ÔN TẬP CƠ SỞ CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC TRONG BÀO CHẾ THUỐC D116ABCD K9 1 Đặc điểm công nghệ sinh học thế hệ 3 Ảnh hưởng của nó đối với sự phát triển của CNSH nói chung 2 Đặc điểm của CNSH Y Dược 3 Ý nghĩa của Công nghệ Gen đối với sự phát triển của CNSH Y Dược 4 Lợi thế và tiêu chuẩn sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme 5 Enzyme bất động nguyên lý, ưu nhược điểm và ứng dụng 6 Phương pháp sản xuất kháng sinh Penicillin G 7 Phương pháp sản xuất 6 APA từ Penicillin G, V 8 Vaccine nguyên tắc chế tạo.
Trang 1ÔN TẬP CƠ SỞ CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC TRONG BÀO CHẾ
THUỐC D116ABCD K9
1 Đặc điểm công nghệ sinh học thế hệ 3 Ảnh hưởng của nó đối với sự phát
triển của CNSH nói chung
2 Đặc điểm của CNSH Y-Dược
3 Ý nghĩa của Công nghệ Gen đối với sự phát triển của CNSH Y Dược.
4 Lợi thế và tiêu chuẩn sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme.
5 Enzyme bất động: nguyên lý, ưu nhược điểm và ứng dụng.
6 Phương pháp sản xuất kháng sinh Penicillin G
7 Phương pháp sản xuất 6-APA từ Penicillin G, V.
8 Vaccine: nguyên tắc chế tạo và phân loại (ví dụ cụ thể)
9 Vaccine phòng AIDS: nguyên lý, khó khăn trong chế tạo.
10.Sản xuất insulin tái tổ hợp
11.Sản xuất hormone tăng trưởng tái tổ hợp
12.Sản xuất interferon
ÔN TẬP CƠ SỞ CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC TRONG BÀO CHẾ
THUỐC D116ABCD K9
1 Đặc điểm công nghệ sinh học thế hệ 3 Ảnh hưởng của nó đối với sự phát triển của CNSH nói chung.
- Công nghệ sinh học thế hệ 3 chính là công nghệ sinh học hiện đại
- Bao gồm các kỹ thuật tái tổ hợp di truyền
- Ứng dụng công nghệ dược phẩm, nông nghiệp, hóa chất, y học
- Các sản phẩm hiện nay là các protein trị liệu, chẩn đoán, vaccin và cải tạo giống nông nghiệp
2 Đặc điểm của CNSH Y-Dược
- Đòi hỏi mức độ đầu tư cho nghiên cứu cao
Trang 2- Quy mô vừa và nhỏ
- Tỷ lệ đầu tư cho nghiên cứu cao hơn sản xuất
- Có tính phối hợp cao
3 Ý nghĩa của Công nghệ Gen đối với sự phát triển của CNSH Y Dược.
