NGHIÊN CỮU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẢN HÓA HỌC ! VÀ PHẦN LẬP CHẮT TINH KHIẾT TRONG DỊCH CHIẾT CỦA ; THÂN CÂY CẢU TÍCH TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHÓ ĐÀ NẴNG.

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ------- HUỲNH THỊ LỆ TRANG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT TRONG DỊCH CHIẾT CỦA THÂN CÂY CẨU TÍ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

HUỲNH THỊ LỆ TRANG

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT TRONG DỊCH CHIẾT CỦA THÂN CÂY CẨU TÍCH TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ

Mã số: 8440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Đà Nẵng, năm 2019

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

HUỲNH THỊ LỆ TRANG

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT TRONG DỊCH CHIẾT

CỦA THÂN CÂY CẨU TÍCH TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ

Mã số: 8440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

GS.TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG

Đà Nẵng, năm 2019

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 3

3.1 Đối tượng nghiên cứu 3

3.2 Phạm vi nghiên cứu 3

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3

5 CẤU TRÚC LUẬN VĂN 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY CẨU TÍCH 4

1.2 CÔNG DỤNG CỦA CÂY CẨU TÍCH 6

1.2.1 Những nghiên cứu ứng dụng của cây cẩu tích trên thế giới 6

1.2.1 Một số bài thuốc của cây cẩu tích đang được dùng ở Viêt Nam 8

1.2.2 Một số bài thuốc của Nam Y Trần Đức Trịnh chữa bệnh có hiệu quả 10

1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÂY CẨU TÍCH Ở NƯỚC NGOÀI 10

1.3.1 Các axit béo được các nhà khoa học tìm thấy trong cây cẩu tích 10

1.3.2 Các hợp chất phenol và flavonoid tan trong nước 12

1.3.3 Các hợp chất sesquitecpen 13

1.3.4 Các chất béo phức tạp 15

1.3.5 Các hợp chất khác 17

1 4 CƠ SỞ LÍ THUYẾT CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

1.4.1 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 18

1.4.2 Phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) 20

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 25

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ 25

2.1.1 Nguyên liệu 25

2.1.2 Hóa chất 26

2.1.3 Dụng cụ 26

2.1.4 Các loại máy móc, thiết bị 26

2.2 NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 27

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 27

2.2.2 Chiết tách và xác định thành phần hóa học trong dịch chiết thân cây cẩu tích 28

2.2.3 Phương pháp phân lập xác định chất sạch từ cao chiết đichloromethane 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 KẾT QUẢ KHỐI LƯỢNG CÁC CAO CHIẾT 33

3.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT 33

3.2.1 Thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane 33

3.2.2 Thành phần hóa học trong dịch chiết dichloromethane 36

3.2.3 Thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform 38

3.2.4 Thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate 40

3.3 PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG HỢP CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT DICHLOMETHANE 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

C-NMR : 13C- Nuclear Magnetic Resonance

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer HMQC : Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence

HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation

3.3 Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết

3.4 Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết

3.5 Kết quả định danh thành phần hóa học trong dịch chiết

3.1 Sắc ký đồ GC của dịch chiết n–hexane từ thân cây cẩu tích 34 3.2 Sắc ký đồ GC của dịch chiết dichloromethane từ thân cây

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Tài nguyên cây thuốc đóng vai trò quan trọng trong chăm sóc sức khoẻ, chữa bệnh cho người dân, đặc biệt ở các nước nghèo, các nước đang phát triển và các nước có truyền thống sử dụng cây cỏ làm thuốc Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện nay có khoảng 80% dân số ở các nước đang phát triển có nhu cầu chăm sóc sức khoẻ ban đầu phụ thuộc vào nền y học cổ truyền Phần lớn trong số đó phụ thuộc vào nguồn dược liệu hoặc các chất chiết suất từ dược liệu Ở Trung Quốc, nhu cầu thuốc cây cỏ là 1.600.000 tấn/năm và tăng khoảng 9%/năm Châu Âu và Bắc Mỹ có nhu cầu

sử dụng cây thuốc tăng khoảng 10% mỗi năm

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa nên có nguồn tài nguyên cây thuốc phát triển phong phú và đa dạng Theo kết quả điều tra nguồn tài nguyên dược liệu ở Việt Nam giai đoạn 2001-2005 của Viện Dược liệu Việt Nam, hiện Việt Nam có khoảng 10.500 loài thực vật bậc cao, nằm trong 2.275 chi, 305 họ (ước tính có thể tới 12.000 loài), 10% số này là loài đặc hữu

• So sánh với hệ thực vật thế giới, hệ thực vật Việt Nam chiếm 4% tổng số loài; 15% tổng số chi; 57% tổng số họ

• Trong hệ thực vật Việt Nam, có 3.950 loài được dùng làm thuốc (17% số cây thuốc của thế giới), không kể cây thuốc dân tộc (Ethno-medicinal plants) còn ít biết [6]

Y dược cổ truyền Việt Nam có nhiều loại cây thuốc quý, nhiều bài thuốc hay và nhiều kinh nghiệm chữa bệnh trong dân gian nhất là của đồng bào các dân tộc Trải qua thực tiễn hàng ngàn năm đến nay những bài thuốc vẫn còn nguyên giá trị chữa bệnh, cứu người Đặc biệt, những bài thuốc bồi bổ cơ thể được nhiều người sử dụng đã góp phần nâng cao thể trạng, phát triển giống

nòi người Việt Nam Hơn thế nữa, nhiều phương pháp chữa bệnh không dùng thuốc như châm cứu, bấm huyệt, khí công, dưỡng sinh

Trong nhiều năm qua, Việt Nam đã từng bước lồng ghép y dược cổ truyền vào hệ thống y tế quốc gia, phát huy được vai trò to lớn của y dược cổ truyền Đường lối phát triển y dược học cổ truyền Việt Nam đã được khẳng định nhất quán là: Kế thừa, phát huy, phát triển y dược học cổ truyền, kết hợp với y học hiện đại, xây dựng nền y dược học cổ truyền Việt Nam khoa học dân tộc và đại chúng Hiện đại hóa y dược cổ truyền và kết hợp y dược cổ truyền với y dược hiện đại đang là mục tiêu và yêu cầu phát triển của thời đại Thực hiện tốt công việc này sẽ góp phần đưa sự nghiệp chăm sóc sức khỏe nhân dân lên tầm cao mới Việc phát hiện các vị thuốc mới và các chất mới trong vị thuốc cho nhu cầu trị, chữa bệnh nhằm hiện đại hóa y học cổ truyền

và kết hợp y học cổ truyền với y học hiện đại là vấn đề mang tính chiến lược hiện nay

Cây cẩu tích là một cây thuốc quý có trong kho tàng cây thuốc, vị thuốc Việt Nam trị, chữa bệnh thông thường và trị nhiều chứng bệnh nan y có hiệu quả cao Trên thế giới hiện có ít công trình nghiên cứu về cây cẩu tích, còn ở nước ta chưa có tổ chức cá nhân nào công bố công trình nghiên cứu thành phần hóa học cây cẩu tích Bởi vậy việc tìm ra thành phần hóa học và công dụng của cây cẩu tích có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng Với những lý

do trên tôi chọn đối tượng đề tài “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và phân lập chất trong một số dịch chiết của thân cây cẩu tích (Cibotium Barometz) ở thành phố Đà Nẵng”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Tìm hiểu về cây cẩu tích (Cibotium Barometz) tại Đà Nẵng

- Xây dựng qui trình chiết tách các hợp chất từ thân cây cẩu tích

- Xác định thành phần hóa học các chất có trong cao chiết của thân cây cẩu tích

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là thân cây cẩu tích, được thu hái tại xã Hòa Phú, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

3.2 Phạm vi nghiên cứu

Thành phần hóa học trong cao chiết của thân cây cẩu tích

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

– Tham khảo các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về loài cây nghiên cứu

– Thu thập, tổng hợp, phân tích các tài liệu, tư liệu về đặc điểm hình thái thực vật, nguồn nguyên liệu, thành phần hóa học và ứng dụng của thân cây cẩu tích

– Tổng hợp các tài liệu về phương pháp lấy mẫu, chiết tách và xác định thành phần hóa học các chất từ thực vật

5 CẤU TRÚC CỦA KHÓA LUẬN

Luận văn gồm 55 trang, trong đó có 7 Bảng và 19 Hình Phần mở đầu 03 trang, kết luận và kiến nghị 01 trang, tài liệu tham khảo 05 trang Nội dung của khóa luận chia làm 3 chương:

Chương 1: Tổng quan, 21 trang

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu, 8 trang

Chương 3: Kết quả và thảo luận, 23 trang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Hình 1.1 Hình ảnh cây cẩu tích

Tên gọi: Cây cẩu tích có tên khoa học là Cibotium Barometz (L) J.Sm

thuộc họ lông cu ly Dicksoniaceae ngoài ra còn có các tên khác phụ thuộc vào

vị trí địa lí và đồng bào địa phương gọi nó như: Cây kim mao cẩu tích, cu ly, nhung nô, xích tiết, co cút pá (tiếng Thái), cút báng (tiếng Tày), cây lông khỉ,

nhải cù vằng (tiếng Dao) Chi Cibotium Kaulfuss là một chi có 12 loài

mọc hoang ở các vùng nhiệt đới châu Á, châu Mỹ Ở nước ta chỉ có 1 loài đó

là Cibotium Barometz [3], [4]

Sự phân bố trên thế giới: Cây cẩu tích là một loại thực vật được

dùng làm dược liệu thuộc họ dương xỉ mọc nhiều ở Đông Nam Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Myanmar, Indonesia, Việt Nam và Nhật Bản [4] Ở Việt Nam, cây cẩu tích được phân bố rất rộng rãi ở ven rừng tái sinh, sau nương rẫy và trên các tràng cây bụi hoặc nơi đất ẩm gần bờ khe suối, rừng núi ở khắp các tỉnh miền núi nước ta từ Lào Cai, Hà Giang (phía Bắc) đến qua Quảng Nam - Đà Nẵng, Lâm Đồng (miền Trung) và vùng núi tỉnh Tây Ninh, Phú Quốc, Côn Đảo (miền Nam)

Mô tả thực vật: Cây cẩu tích được mô tả ở Hình 1.1 có thân thường

yếu, nhưng cũng có thể cao 2,5-3m Lá lớn có cuống dài 1-2m, màu nâu, ở phía gốc có vẩy hình dải rất dài màu vàng và bóng phủ dày đặc Phiến dài tới 3m, rộng 60-80cm Các lá lông chim ở phía dưới hình trái xoan ngọn giáo dài 30-60cm Lá lông chim bậc hai hình dải - ngọn giáo, nhọn lại chia thành nhiều đoạn thuôn, hẹp; mặt trên lá màu lục sẫm, mặt dưới màu lục lơ; trục lá không lông; các gân của các lá chét bậc hai có lông len Ở túi bào tử 1 hay 2, có khi

3 hay 4 ở về mỗi bên của gân giữa bậc 3; các túi màu nâu, có 2 môi không đều nhau; cái ở ngoài hình cầu, cái ở trong hẹp hơn, thuôn

Thu hái và chế biến của các nhà thuốc Đông Y: Cây cẩu tích có thể thu

hái thân rễ quanh năm, tốt nhất vào mùa Thu – Đông Khi thu hái về, trước tiên cắt bỏ rễ con và cuống lá, cạo hết lông vàng để riêng Rễ củ (thân) đã cạo hết lông, rửa sạch, thái phiến hay cắt từng đoạn dài 4-10mm, phơi hay sấy khô, bảo quản nơi khô ráo Khi dùng tẩm dược liệu với rượu để một đêm rồi sao vàng [4], [6]

1.2 CÔNG DỤNG CỦA CÂY CẨU TÍCH

Theo Y học truyền thống Trung Quốc dùng cây cẩu tích có tác dụng bổ gan và thận, tăng cường xương và gân, đau dây thần kinh tọa, phong hàn Do

đó, nó thường được sử dụng như là thành phần chính với các thuốc thảo dược Trung Quốc ngâm rượu để uống bồi bổ cơ thể và điều trị bệnh như mỏi lưng, thấp khớp Trong các ứng dụng lâm sàng hiện đại ở Trung Quốc, cây cẩu tích được sử dụng để điều trị đau thắt lưng, chân tê liệt, liệt nửa người, xuất tinh sớm, xuất huyết ở phụ nữ và các loại khối u như u xương, u xương ác tính, u não, u đa tủy, chống viêm gan virus [29]

Năm 2011, Xiong Zhao và đồng nghiệp đã tiến hành nghiên cứu khả năng chống loãng xương của dịch chiết cây cẩu tích trên chuột, kết quả cho thấy uống hàng ngày dịch chiết xuất từ cây cẩu tích đã góp phần đáng kể để phòng ngừa hoặc điều trị của sự phát triển mất xương gây ra bởi sự cắt bỏ buồng trứng ở chuột Dịch chiết xuất từ cây cẩu tích có thể ngăn chặn sự mất mát khối lượng xương và sự suy giảm của vi kiến trúc trabecular OVX gây ra,

do đó duy trì sự toàn vẹn về cấu trúc và chất lượng cơ sinh học của xương Dịch chiết xuất từ cây cẩu tích có thể là một thuốc thay thế tiềm năng để phòng ngừa và điều trị loãng xương sau mãn kinh [32]

Năm 2011, Xican Li và các cộng sự nghiên cứu hoạt động chống oxi hóa của axit Protocatechuic được chiết suất từ cây cẩu tích và kết luận, axit protocatechuic được chứng minh là hiệu quả hơn nhiều so với trolox trong việc đánh giá toàn diện hoạt động của chất chống oxy hóa trong ống nghiệm của lipid và các phương pháp truyền dung dịch nước, do đó nó có thể được sử dụng trong ngành công nghiệp dược hoặc thực phẩm như chất chống oxy hóa tự nhiên [31], [32]

Năm 2012, Wenqiong Mai và các đồng nghiệp đã nghiên cứu thân cây cẩu tích và nhận thấy thân cây cẩu tích chủ yếu chứa axit béo (ví dụ như axit oleic, acid palmitic, và axit octadecaonic), acid phenolic (ví dụ như axit caffeic,

axit protocatechuic) Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, axit palmitic có tác dụng chống viêm và axit octadecaonic có thể làm giảm mỡ máu, axit phenolic tan trong nước như axit caffeic và axit protocatechuic này là thành phần hoạt động chống viêm khớp dạng thấp và viêm xương khớp Flavonoids như kaempferol và onychin có hoạt tính chống oxy hóa và các hiệu ứng chống ung thư [29]

Năm 2012, Nova Syafni và các đồng nghiệp đã phân lập được hai hợp chất là: axit 3,4-dihydroxybenzoic và 3,4-dihydroxybenzaldehyde, ông và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của hai chất này và nhận thấy chúng có hoạt tính chống oxi hóa mạnh, chúng tham gia vào quá trình đào thải các gốc tự do do quá trình đồng hóa, dị hóa trong cơ thể gây ra [20], [23]

Năm 2011, Chih-Chun Wen và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính ức chế SARS-CoV và nhận thấy rằng hai hợp chất chiết xuất từ cây cẩu tích có hoạt tính

ức chế SARS-CoV ở nồng độ từ 25 đến 200 mg/mL và ức chế đáng kể sự hoạt động của protease 3CL SARS-CoV với IC50 giá trị là 39 mg/mL và 44 mg/mL [9]

Năm 2011, Jiewen Zhang và các đồng nghiệp nghiên cứu hoạt tính của các hợp Perosin là một nhóm lớn thuộc Secquitecpen có trong cây cẩu tích và nhận thấy chúng có các hoạt tính chống tiểu đường Type 1, Type 2, chống béo phì [17]

Năm 2009, Qi Wu, Xiu –Wei Yang nghiên cứu thành phần cấu tạo cây cẩu tích và thử lâm sàng trên người và kết luận onitin có độc tính thấp, an toàn khi uống, dễ được hấp thu qua đường tiêu hóa, có hoạt tính chống co thắt như papaverine, nhưng cơ chế hoạt động khác với papaverine Onitin là một thuốc thử leishmanicidal mạnh [25]

Năm 2009, Nguyễn Xuân Cường và cộng sự đã nghiên cứu “Chất ức chế hình thành tế bào hủy xương từ thân rễ của Cibotium Barometz” kết

(1)

(2)

Chất (1), (2) có khả năng ức chế sự hình thành tế bào hủy xương và không có tác dụng gây độc tế bào tiền thân của tế bào hủy xương, do đó chất (1), (2) có tiềm năng lớn trong việc bào chế thuốc chống loãng xương ở người

Theo y học cổ truyền Việt Nam cây cẩu tích có vị đắng ngọt, tính ấm,

có tác dụng bổ can thận, mạnh gân cốt, trừ phong thấp, chống viêm Lông vàng tác dụng cầm máu dùng dịt vào vết thương Dùng chữa phong hàn, tê thấp, đau lưng nhức mỏi, chứng tiểu tiện són không cầm, di tinh, bạch đới, đau dây thần kinh tọa Liều dùng: 12g - 20g, dùng với các vị thuốc khác [6]

Bài thuốc chữa phong thấp, tê bì chân tay không muốn cử động:

Cẩu tích 20g, Ngưu tất 8g, Mộc qua 12g, Tang chi 8g, Tùng tiết 4g, Tục đoạn 8g, Đỗ trọng 8g, Tầm giao 12g, Quế chi 4g, đun với 600ml nước chia hai lần uống trong một ngày [2]

Rượu bổ thận tráng dương: Cẩu tích 18g, đỗ trọng 15g, tục đoạn 15g,

uy linh tiên 15g, ngưu tất 15g, ngũ gia bì 15g, rượu 30 độ 1000ml Ngâm 7 ngày, ép chiết lấy nước Mỗi lần uống 20ml, ngày 2 lần: sáng, chiều Dùng cho các bệnh chứng phong thấp, đau mỏi lưng gối

Cẩu tích còn có tác dụng bổ thận, trừ thấp Trường hợp gan và thận

suy nhược, lưng đau buốt, đái vặt không nín được, phụ nữ đới hạ Cẩu tích 16g, ngưu tất 12g, thỏ ty tử 12g, sơn thù du 12g, đỗ trọng 12g, thục địa 16g, cao ban long 12g Cao ban long để riêng; sắc các vị khác lấy nước, hoà cao ban long vào để uống

Chữa phong thấp, chân tay tê bại không muốn cử động: Cẩu tích 20g,

tùng tiết 4g, đỗ trọng 8g, mộc qua 12g, tục đoạn 8g, tần giao 12g, tang chi 8g, ngưu tất 8g, quế chi 4g Sắc 2 - 3 lần và cô đặc lấy 200 - 250ml, chia uống 2 lần trong ngày

Chữa thận hư, đau lưng, đi tiểu nhiều lần, bạch đới, di tinh: Cẩu tích

15g, thục địa 12g, đỗ trọng 10g, dây tơ hồng 8g, kim anh tử 8g Sắc uống trong ngày

Chữa phong thấp, đau nhức khớp xương, chân tay yếu mỏi hoặc bại liệt: Cẩu tích 15g, tục đoạn 12g, bổ cốt toái 12g, bạch chỉ 4g, đương quy 10g,

xuyên khung 4g

Trừ thấp giảm đau: Trường hợp nhiễm gió ẩm hoặc rét ẩm, tứ chi và

thân thể đau cứng tê buốt

Bài thuốc hoàn: Cẩu tích 12g, ô đầu chế 12g, tỳ giải 12g, tô mộc 8g

Tán bột làm hoàn Ngày 2 lần, mỗi lần 8g, hãm với nước đun sôi, trị đau các khớp xương do rét ẩm

Bài thuốc sắc: Cẩu tích 12g, ngưu tất 12g, mộc qua 12g, tang chi 12g,

tùng tiết 12g, tần cửu 12g, quế chi 12g, đương quy 12g, hổ cốt 12g, thục địa 12g Sắc với nước hoặc ngâm rượu, uống Trị khí huyết đều hư, cảm gió ẩm, đau khớp và tứ chi, thân thể đều đau [5]

1.2.3 Một số bài thuốc của Nam Y Trần Đức Trịnh chữa bệnh có hiệu quả

Bài thuốc trị, chữa cho hơn 60 bệnh nhân gan viêm suy, kết quả 50 bệnh nhân đã khỏi bệnh bài thuốc bao gồm: ngưu tất 10g, đùm đũm 10g, hạ khô thảo 3g, mía dò 10g, cẩu tích 20g, cam cườm 10g, mã đề 6g

Bài thuốc trị, chữa xuy thoái xương khớp 106 bệnh nhân 100 bệnh nhân khỏi bệnh: ngưu tất 10g, đùm đũm 6g, hà thủ ô 8g, cẩu tích 20g, ba kích 8g, khúc khắc 10g, ngũ gia bì 10g

Bài thuốc trị, chữa cho 200 bệnh nhân thoái hóa xương khớp có 180 bệnh nhân khỏi bệnh: ngưu tất 10g, đùm đũm 6g, hà thủ ô 6g, thục địa 6g, ba kích 4g, mạch môn 4g, cẩu tích 20g, ngũ gia bì 10g

NGOÀI

Theo các tác giả đã nghiên cứu trên đối tượng Cibotium Barometz và

đã công bố cho thấy các lớp chất chủ yếu có trong cây cẩu tích gồm các axit béo, các hợp chất phenolnic tan trong nước, steroit, secquitecpen và các glycozit và các nhóm chất khác

1.3.1 Các axit béo được các nhà khoa học tìm thấy trong cây cẩu tích

Người ta đã tìm thấy nhiều axít béo có trong thành phần hóa học của cây cẩu tích, phổ biến hơn cả là axit palmitic, axit oleic, axit linoleic, axit stearic, este của axit palmitic, este của axit stearic …

Axit palmitic C16H32O2 (hay CH3(CH2)14COOH); điểm nóng chảy 62,90C [8][34]:

Axít oleic là một axít béo có một nối đôi (hay axit béo omega-9); Công

thức: C18H34O2 (hay CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH) Tên khoa học là axít

cis-9-octadecenoic, và tên ngắn gọn là 18:1 cis-9 Nhiệt độ nóng chảy: 13-140C; Nhiệt độ sôi: 3600C (760mm Hg), công thức cấu tạo [8], [34]:

Axit linoleic gồm có: Axit alpha-linolenic (omega-3) tên IUPAC axit

9,12,15-octadecatrienoic (tất cả dạng cis) hay 18:3(n-3); Axit béo omega-6 tên IUPAC axit 9,12-octadecadienoic (tất cả dạng cis) hoặc 18:2(n-6) và axit béo omega-9 hay axit 9-octadecenoic (dạng cis) hoặc 18:1 (n-9), axit béo

omega-9 có công thức cấu tạo [8], [34]:

Este metylpalmitat có công thức phân tử CH3(CH2)14COOCH3 [8], [34]:

O

Este etylstearat có công thức phân tử C17H35COOC2H5, công thức cấu tạo [8], [34]:

O

CH3

O CH3

1.3.2 Các hợp chất phenol và flavonoit tan trong nước

Năm 2012, Nova Syafni và các cộng sự đã tìm ra axit protocatechic (công thức phân tử C7H6O4) từ cây cẩu tích có công thức cấu tạo [23]:

Năm 2003, Cheng Qi-hou và cộng sự đã phân lập được axit caffeic từ cây cẩu tích công thức phân tử C9H8O4, khối lượng riêng 1,478 g/cm3; điểm chảy 223–225°C, công thức cấu tạo [8]:

Năm 2007, Yang Hui-Jie và cộng sự đã phân lập được từ thực vật Cibotium Barometz hợp chất (3R)-des-O-methyllasiodiplodin có công thức cấu tạo [37]:

Năm 2003, Cheng Qi-hou tìm ra hợp chất andehit protocatechuic và vanilin trong cây cẩu tích [8]

- Andehit protocatechuic công thức phân tử là C7H6O3, công

thức cấu tạo:

O

H

OH

HO CHO

Vanilin công thức phân tử là C8H8O3, nhiệt độ nóng chảy là 81-83°C,

nhiệt độ sôi 285°C, khối lƣợng riêng 10g/dm3, công thức cấu tạo:

Năm 2012, Wenqiong Mai và các đồng nghiệp đã phân lập đƣợc chất

sau: Kaempferol, công thức phân tử C15H10O6 có công thức cấu tạo [29]:

Năm 2010, Yang Hui-jie cùng các cộng sự đã phân lập đƣợc các hợp chất isohistopterosin A (6), Pterosin Y (7), petrosin Z (8) từ cây cẩu tích có công thức cấu tạo [37]:

(2S)-3-O-(9Z,12Z-octadecadienoyl)glyceryl-β-D-galactopyranoside

Nguyễn Xuân Cường và cộng sự còn phân lập được hợp chất cerebrosid từ dịch chiết cây cẩu tích Việt Nam có công thức cấu tạo [10]:

Năm 2010, Yang Hui-jie cùng các cộng sự đã phân lập được hợp

chất shinbarometin từ cây cẩu tích có công thức cấu tạo [37]:

(đường mía) trong cây cẩu tích có công thức cấu tạo [32]:

Năm 2003, Cheng Qi-hou đã phân lập được hợp chất có công thức phân tử C10H20O6 từ cây cẩu tích có công thức cấu tạo [8]:

1.4 CƠ SỞ LÍ THUYẾT CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

độ, môi trường axit Và Kpb là hằng số nhiệt động Chiết theo kiểu này có hai cách

là chiết tĩnh và chiết theo dòng chảy liên tục Trong phân tích, kiểu tĩnh được ứng dụng nhiều hơn, và sự đơn giản của nó

Điều kiện

Để có được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảm

bảo được các yêu cầu nhất định sau đây:

- Dung môi chiết phải tinh khiết cao, để không làm nhiễm bẩn thêm các chất phân tích vào mẫu

- Dung môi chiết phải hoà tan tốt các chất phân tích, nhưng lại không hoà tan tốt với các chất khác có trong mẫu

- Hệ số phân bố của hệ chiết phải lớn, để cho sự chiết được triệt để

- Cân bằng chiết nhanh đạt được và thuận nghịch, để giải chiết được tốt

- Sự phân lớp khi chiết phải rõ ràng, nhanh và dễ tách ra riêng biệt các pha

- Phải chọn môi trường axit, pH, loại axit thích hợp,

- Phải thực hiện trong nhiệt độ phù hợp và giữ không đổi trong cả quá trình

- Phải lắc hay trộn đều mạnh để quá trình chiết xảy ra được tốt

b Các phương pháp chiết lỏng – lỏng

• Phương pháp chiết tĩnh

Phương pháp chiết này đơn giản, không cần máy móc phức tạp, mà chỉ cần một số phễu chiết (dung tích 100, 250, 500 mL), là có thể tiến hành được ở mọi phòng thí nghiệm Việc lắc chiết có thể thực hiện bằng tay, hay bằng máy lắc nhỏ Tất nhiên khi phải làm hàng loạt mẫu thì mất nhiều thời gian Hiện nay người ta đó cung cấp các hệ chiết đơn giản có 6, 9 hay 12 phễu với máy lắc nhỏ, nên việc thực hiện chiết cũng dễ dàng và dễ đồng nhất điều kiện

• Phương pháp chiết dòng chảy liên tục

Trong phương pháp chiết này, khi thực hiện chiết, hai pha lỏng không trộn được vào nhau (hai dung môi, có một dung môi có chứa chất phân tích) được bơm liên tục và đi ngược chiều nhau với tốc độ nhất định trong hệ chiết, như phễu chiết, hay bình chiết liên hoàn đúng kín để chúng tiếp xúc với nhau Hoặc cũng có thể chỉ một dung môi chuyển động, cần một pha đứng yờn trong bình Khi đó, chất phân tích sẽ được phân bố vào hai dung môi theo tính chất của chúng, để đạt đến trạng thái cõn bằng Chiết theo cách này hiệu suất cao Đây là phương pháp chiết được ứng dụng trong chiết sản xuất công nghệ Để thực hiện cách chiết này, phải có hệ

thống máy chiết, cột chiết hay bình chiết, có bơm để bơm các chất theo dòng chảy ngược chiều nhau với tốc độ nhất định thích hợp, hoặc chỉ một chất, hay cả 2 chất chuyển động ngược chiều nhau, và phải có bộ tách pha, để tách các chất ngay trong quá trình chiết, để lấy chất được chiết ra liên tục, hay theo từng thời điểm (chu kỳ) nhất định, mà cân bằng chiết đạt được

c Ưu, nhược điểm và phạm vi ứng dụng

Phương pháp chiết tĩnh đơn giản, dễ thực hiện, đó và đang được ứng dụng phổ biến và rất có hiệu quả trong lĩnh vực tách chiết phân tích và làm giàu các chất phân tích phục vụ cho việc xác định hàm lượng vết Nhất là tách và làm giàu các kim loại, các chất hữu cơ, HCBVTV độc hại trong các mẫu nước, nước thải, nước biển,

- Các ưu và nhược điểm chung của kỹ thuật chiết là:

+ Dùng được cho cả chiết phân tích và sản xuất tách chiết lượng lớn,

+ Thích hợp cho làm giàu lượng nhỏ chất phân tích (có thể 10-50 lần)

+ Phục vụ cho chiết được cả các chất vô cơ và các chất hữu cơ

+ Sản phẩm chiết phù hợp được cho nhiều phương pháp phân tích

– Nguyên lý cơ bản của sự tách bằng sắc ký khí là sự phân bố chất thử thành hai pha Một pha gọi là pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc rộng và pha kia gọi là pha động

là chất khí di chuyển đi qua pha tĩnh

– Chất thử có thể là chất khí lỏng hoặc rắn được chuyển thành thể bay hơi nhờ một luồng khí trơ làm chất tải, dẫn đi qua pha tĩnh Nếu pha tĩnh là một chất rắn thì

gọi là sắc ký khí – rắn Chất rắn được dùng là những chất có tính hấp phụ như silicagel, than hoạt tính, oxy nhôm, rây phân tử

– Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì gọi là sắc ký khí – lỏng Chất lỏng được phân tán mỏng như một lớp phim trên bề mặt một chất rắn trơ gọi là nền Khi chất thử được khí tải dẫn đi ngang qua lớp chất lỏng, chúng bị tách riêng ra tùy theo hệ số phân bố của mỗi thành phần trong hỗn hợp chất thử với những điều kiện nhiệt độ khác nhau

– Phạm vi nhiệt độ được sử dụng trong sắc ký khí rất rộng, có thể đến 4000C, nhờ vậy làm tăng ưu thế của phương pháp sắc ký khí trong việc tách các thành phần

ra khỏi hỗn hợp của chúng

Cấu tạo

Mẫu được bơm vào trong và theo dòng khí mang (khí mang thường là N2) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh) Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài được ghi nhận bởi đầu

dò Từ các tín hiệu nhận được máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký

đồ Các chất được xác định nhờ giá trị thời gian lưu trên sắc ký đồ

Hệ thống sắc ký khí bao gồm các thành phần cơ bản như sau:

- Nguồn cung cấp khí mang: Có thể sử dụng bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí (thiết bị tách khí N2 từ không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất,…)

- Lò cột: dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích

- Bộ phận tiêm mẫu: Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đổi Khi đưa mẫu vào cột, có thể sử dụng chế độ chia dòng (split) và không chia dòng (splitless) Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (Autosamper – có hoặc không có bộ phận hóa hơi - headspace)

- Cột phân tích: Có 2 loại cột là cột nhồi và cột mao quản

+ Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi vào trong cột, cột có đường kính 2-4mm và chiều dài 2-3m

+ Cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặt trong (bề dày 0.2-0.5µm), cột có đường kính trong 0.1-0.5mm và chiều dài 30-100m

– Đầu dò:

Đầu dò dùng phát hiện tín hiệu để định tính và định lượng các chất cần phân tích Có nhiều loại đầu dò khác nhau tùy theo mục đích phân tích như đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID-Flame Ioniation Detetor), đầu dò dẫn nhiệt (TCD-Thermal Conductivity Detector), đầu dò cộng kết điện tử (ECD-Electron Capture Detector), đầu dò quang hóa ngọn lửa (FPD-Flame Photometric Detector), đầu dò NPD (NPD-Nitrogen Phospho Detector), đầu dò khối phổ (MS-Mass Spectrometry)

– Bộ phận ghi nhận tín hiệu: Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện

– In dữ liệu: Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển

Ưu, nhược điểm của phương pháp sắc ký khí

- Ưu điểm

+ Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất

+ Không cần làm bay hơi mẫu

+ Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột

+ Độ nhạy cao nhờ đầu dò

của máy khối phổ kế Tùy theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà người

ta phân biệt máy khối phổ ion dương hay âm Loại máy khối phổ làm việc với ion dương cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn

+ Người ta có thể dùng phương pháp khối phổ để nghiên cứu tất cả các nguyên tố hay hợp chất có thể biến thành dạng khí hay hơi

+ Với hợp chất vô cơ, phương pháp phân tích khối phổ thường được dùng để nghiên cứu thành phần đồng vị hoặc để xác định vết các chất nghiên cứu

+ Đối với hợp chất hữu cơ, phương pháp phân tích khối phổ thường được dùng trong quá trình đồng nhất chất hoặc phân tích cấu trúc

- Nguyên lý

+ Máy khối phổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lượng rất bé chất thử (từ microgam đến miligam), phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dương

+ Các mảnh ion này nhờ bộ phận phát hiện và ghi thành pic với cường độ khác nhau tương ứng với lượng khối của mỗi ion

+ Có nhiều loại máy khối phổ với mức độ phân giải (resolution) khác nhau + Máy có độ phân giải cao là máy có khả năng tách được hai mảnh ion có khối lượng chỉ chênh nhau phần trăm đơn vị khối (m/e)

+ Loại máy có độ phân giải trên 10.000 là loại máy khối phổ trình độ phân giải cao Loại máy có mức phân giải thấp nhất cũng có thể tách được các ion chênh nhau một đơn vị khối đối với các ion có số khối dưới 500m/e

- Ứng dụng

+ Xác định các hợp chất chưa biết bằng cách dựa vào khối lượng của phân tử hợp chất hay từng phần tách riêng của nó

+ Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất

+ Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần riêng của nó

c Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS Gas Chromatography Mass Spectometry)

là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp

Thiết bị GC – MS được cấu tạo thành hai phần: Phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối Bằng sự kết hợp hai kĩ thuật này, các nhà hóa học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng, có cách giải quyết đối với một số hóa chất

Ngày nay, người ta ứng dụng kĩ thuật GC – MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm,

Nguyên tắc hoạt động

Tương tự như các hệ thống sắc ký khí khác, hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ cũng bao gồm các bộ phận: nguồn cung cấp khí, lò cột, bộ phận tiêm mẫu, cột phân tích, đầu dò, bộ phận ghi nhận tín hiệu và bộ phận in dữ liệu phân tích Trong đó đầu dò là đầu dò khối phổ

Các cấu tử của mẫu sau khi tách ra khỏi cột mao quản sẽ đi vào trong đầu dò khối phổ Tại đây, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, sẽ diễn ra quá trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau, sau đó các ion được ghi nhận bởi đầu

dò

– Ưu điểm:

+ Chỉ cần một lượng mẫu nhỏ

+ Có khả năng tách tốt các cấu tử ra khỏi hỗn phức tạp

+ Kết quả thu nhận được một cách nhanh chóng (từ 1 đến 100 phút)

+ Độ chính xác cao

+ Độ nhạy cao, có khả năng phát hiện các cấu tử có nồng độ thấp

+ Trang thiết bị không quá phức tạp

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ

2.1.2 Hóa chất

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất

STT Tên hóa chất Độ tinh khiết Tiêu chuẩn Nguồn gốc

3 Dichloromethane Tinh khiết TCCS Trung Quốc

2.1.3 Dụng cụ

- Bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong

- Muỗng, phễu lọc, phễu chiết, chén nung

- Máy cô quay chân không

2.2 NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm