ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH DANH VI TẢO THUỘC HỌ SCENEDESMACEAE TẠI MỘT SỐ THỦY VỰC NƯỚC NGỌT THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG 10600764

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH DANH VI TẢO THUỘC HỌ SCENEDESMACEAE TẠI MỘT SỐ THỦY VỰ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH DANH

VI TẢO THUỘC HỌ SCENEDESMACEAE TẠI MỘT SỐ

THỦY VỰC NƯỚC NGỌT THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

CHU NHẬT HÀ

Đà Nẵng, năm 2020

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH MÔI TRƯỜNG



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH DANH

VI TẢO THUỘC HỌ SCENEDESMACEAE TẠI MỘT SỐ

THỦY VỰC NƯỚC NGỌT THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Ngành: Công nghệ sinh học Khóa: 2016-2020

Sinh viên: Chu Nhật Hà Người hướng dẫn: TS Nguyễn Minh Lý

Đà Nẵng, năm 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đề tài “Ứng dụng sinh học phân tử trong định danh vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae tại các thủy vực nước ngọt thành phố Đà Nẵng” là kết quả công trình

nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, hình ảnh, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Các số liệu liên quan được trích dẫn có ghi

chú nguồn gốc rõ ràng

Tên sinh viên

LỜI CÁM ƠN

Trong thời gian được học tập tại Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, tôi

đã được trang bị rất nhiều kiến thức từ cơ bản đến chuyên ngành công nghệ sinh học Từ việc tiếp thu kiến thức ở lớp đến việc thực hành, áp dụng kiến thức vào thực tế để tôi khắc sâu kiến thức cho bản thân và có thêm nhiều kinh nghiệm thực tiễn Những chuyến

đi thực tập đã đem lại cho tôi những nhận thức và đam mê hơn với ngành và nghề của

mình sau này

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Minh Lý và

TS Trịnh Đăng Mậu, giảng viên Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng, thầy đã trực tiếp hướng dẫn một cách tận tình, chỉ bảo tôi trong suốt

thời gian tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện bài báo cáo khóa luận này

Tôi vô cùng cảm ơn sâu sắc tới tất cả thầy giáo, cô giáo, cán bộ của Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng đã tạo điều kiện thuận lợi và

giúp đỡ tôi trong các nghiên cứu

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè, những người đã luôn giúp đỡ, ủng hộ động viên tôi trong suốt thời gian theo học tại trường nói

chung và thời gian thực hiện nghiên cứu nói riêng

Tôi xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CÁM ƠN ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

TÓM TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

4 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm hình thái, sinh học của vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae 3

1.1.1 Hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học 3

1.1.2 Một số ứng dụng của vi tảo Scenedesmaceae 3

1.2 Ứng dụng DNA mã vạch trong định danh vi tảo 4

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6

2.1 Đối tượng nghiên cứu 6

2.2 Phạm vi nghiên cứu 6

2.3 Phương pháp nghiên cứu 6

2.3.1 Phương pháp thu mẫu ngoài thực địa 6

2.3.2 Phương pháp phân lập vi tảo 6

2.3.3 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái 7

2.3.4 Phương pháp tách chiết DNA, khuếch đại PCR 7

2.3.5 Phương pháp hiệu chỉnh trình tự 8

2.3.6 Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại 8

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 10

3.1 Phân lập vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae 10

3.2 Đánh giá hiệu quả của các đoạn mồi ITS, rbcL, tufA 12

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ vi tảo họ Scenedesmaceae 12

3.2.2 Khả năng khuếch đại các vùng trình tự gen ITS, rbcL, tufA 12

a Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S1 (Bảng 3.2) 14

b Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S2 (Bảng 3.3) 16

c Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S3 (Bảng 3.4) 17

d Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S4 (Bảng 3.5) 19

e Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S5 (Bảng 3.6) 19

f Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S6 (Bảng 3.7) 20

3.3 Thiết lập cây phát sinh chủng loại 21

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

GMYC Generalized mixed Yule-coalescent

rbcL Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase

DANH MỤC BẢNG

2.2 Thông tin các đoạn mồi được sử dụng cho nghiên cứu 8 3.1 Bảng tóm tắt danh mục các loài được phân lập 10

3.2 Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của

3.3 Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của

3.4 Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của

3.5 Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của

3.6 Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của

3.7

Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của

23

3.4

Cây phát sinh chủng loại thể hiện mối quan hệ di truyền của các dòng vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae khuếch đại ở vùng gen tufA – 2