4 Lợi thế và tiêu chuẩn sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme.
5 Enzyme bất động: nguyên lý, ưu nhược điểm và ứng dụng.
Nguyên lý: Enzym đã tinh chế ở dạng tinh khiết được gắn hoặc gói trong
những polymer không hòa tan trong nước Các hạt enzym này được nhồi vào các cột trụ có kích thước thích hợp, sau đó cho dung dịch cơ chất chảy qua, enzym sẽ thực hiện phản ứng phân cắt cơ chất thành sản phẩm tương ứng Thu lấy sản phẩm để thực hiện các bước tinh chế tiếp sau Có thể bất động các enzym hoặc các tế bào vi sinh vật chứa enzym tương ứng
ưu điểm:
- Cho phép sử dụng enzym nhiều lần
- Có thể tiến hành quá trình liên tục
- Sản phẩm là những enzym tự do
- Cho phép kiểm tra chặt chẽ hơn quá trình xúc tác
- Cải thiện được độ ổn định của enzym
- Cho phép phát triển hệ thống phản ứng nhiều enzym
- Cung cấp tiềm năng to lớn cho công nghiệp và Y học
Nhược điểm: Các phương pháp trong kỹ thuật bất động enzym đều
có những hạn chế riêng
- Phương pháp Sự gắn kết đương lượng: lưới hoạt động có thể biến đổi giá thành đắt
- Phương pháp polymer hóa đương lượng: Hoạt tính bị mất trong khi không hiệu quả đối với các cơ chất có phân tử lượng lớn, không có khả năng tái sinh
Trang 3- Phương pháp hấp thụ: Bị thay đổi trong môi trường ion hóa mạnh, enzym bị đẩy
ra dùng cho protease
- Phương pháp bẫy bằng hóa học: Cơ chất khuếch tán vào trong sản phẩm đi ra ngoài, chuẩn bị khó khăn, enzym bị mất hoạt tính, không hiẹu quả đối với cơ chất có phân tử lớn.c
Ứng dụng:
- Tạo ra các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp rất có giá trị, như kháng sinh bán tổng hợp, các steroid, các acid amin
6 Phương pháp sản xuất kháng sinh Penicillin G
- Bứơc thứ nhất là trùng ngưng 3 amino acid—α-aminoadipic axit,
L-cysteine, L-valine thành tripeptit Trước khi trùng ngưng thành tripeptit, amino acid L-valine phải trải qua epimer (đồng phân không gian) hóa để tạo thành D-valine tripeptit được trùng ngưng được đặt tên là
δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteine-D-valine (ACV) Phản ứng trùng ngưng và epimer hóa được xúc tác bởi enzym δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteine-D-valine synthetase (ACVS)
- Bước thứ 2 trong sinh tổng hợp penicillin G là chuyển đổi oxy hóa ACV mạch thẳng thành isopenicillin N trung gian có 2 vòng bởi enzym isopenicillin N synthase (IPNS), được mã hóa bởi gen pcbC Isopenicillin N là một chất trung gian rất yếu, do nó không thể hiện hoạt động kháng khuẩn mạnh
- Bước cuối cùng là sự chuyển hóa amin bởi enzym isopenicillin N
N-acyltransferase, trong đó gốc α-aminoadipyl bênh cạnh chuỗi của isopenicillin N
bị loại bỏ và thay cho chuỗi phenylacetyl Phản ứng này được điều khiển bởi
gen penDE, là duy nhất trong quá trình tạo penicillin
7 Phương pháp sản xuất 6-APA từ Penicillin G, V.
8 Vaccine: nguyên tắc chế tạo và phân loại (ví dụ cụ thể)
Nguyên tắc: Vắc-xin được tạo ra bằng cách sử dụng vi-rút hoặc vi khuẩn
gây bệnh, nhưng ở dạng sẽ không gây hại cho người sử dụng Thay vào
đó, virus hoặc vi khuẩn bị suy yếu, bị giết hoặc một phần khiến hệ thống miễn dịch của chúng ta phát triển các kháng thể bảo vệ cơ thể
Trang 4 Phân loại:
1 Vaccine sống giảm độc lực: vaccine đậu mùa, vaccine thủy đậu,
vaccine sốt vàng
2 Vaccin bất hoạt: Ví dụ: viêm gan A, cúm, bại liệt
3 Vaccin tiểu đơn vị
Ví dụ: vaccine viêm gan B và vaccine ho gà, Zona
4 Vaccin acid nucleid
Ví dụ: HIV, Zika
5 Vaccin virus trung gian
6 Vaccin giải độc tố: Vaccin ngừa bạch hầu và uốn ván
Ví dụ: vaccin Ebola, vaccin AstraZeneca (Covid-19)
9 Vaccine phòng AIDS: nguyên lý, khó khăn trong chế tạo.
2 nguyên lý cơ bản sau:
- Theo nguyên lý của L.pasteur: Nuôi virus HIV bằng phương pháp nuôi cấy tế
bào để cho virus phát triển sau đó xử lý bằng Formaldehyd để làm giảm độc tính hoặc dùng hóa chất để loại bỏ vỏ bọc của virus Phần “lõi” là ARN được xử lý bằng tia y để khử hoạt lực của genom virus Sản phẩm thu được thêm những tá dược cần thiết để đạt được vaccin sản xuất đem thử nghiệm
- Bằng kỹ thuật gen: người ta tách gen gp 160 khỏi HIV, nhân lên bằng phương
pháp công nghệ di truyền, sau đó gắn vào baculovirus của một loại côn trùng nào
đó (bướm chẳng hạn) Virus phát triển trong tế bào nuôi cấy mô, sau đó dùng kỹ thuật tách chiết, tinh chế protein từ mô tế bào để làm vaccin
Những khó khăn
- Hầu hết bề mặt của virus được phủ dày đặc bởi các phân tử đường không kích hoạt phản ứng miễn dịch, và các bộ phận tiếp xúc có khả năng thay đổi rất cao
- Cũng giống như SARS-CoV-2 là virus gây ra COVID-19, HIV sử dụng các protein đột biến trên bề mặt bên ngoài của nó để xâm nhập vào các tế bào chủ
Do sự đột biến nhanh chóng của các gen tạo ra sự tăng đột biến các chủng HIV
Do HIV có nhiều chủng khác nhau, nên các kháng thể chống lại một chủng không có khả năng vô hiệu hóa các chủng khác
Trang 510 Sản xuất insulin tái tổ hợp
- Sản Xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp AND lần đầu tiên được sử dụng trong y học vào năm 1982 ở Mỹ, Tây Đức, Anh, Hà Lan
- Nguyên lý của phương pháp có thể tổng quát như sau: gắn một gen mã hóa cho việc tổng hợp insulin chuỗi a và chuỗi b vào hai tế bào E.coli thường sử dụng E.coli K12 Nuôi riêng biệt hai tế bào này vào các bình lên men, để chúng tổng hợp ra insulin chuỗi a và b Ly tâm thu lấy tế bào, chiết xuất để lấy riêng insulin chuỗi a và b, tinh chế để thu sản phẩm Insulin chuỗi a và b được cho vào bình phản ứng xử lý bằng hóa học để hai chuỗi a và b gắn vào nhau bởi cầu nối disulfid tạo ra sản phẩm insulin người Quy trình này được thực hiện bởi các nhà khoa học viện nghiên cứu Gentech
Cũng bằng kỹ thuật tái tổ hợp AND các nhà khoa học thuộc viện nghiên cứu Eli Lilly đã gắn gen mã hóa tổng hợp proinsulin người vào tế bào E.coli, sau đó lên men và chiết rút lấy ra proinsulin Thủy phân bằng enzym sau đó lên men và chiết rút lấy ra proinsulin Thủy phân bằng enzym protease trong điều kiện đặc biệt để cắt đi mạch peptid C gồm 34 gốc acid amin Cũng có thể gắn gen mã hóa sinh tổng hợp insulin vào tế bào Saccharomyces cerevisiae và cũng tiến hành nuôi cấy nấm men, thu sinh khối, chiết xuất lấy Proinsulin và xử lý bằng enzym như tiến hành với E.coli
- Sản Xuất insulin bằng kỹ thuật tái tổ hợp AND vào vi khuẩn E.coli cần lưu ý trong công đoạn chiết xuất và tinh chế Nếu sản phẩm không đảm bảo độ tinh khiết và còn lẫn dù chỉ một lượng rất nhỏ sản phẩm chuyển hóa khác của E.coli
sẽ gây ra những phản ứng phụ nguy hiểm Coi đó như những kháng nguyên lạ chưa được kiểm soát Vì vậy các công đoạn chiết xuất và tinh chế đòi hỏi phải có những thiết bị hiện đại, chuyên dụng và đặc biệt con người thao tác phải có kỹ năng và trình độ cao
11 Sản xuất hormone tăng trưởng tái tổ hợp
Trang 6Hormon tăng tưởng người (hGH): còn gọi là somatotropin Là một hormone peptid chuỗi đơn, gồm 191 gốc acid amin, trọng lượng phân tử 22kDa
- hGH được sản xuất bởi thuỳ trước tuyến yên, một tuyến nhỏ nằm ở trên não Nếu thừa hoặc thiếu hormon đều gây các hệ luỵ: u tuyến yên, to đầu chi, người khổng lồ (thừa GH), và châm tăng trưởng(thiếu GH)
- hGH được tổng hợp và phóng thích từ tuyến yên phụ thuộc vào sự điều chỉnh bởi hai yếu tố:
- Hormone gây tiết hormone tăng trưởng GHRH/somatorelin
- Hormone ức chế phóng thích hormone tăng trưởn GHRIH/somatostatin-SST
- Công nghệ sản xuất hormon tăng trưởng tái tổ hợp (rhGH)
- Không thể tổng hợp được bằng hoá học do gen mã hoá somatotrophin khá dài
- Sinh tổng hợp từ bộ gen người: gen GH của người nằm trong nhiễm sắc thể 17, kích thước 66kb
- Gen mã hoá hGH bị đột biến hoặc rối loạn, dẫn đến thiếu hụt hormon sinh trưởng, gây hội chứng lùn bẩm sinh
- Gen hGH có đoạn trình tự mã hoá chuỗi peptid tín hiệu không tương thích promoter của E.coli, do đó biểu hiện gen hGH tái tổ hợp trong E.coli rất yếu hoặc không hoạt động Hai phương án sản xuất hGH
Phương án 1:
- ADN mã hoá cho trình tự bài xuất của hormone được cắt bỏ bằng enzym cắt giới hạn cùng với 24 codon đầu tiên của protein trưởng thành
- Đoạn ADN tổng hợp gồm: methionin-24 codon đầu-phần ADN còn lại
- Tạo dòng và biểu hiện trong E.coli (biểu hiện tái tổ hợp tích tụ trong TBC)
- Phá vỡ tế bào để chiết tách hGH
Phương án 2:
- Thay thế đoạn ADN bài xuất bằng đoạn tương tự của vi khuẩn để protein tái tổ hợp sẽ được chiết xuất ra vùng chu chất một tế bào chủ tinh chế dễ dàng hơn
- Tại vùng chu chất, protein tái tổ hợp sẽ bị xử lý bởi protease loại bỏ đoạn ADN bài xuất và phóng thích hGH
12 Sản xuất interferon
- Interferon(IFN) là các glycoprotein do các tế bào tiết ra để chống lại một cách không đặc hiệu sự tấn công của các virus khác vào các tế bào cùng loài
Trang 7- Sản xuất Interferon IFN của lympho bào tự nhiên - Nguyên liệu ban đầu để tinh chế IFN người bao gồm: lympho bào lấy từ máu, nguyên bào sợi mới sinh
và nguyên bào lympho và các dòng bạch cầu
- Trước khi công nghệ gen được áp dụng để sản xuất nguồn cung cấp chính IFN
là các tế bào người được nuôi cấy với những chất cảm ứng thích hợp (như virus hay polynucleotid sợi đôi)
- Tinh chế IFN từ nguồn này mức độ biểu hiện thấp do hoạt tính sinh học cao ở nồng độ thấp các IFN Thể tích ban đầu lớn và việc tinh chế qua nhiều giai đoạn nhưng chỉ thu được rất ít sản phẩm
- Việc tinh chế IFN từ vi sinh vật được biến đổi di truyền có những vấn đề được thù khác với khi tinh chế từ nguồn tự nhiên quy trình sẽ phải thoả mãn các yêu cầu sau:
1 Quy trình tinh chế phải chiết được IFN từ tế bào một cách hiệu quả mà không làm biến tính protein
2 Quy trình tách và tinh chế phải không cho phép sản phẩm bị lẫn với các chí nhiệt tố của vi khuẩn ( lipopolysaccharide của vi khuẩn gram âm)
3 IFN tinh khiết phải không lẫn acid nucleic và protein vi sinh vật chủ nếu muốn được sử dụng trong lâm sàng
4 Sản phẩm phải chứa IFN đồng nhất và không chứa các mảnh kết tập hay phân huỷ bởi protease
5 Để có thể thương mại hoá quy trình phải có hiệu suất cao về hoạt tính sinh học Loại chí nhiệt tố - Chế phẩm IFN cần có năng lượng chí nhiệt tố thấp để sử dụng được trong lâm sàng
- Có thể làm giảm lượng nội độc tố trong các chế phẩm này bằng cách:
• Hấp phụ trên than hoạt tính
• Phá huỷ bằng bức xạ ion hoá Hai phương pháp trên giúp loại bỏ một cách hiệu quả nhưng làm ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học hay cấu trúc của IFN