đậu tương 31

Bảng 2.2 Thành phần các môi trường sử dụng trong chuyển gen cây

Bảng 3.2 Kết quả chuyển gen của giống ĐT26 và Mr 55

Bảng 3.3 Danh sách các dòng đậu tương mang đột biến gen GmGOLS03

Bảng 3.4 Tổng hợp kiểu gen của các dòng cây T2 sau khi sàng lọc với

các chỉ thị phân tử 69

Bảng 3.5 Các thành phần khác trong hạt đậu tương 78

Bảng 3.6 Các đột biến off-target có thể có ở các cây đột biến T2 79

Hình 1.3 Cấu tạo và mối liên hệ của các đường thuộc họ Raffinose 11

Hình 1.4 Con đường sinh tổng hợp các RFOs 15

Hình 1.5. Quá trình hoạt động của cơ chế CRISPR/Cas ở vi khuẩn chống

lại sự xâm nhập của DNA ngoại lai 19

Hình 1.6. Cơ chế hoạt động của CRISPR/Cas9 trong trường hợp gây biến

đổi trình tự gen 20

Hình 1.7 Chỉnh sửa hệ gene bằng hệ thống CRISPR/Cas… 21

Hình 1.8. Chỉnh sửa bằng hệ thống CRISPR/Cas9 trên một số loại cây

trồng 23

Hình 2.1. Sơ đồ minh họa nguyên lý kỹ thuật biến tính hồi tính dùng trong

sàng lọc đột biến gen 34

Hình 2.2. Sơ đồ minh họa nguyên lý thiết kế các chỉ thị phân tử dùng trong

sàng lọc đột biến phân ly 38

Hình 3.1. Mối quan hệ phát sinh loài giữa các protein GOLS đã được xác

định trong các cây Arabidopsis, cà chua, ngô, 23 trình tự protein

GOLS trên đậu tương 42

Hình 3.2. Phân tích transcriptomics cho gen GOLS trong đậu tương 43

Hình 3.3. Cấu trúc gen GmGOLS và vị trí của các trình tự gRNA… 44

Hình 3.4. Sơ đồ thiết kế vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để chuyển

gen vào đậu tương 44

Hình 3.5 Tỉ lệ tạo rễ tơ của các giống đậu tương chuyển gen 46

Hình 3.6. Cảm ứng tạo rễ tơ trên các giống đậu tương thí nghiệm với cấu

trúc pFGC/gfp trên môi trường đồng nuôi

cấy 46

Hình 3.7. Cảm ứng tạo rễ tơ của các giống đậu tương thí nghiệm với cấu

trúc pFGC/gfp sau 5 ngày trên môi trường cảm ứng tạo

rễ 47

Hình 3.8. Quy trình cảm ứng tạo rễ tơ in vitro trên đậu tương thí nghiệm…

48 Hình 3.9 Biểu hiện gen GFP chỉ thị trên rễ tơ cây đậu

tương 51

Hình 3.10 Sản phẩm khuếch đại bằng các cặp mồi đặc hiệu được điện di

trên gel agarose 1.5% trong đệm TAE 1X 52

Hình 3.11 Kết quả phân tích các đột biến ghi nhận trên các dòng rễ tơ

chuyển gen 53

Hình 3.12 Minh họa quá trình chuyển gen vào đậu tương thông qua nốt lá

mầm 55

Hình 3.13 Phân tích sản phẩm PCR của các dòng đậu tương đột biến gen

thế hệ T0 bằng kỹ thuật biến tính - hồi tính trên gel

polyacrylamide 15% 57

Hình 3.14 Trình tự của các vùng trình tự đích trên gen GmGOLS03 (A) và

gen GmGOLS19 (B) ở cây T0 58

Hình 3.15 Sự phân ly của các đột biến ở thế hệ T1 và T2 của dòng DT1.1…

60 Hình 3.16 Kết quả phân tích sự phân ly của các đột biến trên gen

Hình 3.19 Kết quả phân tích sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử

GOLS-seg F1 và GOLS-GOLS-seg F3 với các cây đột biến T2 68

Hình 3.20 Kết quả giải trình tự vùng gen đột biến trên các cây T2 từ dòng

3.1 và 4.1 của thế hệ T0 giống Mr 70

Hình 3.21 Hình thái của các dòng đậu tương đột biến trồng trong nhà lưới 71 Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng và khối lượng hạt của các dòng

đậu tương đột biến 72

Hình 3.23 Khảo sát khả năng nảy mầm của hạt đậu tương đột biến gen 73

Hình 3.24 Tổng số cacbohydrat hòa tan và tổng số RFOs được đo bằng

HPLC 75

Hình 3.25 Thành phần carbohydrate trong hạt đậu tương 76 Hình 3.26 Tỉ lệ carbohydrate dạng stachyose và sucrose trên tổng khối

lượng carbohydrate hòa tan trong hạt đậu tương 77

Hình 3.27 Tỉ lệ các thành phần khác trong hạt đậu tương 78 Hình 3.28 Phân tích trình tự off-target trong genome của các dòng đậu

tương đột biến thế hệ T2 80

Hình 3.29 Xác định các dòng đột biến không mang gen chuyển 81

1 Tính cấp thiết của đề tài

MỞ ĐẦU

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill),

thuộc họ đậu (Fabaceae) là loại cây công nghiệp

có giàu dinh dưỡng và có giá trị kinh tế cao,được sử dụng làm thực phẩm cho người, thức ăntrong chăn nuôi, làm nguyên liệu cho ngànhcông nghiệp và xuất khẩu Cây đậu tương cótính năng cải tạo đất trồng rất tốt Hạt đậu tương

là bộ phận có giá trị dinh dưỡng cao Thànhphần của hạt bao gồm glucid (12,5-25%), lidpid(12,5-25%) được xem là nguồn dầu thực vật chủlực trên toàn cầu, protein (35- 50%) có giá trịdinh dưỡng tương đương với protein có nguồngốc từ động vật và chiếm khoảng 69% lượngprotein trên toàn cầu phục vụ cho ngành chănnuôi gia súc, gia cầm Ngoài ra, thành phần hạtcòn chứa các vitamin nhóm (B, D, E…), một sốcác axit amin thiết yếu và các thành phần muốikhoáng Tuy nhiên, ngoài những thành phầndinh dưỡng giúp ích cho sức khỏe con người,trong hạt đậu tương lại có sự hiện diện củanhóm đường họ raffinose (Raffinose familyoligosaccharide - RFOs) đây là nhóm đườngkhó tiêu chiếm 50% tổng lượng cacbon hòa tantrong hạt Nhóm đường RFOs chứa liên kết α-galactosidic (1-6) chỉ có thể phân giải bởienzyme galactosidase, tuy nhiên trong hệ tiêuhóa của người và nhóm động vật không nhai lạikhông chứa enzyme này Thế nên, khi RFOsvào hệ tiêu hóa của người và nhóm động vậtkhông nhai lại thì không được tiêu hóa ở dạ dày,đến ruột non nhóm đường này không đượchuyển hóa, không được hấp thu Khi RFOs vậnchuyển đến đại tràng được nhóm vi sinh vật ở

2đây lên men tạo ra carbon

dioxide, hydro và mêtan gây

ra hiện tượng đầy hơi, khó

chịu, ngăn cản quá trình tiêu

hóa Chính nguyên nhân này

đã làm giảm đi giá trị dinh

dưỡng trong hạt đậu tương

Những năm qua, các

nhà khoa học đã áp dụng

nhiều biện pháp nghiên cứu

chọn tạo giống theo hướng

truyền thống như lại tạo, đột

biến, chuyển gen hay công

nghệ RNAi nhằm giảm thiểu

thành phần RFOs nâng cao

giá trị dinh dưỡng của hạt

đậu tương Tuy nhiên các

phương pháp này chưa thật

sự mang lại hiệu quả Gần

đây, sự phát triển của công

nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/

Cas9 mở ra cơ hội trong việc

nghiên cứu chức năng gen ở

mức độ DNA và được ứng

dụng rộng rãi trong cải tạo

giống cây trồng, đặc biệt

trong đó có cây đậu tương

CRISPR/Cas9 với những ưu

điểm như dễ dàng thiết kế

cấu trúc chuyển gen, có thể

tác động tới nhiều gen cùng

một lúc với hiệu quả cao và

đặc biệt là tạo được các dòng

cây đột biến không mang

gen chuyển, công nghệ này đang được phát triển và ứng dụng rộng rãi trênnhiều loại thực vật Đặc biệt, các nghiên cứu gần đây trên cây đậu tương cho thấyCRISPR/Cas9 đã được áp thành công để tạo các dòng đậu tương đột biến địnhhướng và không mang gen chuyển.