24

3.5

Cây phát sinh chủng loại thể hiện mối quan hệ di truyền của các dòng vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae khuếch đại ở vùng gen rbcL – 1

25

3.6

Cây phát sinh chủng loại thể hiện mối quan hệ di truyền của các dòng vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae khuếch đại ở vùng gen ITS

26

3.7

Cây phát sinh chủng loại thể hiện mối quan hệ di truyền của các dòng vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae khuếch đại ở vùng gen rbcL – 2

27

TÓM TẮT

Một số chi trong họ Scenedesmaceae là những loài vi tảo nước ngọt phổ biến được tìm thấy trên khắp thế giới, là nguồn vật liệu lý tưởng cho sản xuất nhiên liệu sinh học nhờ lượng lipid đáng kể trong tế bào Tuy nhiên, sự đa dạng về hình thái thực tế của nó gây nhiều tranh cãi do tính dẻo hình thái trong chi Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu

về sinh học phân tử cho vi tảo họ Scenedesmaceae, tuy nhiên lĩnh vực này vẫn còn khá mới ở Việt Nam Do vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phân lập và đánh giá hiệu quả các đoạn mồi phổ quát tufA – 1, tufA – 2, rbcL – 1, ITS, rbcL – 2 đối với vi tảo họ Scenedesmaceae và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài Kết quả định danh bằng cách sử dụng kết hợp các đặc tính hình thái và sinh học phân tử ghi nhận 6 loài,

thuộc 4 chi trong họ Scenedesmaceae, gồm có: Desmodesmus subspicatus, Acutodesmus

reginae, Tetradesmus bernardii, Desmodesmus sp., Pectinodesmus pectinatus, Tetradesmus obliquus Kết quả cho thấy các cặp mồi này đều khuếch đại thành công các

loài thuộc họ Scenedesmaceae, đồng thời vùng gen ITS được chứng minh là DNA mã

vạch lí tưởng đối với loài A reginae, P pectinatus và vùng gen tufA – 1 đối với loài A

reginae với mức độ tin cậy hơn 99% Kết quả khác, cho thấy các vùng gen tufA – 1, tufA

– 2 khuếch đại vùng trình tự chưa được công bố đối với loài T bernardii và tufA – 2 cho loài P.pectinatus trên GenBank Tìm được mối quan hệ của loài Scenedesmus obliquus đã được chuyển thành Tetradesmus obliquus nhờ sinh học phân tử

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Vi tảo là một trong những nhóm sinh vật hiện diện đầu tiên trên trái đất, có vai trò quan trọng trong sinh giới như đóng góp năng suất sơ cấp cho chuỗi thức ăn, tiêu thụ khí

CO2 và sản xuất ra O2 thông qua quá trình quang hợp, có ý nghĩa lớn về kinh tế cho con người (nguồn dinh dưỡng, các hợp chất thứ cấp, sinh khối cho nhiên liệu sinh học) và là đối tượng cho những nghiên cứu khoa học trên thế giới (Nguyễn Văn Tuyên, 2003) Ngoài ra, có rất nhiều mối quan tâm và nghiên cứu trong việc sử dụng vi tảo cho các ứng dụng như sản xuất nhiên liệu, thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (Nascimento và cs, 2013; Subhadra và Grinson-George, 2011)

Những loài thuộc họ Scenedesmaceae phổ biến ở vùng nước ngọt và nước lợ, đặc biệt là trong điều kiện giàu dinh dưỡng Chúng là một nhóm tảo xanh khá quan trọng về mặt sinh thái vì chúng có thể tạo thành một phần chính của sinh khối tảo xanh trong

nhóm thực vật phù du Nhiều loài Scenedesmus sp dễ dàng phát triển trong môi trường

nuôi cấy nhân tạo, do đó thường được sử dụng trong các nghiên cứu sinh hóa và sinh lý thực vật Dựa trên cơ sở dữ liệu trên Algaebase.org nhóm tảo lục, về mặt phân loại vô cùng đa dạng với khoảng 6758 loài, có 895 loài thuộc bộ Sphaerophleales, 340 loài thuộc

họ Scenedesmaceae với 130 loài thuộc chi Scenedesmus, 65 loài ở chi Desmodesmus, 15 loài của chi Tetradesmus và 4 loài thuộc chi Pectinodesmus đã được mô tả tính đến thời

