NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẢN HÓA HỌC VÀ PHẦN LẬP CHẤT TRONG DỊCH CHIẾT CÙA LÁ DIẾP CÁ (HOUTTUYNIA CORDATA) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUỲNH THỊ THỦY NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP CHẤT TRONG DỊCH CHIẾT CỦA LÁ DIẾP CÁ HOUTTUYNIA CORDATA THU HÁI TẠI

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HUỲNH THỊ THỦY

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP CHẤT TRONG DỊCH CHIẾT CỦA LÁ DIẾP CÁ (HOUTTUYNIA CORDATA) THU HÁI TẠI QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG

Đà Nẵng, năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi Các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc rõ ràng,

đã công bố theo đúng quy định Các kết quả nghiên cứu trong luận án do tôi

tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác

Tác giả luận văn

Huỳnh Thị Thủy

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể các thầy cô trong khoa Hóa học đã truyền thụ lại cho em những kiến thức quý báu.Đặc biệt em xin gởi lời cảm ơn chân thành nhất đến với người thầy Đào Hùng Cường đã trực tiếp chỉ bảo cho em và em sinh viên Đặng Thị Ngọc Hạnh đã giúp đỡ em hoàn thành bài luận văn này

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, khoa Sau Đại học, khoa Hóa học Trường ĐHSP Đà Nẵng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ phòng thí nghiệm khoa Hóa học, khoa Sinh, Trường ĐHSP Đà Nẵng và các bạn bè đồng nghiệp đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình thực nghiệm

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tập thể lớp HHC-K33 đã giúp đỡ và động viên em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Học viên

HUỲNH THỊ THỦY

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 2

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

3.1 Đối tượng nghiên cứu 2

3.2 Phạm vi nghiên cứu 2

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2

4.1 Nghiên cứu lí thuyết 2

4.2 Nghiên cứu thực nghiệm 2

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 3

5.1 Ý nghĩa khoa học 3

5.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

6 BỐ CỤC CỦA LUẬN VĂN 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT 5

1.1.1 Tên gọi 5

1.1.2 Vị trí phân loại 5

1.1.3 Mô tả cây 5

1.1.4 Phân ố sinh th i 6

1.2 THÀNH PHẦN H A HỌC VỀ LÁ DIẾP CÁ 7

1.2.1 Tinh dầu 7

1.2.2 Flavonoid 7

1.2.3 Alkaloid 9

1.2.4 Dẫn chất thơm đơn giản 10

1.2.5 Thành phần kh c 10

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CÔNG DỤNG cỦa lá diẾp cá 10

1.3.1 T c dụng dược l 10

1.3.2 Công dụng – Cách dùng 13

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÂY DIẾP CÁ 15

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 15

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

1.5 MỘT SỐ CHẾ PHẨM TRÊN THỊ TRƯỜNG 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 NGUYÊN LIỆU H A CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 20

2.1.1 Nguyên liệu 20

2.1.2 Hóa chất dụng cụ và thiết ị nghiên cứu 20

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.2.1 Phương ph p x c định c c thông số hóa l 21

2.2.2 Phương ph p chiết mẫu thực vật 24

2.2.3 Phương ph p phân tích và định danh thành phần hóa học của c c dịch chiết 26

2.2.4 Phương ph p t ch và tinh chế chất 26

2.2.5 Phương ph p x c định cấu trúc hóa học của c c chất 27

2.2.6 Phương ph p thử hoạt tính sinh học 27

2.4 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 29

2.5 SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CÁC CAO CHIẾT 30

2.6 PHÂN LẬP CHẤT TRONG CAO CHIẾT CHLOROFORM 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ H A LÝ 33

3.1.1 Độ ẩm 33

3.1.2 Hàm lượng tro 34

3.1.3 Hàm lượng kim loại 34

a X c định hàm lượng một số kim loại nặng 34

3.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 35

3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN H A HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS 37

3.3.1 Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan 37

3.3.2 Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform 39

3.3.3 Thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate 42

3.3.4 Thành phần hóa học trong dịch chiết metanol 43

3.4 KẾT QUẢ PHÂN LẬP CÁC CHẤT TRONG PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CHLOROFORM 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

1 KẾT LUẬN 55

2 KIẾN NGHỊ: 56

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

DMSO : Dimethyl sunfoxide DEPT : Distortionless enhancement by polarisation transfer EtOAc : Ethyl acetate

EtOH : Ethanol GC-MS : Gas chromatography-Mass spectrometry HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC : Heteronuclear Single Quantum Corelation MeOH : Methanol

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Số

1.1 Vị trí phân loại chi Houttuynia trong giới thực vật 5

1.2 Một số chế phẩm chứa Diếp c trên thị trường 17 3.1 Kết quả x c định độ ẩm của l diếp c tươi 33 3.2 Kết quả x c định độ ẩm của nguyên liệu ột khô l diếp c 33 3.3 Kết quả x c định hàm lượng tro trong lá diếp cá 34 3.4 Kết quả x c định hàm lượng kim loại trong l diếp c 35

3.6 Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan l diếp c 37 3.7 Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform l diếp c 42 3.8 Thành phần hóa học trong dịch chiết etylaxetat l diếp c 44 3.9 Thành phần hóa học trong dịch chiết metanol l diếp c 40 3.10 Số liệu phổ NMR của hợp chất HC2 và chất tham khảo 53

3.1 Sắc k đồ GC-MS của dịch chiết n-hexan trong l diếp c 37

3.2 Sắc k đồ GC-MS của dịch chiết clorofom trong l diếp c 40

3.3 Sắc k đồ GC-MS của dịch chiết etyaxetat trong l diếp cá 42 3.4 Sắc k đồ GC-MS của dịch chiết metanol trong l diếp c 44

MỞ ĐẦU

1 LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Vấn đề kết hợp y học cổ truyền với y học hiện đại và hiện đại hóa y học cổ truyền là xu hướng chung của thời đại Theo c ch đ nh gi của WHO Việt Nam là nước không chỉ là nước có ề dày truyền thống ph t triển y học cổ truyền từ hàng nghìn năm nay mà thực sự là nước có tiềm năng về y học cổ truyền và đã đạt được nhưng thành công an đầu trong vấn đề kết hợp y học cổ truyền với y học hiện đại Những thành tựu đó đã góp phần tích cực trong việc giảm nhẹ chi phí y tế nâng cao hiệu quả điều trị đối với một số ệnh mạn tính

Y học cổ truyền cần được hiện đại hóa để không có nguy cơ trở thành một thứ

đồ cổ theo chiều dài của thời gian mà s là một khoa học để phục vụ cho yêu cầu của xã hội hiện đại Hiện đại hóa là c ch dùng kiến thức công cụ và c c phương

ph p nghiên cứu khoa học-kỹ thuật hiện đại để hiểu và chứng minh c c cơ sở khoa học của nguyên l l thuyết và phương ph p chữa ệnh của y học cổ truyền của

c c ài thuốc và đặc iệt là c c chất có t c dụng dược l có trong cây thuốc

Tuy nhiên hiện nay c c nguyên liệu dược liệu đang ị làm giả làm nh i rất nhiều và nhiều chế phẩm từ dược liệu c n k m chất lượng Điều này có thể ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến sức khỏe của người sử dụng c ng như gây mất l ng tin của mọi người khi sử dụng c c chế phẩm và cây cỏ từ dược liệu Vì vậy việc phân lập được c c thành phần chính trong dược liệu với độ tinh khiết cao s rất hữu ích cho công t c kiểm nghiệm tiêu chuẩn hóa dược liệu và c c chế phẩm từ dược liệu