Galactinol synthase (GOLS) là enzyme quan trọng xúc tác phản ứng chuyểnhóa L-myo-inositiol thành galactinol Đây là phản ứng đầu tiên trong con đườngsinh tổng hợp đường khó tiêu họ raffinose Trên đậu tương, các nghiên cứu đã xác

định được 6 gen mã hóa cho enzyme GOLS, trong đó gen Glyma.03G222000 (GmGOLS03) và Glyma.19G219100 (GmGOLS19) có biểu hiện mạnh nhất trong

quá trình hạt phát triển Việc giảm hàm lượng Galactinol thông qua đột biến định

hướng trên từng gen riêng biệt hoặc đồng thời cả hai gen (GmGOLS03, GmGOLS19) được kỳ vọng sẽ tăng hàm lượng sucrose, đồng thời giảm hàm lượng

đường khó tiêu RFOs có trong hạt đậu tương Các nghiên cứu trước đây về việcđiều khiển biểu hiện gen mã hóa các enzyme xúc tác trong quá sinh tổng hợp nhómđường RFOs nhằm giảm hàm lượng nhóm đường này trong hạt đậu tương đã thuđược những kết quả khả quan Trong đó, nghiên cứu giảm biểu hiện của các gen

mã hóa cho enzyme raffinose synthase và stachyose synthase đã được thực hiệnthành công trên đậu tương, ghi nhận việc giảm đáng kể hàm lượng raffinose vàstachyose trong hạt Điều này là minh chứng khoa học cho việc điều khiển hoạtđộng của các enzyme tham gia quá trình sinh tổng hợp đường khó tiêu họ raffinose

trong nâng cao chất lượng hạt đậu tương.Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tiễn về tạo giống đậu tương có

hàm lượng đường RFOs thấp, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu

ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03,

GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng

đường họ Raffinose trong hạt”

2 Mục tiêu của đề tài

Phát triển và ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để tạo đột biến định hướngtrên gen mã hóa GOLS nhằm nâng cao chất lượng hạt đậu tương

Mục tiêu cụ thể

- Thiết kế được hệ thống CRISPR/Cas9 và xây dựng thành công phươngpháp kiểm tra hoạt động gây tạo đột biến gen của hệ thống này trên các giống đậutương Việt Nam

- Tạo được các dòng đậu tương mang đột biến định hướng trên hai gen mãhóa enzyme GOLS thông qua hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9.

- Phân tích đặc điểm, tính di truyền và ảnh hưởng của các đột biến địnhhướng trên hai gen mã hóa enzyme GOLS đến hình thái, sinh trưởng phát triển vàthành phần hạt của các dòng đột biến tiềm năng

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học khẳng định vai trò của các gen

GmGOLS tới thành phần đường trong hạt đậu tương, đồng thời cho thấy tiềm

năng và hiệu quả gây tạo đột biến định hướng trên cây đậu tương thông qua hệthống chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9

 Ý nghĩa thực tiễn

Các dòng đậu tương đột biến không mang gen chuyển là vật liệu chocông tác chọn dòng, lai tạo và phát triển các giống đậu tương Việt Nam cónăng suất và chất lượng tốt

4 Những đóng góp mới của luận án

- Đã thiết kế thành công cấu trúc chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 nhằm gâytạo đột biến định hướng trên các gen mã hóa enzyme GOLS và kiểm tra hoạt động

thông qua hệ thống cảm ứng rễ tơ in vitro trên giống đậu tương ĐT22 và ĐT26.

- Tạo thành công các dòng đậu tương mang đột biến định hướng trên các gen

mã hóa cho enzyme GOLS và xác định được các dòng đậu tương (mang đột biếntiềm năng có hàm lượng đường khó tiêu trong hạt giảm

- Khẳng định vai trò của hai gen GmGOLS03 và GmGOLS19 tới con đường

sinh tổng hợp đường khó tiêu họ raffinose trên cây đậu tương

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình sản xuất và chọn tạo giống đậu tương

1.1.1 Tình hình sản xuất

1.1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

Đậu tương là cây thực phẩm ngắn ngày, giàu dinh dưỡng, có giá trị kinh

tế cao, được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyênliệu cho công nghiệp, làm hàng xuất khẩu và là loài cây cải tạo đất trồng rất tốt[1] Do có khả năng thích nghi rộng với các điều kiện khí hậu và sinh thái khácnhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, tập trung nhiềunhất ở Châu Mỹ kế tiếp là Châu Á, sản lượng đậu tương trên thế giới từ năm

2009 đến 2018 đều tăng (Hình1.1) Bình quân hàng năm trên thế giới cókhoảng 91 triệu ha đậu tương được gieo trồng với năng suất bình quân khá cao22-23 tạ/ha Trong đó 90% sản lượng đậu tương thế giới tập trung vào nămnước Mỹ, Brazil, Arghentina, Trung Quốc và Ấn Độ Mỹ là nước có diện tích,năng suất đậu tương đứng vào loại hàng đầu thế giới Năm 2014, diện tích đậutương chuyển gen trồng ở Mỹ đạt 82% (90,7 triệu ha) trong tổng số 111 triệu

ha đậu tương trồng trên toàn thế giới [2]

Hình 1.1 Biểu đồ thể hiện sản lượng cây đậu tương trên thế giới (2009-2018)

Nguồn: Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA)*số liệu dự báo

Một trong những nguyên nhân dẫn đến việc tăng diện tíchgieo trồng là do nhu cầu tiêu thụ đậu tương trên thế giới tăng bìnhquân 4-5%/năm, riêng Trung Quốc tăng 8% bình quân tiêu dùngđậu tương tại Trung Quốc là 36,2 kg/người/năm Châu Á là nơitiêu thụ gần 90 triệu tấn/năm, chiếm 40% sản lượng đậu tươngtoàn cầu Tuy nhiên, sản xuất tại chỗ mới đạt 26,6 triệu tấn/nămcòn phải phụ thuộc tới 70% vào lượng đậu tương nhập khẩu(khoảng 63,3 triệu tấn/năm) Trong số các nước châu Á, TrungQuốc là nước có diện tích đậu tương lớn nhất 8,8 triệu ha, năngsuất cao nhất 16,5 tạ/ha đứng hàng thứ tư trên thế giới Ở khu vựcĐông Nam Á, Indonesia là nước có diện tích trồng đậu tương lớnnhất với 0,72 triệu ha Thái Lan là nước đạt năng suất cao nhất đạt16,3 tạ/ha, kế đến là Việt Nam 14,6 tạ/ha, thấp nhất là Philippines10,0 tạ/ha Theo FAO năm 2019 diện tích trồng đậu tương trên thếgiới đặt 121 triệu ha và sản lượng đặt 2,8 tấn/ha [2].