điểm năm 2020 Nhóm tảo lục là một nhà máy quan trọng trong hệ sinh thái trên cạn và trong nước, thường được sử dụng như chỉ thị sinh học trong quan trắc nước và nghiên cứu sinh thái (Amengual-Morro và cs, 2012; Torres và cs, 2008)

Việc xác định vi tảo có thể là một nhiệm vụ khó khăn và phải yêu cầu kiểm tra chúng dưới kính hiển vi với độ phóng đại lớn bởi sự cẩn thận của chuyên gia phân loại (Bock và cs, 2011; De Clerck và cs, 2013) Tảo lục được nhận diện nhờ quan sát dưới kính hiển vi qua các hình dạng chung của các tế bào sinh dưỡng, như vị trí của lục lạp hay hạt tạo tinh bột và đặc điểm khác như khả năng chuyển động của tế bào

Trên thế giới việc sử dụng các chỉ thị DNA đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phân loại đa dạng sinh học, xác định được khoảng cách di truyền và đặc trưng

cá thể nhằm mục đích bảo tồn và chọn giống Ưu việc hơn so với các chỉ thị truyền thống

về hình thái và sinh học, phương pháp mã vạch – DNA barcode đã được ứng dụng và mang lại những ưu điểm như tính ổn định, chính xác, nhanh chóng (Hebert và cs, 2003) DNA mã vạch đã được nghiên cứu trong định danh các loài thực vật trên cạn (Kelly và

cs, 2010); và số lượng lớn các nhóm tảo lục Sự phát triển của DNA barcodes đối với tảo lục sẽ giúp nhận dạng chính xác và nhanh chóng, bởi vì điều này đặc biệt quan trọng đối với những loài tảo lục có đặc điểm cấu trúc không rõ ràng và khó để quan sát (Hall và cs, 2010)

Hiện nay, việc ứng dụng DNA mã vạch vào các loài vi tảo thuộc họ

Scenedesmaceae vẫn chưa được hoàn thiện Sự đa dạng về hình thái và định danh chính

xác, hiệu quả là một trong những vấn đề cần được giải quyết trong lúc này Chính vì vậy,

nên tôi đề xuất được thực hiện đề tài: “Ứng dụng sinh học phân tử trong định danh vi

tảo thuộc họ Scenedesmaceae tại một số thủy vực nước ngọt thành phố Đà Nẵng”

1 Mục tiêu đề tài

Định danh các loài vi tảo bằng kỹ thuật sinh học phân tử và đánh giá được mối quan

hệ di truyền của các loài thuộc họ Scenedesmaceae

3 Ý nghĩa của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học và phương pháp định danh

các loài vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae bằng DNA mã vạch hiệu quả tại thành phố Đà

Nẵng

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này là cơ sở giúp đánh giá được mối quan hệ của các loài nhờ chỉ thị sinh học phân tử DNA mã vạch Cung cấp công cụ phân tích hiệu quả để định danh các loài vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae

4 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Phân lập và làm thuần các loài vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae tại thành phố Đà Nẵng

Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả của các đoạn mồi ITS, rbcL, tufA trong định danh bằng sinh học phân tử đối với các loài vi tảo họ Scenedesmaceae

 Nội dung 3: Đánh giá tính đa dạng di truyền về mặt hình thái và đặc trưng của các loài vi tảo họ Scenedesmaceae

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm hình thái, sinh học của vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae

1.1.1 Hình thái cấu tạo, đặc điểm sinh học

Về phân loại khoa học, vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae

Giới (Domain): Plantae (Thực vật)

Pectinodesmus được đặc trưng bởi các đường dọc được tạo ra bởi thành tế bào cellulose

bên trong (Eberhard Hegewald và cs, 2010; Johnson và cs, 2007)

