NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ PHYTONCID CHỦ YẾU TỪ CỦ NÉN Ở QUẢNG NAM

Khái niệm Chiết tách là phương pháp mang tính hóa học thuần túy nhằm tách một hoặc một số chất ra khỏi nguyên liệu dựa trên nguyên tắc: Sự phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THỊ LIÊN THANH

Đà Nẵng - Năm 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tác giả luận văn

Đặng Văn Phi

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về củ nén 4

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân loại 4

1.1.2 Thành phần hóa học 5

1.2 Giới thiệu chung về phytolcid 7

1.2.1 Định nghĩa 7

1.2.2 Phân loại 7

1.2.3 Tính chất 7

1.2.4 Ứng dụng của phytolcid 8

1.2.5 Một số hợp chất chính có trong họ hành tỏi 8

1.2.5.1 Hợp chất Allicin 8

1.2.5.2 Hợp chất Diallyl disulfide 10

1.3 Phương pháp tách chiết các hợp chất phytolcid 10

1.3.1 Khái niệm 10

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách 10

1.3.2.1 Dung môi 10

1.3.2.2 Nồng độ dịch chiết 11

1.3.2.3 Đặc điểm của nguyên liệu 11

1.3.2.4 Nhiệt độ 12

1.3.2.5 Thời gian 13

1.3.2.6 Khuấy trộn 13

1.3.3 Một số dung môi thường sử dụng trong chiết tách 13

1.3.4 Một số phương pháp tách chiết thường dùng 14

1.3.4.1 Ngâm 14

1.3.4.2 Phương pháp chiết xuất ngấm kiệt 15

1.3.4.3 Phương pháp chiết tách ngược dòng 15

1.3.4.4 Phương pháp chiết tách bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn 16

1.3.4.5 Chiết siêu âm 17

1.4 Tình hình nghiên cứu về họ hành tỏi trên thế giới và trong nước 17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 20

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 20

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 20

2.1.3 Nơi thực hiện nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp vật lý 20

2.2.2 Phương pháp hóa học 21

2.2.3 Phương pháp hóa sinh 21

2.2.3.1 Xác định hàm lượng glucid tổng 21

2.2.3.2 Xác định hàm lượng nitơ tổng 21

2.2.4 Phương pháp hóa lý 22

2.2.4.1 Xác định hàm lượng các nguyên tố vi lượng 22

2.2.4.2 Đo quang phổ hấp thụ phân tử UV/VIS 22

2.2.4.3 Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC/MS) 23

2.2.5 Phương pháp vi sinh vật 24

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Xác định một số thành phần hóa học có trong củ nén 25

3.2 Xác định cấu tử của hỗn hợp dịch chiết 27

3.3 Chọn dung môi chiết tách các phytolcid chủ yếu trong củ nén 31

3.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách một số phytocid chủ yếu từ củ nén 35

3.4.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tươi (ml/g) đến hiệu suất chiết tách 35

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi diallyl disulfide 38

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian 41

3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH 44

3.5 Đề xuất qui trình ngâm chiết phytolcid từ củ nén 46

3.6 Xác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết củ nén 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI (bản sao) PHỤ LỤC 58

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

khác nhau

32

cơ khác nhau trong cùng điều kiện

33

nén với tỉ lệ dung môi khác nhau

37

3.5 Ảnh hưởng của tỷ dung môi cồn 96 0 / nguyên liệu củ nén

giã nát đến giá trị mật độ quang thu được

37

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ai cũng biết rằng: Ăn ở và mặc là nhu cầu không thể thiếu đối với con người Chính vì thế chế biến món ăn ngon hỗ trợ cho sức khỏe con người luôn được khuyến khích đề cao Đối với người Việt Nam chúng ta vấn đề sử dụng món ăn hợp lí luôn được nhân dân ta chú trọng đúng mức Có thể thấy mỗi món hợp với một số gia vị nhất định chỉ có khi nào dùng đúng món ăn mới phát huy hết công dụng ví dụ: Vịt cần gừng, gà cần chanh, bò nướng cần nén, heo cần hành… Có thể nói gia vị là một phần không thể thiếu, về trực giác nó

là chất điều vị giúp gia tăng hương vị và màu sắc và tăng sự hấp dẫn cho món

ăn điều này một phần giúp cho sự tiêu hóa và hấp thụ thức ăn tốt hơn nhưng

về sâu xa sử dụng gia vị là tận hưởng hoạt chất kháng sinh thực vật – phytolcid (fitolcid) có công dụng giúp cơ thể kháng khuẩn Có thể thấy công dụng của mỗi loại gia vị luôn tồn tại trong kho tàng tri thức nhân gian có loại

đã được khoa học chứng minh rõ ràng như nghệ, gừng, tỏi… Nhưng cũng có loại gia vị được dùng như một vị thuốc trong dân gian nhưng chưa hiểu rõ công dụng thực như củ nén, kiệu…

Nén hay hành tăm có nguồn gốc tại Bắc Á, Bắc Âu châu và Bắc Mỹ,

đã được trồng và sử dụng từ hơn 5000 năm Loài được trồng hiện nay rất tương cận với loài mọc hoang tại vùng núi Alpes, những giống hoang khác cũng mọc khá nhiều tại vùng Bắc bán cầu Tại lục địa Bắc Mỹ, nén đã được

“thích ứng hóa” và được trồng từ khu vực Nam Canada, xuống tới Đông Nam California.[3]

Ở Việt Nam nén được trồng từ rất lâu đời tuy nhiên chỉ được trồng đại trà và có chất lượng tốt ở vùng đất từ Quảng Nam ra Quảng Trị, nhiều nhất là

ở Nghệ An nén thường trồng làm rau ăn và lấy củ làm thuốc Có thể nhân giống như hành hoa, bằng hạt hay tách bụi vào vụ đông xuân Thu hoạch củ

vào mùa hè thu Khi dùng rửa sạch, giã nát, thường dùng tươi,cũng có thể sắc uống

Xuất phát từ nguồn nguyên liệu dồi dào của Quảng Nam và để biết rõ công dụng của các phytolcid trong củ nén, chúng tôi mạnh dạn chọn đề tài :

Nghiên cứu chiết tách và định danh các phytolcid chủ yếu từ củ nén ở Quảng Nam

2 Mục đích nghiên cứu

- Xây dựng qui trình chiết tách chất kháng sinh thực vật

- Xác định công thức cấu tạo, danh pháp của các phytolcid chủ yếu có trong dịch chiết của củ nén

- Xác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ củ nén

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Cử nén ở Quảng Nam

Nơi thực hiện: Phòng thí nghiệm Trường ĐHSP thành phố ĐÀ NẴNG và các trung tâm khác

4 Phương pháp nghiên cứu

4.4 Phương pháp hóa sinh

- Sử dụng phương pháp Ferry cyanure để xác định hàm lượng glucid tổng

4.5 Phương pháp vi sinh

- Xác định khả năng kháng khuẩn củ dịch chiết củ nén

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:

6 Cấu trúc luận văn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây nén (Hành tăm)

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân loại

Cây nén có tên khoa học là Allium schoenoprasum L Các tên gọi

thường gặp: Hành tăm trắng hay Nén (Việt Nam); Chive (Anh, Mỹ); Ciboulette, Civette (Pháp); Schnittlauch (Đức); Cebollino (Tây Ban Nha) [7]

Nén là tên gọi cây hành tăm được sử dụng thống nhất trên toàn lãnh thổ Việt Nam Trong đề tài này củ nén là nguyên liệu được sử dụng để nghiên cứu Về phân loại thực vật nén thuộc: [41]

mọc thành cụm hình đầu, mang nhiều hoa, có cuống ngắn Hoa thường vô sinh nên Hành tăm được phát triển bằng cách tách bụi, hành tăm thích hợp với nhiệt độ từ 60 đến 70 độ F, đất thông thoát không ứ nước, có tính axit nhẹ Thời gian nẩy mầm từ 10 đến 14 ngày.[7]

Dưới đây là một số hình ảnh về hoa, cây nén, củ nén Được thể hiện ở các hình 1.1 [41], hình 1.2 [36], hình 1.3 [32]

Thành phần hóa học của củ nén ở Việt Nam được thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong củ nén [7]

Thành phần hóa học

Nước (%) Protein (g) Lipit (g) Glucid (g) Magie (mg) Canxi (mg) Photpho (mg) Kẽm (mg) Kali (mg) Mangan (mg) Natri (mg) Vitamin C(mg) Caroten (IU) Vitamin B2 (mg) Vitamin B3 (mg) Vitamin B5 (mg) Vitamin B6 (mg)

87,6 1,95 0,73 6,81

42

62

38 0.56

296 0,373

18 58,1 4.353 0,115 0,647 0,324

0,138

Củ nén – loại gia vị sử dụng dạng củ có hàm lượng nước cao cùng với sự hiện diện của các acid amin, chất khoáng và các vitamin , … Đặc biệt củ nén, chứa một lượng tinh dầu, các sulfit hữu cơ giống với các loại hành,có chất kháng sinh alliin [3]

Củ nén có vị đắng, cay, mùi hăng nồng, tính ấm, có tác dụng giải cảm, làm toát mồ hôi, hành khí hạ đàm, lợi tiểu, giải độc, sát trùng Ở Ấn Độ, người

ta chứng minh củ nén có những tính chất gần giống củ hành tây

1.2 Giới thiệu chung về chất kháng sinh thực vật – phytolcid

1.2.1 Định nghĩa

Kháng sinh thực vật – phytolcid (fitolcid) là hợp chất được tạo thành từ quá trình sinh tổng hợp nội bào, có tác dụng chống vi khuẩn thường được phân chiết từ thực vật thượng đẳng Vì vậy phytolcid được hiểu đầy đủ là chất kháng sinh thực vật, chúng có vai trò giúp cho cơ thể chống lại sự nhiễm bệnh, phòng bệnh tốt khi sử dụng nguồn thực vật giàu hợp chất phytolcid

1.2.2 Phân loại

Phytolcid được chia thành hai nhóm chính :