1.1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam

Ở nước ta, cây đậu tương được phát triển từ rất sớm với giống đầu tiên từ câyhoang dại sau đó được thuần hóa và được trồng như một cây có giá trị dinh dưỡngcao Từ năm 1993 cả nước đã hình thành sáu vùng sản xuất đậu tương chủ lực baogồm vùng Đông Nam Bộ với diện tích trồng đậu tương lớn nhất cả nước (chiếm26,2% diện tích đậu tương của cả nước), khu vực miền núi Bắc Bộ (24,7%), vùngđồng bằng sông Hồng (17,5%), đồng bằng sông Cửu Long (12,4%) Tổng diện tíchsáu vùng này chiếm 66,6% tổng diện tích đậu tương cả nước Về mùa vụ, đậu tươngtrồng ở vụ xuân chiếm 14,2% diện tích, vụ hè thu (31,2%), vụ mùa (2,68%), vụ thuđông (22,1%), vụ đông xuân (29,7%) [1]

Hình 1.2 Biểu đồ thể hiện sản lượng cây đậu tương ở Việt Nam (2009-2018)

Nguồn: Tổng cục thống kê *số liệu dự báo

Tuy nhiên với các phương pháp canh tác truyền thống, bộ giống năng suấtthấp, sản xuất nhỏ lẻ, giá thành sản xuất cao, lãi suất thấp, dẫn đến giá thành đậutương trong nước không có khả năng cạnh tranh với đậu tương nhập khẩu Đây lànguyên nhân khiến cho nông dân không mặn mà với cây đậu tương Vì vậy, diệntích và sản lượng đậu tương của nước ta phát triển chậm Năm 2012, sản lượng đậutương nước ta giảm 34,3% so với cùng kỳ năm trước, xuống còn 173,7 nghìn tấn dothời tiết lạnh khắc nghiệt vào cuối năm 2011 đến đầu năm 2012 khiến cho năng suất

và diện tích gieo trồng giảm mạnh Sản lượng đậu tương tiếp tục giảm trong những

năm tiếp theo từ 2012 đến 2016 trước khi tăng trở lại vào năm 2017 Tuy nhiên, quy

mô sản xuất đậu tương vẫn còn rất nhỏ so với các loại cây trồng khác và thấp hơnnhiều so với nhu cầu trong nước, cũng như so với mục tiêu 2020 của Chính phủViệt Nam được trình bày trong "Kế hoạch phát triển nông nghiệp và nông thôn giaiđoạn 2016- 2020" là 265 nghìn tấn đậu tương trên diện tích canh tác 166 nghìn ha.Theo số liệu thống kê sơ bộ của Cục thống kê năm 2020 diện tích đậu tương trồngtrên cả nước đạt 41,6 nghìn ha, sản lượng đạt 65,4 nghìn tấn [3]

1.1.1.3 Yêu cầu đặt ra trong chọn tạo giống đậu tương ở nước ta

Đậu tương là giống cây công nghiệp ngắn ngày, có thị trường tiêu thụ rộnglớn, là nguồn nguyên liệu được sử dụng trong các ngành công nghệ chế biến thựcphẩm, dược phẩm, chế biến thức ăn gia súc… Tuy nhiên, sản lượng đậu tươngtrong nước không đáp ứng đủ nhu cầu và chúng ta đang phải nhập khẩu phần lớnlượng đậu tương để đáp ứng nhu cầu sử dụng Hầu hết ở các vùng trồng trọt trong

cả nước, đậu tương được trồng theo hình thức canh tác nhỏ lẻ theo qui mô hộ giađình, chi phí sản xuất tương đối cao, trong khi giá trị kinh tế thu được từ việc sảnxuất đậu tương không bằng các loại cây trồng khác nên người dân ít chú trọng mởrộng diện tích [4] Bên cạnh đó, tác động của sâu bệnh hại và thiếu bộ giống chấtlượng, thích hợp cho từng vùng miền canh tác cũng là một trong những nguyênnhân chính ảnh hưởng đến năng xuất gieo trồng và sản lượng đậu tương của nướcta

Lợi thế của sản xuất đậu tương trong nước là có thị trường tại chỗ nên giảm

được chi phí vận chuyển, chất lượng hạt tươi mới, phù hợp với khẩu vị của ngườidân Để phát triển sản xuất đậu tương trong nước giải pháp chủ yếu cần phấn đấu làgiảm giá thành sản xuất dựa trên cơ sở tăng diện tích trồng, tăng năng suất, tăngphẩm chất hạt Ngoài ra, khâu chọn giống đóng vai trò hết sức quan trọng trongchiến lược phát triển cây đậu tương ở Việt Nam Các giống đậu tương bản địa phùhợp với điều kiện sinh thái và có khả năng thích nghi tốt với điều kiện trồng trọt củatừng vùng miền sẽ là thế mạnh so với các giống ngoại nhập.

Tuy nhiên, hầu hết các giống này có năng suất và chất lượng hạt chưa cạnhtranh được so với các giống ngoại nhập Do vậy, việc cải tạo các giống đậu tươngtrong nước theo hướng tăng năng suất, tăng chất lượng, tăng khả năng chống chịu

là chiến lược quan trọng trong công tác chọn tạo giống đậu tương của nước ta trongnhững năm gần đây

1.1.2 Các phương pháp phổ biến sử dụng trong chọn tạo giống đậu tương

1.1.2.1 Các phương pháp chọn tạo giống truyền thống

 Chọn lọc

Bản chất của phương pháp chọn lọc chính là quá trình lựa chọn các giốngcây trồng có năng suất cao và chất lượng tốt, có khả năng kháng sâu bệnh hay cókhả năng chống chịu stress của môi trường, thay đổi thời gian chín hoặc các đặctính nông học tốt Ở đậu tương, phương pháp này thường được các nhà nghiên cứu

áp dụng

nhằm chọn lọc các giống nhập nội hay chọn lọc trực tiếp từ nguồn vật liệu di truyền

và nguồn gen của các giống địa phương

 Lai tạo

Lai hữu tính được xem là phương pháp cơ bản để tạo ra các vật liệu, biến

dị di truyền cho chọn giống Nhờ lai tạo giống mà người ta có thể phối hợp nhữngđặc tính hay tính trạng có lợi của các dạng bố mẹ và con lai [5] Đậu tương là cây

tự thụ phấn, tỉ lệ giao phấn chỉ từ 0,5% đến 1%, nên khả năng lai để tạo ra tổ hợpthường thành công với tỉ lệ thấp Tuy vậy, đã có nhiều giống đậu tương nước tađược tạo ra bằng phương pháp lai cho năng suất cao, ví dụ như giống VN1 Tronggiai đoạn 1985 – 2005 các nhà chọn tạo giống đậu tương Việt Nam đã lai tạo được

15 giống đậu tương được công nhận là giống quốc gia

 Đột biến

Đột biến là phương pháp được nhiều nhà nghiên cứu ở nhiều nước áp dụngtrong chọn tạo giống cây trồng, bởi các ưu điểm có thể sửa chữa, khắc phục nhữngtính trạng không mong muốn và tổng hợp nhiều tổ hợp tính trạng nhằm tăng phẩmchất, tăng giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cho cây trồng Cụ thể như làm tăngchất lượng hạt, tăng số lượng quả, tăng trọng lượng hạt hay điều khiển hình thái cao