Đặc điểm nhận dạng chung của họ Scenedesmaceae: Là tảo tập đoàn, tập đoàn gồm 2- 32 tế bào Các tế bào gắn với nhau ở sườn, sắp xếp trên 1 hàng hoặc so le Tế bào hình cầu, hình thoi, hình elip, hình trứng Đầu tế bào đôi khi hơi thắt nhọn và uốn cong vào phía trong Thành tế bào có lớp hemicellulosic và sporopolleninic, thường nhẵn, trơn Các tế bào có gai hoặc không, chứa lục lạp đơn và một hạt tạo tinh bột Sinh sản vô tính bằng bào tử gốc, tảo tập đoàn tách thành các tế bào rời rạc, và giải phóng bào tử tạo ra các thế hệ con

1.1.2 Một số ứng dụng của vi tảo Scenedesmaceae

Việc loại bỏ catmi và đồng ra khỏi nước thông qua quá trình hấp thụ sinh học bằng

cách sử dụng Scenedesmus abundans với nồng độ tảo đủ cao có thể loại bỏ được những

kim loại này trong nước bị nhiễm (Terry và Stone, 2002)

Scenedesmus đã được tìm thấy có khả năng tích lũy carotenoid thứ cấp cùng với sự

tăng trưởng nhanh chóng (Qin và cs, 2008) đem lại cho con người nhiều lợi ích như chống oxy hóa, kích thích tế bào miễn dịch, phối hợp với các chất chống oxi hoá khác như vitamin C và E để giảm các nguy cơ nhiễm trùng, làm chậm quá trình lão hoá, giảm

tác hại của ánh sáng mặt trời, cũng như giảm nguy cơ một số bệnh về tim mạch và ngừa

một số bệnh ung thư (Landrum, 2009)

Scenedesmus obliquus là một trong loài vi tảo đầy tiềm năng cho sản xuất biodiesel

thay thế cho các nhiên liệu đang dần cạn kiệt như dầu mỏ, than đá Với lượng lipid đạt 43% trọng lượng khô, hàm lượng lipid sẽ đạt cao hơn nếu tối ưu hóa các khâu nuôi cấy

và quy trình tách chiết (Mandal và Mallick, 2009)

Desmodesmus sp có thể loại bỏ nước thải ô nhiễm, chứa một lượng lớn nitơ và phốt

pho, đặc biệt là nồng độ amoni cao, với khả năng loại bỏ 100% NH4 – N (68.691 mg/ L),

TP (4.565 mg/ L) và PO4 – P (4.053 mg/ L) và 75,50% TN (84,236 mg/ L) ở mức 10% nước thải phân hủy kỵ khí, với sản lượng sinh khối cao nhất là 0,412g/ L sau 14 ngày canh tác Các chất thải được loại bỏ hằng ngày theo tỷ lệ TN, NH4 lượng N, TP và PO4 hàng ngày lần lượt là 4,542, 5,284, 0,326 và 0,290 mg/ L /ngày (Ji và c.s., 2014)

Chiết xuất khô của vi tảo nước ngọt Scenedesmus rubescens có thể ngăn chặn các

dấu hiệu lão hóa do tế bào gây ra bởi bức xạ UV Nó tăng cường khả năng sống sót của nguyên bào sợi, giải cứu hàm lượng collagen trong da, ức chế sự hình thành các tế bào cháy nắng và ức chế hoạt động tyrosinase trong việc sản xuất melanin (Campiche và cs, 2018)

1.2 Ứng dụng DNA mã vạch trong định danh vi tảo

Khái niệm mã vạch DNA được Paul Heber, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph, Ontario đưa ra lần đầu tiên vào năm 2003, nhằm giúp nhận diện các mẫu vật (Hebert và

cs, 2003) Bên cạnh đó, công nghệ mã vạch DNA đã được chứng minh là hiệu quả đối với việc xác định loài ở cả thực vật và động vật (Hebert và cs, 2003; Krawczyk và cs, 2014) Một đoạn gen của COI đã được chứng minh là điểm đánh dấu phổ biến để định danh cho động vật, nhờ vào cặp mồi và trình tự (Hebert và cs, 2003) Tuy nhiên, trong thực vật, việc khuếch đại COI thường khó khăn và nó không đủ khác nhau để phân biệt hầu hết các loài Trong khi, “rbcL + matk”, được đề xuất làm mã vạch chính cho thực vật, thì mã vạch tiêu chuẩn cho vi tảo vẫn chưa rõ ràng (Wang và cs, 2011)