- Nhóm phytolcid bay hơi (hay còn gọi là esther thực vật, tinh dầu):

Là những phytolcid do thực vật thượng đẳng tiết ra có khả năng khuếch tán vào không khí và có tác dụng ức chế sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn (VK) gây bệnh

Ví dụ: Tinh dầu thông, tinh dầu hồi, trầm, long não, quế,… Rất được thông dụng trong công nghệ hóa dược phẩm với tư cách là chất sát trùng

- Nhóm phytolcid không bay hơi:

Là Phytolcid cũng do thực vật thượng đẳng tiết ra song chúng nằm sâu trong tế bào thực vật nên không có khả năng tự khuếch tán vào không khí như brasilin, leonurin,…

Ví dụ: Tô mộc, kim ngân,…Thường sử dụng trong các loại lá xông Dưới tác động của nhiệt độ cao do nấu, các hợp chất trong nhóm phytolcid được khuýech tán tạo nên hiệu quả cho quá trình xông.[38]

1.2.3 Tính chất

- Phytolcid có nguồn gốc từ thực vật

- Hầu như không có tác dụng phụ như kháng sinh từ vi nấm, vi khuẩn

- Tác dụng hiệu quả trong việc phòng, chống dị ứng như brasilin (tô mộc), leonurin (kim ngân),…do các chất này ức chế hoạt lực của enzyme

histamin decarboxylaza – Nguyên nhân tạo ra hợp chất histamin (gây dị ứng gây độc cho cơ thể)

- Quá trình kháng khuẩn của phytolcid diễn ra rất chậm nên hiệu quả chữa bệnh không đặc trưng bằng hiệu quả phòng bệnh

- Thời gian trồng cây để thu được phytolcid lâu hơn so với việc nuôi cấy vi sinh vật tạo ra chất kháng sinh.Mặt khác vai trò chữa bệnh của phytolcid hiệu quả không cao bằng kháng sinh thu được từ vi sinh vật.[38]

Allicin là hoạt chất có tính kháng sinh mạnh Allicin không phải là cấu

tử hiện diện tự nhiên trong củ nén mà nó được hình thành S-Allyl cystein sunfocid hay là alliin Bản thân alliin không có tác dụng kháng khuẩn nhưng dưới tác dụng của enzim alliinase có sẵn trong nén sẽ tạo thành allicin một ankyl thiosunfinat Sự chuyển hóa này diễn ra rất nhanh 50% trong 2 phút Do

đó, càng cắt nhỏ hoặc càng dập nát hoạt tính của nó thể hiện càng rõ Allicin

có vai trò kháng khuẩn và kháng nấm Quá trình chuyển hình thành Allicin được thể hiện trong sơ đồ chuyển hóa sau:

Công thức cấu tạo của allicin

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Allicin

Alliin là một chất kết tinh không màu tan được trong nước và hầu như không mùi ; ngược lại allicin là chất lỏng không màu có mùi tỏi mạnh có khối lượng riêng (d =1,112 g cm -3) Khi cho kết hợp với kiềm thì allicin tạo thành allyl disunfit kết tủa.[39]

Allicin khi kết hợp với cystein hoạt tính sinh học của nó không tồn tại

do tạo nên chất mới chất này không mang đặc tính giống allicin

1.2.5.2 Hợp chất Diallyl disulfide

Công thức cấu tạo của diallyl disulfide

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của diallyl disulfide Diallyl disulfide một hợp chất có tên gọi là organosulfur Organosulfur

là một chất lỏng màu vàng, không hòa tan trong nước và có ‘ mùi tỏi’’ mạnh

có nhiệt độ sôi 1380C -1390C và là hợp chất không phân cực nên chúng hòa tan tốt trong các dung môi không phân cực

Diallyl disulfide được tạo ra trong quá trình phân hủy của allicin, được hình thành khi nghiền tỏi và cây trồng khác của họ Alliaceae Hợp chất diallyl disulfide khi tăng nhiệt độ sẽ phân hủy tạo ra hỗn hợp chứa nhiều cấu tử khác nhau Diallyl disulfide có nhiều lợi ích sức khỏe bởi tính kháng khuẩn song

nó cũng là một chất gây dị ứng Trong công nghiệp thực phẩm, diallyl disulfide được sử dụng để bảo giữ mùi vị cho thịt, rau và trái cây…[40]

1.3 Phương pháp tách chiết các hợp chất phytolcid

1.3.1 Khái niệm

Chiết tách là phương pháp mang tính hóa học thuần túy nhằm tách một hoặc một số chất ra khỏi nguyên liệu dựa trên nguyên tắc: Sự phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: Một pha lỏng và một pha rắn tạo cân bằng lỏng – rắn hoặc hai pha lỏng, tạo cân bằng lỏng – lỏng [17]