- thấp của cây và ngược lại, tăng hoặc giảm thời gian sinh trưởng, cải thiện được tổhợp các đặc tính kinh tế ở các giống địa phương theo hướng có lợi mà vẫn giữ đượccác đặc tính quý của giống gốc Đậu tương là đối tượng được nhiều nước nghiêncứu tạo giống bằng phương pháp xử lý đột biến cảm ứng nhằm tạo ra các giống vànguồn vật liệu mới Việc sử dụng các tác nhân gây đột biến trên đậu tương đã đạtđược nhiều kết quả thành công ở nhiều nước trên thế giới Ở Việt Nam, các nhànghiên cứu đã sử dụng tác nhân lý hóa để tạo giống đậu đột biến và đã thu đượcnhiều kết quả khả quan, các giống mới được tạo ra có triển vọng ứng dụng vào sảnxuất như giống V70, ĐT84 có năng suất cao, thời gian sinh trưởng ngắn, khả năngchống chịu sâu bệnh tốt, khả năng thích ứng rộng

1.1.2.2 Chọn tạo giống đậu tương với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử và công nghệ gen

 Sử dụng chỉ thị phân tử DNA trong chọn tạo giống đậu tương

Các chỉ thị phân tử DNA như RFLP (restriction fragment lengthpolymorphism), RAPD (random amplified polymorphic DNA), AFLP (amplifiedfragment length polymorphism), SSR (simple sequence repeat), SNP (singlenucleotide polymorphism) kết hợp việc sử dụng bản đồ QTL (Quantitative TraitLoci) đã được áp dụng hiệu quả phục vụ yêu cầu chọn giống tạo giống cây trồngtrong đó có cây đậu tương

Các công trình nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương điển hình như: Hwang

và cộng sự đã phân tích đa hình về độ dài của 377 dấu hiệu lặp lại trình tự đơn giản(SSR) trong 87 loại đậu tương ưu tú được trồng tại Nhật Bản và giống cây hoang

dã, đã xác định được sự tương quan giữa các locus của các giống đậu tương có cùngnguồn gốc địa lý, điều này có ý nghĩa quan trọng và thuận lợi cho việc lập bản đồ ditruyền của các đặc điểm quan trọng về mặt nông học cũng như việc chọn tạo giống

[6] Nghiên cứu của Nguyễn Lộc Hiền (2017) về đánh giá sự đa dạng ditruyền của 22 giống đậu tương rau Nhật Bản dựa trên 15 tính trạng hình thái-nônghọc, 40 primer RAPD và 26 primer SSR, cho kết quả có 62,85% đặc điểm hình thái-nông học được mô tả là đa hình So với chỉ thị hình thái, chỉ thị RAPD và SSR đãchỉ ra mức độ khác biệt cao hơn và hiệu quả trong phân tích đa dạng di truyền chỉthị RAPD với 70,32% đa hình và 94% chỉ thị SSR là đa hình Phân tích nhóm dựatrên 3 loại chỉ thị phân tử này đã phân 22 giống nghiên cứu thành 4 nhóm vớikhoảng cách Euclidean là 4,47- 10,05 Mức độ đa dạng di truyền cho thấy sự khácbiệt giữa các giống đủ để sử dụng cho việc chọn tạo giống mới Bốn giống Waseedamame, Fusanari chamame, Chuse edamame và Yuusuzumi có quan hệ xa về mặt

di truyền so với các giống khác và đây là nguồn vật liệu lai tạo quan trọng chotương lai [7]

 Ứng dụng công nghệ gen trong chọn tạo giống đậu tương

Chuyển gen là kỹ thuật đưa đoạn DNA ngoại lai vào hệ gen tế bào chủ nhằmcải biến tế bào chủ mang đặc tính mong muốn Các ứng dụng ban đầu về chuyểngen cây trồng chủ yếu tập trung vào các đặc tính phù hợp với quá trình sản xuấtnông nghiệp như kháng thuốc diệt cỏ, kháng bệnh do côn trùng, kháng yếu tố bấtthuận của môi trường (hạn, mặn, chua của đất…) Về sau, các kỹ thuật di truyền chútrọng hơn vào các đặc tính chất lượng cây trồng chuyển gen, tạo nên sự đa dạngtrong thành tựu chuyển nạp gen vào cây trồng Cụ thể như cây đậu tương chuyểngen tăng cường hàm lượng dầu Oleic và amino acid đang được thử nghiệm ở Mỹ[8]

Hai phương pháp sử dụng rộng rãi nhất trong chuyển gen vào cây đậu tương

là chuyển gen thông qua vi khuẩn (Agrobacterium-mediated transformation) và

phương pháp chuyển gen sử dụng súng bắn gen (particle bombardment) Trong đó,

phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium là phương pháp đơn

giản, không yêu cầu cao về trang thiết và chi phí thấp nên đã được ứng dụng rộngrãi ở nhiều phòng thí nghiệm và đơn vị nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương Cácvật liệu chuyển gen đậu tương phổ biến là gốc lá mầm, phôi chưa chín, đỉnh phôi,trụ dưới lá mầm, mô lá rất nhiều tính trạng quan trọng của cây đậu tương đã đượccải tạo và phát triển thông qua kỹ thuật chuyển gen như kháng sâu, chống chịu sâubệnh ngoại cảnh, kháng thuốc diệt cỏ…Trong đó, tính trạng kháng thuốc diệt cỏđược nghiên cứu và ứng dụng phổ biến nhất với nhiều loại gen chuyển được sử

dụng như,

gen CP4 EPSPS (kháng glyphosate), gen bar hoặc pat (kháng glufosinate

ammonium)…Từ năm 2015 đến 2019, Mỹ có diện tích cây trồng biến đổi gen lớnnhất trên toàn thế giới đạt mức 71,5 triệu ha trong đó đậu tương biến đổi gen chiếm48,2 % diện tích trên; năm 2020 có 94% giống cây đậu tương đã được biến đổi gen

để kháng thuốc diệt cỏ [1]

1.2 Sinh tổng hợp đường khó tiêu RFOs trong cây đậu tương

1.2.1 Nhóm đường khó tiêu RFOs trong thành phần hạt đậu tương

1.2.1.1 Thành phần hạt đậu tương

Hạt đậu tương là nguồn nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm chếbiến các sản phẩm như bột đậu tương, sữa bột đậu tương, sữa chua đậu tương, nướctương, chao, làm giá đỗ, tào hũ, đặc biệt là dầu đậu tương Hàm lượng lipid tronghạt đậu tương chiếm 12,5–25,0% chứa thành phần các axit béo không no với hàmlượng cao trong khi tổng số chất béo chiếm khoảng 18%, đây được xem là nguồndầu thực vật quan trọng Hàm lượng protein trong hạt đậu tương chiếm tỉ lệ cao nhất35-50%, theo các chuyên gia dinh dưỡng protein có nguồn gốc từ đậu tương có giátrị dinh dưỡng ngang bằng protein có nguồn gốc từ động vật vì thế đậu tương cònđược gọi là “thịt không xương“ Ngoài ra, thành phần hạt còn chứa glucid (10-15%), các vitamin nhóm B như B1, B2, B6, vitamin E,… sắt, canxi, photpho; cácthành phần giúp ích cho sức khỏe con người như phytosterol, lecithin, isoflavon,phytoestogen và những sản phẩm ức chế phân hủy protein [1] Bên cạnh đó, hạt đậutương còn chứa từ 15 đến 20 loại hợp chất carbohydrate hòa tan khác nhau chiếmkhoảng 15 đến 25% trọng lượng khô của hạt Trong đó, nồng độ của nhóm đườngRFOs chiếm hơn 50% tổng lượng đường hòa tan [9] Các nhà khoa học đã chứngminh rằng sự hiện diện của RFOs trong khẩu phần ăn của động vật khiến thức ăn điqua hệ tiêu hóa nhanh hơn từ đó làm giảm lượng các chất dinh dưỡng khác đượchấp thụ từ thức ăn [10]

1.2.1.2 Nhóm đường khó tiêu họ raffinose (Raffinose Family Oligosacharides)

Một trong những hạn chế chính của nguồn carbohydrate đậu tương là sự hiệndiện của các Oligosaccharide thuộc họ Raffinose (RFOs) bao gồm raffinose,stachyose và verbascose Chúng là các mono-, di- và tri-galactoside của sucrose,thành phần chính có trong hạt đậu tương, tồn tại ở dạng carbohydrate có thể hòa tantrong nước [11]

Hình 1.3 Cấu tạo và mối liên hệ của các đường thuộc họ Raffinose

O -α- d -Galactopyranosyl-(1→ 6) - [ O -α- d -galactopyranosyl- (1→ 6)] 2 - O -α- d -glucopyranosyl- (1→ 2) β- d -frutofuranoside Các mũi tên chỉ ra

các điểm bị thủy phân bởi các enzyme [12].