Ngoài ra từ c c chất tinh khiết này c ng có thể phục vụ cho c c thử nghiệm in vitro, in vivo nhằm chứng minh t c dụng và tìm ra c c t c dụng mới của cây thuốc

Trong qu trình nghiên cứu một số cây thuốc ở nước ta chúng tôi nhận thấy cây Diếp c ngoài việc sử dụng làm rau ăn sống c n là cây thuốc dân gian sử dụng rất nhiều để điều trị ệnh trĩ mụn nhọt p xe phổi… Dược liệu này c ng được xuất khẩu sang Nhật và được đưa vào DĐVN 1 2 3 4 và dược điển một số nước (Nhật Trung Quốc )

Việc sử dụng l diếp c hiện nay vẫn chỉ theo kinh nghiệm dân gian Vì vậy việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứng minh được thành phần hoạt chất

cụ thể của l diếp c là một việc làm hết sức cần thiết tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc điều trị c c căn ệnh Trong điều

kiện cho ph p của luận văn thạc sĩ tôi chọn đề tài ghi n c u chiết tách, xác định

thành phần hóa học và ph n lập ch t trong dịch chiết của lá diếp cá thu hái t i uảng a – à ng làm đề tài luận văn thạc sĩ của mình

2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu chiết t ch x c định thành phần hóa học của một số dịch chiết lá diếp cá

- Thăm d hoạt tính sinh học của các dịch chiết lá diếp cá

- Phân lập một số hợp chất ho học từ dịch chiết chloroform của l diếp c x c định cấu trúc ho học của chúng góp phần cung cấp c c thông tin có nghĩa khoa học về thành phần hóa học nâng cao gi trị sử dụng của loài thực vật này trong thực tiễn

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

L diếp c được thu h i tại Quảng Nam-Đà Nẵng

3.2 Phạm vi nghiên cứu

- Thành phần hóa học của một số dịch chiết lá diếp cá

- Phân đoạn dịch chiết dược liệu l diếp c trên với dung môi chloroform

- C c hợp chất phân lập từ dịch chiết nghiên cứu

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4.1 Nghiên cứu lí thuyết

- Thu thập, tổng hợp, phân tích các tài liệu tư liệu trong và ngoài nước về đặc

điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học, tác dụng dược lý của cây diếp cá

- Tổng hợp tài liệu về phương ph p nghiên cứu chiết t ch và x c định các hợp

chất thiên nhiên

4.2 Nghiên cứu thực nghiệm

- Phương ph p lấy mẫu, thu hái và xử lý mẫu

- Phương ph p trọng lượng để x c định các thông số hóa lí

- Phương ph p phân hủy mẫu phân tích (tro hoá mẫu)

- Phương ph p chiết: ngâm chiết trong dung môi MeOH sau đó chiết lại trong

c c dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, clorofom, ethyl acetate, metanol

- Phương ph p vật lý: quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) để x c định hàm lượng các kim loại nặng; sắc ký khí ghép phổ khối (GC-MS) nhằm x c định thành phần định danh các cấu tử trong mỗi dịch chiết; c c phương ph p phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, MS x c định cấu trúc của cấu tử tinh khiết phân lập được

- Phương ph p thử hoạt tính sinh học: phương ph p thông qua phản ứng bao vây gốc tự do(DPPH)

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

5.1 Ý nghĩa khoa học

- Cung cấp những thông tin khoa học về quy trình chiết t ch x c định thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của một số dịch chiết lá diếp cá, góp phần khai thác sử dụng hiệu quả cây thuốc cổ truyền này

- Tạo tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về cây diếp cá ở Việt Nam

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Sử dụng cây diếp cá chữa bệnh một cách khoa học, không chỉ hạn chế trong

y học cổ truyền mà còn có thể mở rộng nghiên cứu nhiều hơn để chế tạo các dạng thuốc trong y học hiện đại

- Giải thích một cách khoa học một số công dụng chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian của cây diếp cá

- Mở rộng phạm vi khai thác cây diếp cá, không chỉ có lá mà các bộ phận khác của cây c ng có thể có tác dụng dược lý

6 BỐ CỤC CỦA LUẬN VĂN

Luận văn ao gồm 59 trang, 12 ảng 18 hình, 26 tài liệu tham khảo

Cấu trúc luận văn như sau:

Mở đầu (4 trang)

Chương 1 Tổng quan (15 trang)

Chương 2 Nguyên liệu và phương ph p nghiên cứu (13 trang)

Chương 3 Kết quả và thảo luận (22 trang)

Kết luận và kiến nghị (2 trang)

Tài liệu tham khảo (3 trang)

Phụ lục (14 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 MÔ TẢ THỰC VẬT

1.1.1 Tên gọi

Diếp c hay c n có tên kh c Cây l giấy Rau giấy c Rau diếp tanh Ngư tinh thảo (TQ) Râu trầu (H Mông) Chờ mờ mía (Dao) Co vầy m o (Th i) Chameleon Heartleaf Houttuynia Her (Anh) là dược liệu đã được sử dụng lâu đời ở Việt Nam

Tên khoa học là Houttuynia cordata Thun họ L Giấp Saururaceae được đặt

để tôn vinh Marteen Houttuyn (1720 – 1798) thầy thuốc và nhà thực vật học Hà Lan chuyên về Rêu và Quyết thực vật [8]

1.1.2 Vị trí phân loại

Chi Houttuynia thuộc họ Saururaceae Vị trí của chi trong giới thực vật [6]

Vị trí phân loại chi Houttuynia trong giới thực vật được cho ở ảng 1.1

Bảng 1.1 Vị trí phân loại chi Houttuynia trong giới thực vật

Ngành Magnoliophyta Lớp Magnoliopsida

Hoa nhỏ màu vàng nhạt không có ao hoa mọc thành ông có 4 l ắc màu trắng trông toàn ộ ề ngoài của cụm ông và l ắcgiống như một cây hoa đơn độc Hoa nở về mùa hạ vào c c th ng 5-8

Quả nang mở ở đỉnh hạt hình tr i xoan nhẵn Mùa quả: th ng 7 – 10

Toàn cây v có mùi tanh như c Vị hơi ch t se

Diếp c từ lâu đã được trồng lấy l làm rau ăn Tại tây nam Trung Quốc chẳng hạn c c tỉnh Vân Nam Qu Châu và Tứ Xuyên c c rễ phụ c ng được dùng như là rau Ở Việt Nam diếp c được dùng nhiều ở c c tỉnh phía nam ở vùng núi cao m t như Sapa (Lào Cai) diếp c mọc hoang dài hàng kilômet ven suối thường dùng ăn

l sống k m với nhiều món như thịt nướng chả gi ún gỏi cuốn

Nhật đã có c c công nghệ chế iến rau diếp c thành c c loại thực phẩm như trà rượu