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách

1.3.2.1 Dung môi

Dung môi có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình chiết tách, nó phụ thuộc rất lớn vào khả năng xâm nhập của dung môi qua lớp vỏ của tế bào, khả năng hòa tan chọn lọc của các hoạt chất khi dung môi thẩm thấu vào bên

trong tế bào và sau cùng, phải kể đến khả năng di chuyển của hỗn hợp dung môi – chất chiết từ bên trong đi ra bên ngoài qua rào cản của các lớp rắn chắc của nguyên liệu Trong nguyên liệu, ngoài chất cần chiết còn xen lẫn cả các chất có cùng những tính chất như chất cần thiết Do đó, nếu lựa chọn dung môi không tốt, không mang tính đặc trưng có chọn lọc thì hỗn hợp chiết sẽ có

cả sự hiện diện của các chất không mong muốn [17] Vì vậy, để đạt hiệu suất chiết tách cao, yêu cầu dung môi phải:

- Có tính hòa tan chọn lọc, nghĩa là chỉ hòa tan cấu tử cần tách, không hoặc hòa tan rất ít các cấu tử khác

- Không ăn mòn thiết bị

1.3.2.3 Đặc điểm của nguyên liệu

Nguyên liệu càng nhỏ thì diện tích tiếp xúc bề mặt với dung môi càng lớn, làm cho quá trình thẩm thấu diễn ra nhanh hơn, tạo điều kiện cho quá trình chiết dễ dàng và hiệu quả hơn Nghiền hay băm nhỏ nguyên liệu là phương pháp thường được áp dụng Tuy nhiên, nếu kích thước vật liệu cần chiết quá nhỏ cũng gây trở ngại cho quá trình chiết vì nó có thể làm tắc các

ống mao dẫn, làm giảm áp suất bề mặt và làm phức tạp cho các quá trình xử

lý tiếp theo [14] Ngoài ra cấu trúc bên trong hay thành phần hóa học, tính chất của vật liệu cũng ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu quả chiết tách Nếu độ

ẩm cao thì nước có thể tác dụng với thành phần protein và các chất háo nước khác, có thể ngăn cản sự di chuyển của dung môi thấm sâu vào nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán Do đó, để làm giảm tác động không mong muốn này, người ta thường dùng nguyên liệu có kích thước nhỏ được sấy khô Đối với nguyên liệu non có cấu trúc mô mềm, nên khi xay chỉ cần xay thô không cần xay mịn để tránh chiết nhiều tạp chất (chất không cần chiết) hiện diện vào dịch chiết [8]

1.3.2.4 Nhiệt độ

Nhiệt độ có tác dụng làm tăng khả năng khuếch tán và giảm độ nhớt của dung môi nên làm cho phần tử cần hòa tan có thể chuyển động khuếch tán

dễ dàng giữa các phân tử dung môi Tuy nhiên nhiệt độ là một yếu tố giới hạn

vì có khả năng gây ra các phản ứng không mong muốn

Nhiệt độ chiết thích hợp tùy thuộc vào loại nguyên liệu, loại dung môi

và phương pháp chiết

Đối với dung môi dễ bay hơi khi nhiệt độ tăng đồng nghĩa với sự hao hụt dung môi tăng Để hạn chế sự hao hụt thiết bị phải kín và có bộ phận thu hồi dung môi để tái sử dụng bằng cách hồi lưu

Đối với những chất cần chiết kém bền ở nhiệt độ cao: nhiệt độ tăng cao

sẽ gây phá hủy một số chất như vitamin, glycosid, alcaloid Đối với những hợp chất dễ hòa tan bởi nhiệt, khi nhiệt độ tăng không những độ tan của chúng tăng theo mà còn là yếu tố làm tăng sự hiện diện của chất tan khác không mong muốn có trong dịch chiết có nghĩa là lượng tạp chất cũng tăng, dịch chiết sẽ lẫn tạp [1]

1.3.2.5 Thời gian

Về mặt nguyên tắc: Khi thời gian trích ly dài thì hiệu suất trích ly tăng tuy nhiên, việc kéo dài thời gian phải có giới hạn: Nếu hiệu suất trích ly đã đạt mức tối đa mà tiếp tục kéo dài thời gian ngâm có thể không mang lại hiệu quả trích ly như mong muốn mà còn gây ảnh hưởng đến độ tinh sạch của sản phẩm sau khi chiết tách [1]

1.3.2.6 Khuấy trộn

Khi dung môi tiếp xúc với nguyên liệu, dung môi sẽ thấm vào nguyên liệu để, hòa tan chất tan; chất tan được khuếch tán từ nguyên liệu vào dung môi qua màng tế bào Sau một thời gian khuếch tán, nồng độ chất tan trong tế bào giảm, nồng độ chất tan trong dung môi tăng lên, chênh lệch nồng độ bên trong và bên ngoài tế bào giảm dần và dẫn tới cân bằng nên quá trình khuếch tán cũng giảm và đạt đến trạng thái cân bằng có nghĩa là quá trình trích ly cũng tuân thủ theo qui luật trên rồi dừng lại Do đó cần phải tiến hành khuấy trộn để di chuyển lớp dịch chiết ở phía sát màng tế bào ra xa và dung môi ở phía xa vào sát màng tế bào để tạo sự chênh lệch nồng độ nhằm tăng cường quá trình khuếch tán [1]