RFOs là chất lưu trữ phổ biến có trong hạt đậu tương, nó ảnh hưởng đến khảnăng giữ ẩm của hạt và khả năng chịu stress của cây [13] Một số nghiên cứu gầnđây cho thấy trong hạt đậu tương của các giống đang được gieo trồng có chứa hàmlượng cao stachyose và raffinose [14] Bên cạnh đó, một vài nghiên cứu về hạt đậutương có lượng hàm stachyose và raffinose thấp hoặc raffinose tổng thể (RFOs) lạithấp hơn so với cây hoang dại, mà không dẫn tới sự khác biệt đáng kể về khả năngchống chịu stress hoặc khả năng nảy mầm của hạt [15] Trên các giống đậu tươngthuần chủng thành phần chính trong RFOs là stachyose (30-60 g/1 kg), tiếp đến làraffinose (2-9 g/1 kg) [16] Nghiên cứu của Kumar cũng chỉ ra rằng trong hạt đậutương có chứa từ 6,4-25,3 mM/kg raffinose và 20,9-71,0 mmol/kg stachyose [17] Ởhạt trưởng thành RFOs chủ yếu dạng stachyose, các hợp chất này có nguồn gốc từsucrose có tác dụng tích cực đến quá trình chuyển hóa năng lượng Tuy nhiên đây lànhóm đường khó tiêu hóa đối với người và động vật dạ dày đơn [10]

Các nghiên cứu vừa qua cho thấy RFOs là nguồn năng lượng ảnh hưởng đếnquá trình nảy mầm của hạt, việc ức chế chuyển hóa RFOs làm giảm đáng kể khảnăng nảy mầm của hạt [18] Hàm lượng stachyose trong hạt tỉ lệ thuận với khảnăng chịu

ẩm của hạt đậu tương, đối với hạt non bị khô nước sẽ chậm làm tăng tích lũyRFOs [19] Những oligosaccharide khó tiêu hóa này thông qua hệ tiêu hóa đi từ qua

dạ dày đến ruột non, sau đó chúng được lên men bởi các vi sinh vật kỵ khí cư trútrong ruột già Quá trình lên men tạo ra khí CO2 và CH4 làm rối loạn hoạt động tiêuhóa dẫn đến chứng đầy hơi và tiêu chảy ở động vật dạ dày đơn [20]

Mối quan tâm đến các yếu tố gây ra sự thay đổi này bắt nguồn từ ý nghĩanông nghiệp của RFOs Do đặc tính khó chuyển hóa trong hệ tiêu hóa của người vàđộng vật dạ dày đơn nên việc loại bỏ RFOs trong hạt của cây trồng vẫn đang đượcnghiên cứu tích cực [21]

 Raffinose

Raffinose (RFO) là một trisaccharide gồm galactose, glucose và fructose.Chúng có thể được tìm thấy trong đậu, bắp cải, cải bruxen, bông cải xanh, măng tây,các loại rau khác và ngũ cốc nguyên hạt RFO có khối lượng phân tử cao hơnStachyose, Verbascose và Ajugose Raffinose, có thể được thủy phân thành D-galactose và sucrose bởi enzyme α-galactosidase (α-GAL), một loại enzyme không

có trong đường tiêu hóa của con người [22] Các nhà khoa học cho rằng RFO đượcxem như tác nhân bảo vệ phôi hạt trong quá trình tạo độ ẩm và bảo quản hạt ở trạngthái khô [13], tuy nhiên không có bằng chứng về mối quan hệ giữa sự tích tụ củachúng và khả năng chịu ẩm RFO thường tích tụ trong các mô sinh dưỡng như mộtkháng thể của thực vật giúp cây chống lại stress sinh học và phi sinh học [23]

 Stachyose

Một trong những tetrasaccharide dồi dào trong thực vật là stachyose.Stachyose bao gồm bốn đơn vị đường: hai đơn vị α-D-galactoza, một đơn vị α-D-glucoza và một đơn vị β-D-fructose lần lượt liên kết như sau gal(α1→6) gal (α1→6)

glc (α1↔2β) fru Stachyose lần đầu tiên được phân lập từ thân rễ của Stachys tuberifera, cùng tồn tại với RFO và các oligosaccharide liên quan khác trong các cơ

quan khác nhau của nhiều loài thực vật Trong cây thân gỗ, họ bầu bí và cây họ đậuloại đường này tồn tại trong không bào, rễ, hạt mang chức năng dự trữ và vậnchuyển trong cây

Các tế bào trung gian là nơi chủ yếu tổng hợp RFO và stachyose Trong

lá Catalpa và Buddleia, stachyose được tổng hợp từ sự kết hợp của RFO và

galactinol thông qua quá trình quang hợp Enzyme raffinose synthase (RS)không thể tổng hợp stachyose, một loại enzyme cụ thể tồn tại trong nguồnthực vật đã tổng hợp tetrasaccharide này Enzyme này được phân lập từ một

số nguồn và được tìm thấy để xúc tác phản ứng sau [24]:

 [14C] Galactinol + raffinose    →[14C] stachyose + myo-inositol

Tuy nhiên, phản ứng chuyển vị có thể thuận nghịch tự do, nhưng quá trình tổng hợp stachyose được ưu tiên [25]:

Stachyose + [14C] raffinose    ⇌ [14C] stachyose + raffinose

Ở thực vật, stachyose được tổng hợp trong quá trình phát triển của lá và quátrình tổng hợp đạt mức cao nhất ở giai đoạn lá trưởng thành Stachyose sẽ vậnchuyển đến tất cả các bộ phận khác trong cây thông qua mạch rây (libe), ngoại trừ

lá trưởng thành khác Sự tổng hợp stachyose xảy ra ngay cả ở những lá già và một

phần bị vàng.Trong hạt, stachyose được chuyển hóa trong quá trình nảy mầm Ở nhữngcây cứng mùa đông, stachyose và các oligosaccharide liên quan tạo nên sự cứng cápcho cây; hàm lượng có sự thay đổi theo mùa về kích thước vách tế chúng Stachyosechủ yếu được sử dụng làm chất tạo ngọt hoặc sử dụng với tính chất, chức năng củamột oligosaccharide Con người không tiêu hóa được stachyose hoàn toàn

Verbascose

Verbascose là một pentasaccharide có mặt trong tầng libe và trong các cơquan lưu trữ của nhiều loài thực vật, đặc biệt là trong hạt của cây họ đậu [26].Nhóm đường này có rất ít trong hạt nên nghiên cứu về chức năng sinh lý củaverbascose trong hạt cũng hạn chế Verbascose có thể hoạt động như một chất bảo

vệ trong quá trình trưởng thành hạt bị khô hạn hoặc là nguồn dự trữ carbon cho quátrình hạt nảy mầm [27] Hàm lượng của verbascose trong hạt có thể biến đổi mạnh,

cụ thể nghiên cứu về sự thay đổi hàm lượng verbascose ở đậu faba (Vicia faba) thay