Các nghiên cứu DNA đầu tiên cho họ Scenedesmaceae được thực hiện bởi (Paschma và Hegewald, 1986) Mã vạch DNA hiệu quả đối với tảo khá mơ hồ và hiệu quả hơn nếu sử dụng nhiều gen cho mã hóa tảo Những vị trí gen được đề xuất cho DNA

mã vạch cho tảo như rbcL, ITS, tufA (Hall và cs, 2010)

Nghiên cứu nhằm đánh giá tính khả thi của việc sử dụng rbcL và ITS1 – ITS 2 cho

51 loài vi tảo lục được phân lập tại đất nước Brazil Mồi sử dụng phổ biến ITS1 - 5.8S j ITS2 khuếch đại thành công 92% các mẫu, mặt khác, cặp mồi rbcL, đã khuếch đại tới 96% mẫu 35% các chủng có thể được xác định rõ ràng ở cấp loài dựa vào ITS1 và ITS2, ngược lại, chỉ có 6% chủng được phát hiện chính xác nhờ trình từ mồi rbcL Tóm lại, với đoạn gen ITS1 và ITS2 là những chỉ thị hữu ích cho việc định danh các loài vi tảo lục nước ngọt (Hadi và cs, 2016)

Theo (Zou, Fei, Song, và cs, 2016) miêu tả một số phương pháp mã vạch khác nhau dùng để phân biệt các loài đang được cải tiến, nhưng phương pháp nào là tốt nhất vẫn còn

gặp nhiều tranh cãi Chlorella đã được phân tích toàn diện về mã vạch ở các giống như

Chlorella, Chloroidium, Dictyosphaerium và Actinastrum dựa trên các chuỗi rbcL, ITS,

tufA và 16S Trong đó, tufA được chứng minh là mã vạch đem lại hiệu quả nhất đối với

giống Chlorella trong việc phân biệt mối quan hệ phát sinh loài

Theo (Zou, Fei, Wang, và cs, 2016) đã đánh giá sự đa dạng Scenedesmus thông qua

các mã vạch dựa trên ký tự đã được chứng minh là cách tiếp cận hiệu quả nhất để phân biệt loài trong cả dữ liệu đơn và dữ liệu kết hợp tạo ra nhận dạng loài nhất quán nhờ vào các vùng gen rbcL, tufA, ITS, 18S Tất cả các kết quả thu được đã phục hồi 11 loài, năm trong số đó là những loài tiềm năng

Tại Việt Nam, vẫn chưa có những bài nghiên cứu được công bố về DNA mã vạch đối với loài vi tảo, đặc biệt là những chủng vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các loài vi tảo họ Scenedesmaceae được thu tại một số thủy vực nước ngọt thành phố Đà Nẵng

2.2 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học tế bào và công nghệ sinh học tảo, Khoa sinh- môi trường, Trường đại học sư phạm – Đại học Đà Nẵng

Thời gian thực hiện: 6 tháng (12/2019 – 06/2020)

Bảng 2.1 Vị trí lấy mẫu tại Đà Nẵng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu mẫu ngoài thực địa

Mẫu vi tảo được thu bằng lưới thu mẫu thực vật phù du.Tại mỗi điểm thu mẫu kéo lưới theo hình số tám hay zic zắc Kéo lưới khoảng vài lượt, nhấc lưới lên, mở khóa ống đáy đổ mẫu vào lọ 50ml Thời gian phù hợp để thu mẫu là từ 7 – 9 giờ sáng Khoảng thời gian này nhiệt độ ổn định, các tế bào đang ổn định thích hợp cho việc thu mẫu Mẫu tảo phục vụ cho phân lập nên không sử dụng hóa chất trong quá trình thu mẫu Luôn tạo điều kiện cho sự trao đổi khí của mẫu tránh tổn hại mẫu

2.3.2 Phương pháp phân lập vi tảo

Dựa theo phương pháp phân lập của Singh và cs (2015) để tách rời các tế bào VSV, nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để tạo khuẩn lạc riêng lẻ, cách biệt nhau

nhỏ lên lame, quan sát dưới kính hiển vi, dùng pipette hút tế bào tảo mong muốn cấy lên môi trường Agar Lập lại thao tác nhiều lần để được giống thuần

môi trường dinh dưỡng BG11 ( Phụ lục 1) đã vô trùng Dùng que cấy trải phân tán các tế bào tảo ra Sau 2-3 tuần, quan sát tảo và chọn tảo từ khuẩn lạc riêng lẻ đem cấy lại vào đĩa agar dinh dưỡng mới và lặp lại tiến trình như vậy để được giống thuần