1.3.3 Một số dung môi thường sử dụng trong chiết tách

Việc lựa chọn dung môi thích hợp quyết định thành công của chiết xuất Dung môi được lựa chọn phải đáp ứng yêu cầu cho hiệu suất cao nhất nhưng lượng tạp chất ít nhất Các tính chất quan trọng của dung môi là khả năng hòa tan, độ phân cực, độ sôi và tỷ trọng

Trong các điều kiện trên, khả năng hòa tan các chất cần chiết là quan trọng nhất Khả năng hòa tan lại liên quan chặt chẽ với độ phân cực của dung môi Các chất có nhiều nhóm ưa nước như – OH, - COOH, - CN, - CHO thường dễ tan trong các dung môi phân cực Ngược lại các chất có nhiều nhóm kỵ nước như các chất béo, nhóm – CH3, - C2H5 thường dễ tan trong

dung môi không phân cực Một số dung môi thường dùng trong chiết tách như: nước, rượu etylic, metylic, glyxerin, ete dầu hỏa, n- hexan, heptan, dầu béo

Nước là dung môi phân cực quan trọng bậc nhất trong công nghệ chiết xuất Có thể sử dụng nước nguyên chất hoặc phối hợp với các dung môi hữu

cơ Lượng nước có trong dung môi cũng đóng vai trò đáng kể vào quá trình chiết tách và ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả và chất lượng của dịch sau chiết

Một số tính chất vật lý của các dung môi được thể hiện qua bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số tính chất vật lý của dung môi [17]

n- hexan Ete dầu

Là phương pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ xưa Nguyên liệu đã

xử lý sơ bộ cho vào bình chiết sau đó đổ dung môi ngập nguyên liệu, ngâm trong một thời gian nhất định (tùy nguyên liêu), lấy dịch chiết rồi rửa bã bằng dung môi thích hợp Để tăng cường hiệu quả chiết rút có thể tiến hành khuấy trộn hoặc tuần hoàn cưỡng bức dung môi

Có nhiều cách ngâm : Ngâm tĩnh, ngâm động,ngâm nóng, ngâm lạnh,

dung môi được bổ sung khi ngâm một hoặc nhiều lần

Phương pháp này có ưu điểm: Thiết bị đơn giản, rẻ tiền, dễ thực hiện nhưng cũng có nhiều nhược điểm như năng suất thấp, phải thao tác thủ công Nếu chỉ chiết xuất một lần thì hiệu suất thu hồi thấp, còn nếu chiết nhiều lần thì tốn dung môi và thời gian

1.3.4.1 Phương pháp chiết xuất ngấm kiệt

Ngâm nguyên liệu vào dung môi trong bình ngấm kiệt sau một thời gian xác định, rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dưới bình ngấm kiệt, đồng thời

bổ sung thêm dung môi ở phía trên bằng cách cho dung môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp vật liệu chiết nằm dưới Lớp dung môi trong bình chiết thường phải ngập lớp vật liệu khoảng 3-4cm

Chiết xuất ngấm kiệt thường chia thành các phương pháp sau :

- Ngấm kiệt đơn giản : Là phương pháp ngấm kiệt luôn sử dụng dung môi mới để chiết đến kiệt chất cần chiết trong nguyên liệu

- Ngấm kiệt phân đoạn (tái ngấm kiệt) : Là phương pháp ngấm kiệt có

sử dụng dịch chiết loãng để chiết mẻ mới hoặc chiết các mẻ chiết có mức độ chiết khác nhau

Ưu điểm của phương pháp này là nguyên liệu được chiết kiệt hơn,đỡ tốn dung môi hơn phương pháp ngâm

Nhược điểm là năng suất thấp, phải thao tác thủ công, thao tác phức tạp hơn phương pháp ngâm Đối với ngấm kiệt đơn giản lại tốn nhiều dung môi

1.3.4.3 Phương pháp chiết tách ngược dòng

Là phương pháp sử dụng một số chuỗi thiết bị chiết tách, đường đi của dung môi và nguyên liệu ngược chiều nhau trong thiết bị Dịch chiết di chuyển trong thiết bị nhờ những cơ cấu chuyên dùng khác nhau Nguyên liệu

trước khi lấy ra khỏi thiết bị được tiếp xúc với nguyên liệu mới nên dịch chiết thu được đậm đặc hơn, bã trước khi tháo khỏi thiết bị được tiếp xúc với dung môi mới nên bã được tách kiệt hơn.[8]

Ưu điểm :

- Năng suất cao, không phải thao tác thủ công

- Dịch chiết thu được có nồng độ cao

- Nguyên liệu được chiết kiệt, ít tốn dung môi

- Có thể cơ giới hóa được quá trình chiết

Nhựợc điểm :

Thiết bị có cấu tạo phức tạp, đắt tiền, khó vận hành

1.3.4.4 Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn

Phương pháp chiết tách bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn (SFE) là phương pháp tận dụng chất lưu ở trạng thái siêu tới hạn làm dung môi chiết để, tách thành phần khác nhau trong nguyên liệu từ chất rắn hoặc chất lỏng rồi tiến hành phân tách

Chất lỏng siêu tới hạn hình thành khi nhiệt độ và áp suất vượt quá điểm tới hạn Ở trạng thái này, tỷ trọng của pha lỏng và pha khí bằng nhau, ranh giới phân biệt giữa 2 pha không tồn tại