đổi từ 1,1% đến 9,9% chất khô của hạt [28] Trong một cuộc khảo sát về kiểu gen

của hạt đậu (Pisum sativum), các giá trị về hàm lượng verbascose dao động từ mức

không thể phát hiện đến 3,1% chất khô

Nghiên cứu ban đầu chỉ ra rằng sinh tổng hợp verbascose tiến hành bằngcách chuyển một đơn vị galactose từ galactinol [O ‐ α ‐ d ‐ galactopyranosyl‐ (1

→ 1) ) l ‐ myo ‐ inositol] thành stachyose Việc phân lập được enzyme verbascosesynthase

(VBS) từ hạt đậu của các nhà khoa học đã chứng minh đây là quá trình tổnghợp stachyose đa chức năng [29] Enzyme hoạt động theo cơ chế bóng bàn Trongnửa phản ứng đầu tiên, đơn vị galactose được chuyển từ galactinol sang enzyme, tạothành phức hợp enzyme-galactose trung gian:

Galactinol + E ⇔ myo ‐ inositol + [E ‐ Gal] (1)

Trong nửa sau phản ứng, đơn vị galactose được chuyển sang raffinose (hoạtđộng STS) hoặc stachyose (hoạt động VBS):

[E ‐ Gal] + raffinose ⇔ E + stachyose (2)

[E ‐ Gal] + stachyose ⇔ E + verbascose

(3)

Tất cả các phản ứng đều có tính chất thuận nghịch, xảy ra tại một vị trí hoạtđộng duy nhất Do đó, sự đảo ngược của một nửa phản ứng (Phương trình 2) và mộtnửa phản ứng (Phương trình 3) có thể được kết hợp như một chu trình xúc tác toàn

bộ, tạo ra verbascose và raffinose từ stachyose làm chất nền duy nhất:

Stachyose + stachyose ⇔ raffinose + verbascose (4)

Trong một nghiên cứu về sự tích tụ của RFOs trong hai giống đậu tương chothấy yếu tố giống cũng ảnh hưởng đến sự tích tụ đường verbascose Cụ thể, sự tích

tụ của RFOs được nghiên cứu trong hạt chín của hai dòng đậu (Pisum sativum), hạt

của dòng SD1 tích lũy stachyose là chiếm ưu thế trong khi verbascose dường nhưkhông có mặt Tuy nhiên, hạt của dòng RRRbRb có một lượng verbascose được tíchlũy cùng với stachyose Sự gia tăng verbascose trong việc phát triển hạt RRRbRb cóliên quan đến hoạt động tổng hợp verbascose và phụ thuộc galactinol mà cụ thể làcác mRNA liên quan đến việc mã hoá các enzyme [30]

1.2.2 Con đường sinh tổng hợp RFOs trong cây đậu tương và các enzyme tham gia

1.2.2.1 Con đường sinh tổng hợp RFOs trong cây đậu tương

Quá trình sinh tổng hợp RFOs ở thực vật bao gồm một chuỗi các phản ứngđược thực hiện để chuyển nhóm chức (nhóm hoạt tính) galactosyl từ các hợp chấtnhượng nhóm chức (bao gồm: UDPD-galactose, galactinol và từ chính các hợp chấtRFOs) sang các phần tử nhận nhóm chức điển hình như đường sucrose, raffinosehay các hợp chất có đồng vị cao với nó (Hình 1.4) [31] Nhiều nghiên cứu cho thấy

sự tổng hợp RFOs thường diễn ra ở lá, cụ thể là lớp trung bì của màng tế bào và các

tế bào trung gian nằm ở tượng tầng libe, sau đó sẽ được vận chuyển đến các bộkhác

trong cây và tích lũy nhiều nhất ở hạt [30] Quá trình tổng hợp RFOs ở thựcvật diễn ra như sau:

Bước một (1): dưới tác động của enzyme GOLS, galactinol được hình thành

từ hai thành phần ban đầu là UDP-galactose và myo-inositiol

Bước hai (2): enzyme raffinose synthase (RS) xúc tác chuyển vị nhómgalactosyl từ galactinol sang vị trí các bon số 6 (C6) của đơn vị đường glucose trongphân tử đường sucrose, tạo lên liên kết α-1,6-galactosidic nhằm hình thành hợp chấtđường ba phân tử raffinose [32]

Bước ba (3) của quá trình sinh tổng hợp RFOs: enzyme stachyose synthasexúc tác việc chuyển đơn vị galactosyl từ galactinol sang vị trí cacbon số 6 của đơn

vị đường galactose trong thành phần của raffinose để hình thành hợp chất với bốnđơn vị đường đơn stachyose [33]

Ở đậu tương, quá trình sinh tổng hợp raffinose xảy ra trong hạt đang pháttriển được xúc tác bởi raffinose synthase 2 (RS2), được mã hóa bởi

Glyma06g18890 [14] RS2 xúc tác phản ứng giữa sucrose và galactinol tạo thành

raffinose và myo- inositol Sự chuyển đổi tiếp theo của raffinose thành stachyose

và stachyose thành verbascose tạo ra tổ hợp oligosaccharides họ raffinose, tuy

nhiên hàm lượngverbascose trong hạt đậu tương là không đáng kể [17]

1.2.2.2 Các enzymes tham gia con đường sinh tổng hợp

 Raffinose synthase (RS)

RS là enzyme thứ hai có mặt trong quá trình tổng hợp RFOs từ galactinol và

sucrose, được tinh chế lần đầu tiên từ hạt Vicia faba, kế đến là mầm lúa mì và hạt

đậu tương [33] RS có độ pH tối ưu trung tính, là chất xúc tác quá trình galactosyl

hóa, hoặc nghịch chuyển sucrose từ galactinol tạo ra raffinose và myo –inositol [33].

 Stachyose synthase (STS)

Đây là enzyme thứ ba trong con đường tổng hợp RFOs Enzyme tham giatổng hợp stachyose từ galactinol và raffinose và được đề xuất là một enzyme điềuhòa tổng hợp RFOs, trên cơ sở các phát hiện cho thấy hoạt động STS trên lá tănglên song song với việc tăng nhu cầu tiêu thụ khi đậu quả của cây dưa chuột và dưa

hấu; STS lần đầu tiên được phân lập và đặc trưng từ hạt giống của Phaseo lus vulgaris và sau đó được tinh chế, chiết xuất trong hạt Vicia faba và trong lá của một

số cây họ bầu bí và Ajuga Enzyme này hoạt động tối ưu ở mức pH trung tính [35].

1.2.3 Gen mã hóa cho Galactinol synthase (GOLS) trong đậu tương

GOLS là một enzyme quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp raffinosebằng cách xúc tác sự hình thành galactinol từ myo-inositol và UDP-Galactose Việcgây mất chức năng của gen mã hóa cho GOLS làm giảm galactinol, stachyose và

tăng hàm lượng sucrose đã được nghiên cứu trên Arabidopsis Bên cạnh đó, khi

tăng cường biểu hiện của các gen mã hóa enzyme tham gia quá trình sinh tổng hợp

galactinol (AtGolS1, AtGolS2, AtGolS4) trong cây Arabidopsis đã làm tăng nồng độ

galactinol, raffinose và tăng khả năng chống chịu oxy hóa [36] Tuy nhiên, cácnghiên cứu về chức năng của nhóm gen này trên đậu tương còn rất hạn chế Nghiêncứu tạo đột biến từng gen riêng biệt hoặc đồng thời các gen này sẽ là cơ sở để phântích chức năng của

các gen mã hóa cho GOLS trên đậu tương đồng thời định hướng ứng dụngtrong cải tạo và nâng cao chất lượng hạt đậu tương, tạo ra sự giảm hàm lượng củaraffinose và starchyose trong hạt đậu tương.