Cây diếp c và hoa diếp c được cho ở hình 1.1 và hình 1.2

Hình 1.1 Cây diếp cá Hình 1.2 Hoa diếp cá

1.1.4 Phân ố sinh th i

Chi Houttuynia chỉ có một loài Diếp c phân ố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và

cận nhiệt đới Châu Á từ Nhật Bản Trung Quốc đến Việt Nam Lào Ấn Độ và c c nước Đông Nam Á kh c Ở Việt Nam cây mọc hoang dại c c tỉnh miền núi trung

du và đồng ằng Cây c n được trồng ở nhiều nơi để làm rau và làm thuốc

Diếp c là loài ưa ẩm và chịu óng thường mọc ở đất ẩm nhiều mùn dọc theo c c

ờ khe suối mương nước trong thung l ng và ở vùng đồng ằng Cây sinh trưởng gần như quanh năm mạnh nhất trong mùa xuân h có hoa quả hàng năm trên những cây không ị ngắt ngọn và h i l thường xuyên có khả năng t i sinh chồi mạnh từ thân rễ Ở vùng thị trấn Tam Đảo và núi Ngọc Linh Diếp c mọc nhiều đến mức ảnh hưởng đến c c loài cây kh c [1]

Thu h i cành l quanh năm thường dùng tươi có thể phơi hay sấy khô để dùng dần

Nhóm terpen ao gồm c c chất: α-pinen, camphen, myrcen, limonen, linalol, bornyl acetat, geraniol Ngoài ra tinh dầu c n chứa acid caprinic laurinaldehyd benzamid,acid hexadecanoic, acid decanoic, acid palmitic, acid linoleic, acid oleic, acid stearic, aldehyd capric, acid chlorogenic, lipid và vitamin K [1]

OH

OH

OH O

OH

O

H

O H

O H

O

OH O

OH O

O O

H

O H OH

O

OH

O H

O O

OH OH

O

OH OH

OH

O H

Quercetin

CTPT: C15H10O7

KLPT: 302.24

Quercitrin CTPT: C21H20O11 KLPT: 448.38

Hyperin CTPT: C21H20O12 KLPT: 464.38

O O

H

OH

O O

OH OH

O

OH

OH

OH OH

OHO

H

OH

Isoquercitrin CTPT: C21H20O12

KLPT: 464.38

Phloretin CTPT: C15H14O5KLPT: 274

Ngoài ra diếp c Nhật c n chứa afzelin [23]

OO

HO

OHĐối với Diếp c mọc ở Việt Nam có tài liệu công ố trong hoa và quả có chứa isoquercitrin nhưng không có quercitrin; ngược lại trong l có chứa quercitrin (0,2%), mà không có isoquercitrin [7], [10]

1.2.3 Alkaloid

Một số alkaloid có hoạt tính sinh học là aristolactam B aristolactam A piperolactam A, norcepharadion B, cepharadion, splendidin được tìm thấy trong dịch chiết methanol của cây Diếp c có t c dụng ức chế 5 d ng tế ào ung thư ơ người ( A-549, Sk-MEL-2, XF-489, HCT-15) [19] Ngoài ra c n có dẫn xuất 4 5-dioxo aporphin [20]

O

O

N O

O

H

O O

O

O H

Aristolactam A Aristolactam B Norcepharadion B

N O

H

H

O O

N

O

H O

O

1.2.4 Dẫn chất thơm đơn giản

- Chlorogenic methyl ester

- (E)-4-Hydroxy-4-[3 ( eta-D-glucopyranosyloxy) butyliden]-3, 5,

1.3 TÁC DỤNG DƢỢC LÝ CÔNG DỤNG cỦa lá diẾp cá

1.3.1 T c dụng dƣợc l

a Tác dụng sinh học của flavonoid

C c dẫn chất flavonoid có khả năng dập tắt c c gốc tự do nhƣ: HO•, ROO• các gốc này nếu sinh ra cạnh c c DNA s gây ra những nguy hại nhƣ iến dị ung thƣ tăng nhanh sự lão hóa

Khi đƣa c c chất chống oxy hóa nhƣ flanovoid vào cơ thể để ảo vệ tế ào thì

có thể ngăn ngừa c c nguy cơ xơ vữa động mạch tai iến mạch lão hóa …Khả năng chống ôxy hóa của flavonoid c n mạnh hơn c c chất kh c nhƣ vitamin C E selenium và k m

Flavonoid tạo được phức với c c ion kim loại như c c phức: oxychromon oxycar onyl orthodioxyphenol mà chính c c ion kim loại này là xúc t c của nhiều phản ứng oxy hóa

T c dụng chống độc của flavonoid làm giảm thương tổn gan ảo vệ chức năng gan

Flavonoid thể hiện t c dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi mật ống dẫn mật phế quản và một số tổ chức kh c)

Trên ộ m y tiết niệu nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon flavanon flavonol thể hiện t c dụng thông tiểu rõ rệt

T c dụng chống lo t của flavanon và chalcon-glycoside của rễ cam thảo được ứng dụng để chữa đau dạ dày [2]

b Tác dụng sinh học của cây Diếp cá

- T c dụng chống oxy hóa

Công trình nghiên cứu được thực hiện tại Viện Đại học Y Dược Toyama Nhật Bản đã cho thấy t c dụng chống oxy-hóa của 12 loại dược thảo và c c hợp chất được chiết xuất từ chúng C c nhà khoa học đã sử dụng phương ph p thiocyanate để

đ nh gi t c dụng ức chế trên hiện tượng peroxyd hóa chất o trong hệ thống acid linoleic Trong 12 dược thảo được thử nghiệm diếp c là một trong 4 chất có t c dụng chống oxy-hóa mạnh nhất Hợp chất Quercetin của diếp c có t c dụng loại trừ

c c gốc tự do mạnh nhất

- T c dụng chống ung thư m u

Công trình nghiên cứu được thực hiện tại trường Đại học Y khoa Kaohsiung

Đài Loan Mục đích để đ nh gi t c dụng chống ung thư m u của H.cordata và Bidens pilosa 5 d ng tế ào ung thư m u theo thứ tự là L1210 U937 K562 Raji

và P3HR1 được nuôi cấy với chất chiết xuất của H cordata và Bidens pilosa Kết

quả cho thấy chiết xuất từ c c chất trên có t c dụng ức chế sự ph t triển của 5 d ng

tế ào này

- T c dụng chống viêm xoang kinh niên và polyp

Công trình nghiên cứu được thực hiện tại Trường đại học Y khoa Tây Trung Hoa, Trung Quốc để đ nh gi t c dụng t i tưới m u sau phẫu thuật xoang Kết quả

cho thấy H cordata đóng vai tr rất quan trọng trong vấn đề t i tưới m u sau mổ

- T c dụng chống viêm tuyến vú

Công trình nghiên cứu được thực hiện tại Trường đại học Thú y thuộc Viện đại

học Nông nghiệp Z ejiang Hangh ou Trung Quốc Từ Houttuynia cordata, các nhà

nghiên cứu đã chiết xuất được chất Houttuynin sau đó cho Houttuynin phản ứng với isulphat natri để có được chất Houttuynin isulphat natri Từ chất này họ đã chế iến được một dung dịch tiêm vào vú để điều trị ệnh viêm tuyến vú ở Thử nghiệm trên

52 trường hợp viêm tuyến vú ở được chia làm 2 nhóm: nhóm 1 tiêm 80mg dung dịch H isulphat Na và nhóm 2 tiêm 800.000 đơn vị pnicillin kết hợp với 1g streptomycin Kết quả cho thấy 88 2% viêm tuyến vú đã điều trị khỏi với H isulphat

Na so với 90% được chữa lành với penicillin + streptomycin Như vậy không có sự

kh c iệt đ ng kể trong điều trị viêm tuyến vú cấp tính giữa 2 nhóm trên

- T c dụng kh ng viêm

Người ta tiến hành làm phản ứng dựa trên dịch chiết của cây Diếp c với natri isulfit để tạo ra α-hydroxyl-capryl-ethyl-sodium-sulfonat có t c dụng chữa viêm tuyến vú cấp tính mãn tính cho và hiệu quả trong điều trị cấp tính là 94 3% [24] Dịch chiết nước Diếp c được dùng để điều trị hen suyễn viêm m i dị ứng do

t c dụng ức chế yếu tố tế ào gốc (SCF) gây ra ởi sự di chuyển của tế ào Mast dòng HMC-1 [22] hoặc do ức chế c c phản ứng qu mẫn qua trung gian tế ào Mast [25]