Nhân sinh khối giống từ cấp 1, cấp 2, cấp 3 trong các ống nghiệm 10ml, 50ml, 250ml tương ứng chu kỳ qua với môi trường BG11 Tạo nhiệt độ thích hợp 250C, cường

độ chiếu sáng 1700 lux, chu kì quang 16:8 Các mẫu sau khi được làm giàu tiến hành giữ giống trên đĩa thạch BG11

2.3.3 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái

Các tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học sẽ được chụp lại, mô tả, và so sánh hình thái dựa vào các tài liệu phân loại vi tảo của các tác giả (Bellinger và cs Sigee, 2015; Nguyễn Văn Tuyên, 2003; Wehr và cs, 2015) và dựa trên cơ sử dữ liệu Algaebase.org

2.3.4 Phương pháp tách chiết DNA, khuếch đại PCR

Trong nghiên cứu chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số từ các mẫu vi tảo

được phân lập dựa theo phương pháp Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) (Phillips và cs, 2001) với một số thay đổi:

lần để phá vỡ tế bào hiệu quả hơn

lạnh ở nhiệt độ 5oC trong 30 phút để thu được lượng kết tủa tối đa

Các đoạn mồi tufA – 1, tufA – 2, rbcL – 1, ITS, rbcL – 2 từ các nghiên cứu trước (Fama và cs, 2002; Henrion và cs, 1992; Zou, Fei, Wang, và cs, 2016) được sử dụng cho khuếch đại DNA bằng phản ứng trùng hợp Polymerase Chain Reaction (PCR) được miêu

tả ở (Bảng 2.2) Tổng 20μL cho thực hiện phản ứng PCR (Aeris Thermal Cycler ESCO, Singapore) bao gồm 10μL Mastermix; 2μL mồi xuôi và 2μL mồi ngược với nồng độ cuối

1μM; 2μL DNA nồng độ 50ng; 4μL nước (nước không có DNAse) Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR được miêu tả: giai đoạn khởi đầu ở 94oC trong 3 phút; nhân trong 35 chu

kỳ gồm giai đoạn biến tính tại 94o

C trong 30s, giai đoạn gắn mồi tại 47 – 55 oC trong 45s, giai đoạn kéo dài chuỗi tại 72 oC trong 45s; giai đoạn kết thúc kéo dài chuỗi ở 72 oC trong

5 phút; giai đoạn bảo quản sản phẩm tại 4oC

Bảng 2.2 Thông tin các đoạn mồi được sử dụng cho nghiên cứu

Kí hiệu Tên mồi Trình tự mồi theo chiều 5’ – 3’ Nhiệt độ gắn mồi

2.3.6 Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại

Các cây phát sinh chủng được thiết lập và phân tích để biết mối quan hệ giữa các loài và giả định tổ tiên chung của chúng được ước tính nhờ phương pháp Bootstrap Với

số lần sao chép bootstrap 2000 lần được kiểm tra để tăng mức độ tin cậy của cây phả hệ Khi phân tích hoàn tất, cây sẽ xuất hiện các số trên mỗi nút Những con số đó là tỷ lệ phần trăm bootstrap, cho thấy độ tin cậy của cụm (100%), các nút có mức độ tin cậy lớn hơn 70% được đánh giá tốt Thử nghiệm bootstrap không ước tính độ tin cậy tổng thể của

cây, thay vào đó nó ước tính độ tin cậy của từng nút Điều đó thực sự có lợi vì nó cho biết phần nào của cây nên tin tưởng và phần nào nên xem xét lại Cây phát sinh gen bao gồm các nút ngoài cùng đại diện cho chuỗi tồn tại hiện nay, các nút bên trong cùng ở gốc là tổ tiên chung mà từ đó tất cả các chuôi được hạ xuống (Hall, 2013) Chương trình ClustalX: Bootstrap Neighbors – joining tree được xử dụng, loại Nucleotit thay thế, phương thức p – distance