1.2.4 Nghiên cứu thay đổi hàm lượng RFOs trên cây đậu tương

GOLS là enzyme đầu tiên tham gia trong quá trình sinh tổng hợp các RFOs.GOLS xúc tác chuyển hóa L-myo-inositiol thành galactinol, đây phản ứng đầu tiêntrong quá trình sinh tổng hợp đường raffinose [31] Sự biểu hiện quá mức của gen

tổng hợp galactinol trong cây Arabidopsis biến đổi gen làm tăng nồng độ galactinol

nội sinh và raffinose trong điều kiện bình thường [37]

RS xúc tác chuyển hóa đường sucrose thành đường raffinose và các hợp chấtcao phân tử tiếp theo như Stachyose, Verbascose và Ajugose Trên đậu tương, trên

ba gen mã hóa cho RS được xác định, trong đó gen mã hóa RS2 (Glyma06g18890)

có biểu hiện mạnh nhất trong quá trình phát triển của hạt đậu tương [14] Do vậy,việc giảm biểu hiện của gen này sẽ tăng hàm lượng đường sucrose đồng thời nhómđường đơn như raffinose và stachyose sẽ giảm xuống Một số dòng đậu tương mang

gen đột biến RS2 được khẳng định có chứa hàm lượng thấp raffinose trong hạt [38].

Thêm vào đó, nghiên cứu trên dòng đậu tương tạo được bằng công nghệ

RNAi nhằm giảm biểu hiện của gen RS2 cũng ghi nhận sự giảm xuống của đường

raffinose trong hạt đậu tương và tăng hiệu suất tiêu hóa và hấp thu năng lượng củagia cầm sử dụng loại hạt này [15] Điều này cho thấy cơ hội và ý nghĩa quantrọng trong việc nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp raffinose trong cải tạo chấtlượng hạt đậu tương Ngoài ra, STS là enzyme đóng vai trò quan trọng trong quátrình sinh tổng hợp stachyose Các dòng đột biến tự nhiên cho thấy sự ức chế hoạtđộng của enzyme này cũng làm tăng lượng đường trong hạt và giảm đáng kể hàm

lượng stachyose trong hạt[39]

1.3 Chỉnh sửa hệ gen thông qua hệ thống CRISRP/Cas9

Năm 2011-2012, hai nhóm nghiên cứu độc lập của Tiến sĩ EmmanuelleCharpentier tại trường đại học Umea và Tiến sĩ Jennifer Doudna tại trường đại họcCalifornia, Berkeley đã cùng khám phá ra cơ chế hoạt động của enzyme Cas vàCRISPR Hệ thống CRISPR/Cas được xác định là một hệ miễn dịch ở sinh vật nhân

sơ có khả năng chống lại các yếu tố di truyền ngoại lai như sự xâm nhập củaplasmid và thể thực khuẩn vi khuẩn; CRISPR/Cas còn được gọi là hệ thốngmiễn dịch di

truyền hay miễn dịch thu được Cơ chế hoạt động của enzyme Cas vàCRISPR dựa trên RNA bắt cặp với trình tự của vùng đệm spacer trên DNA mớixâm nhập và giúp protein Cas (CRISPR-associated) nhận diện và thực hiện cắt đứtsợi DNA; ngoài ra phức hệ gồm RNA dẫn đường và protein Cas còn có thể cắt cácRNA ngoại lai xâm nhập [41].

Tháng 1/2013, Doudna và Charpentier đã nghiên cứu đột phá cắt một mẫuDNA từ tế bào người và thay thế nó bằng một đoạn mã di truyền khác [42] Cùnglúc, một nhóm các nhà nghiên cứu khác đến từ Đại học Harvard và Viện Broadcũng đã độc lập tuyên bố đã phát triển thành công phương pháp tương tự [43] Đặcđiểm chủ yếu của hệ thống CRISPR/Cas : (1) tạo ra điểm đứt gãy sợi kép trên DNA

và (2) điểm đứt gãy này được định vị một cách chính xác nhờ đoạn crRNA địnhhướng Các nhà khoa học đã ví CRISPR/Cas là “chiếc kéo phân tử” có khả năng cắt

bỏ các đoạn gen không mong muốn và thay bằng đoạn gen mới theo yêu cầu [44].Năm 2015, tạp chí Science đã bình chọn CRISPR/Cas9 là công nghệ quan trọngnhất, khởi đầu kỷ nguyên mới của công nghệ sinh học, giúp chỉnh sửa thông tin

di truyền của mọi tế bào một cách nhanh chóng và chính xác [45] Và hai nhàkhoa học Doudna và Charpentier với công trình nghiên cứu về CRISPR/Cas9 đã

đạt giải Nobel năm 2020

Từ đó đến nay, hệ thống CRISPR/Cas được các nhà khoa học nghiên cứuứng dụng trong lĩnh vực y tế, dược phẩm, nông nghiệp….Hệ thống này đang đượcứng dụng trong nghiên cứu điều trị bệnh ung thư bằng cách loại bỏ các phần của bộgen chịu trách nhiệm trực tiếp đối với sự phát triển của khối u, tiêu diệt muỗi mangvirus Zika gây các bệnh sốt vàng da, điều trị mù lòa, tiêu diệt HIV [46] Thêm vào

đó, CRISPR/Cas cũng được sử dụng trong nghiên cứu các bệnh do di truyền thôngqua chỉnh sửa các bộ gen của phôi thai người; điều chế các loại thuốc tốt hơn; cảithiện các thuộc tính cây nông nghiệp hay động vật trong chăn nuôi…[47]

1.3.1 Nguyên lý hoạt động của hệ thống CRISRP/Cas

Hệ thống này dựa trên cơ chế “miễn dịch” của vi khuẩn chống lại sự xâmnhiễm phân tử DNA ngoại lai từ virus hoặc DNA plasmid Khác với hệ thống “miễndịch” dựa trên enzyme cắt giới hạn, hệ thống CRISPR/Cas dựa trên phân tử RNA đểnhận diện và phá hủy DNA ngoại lai Để bảo vệ vi khuẩn khỏi DNA ngoại lai, vikhuẩn gắn chèn một đoạn ngắn DNA ngoại lai vào DNA bộ gen tại vùng trình tựlặp lại CRISPR Vùng trình tự này được phiên mã và được xử lý thành các đoạnRNA

ngắn (được gọi là crRNA_CRISPR-derived RNA), các crRNA này sẽ liênkết với endonuclease Cas để nhận diện DNA mục tiêu (thông qua liên kết bổ sungcủa trình tự crRNA và DNA mục tiêu) và cắt phân tử DNA mục tiêu (thông qua

hoạt động endonuclease của Cas) [48] (Hình 1.5).

CRISPR/Cas được phân nhóm dựa vào sự tham gia của nuclease Cas và cấutrúc đoạn lặp lại trong CRISPR Trong đó, phổ biến nhất là CRISPR loại II có sựtham gia của một endonuclease mang vùng tương đồng với enzyme resolvase(RuvC) và vùng Histidine-Asparagine-Histidine (H-N-H domain), được gọi là Cas9(CRISPR associated protein 9) [49] Hệ thống CRISPR/Cas9 được ứng dụng phổbiến trong các nghiên cứu chỉnh sửa gene và cải thiện cây trồng [50]

Hình 1.5 Quá trình hoạt động của cơ chế CRISPR/Cas ở vi khuẩn chống lại sự xâm

nhập của DNA ngoại lai [51]

1.3.2 Cơ chế hoạt động của hệ thống chỉnh sửa gen CRISRP/Cas9

Với hệ CRISPR/Cas9, các trình tự CRISPR và vùng đệm được phiên mãthành crRNA (CRISPR-RNA) Sau đó phân tử crRNA này được cắt lọc một số phần

và hoàn thiện cấu trúc tạo thành phân tử tracrRNA đầy đủ chức năng dẫn đường choCas9 đến cắt DNA ở vị trí xác định Quá trình biến đổi này được xúc tác bởienzyme

RNase III crRNA chứa một trình tự phiên mã của CRISPR và DNA ngoạilai Nó đóng vai trò nhận biết chính xác vị trí cắt trên trình tự của DNA ngoại lai.

Sự kết hợp giữ crRNA bám vào tracrRNA tạo ra một phức hệ thông minh(crRNA/tracrRNA hay hay guide RNA) vừa có thể cho Cas9 biết chính xác vị trí vàthực hiện cắt phân tử DNA ngoại lai tại vị trí đó [52] Tuy nhiên, để Cas9 có thểbám vào sợi xoắn kép DNA ngoài sự có mặt của crRNA cần phải có thêm sự hiệndiện của một motif nằm cạnh tiền vùng đệm (proto-spacer adjacent motif) hay viếttắt là PAM Cas9 chỉ có thể bám vào sợi xoắn kép DNA nếu một trình tự PAM có

ba nucleotide có chứa hai guanine và một base bất kỳ khác nằm cạnh trình tự nhậndiện Khi phức hệ Cas9 và gRNA được hình thành và bám vào vùng định hướng củaDNA ngoại lai, hai mạch của DNA bị tháo xoắn và phân tử crRNA/tracrRN gắn bổsung với trình tự định hướng (target) trên DNA sợi đơn Protein Cas9 sau đó thựchiện cắt đặc hiệu tại hai sợi đơn DNA ở cùng một vị trí cách trình tự PAM từ 2-3nucleotides [53], Hình 1.6

Hình 1.6 Cơ chế hoạt động của CRISPR/Cas9 trong trường hợp gây biến đổi trình

tự gen [51]

Nếu có một đoạn DNA mẫu (template DNA, hay donor DNA) tương đồngvới vị trí mục tiêu thì DNA sợi đôi bị đứt gãy này có thể được sửa chữa bằng cơ chếHDR Phần DNA ở quanh vị trí đứt gãy sẽ được thay thế bằng phần DNA tươngứng ở DNA mẫu Nếu một đột biến được chủ ý đưa vào DNA mẫu thì đoạn DNAsau khi

sửa chữa sẽ mang đột biến đó (Hình 1.7A) [51].

Khi mẫu DNA có số lượng lớn cơ chế chỉnh sửa theo hướng HDR và NHEJ,

có thể cùng xảy ra đồng thời dẫn tới hiện tượng chèn/xóa đoạn không mong muốn.Khi đó biến thể của Cas9 là Cas9D10A sẽ hạn chế điều này Cas9D10A khác vớiCas9 thông thường là nó chỉ có khả năng cắt trên một mạch DNA thay vì hai mạch,

do đó không kích hoạt cơ chế NHEJ mà việc sửa chữa DNA chỉ được tiến hành theo

cơ chế HDR [54] Nếu sử dụng từ hai phức hợp Cas9D10A để tạo nên các vị trí đứtgãy sợi đơn (nick) cạnh nhau sẽ làm tăng sự đặc hiệu mục tiêu [55] (Hình 1.7)

Biến thể thứ ba của Cas9 là nuclease-deficient Cas9 (dCas9) (Hình 1.7C)không có khả năng cắt DNA) Các đột biến xảy ra với HNH và RuvC domain bấthoạt khả năng cắt DNA, nhưng vẫn giữ lại khả năng liên kết với DNA Ứng dụngcủa biến thể này là biến dCas9 thành công cụ hoạt hóa hoặc ức chế phiên mã khidung hợp dCas9 với các domain tác động (hoạt hóa hoặc ức chế) Ngoài ra, có thểlợi dụng khả năng bắt cặp đặc hiệu trình tự của dCas9 với DNA để hiển thị trình tựDNA mong muốn trên genome bằng cách dung hợp dCas9 với protein huỳnh quang[56] Nhờ những biến thể trên CRISPR/Cas9 ngày càng được sử dụng rộng trongviệc tạo ra thực vật biến đổi gen với hiệu quả cao

Hình 1.7 Chỉnh sửa hệ gene bằng hệ thống CRISPR-Cas9 (Nguồn: [51])

1.3.3 Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trong chọn tạo giống ở đậu tương

Chỉnh sửa hệ gen là kỹ thuật tạo ra những thay đổi trên trình tự gen nội sinhtheo cách có chủ đích tại một vị trí xác định khác với đột biến gen Công nghệ chỉnhsửa gen tạo ra các đặc tính ưu việt cho cây trồng Đến nay có 24 đối tượng câytrồng, với ít nhất 193 gen đã được chỉnh sửa bằng hệ thống này [57]

Kanazashi đã chuyển gen thông qua Agrobacterium sử dụng một sgRNA gây đột biến định hướng đồng thời hai locus GmPPD trong đậu tương Các đột biến ở locus GmPPD được xác nhận trong ít nhất 33% hạt T2 [58] Ngoài ra, trên cùng

một gen mục tiêu, sử dụng cùng một cấu trúc CRISPR/Cas9 nhưng các sgRNAkhác nhau có thể dẫn đến hiệu quả đột biến khác nhau [59]

Nhóm nghiên cứu của Mengyan Bai đã khai thác 74 gen liên quan đến việchình thành nốt sần ở rễ và 28 gen chức năng có trong hạt đậu tương để cải tạo ditruyền, xây dựng quần thể đột biến gen mục tiêu [60] Jie Wang và cộng sự đã thànhcông trong việc tạo giống đậu tương cải biến gen tạo hạt không chứa lipoxygenase

(chất tạo mùi đặc trưng) được qui định bởi ba gen (LOX1, LOX2, LOX3) Hệ thống CRISPR/Cas9 được thiết kế nhắm mục tiêu vào ba gen GmLox (GmLox1, GmLox2

và GmLox3) đã được áp dụng, 60 cây chuyển gen T0 dương tính được tạo ra, mang

các tổ hợp của sgRNA và đột biến Thử nghiệm so màu cho thấy rằng các cây mangcác tổ hợp đột biến khác nhau đã mất các hoạt động lipoxygenase tương ứng Cácđột biến không chuyển gen thu được bằng cách sàng lọc thế hệ T2 của các dòng đột

biến không có lipoxygenase (GmLox-28 và GmLox-60) [61].

Công nghệ CRISPR/Cas9 được sử dụng để tạo ra các vector loại trực tiếp độtbiến đơn và kép các gen chức năng mã hóa enzyme sinh tổng hợp axit béo họFAD2 Xác định trình tự của gen mục tiêu thể hiện hiệu suất chỉnh sửa gen

GmFAD2-03 và GmFAD2-2A lần lượt là 95% và 55,56%, hiệu suất chỉnh sửa đột

biến kép là 66,67% Kết quả ở thế hệ T2, hạt đậu tương có hàm lượng axit oleictăng từ 17,10% lên 73,50%; hàm lượng axit linoleic giảm từ 62,91% xuống 12,23%;hàm lượng protein tăng từ 37,69% lên 41,16% [62]

CRISPR/Cas9 được Peipei Zhang và cộng sự ứng dụng trong nghiên cứu

chỉnh sửa đa gen của cây đậu tương (GmF3H1, GmF3H2 và GmFNSI ‐1) nhằm cải

thiện hàm lượng isoflavone và khả năng kháng virus khảm trên cây Phân tíchchuyển hóa của lá đột biến thế hệ T0 cho thấy hàm lượng isoflavone cải thiệnđáng kể [63]