- T c dụng chống vius Herpes simplex

Công trình nghiên cứu được thực hiện tại trường Đại học Y khoa Kaohsiung Đài Loan nhằm đ nh gi t c dụng chống virus của diếp c Kết quả nghiên cứu cho

thấy Houttuynia cordata có t c dụng ức chế đ ng kể đối với sự sinh sản của virus

Herpes simplex ở nồng độ 100 microg/ml Theo khuyến c o của c c nhà nghiên

cứu H.cordata có thể được xem như dược thảo chữa trị Herpes simplex

- T c dụng của dịch chiết Houttuynia cordata trên leomycin gây ra chứng xơ phổi ở chuột

Nghiên cứu của Đại học Tajen Bình Đông Đài Loan cho thấy t c dụng ảo vệ của HC trên leomycin gây ra chứng xơ phổi ở chuột Trong c c nghiên cứu trên động vật HC làm giảm đ ng kể mức superoxide dimustase malondialdehyde hydroxyproline, interferon-gamma và yếu tố hoại tử khối u alpha HC c ng cải thiện đ ng kể sự xuất hiện hình th i ở phổi của chuột được điều trị leomycin C c kết quả này cho thấy HC có t c dụng ảo vệ chống lại leomycin gây ra chứng xơ hóa phổi T c dụng ảo vệ này rõ rệt hơn so với vitamin E [18]

- T c dụng ức chế của dịch chiết Diếp c trên sự di chuyển của tế ào Mast

d ng HMC-1

Hottuynia cordata Thun (HC) được iết đến như một loại thuốc điều trị đã được sử dụng trong y học phương Đông truyền thống để điều trị dị ứng Tế ào mast đóng một vai tr quan trọng trong một loạt c c ệnh viêm và đặc iệt ệnh hen suyễn và atopy Ph ng thí nghiệm Đại học Eulji Hàn Quốc đã tiến hành nghiên cứu t c động của dịch chiết HC trên sự di chuyển của tế ào Mast d ng HMC-1 trên

sự đ p ứng với yếu tố tế ào gốc (SCF) Cả hai cao EtOH (HC1) và EtOAc (HC-3) đều có t c dụng ức chế sự di chuyển d ng tế ào HMC-1 Kết quả cho thấy rằng dịch chiết HC-1 và HC2 đều làm giảm khả năng hóa hướng động của tế ào HMC-1

để ức chế phản ứng của SCF ằng c ch ức chế sự kích hoạt NF-kappaB Ở liều 10 mug/ml HC-1 từ 6-24h chỉ số hướng động (CI) của HMC-1 giảm từ 74 xuống 63%,

và c c chất này có thể hữu ích cho việc điều trị c c ệnh viêm nhiễm liên quan đến

c c loại rau kh c Diếp c c ng được sử dụng làm thuốc trị: T o ón l i dom; trẻ

em lên sởi mày đay; viêm vú viêm mô tế ào viêm tai giữa; mắt đau nhặm đỏ

hoặc nhiễm trùng gây mủ xanh; viêm mủ màng phổi; viêm ruột lỵ; viêm nhiễm đường tiết niệu viêm thận phù th ng; phụ nữ kinh nguyệt không đều…

Ở Th i Lan người ta dùng l tươi trị c c ệnh hoa liễu và c c ệnh ngoài da Toàn cây dùng lam thuốc lợi tiểu s t khuẩn đường tiết niệu sinh dục

Ở Trung Quốc người ta c ng sử dụng Diếp c trong c c trường hợp:

- Viêm mủ màng phổi: dùng 30g l Diếp c 15g rễ C t c nh sắc lấy nước uống

- Thử nghiệm điều trị ung thư phổi: dùng Diếp c 18g hạt Đông quỳ 30g rễ Thổ phục linh 30g Cỏ nhọ nồi và Dương xỉ mộc mỗi vị 18g rễ Cam thảo ắc 5g sắc nước uống

- Cây tươi dùng giã đắp ngoài dùng trị dị ứng mẩn ngứa mày đay

Ở Nhật Bản Nepan thân rễ Diếp c có trong thành phần của một số chế phẩm thuốc dùng chữa một số ệnh của phụ nữ [7]

b Cách dùng

- Chữa viêm tuyến vú

L Diếp c 30g l Cải trời 30g (tức hạ khô thảo nam) giã n t thêm chút nước sôi để nguội vắt lấy nước cốt uống - c n ã chưng nóng với giấm rịt vào nơi sưng đau vài lần là khỏi [7]

- Chữa đ i uốt đ i dắt

Rau Diếp c Rau m rau Mã đề mỗi thứ 50 g rửa sạch v n t lọc lấy nước trong nhiều lần s khỏi [7]

- Chữa trẻ lên sởi

Rau Diếp c một nắm sao sơ uống s tiệt nọc không t i ph t [7]

- Chữa viêm phổi do sởi

Rau Diếp c rau Dền đỏ l Đậu săng Cam thảo đất mỗi thứ 15 – 20g Đổ 3

t sắc c n 1 t chia 3 lần uống trong ngày

Lưu : chỉ dùng trong điều kiện xa cơ sở y tế hoặc dùng kết hợp với điều trị Tây y

Theo danh y Lê Trần Đức khi mắc chứng viêm phổi viêm ruột viêm thận phù th ng đi lỵ dùng 50g rau Diếp c sắc uống nóng thì khỏi C n c sĩ Lê Minh

lấy rau Diếp c khô 20g và 10 quả t o đỏ sắc với 600ml nước c n 200ml chia làm 3 lần uống trong ngày chữa được chứng viêm tai giữa [7]

- Chữa kinh nguyệt không đều

L Diếp c 30 – 40g sắc uống thường xuyên s khỏi [7]

- Chữa chứng âm thư ph t ở lưng

Lấy rau Diếp c giã n t vắt lấy nước cốt ôi lên chỗ lưng đau Hoặc dùng l chuối tươi gói lại nướng chín rồi đắp vào chỗ đau khi đắp vào vết thương phải chừa một lỗ chính giữa vùng đau để hơi độc tiết ra Thay đổi nhiều lần trong ngày s kết quả [7]

- Bệnh trĩ đau nhức

Dùng l Diếp c nấu nước xông ngâm rửa lúc c n nóng c n ã dùng đắp vào chỗ đau C ng dùng Diếp c uống tươi hoặc sắc uống liên tục trong 3 th ng [7]

- Đau mắt nhặm đỏ đau mắt do trực trùng mủ xanh

Dùng l diếp c tươi giã n t trộn với l ng trắng trứng gà để đắp lên mi mắt khi

1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Đại học Chiết Giang, Sở Khoa học và Kỹ thuật Y học Trung Quốc đã dùng sắc k khí / khối phổ (GC/MS) phân tích về tinh dầu của HC ằng c ch sử dụng-methyl hóa cột với acetate tetramethylammonium (TMAA) Tinh dầu được chưng cất c c thành phần acid o được methyl hóa với acetate tetramethyl ammonium (TMAA) ở 2500C và được x c định ằng GC/MS Kết quả cho thấy rằng acid béo

thiết yếu của tinh dầu khoảng 81% trong số c c axit o được tìm thấy đã được methyl hóa có acid capric, methyl (43,66%) methyl, laurate (16,15%), methyl hexadecanoate (9,27%), undecanoic acid, methyl (5,62%), methyl oleate (1,98%),

và linoleate methyl (1 40%) C c thành phần chính là (-)-beta-pinene (1,02 %), beta-myrcene (1,62%), 1-terpinen-4-ol (1,59%), decanal (1,49%), và 2-undecanone (1,47%) [13]