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập vi tảo thuộc họ Scenedesmaceae

Kết quả phân lập thu được tại các địa điểm ở thành phố Đà Nẵng, nghiên cứu ghi

nhận 6 loài khác nhau thuộc họ Scenedesmaceae Các chủng vi tảo được kí hiệu là S1,

Bảng 3.1 Bảng tóm tắt danh mục các loài được phân lập

Kí hiệu

loài

S1 Tập đoàn không bắt buộc bao gồm 2, 4 TB xếp tuyến

tính TB có hình dạng trứng hoặc elip TB nằm ngoài

có gai dài ở hai đầu và gai ngắn ở mặt ngoài Chiều

dài tế bào 4 ± 0,5μm, chiều rộng TB 2 ± 0,2μm

S2 Các TB xếp theo dạng không gian gồm 2, 4, 6 TB có

hình vòng cung, không có răng và gai với chiều dài

TB khoảng 15 – 17μm, và bề ngang TB 3 – 5μm

S3 Tập đoàn gồm 8 TB,các TB dính với nhau ở

sườn,theo hình zíc zắc, đầu TB hơi thắt nhọn, kích

thước chiều dài 23,7 ± 0,8μm, bề ngang 5,2 ± 0,7 μm

S4 Tập đoàn gồm 2, 4, 6, 8 TB, dính với nhau ở sườn,

với chiều dài 13 ± 0,5μm, và bề ngang 6 ± 1 μm

S5 Tập đoàn gồm 4 TB, các TB dính với nhau ở sườn,

TB hình elip hẹp, đầu TB hơi thắt nhọn, tập đoàn hẹp

TB bên trong thẳng, TB bên ngoài hình vòng cung,

thành TB nhẵn , không có răng và gai, TB với kích

thước chiều dài 13 ± 1,02μm và chiều ngang 5,1 ±

0,6μm

S6 Cộng đơn bào gồm 2 – 4 – 8 TB Các TB gắn với

nhau ở phần giữa TB, sắp xếp trên 1 hàng TB hình

thoi, đầu thắt nhọn, đôi khi TB hơi uốn cong vào phía

trong Thành TB nhẵn, thể màu nằm ở ngoại vi, có 1

hạt tạo bột, kích thước TB với chiều dài 14 ± 0,5 và

chiều rộng 4 ± 1,05µm

3.2 Đánh giá hiệu quả của các đoạn mồi ITS, rbcL, tufA

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ vi tảo họ Scenedesmaceae

Chúng tôi đã tiến hành thực hiện tách chiết DNA tổng số từ 6 mẫu vi tảo họ

Scenedesmaceae khác nhau, được đánh dấu S1, S2, S3, S4, S5, S6 Kết quả ở Hình 3.1

cho thấy sản phẩm DNA tổng số sau khi tách chiết bởi phương pháp CTAB thể hiện được

các vạch DNA ở 6 mẫu vi tảo họ Scenedesmaceae, đảm bảo được chất lượng cho các

bước nghiên cứu tiếp theo Bên cạnh đó, có những giếng với những vạch màu sáng kéo dài, đã thu được lượng DNA nhưng vẫn lẫn nhiều tạp chất khiến vạch bị nhòe Ngoài ra

có một số mẫu màu khá tối, bởi lượng DNA thu được ít, khiến cho vạch không sáng rõ, còn mờ, lẫn nhiều tạp chất như protein hay RNA

Hình 3.1 Điện di DNA tổng số từ 6 mẫu vi tảo họ Scenedesmaceae khác nhau

3.2.2 Khả năng khuếch đại các vùng trình tự gen ITS, rbcL, tufA

Để phân tích định danh 6 mẫu vi tảo họ Scenedesmaceae, chúng tôi đã sử dụng các cặp mồi ở các vùng trình tự tufA – 1, tufA – 2, rbcL – 1, ITS, rbcL – 2 (Bảng 2.2.) Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, cả 5 đoạn mồi được sử dụng đều xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản với chiều dài lần lượt là khoảng 800bp, 1000bp, 900 bp, 600

bp, 700 bp Kết quả ở Hình 3.2 cho thấy sản phẩm khuếch đại của các vùng gen tufA –1, tufA – 2, rbcL – 1, ITS, rbcL – 2 tương ứng với các kí hiệu A, B, C, D, E

Hình 3.2 Sản phẩm khuếch đại PCR sử dụng 5 cặp mồi khác nhau

Lane M: Ladder, 2kb; Lane 1, S1; lane 2, S2; lane 3, S3; lane 4, S4; lane 5, S5; lane 6, S6

E

a Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S1 (Bảng 3.2)

Sau khi có kết quả trình tự gen tufA – 1, tufA – 2, rbcL – 1, ITS, rbcL – 2 đối với mẫu S1, chúng tôi đã tiến hành truy cập GenBank trên NCBI để so sánh trình tự tương đồng của họ Scenedesmaceae với các chủng tham khảo Kết quả BLAST cho thấy sự hiện diện thành công đến việc định danh cấp họ Scenedesmaceae sp của vùng khuếch đại tufA – 1 và tufA – 2 nhưng chưa xác định được chính xác tên cấp độ chi, loài

Bên cạnh đó, vùng gen ITS có mức độ tương đồng 99,03% hệ gen thuộc chi

Pectinodesmus sp Tuy nhiên, về mặt hình thái nhận định ban đầu hoàn toàn không

tương ứng Bởi vì, vùng gen ITS khá giống nhau về khả năng bắt cặp, dẫn đến khuếch đại

với sự tương đồng cao ở chi Pectinodesmus sp Do vậy, sử dụng ITS trong việc định danh

vi tảo S1 hoàn toàn không phù hợp Tuy nhiên theo An và cs (1999) cho rằng việc sử

dụng đoạn mồi ITS – 2 rất phù hợp để giải quyết mối quan hệ của hai chi Scenedesmus

và Desmodesmus khi so sánh về sự khác biệt đáng kể ở chiều dài của vùng ITS – 2 Tuy nhiên, vùng gen rbcL – 2 có mức độ tương đồng đạt 93,52% ở hệ gen loài D

subspicatus trùng với miêu tả về hình thái như miêu tả trên cơ sở dữ liệu và tài liệu tham

khảo trên Algaebase.org Cho thấy rằng, vùng gen rbcL – 2 là vùng gen có thể phân biệt

được loài D Subspicatus

Bảng 3.2 Kết quả so sánh trình tự tương đồng trên BLAST của vùng gen mẫu S1

Vùng gen Kết quả định danh So sánh mức độ tương đồng trên

b Kết quả phân tích trình tự các vùng gen mẫu S2 (Bảng 3.3)

Kết quả BLAST cho thấy vùng gen ITS vô cùng hiệu quả đối với loài A reginae

với mức độ tương đồng chiếm tới 99,68% trong hệ gen và trùng với đặc điểm nhận dạng

về mặt hình thái được miêu tả Bên cạnh đó, ở vùng gen tufA – 1, tufA – 2 và rbcL – 2

khuếch đại với mức độ tương đồng hơn 96,5% ở loài A reginae Theo (Holtmann, 1994), hai loài này được nhận định chung với tên Scenedesmus wisconsinensis var reginae Bởi

vì hai loài này chỉ có những thay đổi nhỏ trong bộ gen và sự khác biệt di truyền như sự khác nhau về số lượng và đường kính TB nhưng vẫn thuộc chung một loài Tuy nhiên, theo mô tả Tsarenko và cs (2005) hai loài này đã được tách riêng thành hai loài riêng với

sự khác nhau ở một dạng bó gồm 4 tế bào ở loài A wisconsinensis và đường kính nhỏ hơn so với hai dạng bó gồm 8 tế bào cho loài A reginae

Bên cạnh đó, vùng gen rbcL – 1 có mức độ tương đồng tới 98,25% trong hệ gen

thuộc chi T dimorphus Tuy nhiên, về mặt hình thái nhận định ban đầu hoàn toàn không

tương ứng với loài được tham khảo (Wynne, 2016) Do vùng gen rbcL – 1 khá giống nhau về khả năng bắt cặp, dẫn đến khuếch đại với sự tương đồng cao Do vậy, sử dụng ITS trong việc định danh vi tảo S1 hoàn toàn không phù hợp

Do vậy, ITS là mật mã tiềm năng để định danh loài A reginae với độ tin cậy hơn

99%