Chất chiết dùng trong phương pháp này là khí cacbonic (CO2), nhờ vào các đặc điểm không độc, không ăn mòn, điều kiện tới hạn thích hợp của CO2

nên nó trở thành chất lưu siêu tới hạn được dùng phổ biến nhất trong phương pháp chiết tách này

CO2 khi ở điểm tới hạn có nhiệt độ cao và áp suất cao sẽ xảy ra hai khuynh hướng: Nhiệt độ cao sẽ bay hơi, áp suất cao thì hóa lỏng Thế nên, ở

khoảng nhiệt độ và áp suất nào đó, hai pha khí và lỏng cùng tồn tại, đó là trạng thái siêu tới hạn Khi mang tính chất của chất khí (dễ khuyếch tán vào chất rắn) và chất lỏng (hòa tan chất khác) Người ta thường cho CO2 hóa lỏng

ở áp suất cao để tạo điều kiện trích ly các chất có trong nguyên liệu rồi sau đó giảm áp suất để CO2 hóa khí, tiến hành thu hồi CO2 nhằm tái sử dụng [30]

Ưu điểm :

- Khả năng chiết xuất cao

- Có khả năng tái sử dụng nên chi phí rẻ hơn

- An toàn, độ tinh khiết cao

1.3.4.5 Chiết siêu âm

Là phương ngấm chiết dùng sóng siêu âm có tác dụng tăng tần số và vận tốc chuyển động phân tử của vật chất; tăng khả năng thẩm thấu; tăng tốc

độ và số lần thoát ra; rút ngắn thời gian chiết

Tác dụng của sóng siêu âm :

- Làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúng thành hạt nhỏ

- Phá vỡ một phần tế bào

- Tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp

- Có tác dụng làm tăng nhiệt tại chỗ

Phương pháp siêu âm tuy có khả năng tăng cường quá trình chiết xuất nhưng phương pháp này chỉ mới được nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa có ứng dụng thực tế vì giá thành cao.[8]

1.4 Tình hình nghiên cứu về họ hành tỏi trên thế giới và trong nước

David Putman và Shu Hai Zhao đã sử dụng sắc kí lỏng cao áp- HPLC

phân tích thiosulfinates từ hành tây, tỏi, tỏi hoang dã (ramsoms), tỏi tây, hành

lá, hẹ, hành tăm, và chive Trung Quốc [23]

Nghiên cứu tại khoa Thực phẩm – Dinh dưỡng, đại học Sunchon, Korea ghi nhận các hượp chất S-Metyl methanenthiosulfinate và S-metyl-2-propene-1-thiosulfinate, trích từ hẹ có khả năng diệt được E Coli O-157 : H7

là vi khuẩn gây hư hại thực phẩm [27]

Nghiên cứu tại Sơn Đông, Trung Hoa do National Cancer Institute tài trợ : Tại Sơn Đông, tủ lệ người mắc bệnh ung thư bao tử rất cao Nghiên cứu xem xét cách ăn uống của 564 bệnh nhân bị ung thư so với 1131 người khỏe mạnh Kết quả ghi nhận những người ăn 85gam hành, tỏi mỗi ngày chỉ có 40% nguy cơ bị ung thư so với người ăn mỗi ngày 28,3gam Trong số các loại hành và tỏi, hành hương scallions có tiềm năng chống ung thư mạnh nhất, ngoài ra khả năng chống ung thư còn tùy thuộc vào liều lượng hành tỏi vào Tác dụng chống ung thư được cho là do ở các hợp chất chứa sulfur có trong hành, tỏi (Journal of the National Cancer Institute Số 84- 1992) [9]

Theo các nhà khoa học trường Đại học Pensylvania khả năng ngăn chặn khối u ung thư của tỏi liên quan đến các hợp chất S-allyl cysteine, diallyl disulfide và diallyl trisulfide [36]

Nghiên cứu tại đại học Rutgers, New Brunswick, New Jersey (USA): Glycerol mono-(E)-8,11,12-trihydroxy-9-octadecanoate lá một axid béo loại monoglyceride chưa bão hòa và tianshic acid ly trích từ hạt hành hương có hoạt tính ức chế sự tăng trưởng của nấm Phytophtohora capsici (Journal of Agricultural Food Chemistry Số 23- 2002) [9]

Theo tài liệu ‘Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam’ của Đỗ Tất Lợi Thí nghiệm trong ống nghiêm, tác dụng diệt khuẩn của hợp chất allicin có trong tỏi rất mạnh dung dịch 1/85000- 1/125000 đủ ức chế sinh trưởng các

trùng Staphylococcus, Streptococus, trùng thương hàn, phó thương hàn,trực trùng lỵ [9]

Ở Việt Nam cây nén thường trồng làm rau ăn và lấy củ làm thuốc Phần lớn củ nén được sử dụng làm gia vị trong các món ăn và sử dụng như một bài thuốc dân gian trong điều trị các bệnh cảm, trúng độc, côn trùng cắn, ho gà Những nghiên cứu về củ nén, trên lĩnh vực các hoạt chất có khả năng kháng khuẩn hầu như còn rất ít chưa có những tổng kết nào mang tính học thuật Chính vì vậy trong trong nghiên cứu này tôi chọn đề tài : ‘‘Nghiên cứu chiết tách, định danh một số phytolcid có trong củ nén ở Quảng Nam’’ nhằm cung cấp thêm những tư liệu về củ nén trên phương diện vai trò của hoạt chất sinh học

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Nguyên liệu thực nghiệm là củ nén tại Quảng Nam

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất

- Dung dịch n- hexan (Trung Quốc, độ tinh khiết 98%); Dung dịch ete dầu hỏa (Trung Quốc, độ tinh khiết 96%); Na2SO4, rắn (Trung Quốc, độ tinh khiết 99%); Aceton (Trung Quốc, độ tinh khiết 98%); Cồn tuyệt đối 960C (Việt Nam, độ tinh khiết 99%); Metanol (Trung Quốc, độ tinh khiết 98%); KMnO4

0,1N chuẩn (Merck, Đức); H2SO4 (95 – 98%, Trung Quốc); NaOH (loại P.A., Trung Quốc); HCl (Trung Quốc); Ethyl acetate (Trung Quốc); Methyl đỏ, Methylen blue, Glucose chuẩn, K3Fe(CN)6,…

Thiết bị:

- Máy đo quang phổ UV –VIS Jenway 6305 (Mỹ), máy li tâm, tủ sấy, cân điện tử, máy cô quay chân không, máy đo pH, tủ sấy Memmert UM 400 (Đức) ,cân điện tử…

- Các thiết bị, dụng cụ thủy tinh thông thường trong phòng thí nghiệm

2.1.3 Nơi thực hiện nghiên cứu

Phòng B4 trường đại học Sư Phạm Đà Nẵng và một số trung tâm phân tích khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vật lý: Xác định hàm lượng nước có trong nguyên liệu

Nguyên tắc: Hàm lượng nước có trong nguyên liệu được xác định bằng

phương pháp sấy đến khối lượng không đổi [11]

Cách tiến hành: Phụ lục

2.2.2 Phương pháp hóa học: Xác định phytolcid

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hòa tan của một số hợp chất phytolcid

trong các dung môi hữu cơ [39],[40] Trong dịch chiết củ nén chứa nhiều hợp chất thuộc phytolcid, trong đó 02 hợp chất allicin và diallyl disulfide có tính đặc trưng về khả năng kháng khuẩn quan trọng đều tan tốt trong dung môi ethanol Do đó ethanol sẽ là dung môi được xem xét thấu đáo trong quá trình nghiên cứu chiết tách 2 hợp chất nêu trên

Mẫu được ngâm trong dung môi etanol trong 1 tháng, đậy kín Dịch

chiết được lọc trong điều kiện chân không yếu

độ được tiến hành trong môi trường kiềm, khi đun nóng với chỉ thị Methylen blue Phương trình phản ứng:

CH2OH-(CHOH)4-CHO + K3Fe(CN)6 + 2NaOH  CH2OH-(CHOH)4COONa + NaK3Fe(CN)6 + H2O

Dưới tác dụng của H2SO4 ở nhiệt độ cao, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ (N) bị phân hủy và bị oxi hóa thành CO2, H2O, còn nitơ tạo thành NH3,

và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sunfat

- Vô cơ hóa nguyên liệu:

NH2-CH2COOH + 3 H2SO4  NH3 + 2CO2 + 4H2O

- Khí amoniac sinh ra sẽ kết hợp ngay với H2SO4 dư tạo thành

2NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4

Amoniac sunfat amoni

Đốt thực phẩm trong bình Kjeldahl Sau khi vô cơ hóa xong, làm lạnh bình rồi thêm một lượng natri hydroxyt để đẩy amoniac ra :

(NH4)2SO4 + NaOH = 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O

Cất amoniac và dùng acid sulfuric hấp thụ Từ lượng acid sunfuric đã kết hợp với amoniac, tính ra được amoniac, sau đó tính được lượng nitơ Lượng nitơ được nhân với 6.25, sẽ ra được lượng protein toàn phần

Thực hiện tại Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm, thành phố Huế

2.2.4 Phương pháp hóa lý

2.2.4.1 Xác định hàm lượng các nguyên tố vi lượng

Thực hiện tại Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm, thành phố Huế

Theo phương pháp F-AAS

2.2.4.2 Đo quang phổ hấp thụ phân tử UV/VIS

Phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử UV/VIS là phương pháp phân tích dựa trên kết quả so sánh giữa khả năng hấp thụ năng lượng (tia) bức

xạ đơn sắc của dung dịch nghiên cứu với dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định Phương pháp UV/VIS cho phép xác định hợp chất có khối lượng nhỏ, lại tốn ít thời gian so với các phương pháp khác nhưng kết quả đo có độ chính

xác cao Phương pháp này còn có thể áp dụng để phân tích định tính bởi mỗi dung dịch màu chỉ hấp thụ những tia sáng có bước sóng nhất định

Cơ sở lý thuyết của phương pháp

Cơ sở lý thuyết của phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV/VIS dựa trên định luật Lambert- Beer

Khi năng lượng (tia) bức xạ đơn sắc đi qua dung dịch chứa chất hấp thụ thì cường độ của tia ló bức xạ có xu hướng giảm mạnh nếu có càng nhiều phân tử hấp thụ được năng lượng bức xạ Sự giảm cường độ phụ thuộc vào nồng độ chất hấp thụ và độ dài đoạn đường mà bức xạ đơn sắc đi qua

Định luật Lambert- Beer có thể biểu diễn bởi phương trình sau:

D=lg D lgI0

I

  ε.C.l Trong đó:

D: Mật độ quang (hay độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch)

Đối với dung dịch nhất định chứa trong một loại cuvet nhất định thì ε,l

là cố định do vậy D=kC cho biết sự phụ thuộc tuyến tính giữa mật độ quang

và nồng độ của dung dịch, đây chính là cơ sở của phương pháp phân tích định lượng

2.2.4.3 Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC/MS )

Nguyên tắc:

GC/MS: là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay

với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.Được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp

Bản chất của phương pháp GC/MS, là sự kết hợp của Sắc ký khí và Khối phổ, ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picogram

Nhờ có khí có trong bơm khí, mẫu từ buồng bơm hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt Quá trình sắc ký được diễn ra tại đây Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện.Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi Các tín hiệu được xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả

Cách tiến hành: Mẫu được đo tại trung tâm đo lường chất lượng 2

(thành phố Đà Nẵng)

2.2.5 Phương pháp vi sinh vật

Dùng để xác định khả năng kháng khuẩn vi sinh vật kiểm định của dịch chiết bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch bằng cách đo đường kính vong thủy phân

Nguyên tắc :

Nuôi cấy một số chủng vi khuẩn dùng kiểm định trong môi trường TSA Pha loãng mẫu thử và thử khả năng kháng khuẩn của mẫu bằng cách đo đường kính vòng thủy phân xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường TSA

Cách tiến hành: Mẫu được xác định tại trung tâm đo lường Sắc kí Hải Đăng thành phố Hồ Chí Minh

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

+ Hàm lượng các nguyên tố: canxi, natri, kali, magie

Kết quả xác định một số thành phần hóa học và các nguyên tố vi lượng chính của củ nén tươi được trình bày trên bảng 3.1

Bảng 3.1 Một số thành phần hóa học của củ nén ở Quảng Nam

- Hàm lượng nước của các nguyên liệu tươi nằm trong khoảng 86,3% là hoàn toàn phù hợp với hàm lượng nước đã được công bố trên tài liệu [37]

Mục tiêu xác định hàm lượng nước ban đầu có trong nguyên liệu tươi nhằm mục đích sau: Trong quá trình chiết tách đối với nguyên liệu tươi, hàm lượng nước có trong nguyên liệu là một trong những yếu tố gây ảnh hưởng đến hiệu quả chiết tách Lượng nước lớn sẽ gây ra sự dính bết giữa các phân

tử khác nhau chứa trong nguyên liệu Nước trong nguyên liệu sẽ liên kết giữa protein với các thành phần háo nước khác (gluxit, khoáng…), làm ngăn cản

sự thẩm thấu của dung môi, làm chậm quá trình khuếch tán và đối lưu của phân tử, do đó làm giảm hiệu suất chiết tách [17] Để nâng cao hiệu suất chiết tách các hợp chất mong muốn từ nguyên liệu tươi, rất cần phải loại bỏ hoàn toàn nước ra khỏi nguyên liệu trước khi tiến hành chiết tách Vì vậy trong quá trình xử lý và làm nhỏ nguyên liệu người ta thường bổ sung một lượng chất hút ẩm phù hợp (Na2SO4) để loại nước Khối lượng chất hút ẩm cần dùng tùy thuộc vào khối lượng và độ ẩm của nguyên liệu chiết tách Theo A.F.Nametnhicov [12], đối với loại chất hút ẩm Na2SO4, khối lượng chất hút

ẩm cần dùng là 40- 45g Na2SO4 / 5 g nguyên liệu tươi

Mặt khác, bất kỳ một quá trình chiết tách nào (đặc biệt là dùng dung môi để chiết tách) thì vấn đề xác định nồng độ thích hợp của dung môi chiết tách có thể được xem là yếu tố tiên quyết quyết định đến hiệu suất thu hồi sản phẩm chiết Do đó, để bảo đảm sử dụng dung môi theo nồng độ đã định, hàm lượng nước ban đầu (hoặc còn gọi là hàm ẩm của nguyên liệu chiết tách) là tham số rất quan trọng để điều chỉnh nồng độ dung môi phù hợp cho mục tiêu đạt hiệu quả cao khi tiến hành chiết

- Hàm lượng glucid tổng trong củ nén ở Quảng Nam là xấp xỉ với hàm lượng gluxid tổng trong thành phần hóa học của củ nén theo tài liệu [7] So với hàm lượng glucid trong củ tỏi thì hàm lượng glucid trong củ nén thấp hơn