Theo một nghiên cứu của Đại học Y khoa Koahsiung Đài Loan diếp c có t c dụng ức chế đ ng kể đối với sự sinh sản của virus herpes simplex Nó được xem là dược thảo chữa ệnh này Đại học Koahsiung c ng ph t hiện diếp c có t c dụng ngăn chặn 5 d ng tế ào ung thư m u Một số nghiên cứu kh c cho thấy diếp c có

t c dụng chống viêm xoang kinh niên và polyp làm tăng tươi m u sau phẫu thuật Chất Houttuynin isulphat natri chiết suất từ nó có thể điều trị viêm tuyến vú

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Diếp c là đối tượng nghiên cứu của nhiều t c giả kh c nhau và đã được o

c o là có khả năng kh ng khuẩn kh ng viêm tăng cường đ p ứng miễn dịch do chứa nhiều thành phần có hoạt tính sinh học cao đặc iệt là hợp chất thuộc nhóm

flavonoid như rutin quercetin

T c giả Phan Văn Cư Nguyễn Thị Thu Hường Trường Đại học Khoa học Đại học Huế đã chọn nghiên cứu chiết t ch sterol tổng từ l của cây Diếp c (Houttuynia cordata Thunb) ở tỉnh Thừa Thiên Huế Qu trình sử dụng phương ph p xà ph ng hóa tinh chế sản phẩm thu được sterol tổng sau đó định lượng sterol tổng với thuốc thử Lie ermann- Burchard (dùng cholesterol chuẩn USA) ằng phương ph p UV-VIS Từ sterol tổng định lượng được stigmasterol campesterol và β-sitosterol ằng phương ph p HPLC.Sterol là một trong những thành phần hóa học của cây Diếp c

có hoạt tính sinh học và hàm lượng tương đối cao có t c dụng về cải thiện lipid

m u giảm lượng cholesterol trong m u xơ cứng động mạch

Ở Việt Nam một số t c giả đã nghiên cứu phân lập flavonoid trong cây Diếp

c Gần đây chúng tôi mới tìm được t c giả Trần Thị Việt Hoa đã phân lập được cấu

tử -sitosterol từ cây Diếp c ở tỉnh Tiền Giang

 hận xét

Số lượng lớn c c công trình nghiên cứu về l diếp c đến từ nhiều quốc gia

kh c nhau đã cho thấy tầm quan trọng của cây thuốc cổ truyền này trong đời sống của c c dân tộc trên thế giới Nhiều nước ph t triển như Mỹ Braxin Ấn Độ Trung Quốc Nhật Bản tuy có nền y học hiện đại nhưng họ vẫn rất quan tâm nghiên cứu cây này đã minh chứng cho gi trị của cây diếp c Từ c c kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng toàn cây diếp c đều có gi trị sử dụng chữa ệnh mở ra khả năng khai

th c hiệu quả loài cây này trong y học hiện đại để ào chế c c dạng thuốc chữa ệnh hoặc thực phẩm chức năng có lợi cho sức khỏe con người Trong khi thế giới

đã nghiên cứu về loài cây này từ rất sớm nhưng ở Việt Nam loài cây này chưa được

c c nhà khoa học quan tâm nhiều số công trình nghiên cứu là rất ít và mang tính riêng lẻ Mặc dù ở nước ta loài cây này rất quen thuộc và được sử dụng phổ iến làm thuốc chữa ệnh trong dân gian Hơn nữa khí hậu Việt Nam rất thuận lợi để loài cây diếp c sinh sống và ph t triển Nếu cây diếp c được nghiên cứu đầy đủ và

có hệ thống để khai th c hiệu quả thì đây s là nguồn thảo dược tiềm năng của nước

ta

1.5 MỘT SỐ CHẾ PHẨM TRÊN THỊ TRƯỜNG

Một số chế phẩm chứa Diếp c trên thị trường được cho ở ảng 1.2

Bảng 1.2 Một số chế ph m chứa Diếp cá trên thị trường

STT Tên Thành phần, C ng dụng H nh ảnh

1 Trà Hoa h e

Thành phần: Diếp cá, Hoa hòe

T c dụng thông tiểu nhuận tràng

Đặc iệt rất tốt cho những người ệnh trĩ ngăn ngừa vỡ mao mạch ở người cao huyết p

STT Tên Thành phần, C ng dụng H nh ảnh

2 Trà Ruton

Thành phần: Rau Diếp cá Nụ H e

chất thơm thiên nhiên

Thông tiểu nhuận tràng T c dụng rất tốt cho những nguời ệnh trĩ ngăn ngừa vỡ mao mạch xuất huyết não ở nguời cao tuổi nguời cao huyết p cầm m u trong c c truờng hợp xuất huyết Trị c c chứng mụn mẩn ngứa do t o ón

dị ứng thức ăn

Dạng ào chế: túi lọc

Sản xuất: Công ty cổ phần Dược phẩm OPC

4 Triselan

Thành phần: Diếp cá, Hoàng liên,

Ho hoa Đương quy Thăng ma Kim ngân hoa Chỉ x c Trắc ch diệp Sinh địa Cam thảo …

Suy tĩnh mạch chân nặng chuột rút phù trĩ nội trĩ ngoại

Dạng ào chế: Viên nang

Sản xuất: Công ty cổ phần Dược phẩm Đông Dược 5

STT Tên Thành phần, C ng dụng H nh ảnh

5 Trĩ Linh

Đơn-NT

Thành phần: Bạch truật Đương quy trần ì Cam thảo Đẳng sâm

Hoàng kỳ Diếp cá

Ph ng ngừa và hỗ trợ điều trị ệnh trĩ nội trĩ ngoại t o ón …

Dạng ào chế: Viên hoàn cứng Sản xuất: Công ty cổ phần Dược Danapha

6 Hameselaphin

Thành phần : Cao lỏng l Sến cao lỏng thân cây Lân tơ uyn tươi cao

lỏng Diếp cá cao lỏng Bạch hoa

xà cao lỏng Ph cố chỉ cao lỏng l Dâu cao lỏng Hoa h e Dầu hạt Sến

T c dụng kh ng khuẩn với: Tụ cầu vàng, Trực khuẩn mủ xanh Trực khuẩn E.coli Proteus Chữa ỏng vết thương nhiễm khuẩn c c vết xây x t đứt tay chảy m u mụn nhọt lở lo t

Sản xuất: Công ty cổ phần Dược phẩm Quảng Bình

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU H A CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Cây Diếp c Houttuynia cordata Thun Saururaceae được thu mua tươi tại

Quảng Nam Đà Nẵng vào th ng 10 năm 2017

Sơ chế: Thu mua mẫu vật tươi (cả cây) cắt ỏ rễ ngắt riêng thân l rửa sạch

phơi riêng l và thân đến khô xay nhỏ đến độ mịn cần thiết

Dược liệu l diếp c khô cho ởi hình 2.1

Hình 2.1 Dược liệu lá Diếp cá khô

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

a Hóa chất

C c dung môi dùng để chiết t ch và tinh chế gồm: methanol n-hexan, ethyl acetate chloroform đã được cất lại ằng soxhlet ở nhiệt độ sôi của mỗi dung môi để loại ỏ tạp chất chất làm mềm

Ngoài ra c n sử dụng Na2SO4 khan để làm khan nước và một số hóa chất kh c Thuốc thử phun lên ản mỏng là vanilin 1% trong dung dịch methanol –

H2SO4 đặc

b Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

- M y quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) của Ph ng Thí nghiệm phân tích môi trường - Trung tâm khí tượng thủy văn Khu vực Trung Trung Bộ số 660 Trưng

Nữ Vương TP Đà Nẵng

- Thiết ị đo sắc k khí gh p phổ khối (GS–MS) Agilent 7890A/5975C của Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Mỹ phẩm Thực phẩm TP Huế

- Bộ chiết soxhlet tủ sấy l nung cân phân tích m y quay cất chân không

m y sấy C c dụng cụ thí nghiệm kh c như: cốc thủy tinh, bình tam giác ếp c ch thuỷ cốc sứ pipet ình định mức ình hút ẩm nhiệt kế phễu chiết cối chày sứ

- Sắc kí ản mỏng sử dụng ản mỏng nhôm tr ng sẵn silicagel TLC 60F254 độ dày 0,25 mm, hãng Merck Đức

- Chất hấp phụ nhồi cột sắc kí là silicagel cỡ hạt 0 04 – 0,06 mm, hãng Merck, Đức

- C c thiết ị x c định cấu trúc chất của Viện hóa học: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H–NMR, 13C–NMR được ghi trên máy Bruker Avance–500 MHz, tín hiệu dung môi (CDCl3) cho 1H–NMR và 13C–NMR

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương ph p x c định các thông số hóa lý

a Phương pháp trọng lượng

Áp dụng phương ph p trọng lượng để x c định c c yếu tố sau:

- Độ ẩm của l diếp c tươi và l diếp c khô

Dụng cụ, thiết bị: ch n sứ để đựng mẫu tủ sấy ình hút ẩm cân phân tích Tiến hành: Ch n sứ có kí hiệu sẵn c c ch n sứ được rửa sạch và sấy trong tủ

sấy đến khối lượng không đổi Sấy xong để vào ình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt

độ ph ng thì cân khối lượng c c ch n sứ

+ Xác định độ m của lá diếp cá tươi: Lấy vào 3 ch n sứ mỗi ch n khoảng 5

gram l diếp c tươi đã được xử lí ở trên (theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên ch n sứ) Tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 800C cứ sau 5 giờ lại lấy ra cân cứ tiến hành như vậy đến khi khối lượng của mẫu và ch n sứ giữa 2 lần cân không đổi là được

Ghi lại gi trị khối lượng đó Độ ẩm của mỗi ch n là hiệu số khối lượng giữa khối lượng mẫu trước và sau khi cân Từ đó suy ra độ ẩm trung ình của 3 mẫu

+ Xác định độ m tương đối của nguyên liệu bột: cho vào 3 ch n sứ mỗi ch n

khoảng 5 gam nguyên liệu ột đã chuẩn ị ở trên C c ước tiếp theo thực hiện tương tự như đối với x c định độ ẩm của l tươi

 Cách tính độ m:

- Độ ẩm mỗi mẫu:

1 2 3 2

(%)(%)

3



Trong đó m1(gam) : Khối lượng ì ch n sứ

m2 (gam) : Khối lượng l diếp c an đầu

m3(gam) : Khối lượng ch n sứ và mẫu l diếp c sau khi sấy khô  (%) : Độ ẩm của mỗi mẫu

TB (%) : Độ ẩm trung ình

- X c định hàm lượng tro

Tro toàn phần: Là khối lượng cắn c n lại sau khi nung ch y hoàn toàn một

mẫu thử trong điều kiện nhất định

Dụng cụ: ch n sứ đựng mẫu l nung ình hút ẩm cân phân tích

Tiến hành: Để x c định hàm lượng tro trong l diếp c ta cân khoảng 5 gam l

diếp c tươi cho vào cốc sứ đã sấy khô và iết chính x c khối lượng Cho cốc sứ có chứa mẫu vào l nung và nung ở 7000C Sau thời gian tro ho khoảng 12 giờ ta thấy diếp c tươi ị tro ho hoàn toàn Lúc này tro ở dạng ột mịn màu trắng Dùng kẹp sắt dài lấy cốc ra khỏi l nung cho vào ình hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và ghi gi trị khối lượng Tiếp tục cho cốc vào l nung nung 30 phút lấy ra thực hiện lại qu trình trên đến khi khối lượng giữa 2 lần cân liên tiếp nhau không đổi hoặc sai số 0.001 thì dừng lại Hàm lượng tro trong diếp c tươi được tính theo công thức:

0

.100%

m H m

Trong đó m0 (gam): khối lượng mẫu diếp c tươi trước khi tro ho

m1 (gam): khối lượng tro

H (%) : hàm lượng tro trong l diếp c

b Phương pháp vật lý

Sử dụng phương ph p quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) để x c định hàm lượng một số kim loại nặng có trong mẫu nguyên liệu nghiên cứu

- Giới thiệu phương pháp

Phương ph p AAS được viết tắt từ phương ph p hấp thụ nguyên tử (Atomic

A sorption Spectrophotometric) C c nguyên tử ở trạng th i ình thường thì chúng không hấp thụ hay ức xạ năng lượng nhưng khi chúng ở trạng th i tự do dưới dạng những đ m hơi nguyên tử thì chúng hấp thụ và ức xạ năng lượng Mỗ i nguyên tử chỉ hấp thụ những ức xạ nhất định tương ứng với những ức xạ mà chúng c ó thể phát ra trong quá trình phát xạ của chúng Khi nguyên tử nhận năng lượng chúng chuyển lên mức năng lượng cao hơn gọi là trạng th i kích thích Qu trình đó gọi là

qu trình hấp thụ năng lượng của nguyên tử tự do ở trạng th i hơi và tạo ra phổ của nguyên tử đó Phổ sinh ra trong qu trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử Phương

ph p phân tích dựa trên cơ sở đo phổ hấp thụ nguyên tử của một số nguyên tố như thế được gọi là ph p đo phổ hấp thụ nguyên tử

Ph p đo phổ hấp thụ nguyên tử là một kỹ thuật phân tích tương đối mới đã và đang ph t triển mạnh m và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và kĩ thuật ở c c nước ph t triển Đối tượng của phương ph p phân tích theo phổ hấp thụ nguyên tử là lượng nhỏ c c kim loại và một số kim trong rất nhiều đối tượng mẫu: quặng đất nước kho ng c c mẫu sinh học y học c c sản phẩm nông nghiệp thực phẩm nước uống phân ón vật liệu

Với trang ị và kỹ thuật hiện nay người ta có thể định lượng được hầu hết c c kim loại và một số kim đến giới hạn nồng độ c ở pp (nanogram) với sai số không lớn hơn 15%

- Nguyên tắc của phép đo AAS

Trên cơ sở của sự xuất hiện phổ hấp thụ nguyên tử, chúng ta thấy phổ hấp thụ nguyên tử chỉ sinh ra được khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái khí tự do và trong mức năng lượng cơ ản Do vậy, muốn thực hiện được ph p đo AAS cần phải thực hiện

các công việc sau :

+ Hóa hơi mẫu phân tích đưa vật mẫu về trạng thái khí

+ Nguyên tử hóa đ m hơi đó tức là phân ly các phân tử để tạo ra c c đ m hơi các nguyên tử tự do của các nguyên tố cần phân tích ở trong mẫu có khả năng hấp thụ bức xạ đơn sắc Hai công việc này được gọi là quá trình nguyên tử hóa mẫu Đây là giai đoạn quan trọng nhất và ảnh hưởng đến quyết định kết quả của ph p đo AAS vì nó tạo ra môi trường hấp thụ nguyên tử của ph p đo

+ Chọn nguồn phát tia sáng có ước sóng phù hợp với nguyên tố phân tích (bức xạ cộng hưởng) và chiếu vào đ m hơi đó như vậy phổ hấp thụ s xuất hiện + Thu toàn bộ chùm s ng sau khi đi qua môi trường hấp thụ, phân ly chúng thành phổ và chọn 1 vạch phổ cần đo của nguyên tố phân tích để hướng vào khe đo

để đo cường độ của nó

+ Thu và ghi lại kết quả đo của cường độ vạch phổ hấp thụ bằng thiết bị ghi và

xử lý thích hợp

2.2.2 Phương ph p chiết mẫu thực vật

Mẫu thực vật thường được chiết theo hai cách:

 Cách th nh t: Chiết mẫu với dung môi là MeOH ở nhiệt độ thường Rút

dịch chiết và thêm dung môi mới thực hiện chiết mẫu 4 lần Dịch chiết thu được được cất loại dung môi dưới p suất giảm ở nhiệt độ 45o

C ằng m y quay cất chân không Thu được cao chiết MeOH tổng Cao chiết tổng này được chế thêm nước và chiết phân lớp lần lượt với n–hexane, EtOAc và MeOH, clorofom ằng phễu chiết Với mỗi loại dung môi ta c ng thực hiện chiết 3 lần C c dịch chiết được cất loại dung môi s thu được c c cao chiết tương ứng (cao n–hexane, cao clorofom, cao EtOAc, cao MeOH ) để tiếp tục nghiên cứu

 Cách th hai: Mẫu thực vật khô được chiết lần lượt với từng loại dung môi

có độ phân cực kh c nhau như n–hexane, clorofom, EtOAc và MeOH Với mỗi loại

dung môi được chiết a lần Cất loại dung môi dưới p suất giảm ằng m y quay cất chân không s thu được c c cao chiết tương ứng để tiếp tục nghiên cứu

- Đối với kĩ thuật soxhlet

 Nguyên tắc:

Chiết soxhlet là một kiểu chiết liên tục đặc iệt thực hiện nhờ một trang thiết

ị của nó Song ở đây pha mẫu là ở trạng th i ột hoặc dạng mảnh hoặc dạng l

C n dung môi chiết (chất hữu cơ) là dạng lỏng

Ví dụ: chiết lấy tinh dầu melton từ l cây ạc hà ằng dung môi hữu cơ hexan hay enzen Chiết c c thuốc trừ sâu hoặc ảo vệ thực vật trong mẫu rau quả mẫu đất ằng n-hexan Vì thế đây là kiểu chiết của hệ chiết có thể là cả đồng thể và

n-dị thể mà chất phân tích nằm trong mẫu rắn ột l sợi…

 C c trang thiết ị và ví dụ:

Trang thiết ị của kỹ thuật chiết soxhlet là 2 loại:

1 Hệ soxhlet thường và đơn giản

2 Hệ soxhlet tự động (Auto-soxhlet)

C ch chiết theo hệ (1) là đơn giản vận hành ằng tay C n c ch (2) là vận hành một c ch tự động Kĩ thuật này chủ yếu sử dụng để chiết t ch chất hữu cơ nằm trong pha rắn hay ột hay mảnh nhỏ hay c c vật liệu khô (l cây) Vì thế nên nó là hệ chiết dị thể

Ví dụ:

Chiết soxhlet thường lấy một số hóa chất ảo vệ thực vật từ mẫu rau quả: Lấy 10g mẫu đã được nghiền nhỏ và trộn đều vào cốc chiết của hệ chiết Thêm 25-30g Na2SO4 khan 30ml dung môi chiết n-hexan có 20% Cl2H2 Sau đó tiến hành chiết trong 180 phút

Kĩ thuật này có ưu điểm là chiết triệt để nhưng những điều kiện chiết phải nghiêm ngặt thì mới có kết quả tốt Vì thế hệ thống vận hành chiết tự động cho kết quả tốt hơn nhưng phải có hệ thống trang ị hoàn chỉnh Nó thích hợp chiết c c chất hữu cơ từ c c đối tượng mẫu kh c nhau Chất phân tích có trong mẫu rắn ột mẫu xốp khô (l cây)…kĩ thuật này được ứng dụng chủ yếu để t ch c c hợp chất hữu cơ

từ mẫu l cây rau quả hoặc mẫu đất như ví dụ trên

 Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi thực hiện việc chiết mẫu theo c ch

thứ nhất Vì Methanol được xem là dung môi vạn năng trích li được hầu hết các hợp chất thiên nhiên trong mẫu nguyên liệu Nó h a tan được các chất không phân cực đồng thời c ng có khả năng tạo dây nối hidro với các nhóm phân cực khác Việc chiết cao tổng trong c c dung môi có độ phân cực từ yếu đến mạnh nhằm tách phân đoạn các hợp chất có độ phân cực tương tự nhau, giúp cho việc phân lập chất bằng sắc kí cột về sau bớt phức tạp Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất, ta có thể dự đo n sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết,

từ đó lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí thích hợp

2.2.3 Phương ph p phân tích và định danh thành phần hóa học của các dịch chiết

 Trong luận văn này chúng tôi phân tích và định danh thành phần hóa học

c c dịch chiết n-hexan, chloroform, ethyl acetate, metanol của l diếp c ằng phương ph p đo sắc kí khí gh p phổ khối (GC-MS)

Phương ph p GC - MS dựa trên cơ sở nối gh p m y sắc kí khí (GC) với m y khối phổ (MS) C c chất sau khi đi qua cột GC có thể ị ion hóa và có khả năng đầy

đủ để phân tích ởi m y khối phổ MS Kĩ thuật sắc kí cho ph p t ch c c cấu tử của hỗn hợp có được c c chất nguyên chất để đưa vào m y khối phổ với khả năng nhận diện rất ưu việt đặc iệt là những chất có đặc trưng lưu giữ giống nhau hoặc tương tự nhau nhưng có phổ khối kh c nhau nhờ đó có thể nhận diện được chúng Phương ph p này chỉ được giới hạn với chất có thể ốc hơi mà không ị phân huỷ hay là trong khi phân huỷ cho sản phẩm phân huỷ x c định dưới thể hơi

2.2.4 Phương ph p t ch và tinh chế chất

C c cao chiết trong các dung môi khác nhau được t ch và tinh chế ằng phương ph p sắc kí cột kết hợp với sắc kí ản mỏng với c c hệ dung môi thích hợp Sắc kí cột gồm sắc kí cột thường và sắc kí cột nhanh sử dụng silicagel Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng phương ph p kết tinh phân đoạn kết tinh lại để tinh chế chất Kiểm tra độ tinh khiết của c c chất c ng như theo dõi qu trình t ch chất trên cột ằng sắc kí ản mỏng với hệ dung môi thích hợp

 Trong luận văn này chúng tôi tiến hành tách, tinh chế chất trong cao chiết clorofom của l diếp c sử dụng phương ph p sắc kí cột thường silicagel kết hợp với sắc kí ản mỏng

2.2.5 Phương ph p x c định cấu trúc hóa học của các chất

Việc x c định cấu trúc hóa học của c c chất sạch được thực hiện thông qua việc kết hợp c c phương ph p phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT–IR) phổ khối (MS) phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) như

1H–NMR, 13C–NMR C c loại phổ được đo tại Viện Ho học – Viện KHCN Việt Nam

2.2.6 Phương ph p thử hoạt tính sinh học

 Dựa theo công dụng của l diếp c trong c c ài thuốc dân gian chúng tôi tiến hành thăm d hoạt tính chống oxi hóa c c dịch chiết từ l diếp c trong đề tài nghiên cứu này

Phương ph p đ nh gi hoạt tính chống oxi hóa gồm những phương ph p như phương ph p thông qua ao vây gốc tự do (DPPH), phương ph p dựa vào năng lượng khử phương ph p x c định chống oxi hóa trên mô hình dầu- nước

Hoạt tính chống oxy hóa gần đây được quan tâm nhiều hơn ởi nó như một chìa khóa vạn năng cho c c nghiên cứu hoạt tính sinh học kh c C c chất chống oxy hóa được iết đến như vitamin E vitamin C lycopen resveratrol và một số chất trao đổi thứ cấp kh c trong cây C c chất này được ổ sung vào dược phẩm và thực phẩm chức năng có t c dụng tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể ph ng và điều trị c c ệnh do gốc tự do sinh ra như tiểu đường tim mạch alzheimer ung thư…

C c chất chống oxy hóa nguồn gốc thực vật đang được ưa chuộng do đặc điểm

l hóa của chúng như thân thiện với cơ thể ền nhiệt … c c chất này thường có

ản chất là c c polyphenon Theo như tài liệu đã công ố chi Houttuynia rất giàu polyphenon và c ng có hoạt tính chống oxy hóa tương đối cao Do vậy chúng tôi tiến hành thử hoạt tính chống oxy hóa nhằm tìm kiếm c c hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa mới có nguồn gốc thực vật

DPPH là gốc tự do có màu tím hấp thụ cực đại ở ước sóng 517 nm nó đại diện cho c c gốc tự do có ản chất hóa học Chất thử có khả năng khử gốc tự do này nghĩa là chúng làm mất màu DPPH quan s t khả năng làm mất màu DPPH của chất thử nhiều hay ít để có thể đ nh gi mức độ chống oxy hóa của chất thử Ở đây chúng tôi tiến hành thử khả năng ẫy gốc tự do DPPH của c c cao chiết tổng methanol của l vỏ thân rễ và cành

Trong đề tài này tôi chọn phương ph p thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH) Mẫu được đem đi kiểm tra tại viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam Viện hóa học Phòng hóa sinh ứng dụng

2.4 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

Quá trình thực nghiệm được mô tả theo sơ đồ thể hiện ở hình 2.2

Sấy khô xay ột

Bột nguyên liệu khô

C c cao chiết

1 Làm khan nước

2 Cất loại dung môi

Thử hoạt tính sinh học

2.5 SƠ ĐỒ ĐIỀU CHẾ CÁC CAO CHIẾT

Sơ đồ chiết mẫu l diếp c được cho ởi hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ chiết mẫu lá diếp cá

- Xử lý nguyên liệu: Nguyên liệu lá cây diếp cá ở Quảng Nam - Đà Nẵng, thu hái vào tháng 10/2017 Chọn hái những l tươi không ị hư sâu cắt phần trên mặt đất Lá diếp c được rửa sạch, loại bỏ tạp bẩn để r o nước rồi thái nhỏ

L đã th i nhỏ được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 300

C Trong quá trình sấy, thỉnh thoảng dùng tay trộn xới nguyên liệu để nguyên liệu được khô đều

Nguyên liệu khô đem xay nhỏ thu được bột dược liệu

- Chiết t ch và x c định thành phần hóa học của các dịch chiết lá diếp cá Khoảng 1 kg nguyên liệu ột khô được ngâm chiết trong MeOH ốn lần với mỗi lần 1 lít dung môi ở nhiệt độ ph ng trong thời gian 2 ngày thu lấy dịch chiết Phần dịch chiết này được cất quay dưới p suất giảm để đuổi dung môi, thu đươc cao tổng MeOH Cao tổng này được chế thêm 200ml nước cất Chiết phân lớp lần lượt với c c dung môi n-hexan, clorofom, ethyl acetate, metanol ằng phễu chiết Mỗi dung môi c ng tiến hành chiết 3 lần thu được c c phân đoạn dịch chiết tương ứng Làm khan nước c c dịch chiết này ằng Na2SO4

L diếp c

Cao MeOH

1 Sấy khô xay ột

2 Ngâm chiết với MeOH (3 lần x 1 lít)

3 Cất loại dung môi

Cao n-hexane

(5.914g)

Cao clorofom (5.351g)

Cao EtOAc (8.875g)

1 Thêm 200ml nước cất

2 Chiết phân lớp lần lượt với c c dung môi : n-hexan ,clorofom, , EtOAc, MeOH

3 Cất loại dung môi

Cao nước (5,025 g)

 Lấy ở mỗi dịch chiết khoảng 5 ml để đem phân tích GC – MS x c định thành phần và hàm lượng c c cấu tử có trong mỗi dịch chiết Hệ thống GC-MS với cột

t ch mao quản DB-5MS, khí mang He 10psi, thể tích tiêm mẫu 1μl (split 10:1), ghép máy MS EI+ k m ngân hàng dữ liệu và theo chương trình gradient nhiệt độ: từ

500C đến 3000

C (5 phút); injector 2500C và detector 500 chế độ qu t Fullscan

 Toàn ộ c c phần dịch chiết c n lại được cất quay dưới p suất giảm để đuổi hết dung môi thu được: 5.914g cao n–hexan, 5.351g cao clorofom và 8.875g cao EtOAc và 5,025 g cao nước

Tất cả c c mẫu được đo GC-MS ở Trung tâm kiểm nghiệm thuốc mỹ phẩm thực phẩm Thành phố Huế

2.6 PHÂN LẬP CHẤT TRONG CAO CHIẾT CHLOROFORM

 Trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu phân lập và tinh chế chất trong cao chiết chloroform l diếp c

Cao chiết chloroform được t ch và tinh chế ằng sắc kí cột thường kết hợp sắc

kí ản mỏng silicagel

Để phân lập và tinh chế chất chúng tôi sử dụng:

- Sắc kí ản mỏng TLC Silicagel 60 F254 hãng Merck, dày 0.25mm tráng trên nền nhôm

- Silicagel nhồi cột là silicagel Merck cỡ hạt 0.04 - 0.06mm

- Cột sắc kí là ống thủy tinh có kích thước 2 cm x 80 cm ên dưới có van khóa

- Thuốc thử phun lên ản mỏng sử dụng vanilin 1% trong dung dịch methanol – H2SO4 đặc sau đó sấy ản mỏng ở nhiệt độ khoảng 1100C

 Chu n bị thuốc thử: Lấy vào bình tam giác 200ml MeOH, thêm 25 ml

CH3COOH làm lạnh hỗn hợp Sau đó thêm từ từ 11ml H2SO4 đậm đặc Cân 1.2 g vanilin Cho từ từ từng lượng nhỏ vanilin vào hỗn hợp trên vừa dùng đ a thủy tinh khuấy đều

 Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí

Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel dựa vào sắc kí

ản mỏng với c c ước sau: