BÀI BÁO CÁO NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT TRONG XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI DẠNG RẮN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA MÔI TRƯỜNG BÀI BÁO CÁO NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT TRONG XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI DẠNG RẮN Nhóm 3 1 Tạ Thị Đoan 4 Nguyễn Thị Diệu Linh 2 Nguyễn Thị Xuân Hồng 5 Lê Thị Duyên 3 Phạm Thu Uyên Cán bộ hướng dẫn PGS TS Nguyễn Thị Hà TS Nguyễn Minh Phương TS Ngô Vân Anh Hà Nội 112020 1 Mục lục Mục lục 1 Lời mở đầu 2 I Giới thiệu chủ đề 3 II Cơ chế và quá trình chuyển hóa 3 1 Cơ chế 3 1 1 VSV phân giải xenluloza 3 1 2 VSV thủy phân tinh bột 5 1.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA MÔI TRƯỜNG

BÀI BÁO CÁO NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT TRONG XỬ LÝ CHẤT THẢI

CHĂN NUÔI DẠNG RẮN

Nhóm 3:

2 Nguyễn Thị Xuân Hồng 5 Lê Thị Duyên

3 Phạm Thu Uyên

Cán bộ hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thị Hà

TS Nguyễn Minh Phương

TS Ngô Vân Anh

Hà Nội 11/2020

Mục lục

Mục lục 1

Lời mở đầu 2

I Giới thiệu chủ đề 3

II Cơ chế và quá trình chuyển hóa .3

1 Cơ chế .3

1.1 VSV phân giải xenluloza. 3

1.2 VSV thủy phân tinh bột. 5

1.3 VSV phân giải protein. 6

2 Quá trình chuyển hóa 7

2.1 Điều kiện nhân sinh khối vi sinh vật .7

2.2 Quy trình sản xuất chế phẩm. 8

III Yếu tố ảnh hưởng. 9

3.1 Ảnh hưởng đến khả năng phân giải xenluloza của chủng xạ khuẩn XK112. 9

3.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ. 9

3.1.2 Ảnh hưởng của pH. 9

3.2 Ảnh hưởng đến khả năng phân giải tinh bột vi khuẩn B20. 9

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ. 9

3.2.2 Ảnh hưởng của pH. 9

3.2.3 Ảnh hưởng của ion kim loại. 10

3.3 Ảnh hưởng đến khả năng phân giải protein của chủng B15. 10

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ. 10

3.3.2 Ảnh hưởng của pH. 11

3.3.3 Ảnh hưởng của ion kim loại. 11

3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng khuẩn của LH19. 12

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ. 12

3.4.2 Ảnh hưởng của pH. 12

3.4.3 Ảnh hưởng của nguồn hydratcacbon. 13

3.4.4 Ảnh hưởng của các muối nito vô cơ. 13

IV Hiệu quả sử dụng chế phẩm chất thải chăn nuôi đối với cây trồng. 13

V Kết luận và kiến nghị. 15

1 Kết luận. 15

2 Kiến nghị. 15

Tài liệu tham khảo 16

Lời mở đầu

Với sự giúp đỡ của các Thầy giáo, Cô giáo cùng các bạn sinh viên trong nhóm 3, sau

một thời gian nghiên cứu và nhóm đã hoàn thành bài báo cáo

Thông qua bài báo cáo, chúng em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo Khoa Môi trường - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ nhóm 4 trong quá trình làm bài báo cáo

Chúng em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Nhóm 3

NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT TRONG XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI

DẠNG RẮN

I Giới thiệu chủ đề

Tổng số dân của Việt Nam năm 2019 khoảng 96,2 người Sau 10 năm, quy mô dân số Việt Nam tăng thêm 10,4 triệu người Tỷ lệ tăng dân số bình quân năm giai đoạn 2009

- 2019 là 1,14%/năm Do đó, nhu cầu về thực phẩm cũng tăng lên nhanh chóng, đồng thời mô hình tiêu thụ thực phẩm cũng đã thay đổi

Chăn nuôi thâm canh chính là cách phản hồi của ngành đối với nhu cầu gia tăng này, đặc biệt là trong sản xuất gia cầm và chăn nuôi lợn Năm 2014 giá trị sản xuất ngành chăn nuôi tăng 4,1% so với năm 2013, mục tiêu mức tăng trưởng giá trị sản xuất giai đoạn 2021-2025 trung bình từ 4-5%/năm Việc ngành chăn nuôi phát triển nhanh chóng, góp phần quan trọng vào sự phát triển chung của ngành nông nghiệp

Tuy nhiên, việc kiểm soát, quản lý và xử lý chất thải chưa được nhiều hộ chăn nuôi chú trọng Đây là một trong các nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường

Đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng VSV khởi động để rút ngắn thời gian phân hủy chất thải hữu cơ Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam chưa có chế phẩm VSV đặc thù cho xử lý chất thải chăn nuôi Một số chế phẩm sử dụng VSV không có lý lịch chủng giống rõ ràng, gây nhiều băn khoăn về tính an toàn đối với sức khỏe người, vật nuôi và môi trường sinh thái Đề tài “Nghiên cứu VSV để xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn” nhằm nghiên cứu các chế phẩm từ các chủng VSV an toàn có khả năng xử lý hiệu quả chất thải chăn nuôi, phân hủy nhanh chất hữu cơ tạo ra phân bón có chất lượng, đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho cây trồng

II Cơ chế và quá trình chuyển hóa

1 Cơ chế

1.1 VSV phân giải xenluloza

1.1.1 Xenluloza

Xenluloza là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật với tỷ lệ khoảng 30-80% tính theo khối lượng khô Xenluloza là một polyme mạch thẳng bao gồm nhiều gốc anhydraglucoza gắn với nhau nhờ liên kết β-1,4 glycozit, chúng liên kết chặt chẽ với các polysacarit khác tạo thành những phức hợp bền vững

Hình 1 Cấu trúc phân tử xenluloza

Xenluloza là hợp chất phức tạp và bền vững không tan trong nước và trong nhiều dung môi hữu cơ, không bị các dung dịch axit và kiềm loãng tác dụng, chỉ bị thủy phân khi đun nóng với axit hoặc kiềm Xenluloza tự nhiên khi thủy phân sẽ cho sản phẩm cuối cùng là D-glucoza

1.1.2 Enzym xenlulaza

Xenlulaza là một phức hệ các enzym hoaatj động cùng nhau để thủy phân xenluloza, tạo ra các loại đường đi qua thành tế bào VSV Phức hệ xenlulaza gồm 3 enzym chủ yếu sau:

- Endo-1,4-glucanaza (Cx): phân hủy liên kết β-1,4-glycozit giải phóng xenlobioza và glucoza

- Exo-1,4-glucanaza (C1): giải phóng xenlobioza hoặc glucoza từ đầu không khử của xenluloza

- Β-1,4-glucozidaza (xenlobioza): thủy phân xenlobioza và các xenlodextrin khác hòa tan trong nước

Tùy thuộc vào loài VSV và điều kiện nuôi cấy, tỷ lệ các enzym thành phần trong phức

hệ xenlulaza và hiệu lực phân giải xenluloza của xenlulaza khác nhau

Xenlulaza có mặt trong nhóm VSV, như ở nhiều loài vi khuẩn, vi nấm và xạ khuẩn có

ít nhất 2 bước trong phân hủy xenluloza do VSV:

- Bước 1 (tiền thủy phân): trong bước này một enzym (C1) sẽ làm trương hoặc hydrat hóa các mạch glucoza khan

- Bước 2: sử dụng các enzym thủy phân (Cx) và xenlobioza

1.1.3 VSV tổng hợp xenlulaza

 Vi khuẩn

Là nhóm VSV được nghiên cứu nhiều nhất Năm 1785, lần đầu tiên Popove đã phát hiện rằng vi khuẩn kỵ khí tham gia vào qua trình lên men xenluloza Năm 1902,Omelianski

đã thuần khiết và mô tả 2 chi vi khuẩn với 2 kiểu lên men xenluloza, chúng là vi khuẩn

ưa ấm Đến nay hàng loạt công trình nghiên cứu cho thấy rất nhiều VSV có khả năng phân giải xenluloza

Trong điều kiện kỵ khí có các loài vi khuẩn phân giải xenluloza như: Clostrodium, Bacteroides succienpgennes,… Trong điều kiện hiếu khí có các loài ưa ấm hoặc ưa nhiệt như: Pseudomonas fluorescens, Cellulomonas fimi, Bacillus subtilis,…

 Xạ khuẩn

Xạ khuẩn phân giải xenluloza được tìm thấy trong tất cả các loại đất, mùn rác và những nơi có chứa xenluloza

Dựa vào đặc điểm nhiệt độ sinh trưởng, người ta chia xạ khuẩn thành 2 dạng:

Xạ khuẩn ưa ấm: sinh trưởng tốt ở 25-370C

Xạ khuẩn ưa nhiệt: sinh trưởng tốt ở 45-700C

Các nhóm xạ khuẩn phan giải xenluloza chính: Streptomyces, Nocardia, Micromonospora,…

 Nấm sợi

Nấm sợi phân giải xenluloza tốt hơn vi khuẩn vì chúng tiết vào môi trường lượng enzym ngoại bào nhiều hơn

Các loại nấm được nghiên cứu nhiều là: Tricoderma reesi, Aspergillus, T viride, Fusarium solanii,…

Nấm sinh trưởng và sản xuất xenluloza mạnh khi ở 20-300C, pH 3,5-6,6 và độ ẩm cao Nấm thường phân hủy xenluloza ở giai đoạn cuối của quá trình ủ, khi nhiệt độ đống ủ

đã giảm xuống

1.2 VSV thủy phân tinh bột

1.2.1 Cấu trúc của tinh bột

Đại phân tử tinh bột được tạo thành từ nhiều lớp đồng tâm: lớp ngoài là amilopectin, lớp trong là amyloza Hai hành phần amyloza và amylopectin có tỷ lệ đặc thù, thay đổi tùy theo từng loại tinh bột, amyloza thường chiếm tyrleej 13-37%, amylopectin chiếm 63-87%

H2 Cấu trúc của tinh

bột

h3 Cấu trúc mạch amylopectin

h4 Cấu trúc mạch amylozo

1.2.2 Enzym thủy phân tinh bột

Amylaza rất phổ biến ở VSV, thuộc nhóm enzym xúc tác cho sự phân giải liên kết nội phân tử trong polysacarit với sự tham gia của nước cơ chất của amylaza là tinh bột và glycogen, theo tính chất và cách tác dụng lên tinh bộ, phân biệt amylaza thành các loại: α-amylaza, β-amylaza, glucoamylaza và oligo 1-6 glucozidaza

α-amylaza có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glycozit nằm phía bên trong phân tử

cơ chất một cách ngẫu nhiên không tuân theo trình tự nào

β-amylaza xúc tác thủy phân liên kết 1-4 glycozit trong tinh bột, glycogen và polysacarit đồng loại, phân cắt tuần tự gốc glucoza từ đầu không khử của mạch

Glucoamylaza là một exoenzym, thủy phân liên kết 1-4 glycozit trong phân tử polysacarit, tách tuần tự từng gốc glucoza khởi đầu không khử mạch

Oligo 1-6 glucozidaza thủy phân các liên kết α-1-6 glycozit trong izomantoza, các dextrin tới hạn và có khả năng chuyển hóa chất này tới đường lên men được

1.2.3 VSV tổng hợp enzym thủy phân tinh bột

VSV là nguồn sinh amylaza rất lớn α-amylaza được tìm thấy ở hầu hết các loại VSV như nấm sợi, nấm men giả, vi khuản có bào tử và xạ khuẩn Ở vi khuẩn amylaza chủ yếu được sinh ra từ các loài thuộc chi Clostridium, Bacillus

Amylaza của vi khuẩn khác với nấm sợi ở chỗ ít có khả năng đường hóa nhưng lại dịch hóa hồ tinh bột rất mạnh, tạo thành những dextrin phân tử lượng cao bắt màu iot, α-amylaza của vi khuẩn giống với nấm men ở chỗ là chúng được ổn định bằng ion canxi

1.3 VSV phân giải protein

Protein là các polyme phân tử lớn, chủ yếu bao gồm các L.axit amin kết hợp với nhau qua liên kết peptit

1.3.1 Enzym proteaza

Proteaza phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng, song proteaza giữa động vật, thực vật

và VSV đều có sự khác biệt

Hệ proteaza ở VSV là một hệ thống rất phức tạp, bao gồm nhiều enzym rất giống nhau

về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng

nhất ngoài ra, proteaza VSV có tính đặc hiệu rộng rãi, cho sản phâm thủy phân triệt để

và đa dạng

1.3.2 VSV tổng hợp enzym phân giải protein

- Vi khuẩn

Proteaza của vi khuẩn có tinhs đặc hiệu cao với cơ chất có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptit trong phân tử protein một cách nhanh chóng Ngoài ra có thể phân hủy một số liên kết không đặc trưng

Các loài vi khuẩn có kharnawng tổng hợp proteaza tốt là: B.subtilis, B horicoshii, B.mesentericus,… và 1 số loài thuộc chi Serratia

Các vi khuẩn thường tổng hợp proteaza hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu

Các proteaza trung tính hoạt động ở khoảng pH hẹp (5-8)v và có khả năng chịu nhiệt thấp

Proteaza của Bacillus ưa kiềm, ổn đinh trong khoảng pH 6-12

2 Quá trình chuyển hóa

Mặc dù các chủng vi sinh vật được tuyển chọn là đa hoạt tính nhưng trong khuôn khổ nghiên cứu này chỉ tập chung xác định một hoạt tính sinh học chính mà chủng được tuyển chọn có khả năng phân giải chất hữu cơ mạnh nhất Cụ thể là xác định hoạt tính phân giải xenluloza của chủng xạ khuẩn XK112, phân giải tinh bột vi khuẩn B20, phân giải protein của chủng vi khuẩn B15, riêng chủng lactic LH19 thì xác định khả năng kháng khuẩn

2.1 Điều kiện nhân sinh khối vi sinh vật

- Thời gian nuôi cấy : Thời điểm thu sinh khối thích hợp nhất đối với chủng XK112 là

72 giờ , các chủng B20,B15 và LH19 là 48 giờ

- Tỷ lệ giống cấy : Ở tỷ lệ giống cấy là 3% cả 4 chủng đều sinh trưởng và phát triển tốt (đạt mức ổn định >109 CFU/ml).Bổ sung 3% giống vào bình lên men vừa thích hợp cho thu sinh khối vừa hiệu quả đối với chi phí sản xuất

- Điều kiện cấp khí : Các chủng được nuôi cấy trong các điều kiện cấp khí là 0,3 ; 0,4 ; 0,5 ; 0,6 và 0,73 dm3 không khí / lít môi trường / phút Nhu cầu oxy của chủng XK112

và B15 là 0,5 – 0,6 dm3 không khí / lít môi trường / phút ; chủng B20 là 0,3 – 0,4

dm3không khí / lít môi trường / phút Riêng chủng LH19 có nhu cầu oxy thấp nhất, có thể len men tĩnh hoặc khuấy nhẹ (< 0,3 dm3 không khí / lít môi trường / phút)

- Môi trường nhân sinh khối : Môi trường SX1 phù hợp cho sinh trưởng và phát triển của chủng XK112 ; chủng LH19 cho sinh khối cao nhất nên phù hợp vớ môi trường SX2

; còn chủng B20 và B15 sinh trưởng tốt hơn trên môi trường SX3 Trong các môi trường sản xuất thch hợp , các chủng đều đạt mật độ tế bào > 109 CFU/ ml

2.2 Quy trình sản xuất chế phẩm

(1) Chuẩn bị sinh khối vi sinh vật : Bốn chủng được nuôi cấy riêng rẽ trong môi trường và điều kiện thích hợp,sau đó đem đi nhân giống cấp 1 được chuyển sang bình lên men nhân sinh khối cấp 2 với tỉ lệ 3%.Giống và sinh khối đều được kiểm tra độ thuần khiết và hoạt tính sinh học Cần chú ý là giống cây phải trẻ và có sức sống cao nên phải chọn ở pha logarit

(2) Chẩn bị chất mang : than bùn được phơi khô tự nhiên ,nghiền mịn bắng máy,rây qua sang 0,1mm sau đó sử dụng vôi bột điều chỉnh pH về 6,5

(3) Phối trộn ,kiểm tra chất lượng : Dịch vi sinh vật được phối trộn đều với chất mang tho tỉ lệ 5/100 Nguồn dinh dưỡng được bổ sung thêm là cám gạo(0,5%),ri đường (1%) ,ure(0,2%), sau đó ủ 3 ngày rồi hong khô kiểm tra chất lượng và đóng gói (4) Bảo quản ,sử dụng : Chế phẩm được đóng gói trong túi ni long tráng thiếc hoặc tối màu Bảo quản chế phấm trong phòng thoáng khí ,điều kiện thường,kiểm tra mật độ và hoạt tính của vi sinh vật theo thời gian định kì

III Yếu tố ảnh hưởng

3.1 Ảnh hưởng đến khả năng phân giải xenluloza của chủng xạ khuẩn XK112

3.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Chủng XK112 có khả năng thích nghi ở dải nhiệt độ tương đối dài (25-60°C), nhiệt độ thích hợp là 35-55°C, trong đó sinh trưởng và hoạt tính của xenlulaza cao nhất ở nhiệt

độ 40°C Khoảng nhiệt độ này hoàn toàn phù hợp với sự biến động nhiệt độ trong quá trình ủ, đặc biệt là ngày thứ 4 đến ngày thứ 15, khi nhiệt độ đống ủ tăng cao phù hợp cho VSV ưa nhiệt phát triển và phân giải xenluloza

3.1.2 Ảnh hưởng của pH

pH thích hợp cho chủng XK112 sinh trưởng và tổng hợp xenlulaza là pH 6-8 trong đó

pH 7 là tối thích Kết quả nghiên cứu này phù hợp với các nghiên cứu trước kia khi cho rằng pH ban đầu thích hợp nhất cho sinh trưởng và tổng hợp xenlulaza của xạ khuẩn là 7-7,5 Chất thải chăn nuôi thường có pH trong khoảng ban đầu từ 5-8 và đạt mức trung tính sau khi xử lý cơ chất, do đó chủng XK112 phù hợp cho sản xuất chế phẩm chăn nuôi

3.2 Ảnh hưởng đến khả năng phân giải tinh bột vi khuẩn B20

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Chủng B20 sinh trưởng và tổng hợp amylaza trong dải nhiệt độ 30-55 C nhưng thích hợp ở 30-50 C, sinh khối và hoạt tính đạt giá trị cao nhất ở nhiệt độ 37 C Khoảng nhiệt

độ này là phù hợp với giai đoạn 15 ngày đầu của quá trình xử lý chất thải chăn nuôi, khi

đó quá trình phân giải tinh bột trong khối ủ sẽ diễn ra mạnh nhất Kết quả này phù hợp khi đã có nghiên cứu cho rằng nhiệt độ tối ưu cho khả năng tổng hợp amylaza của Bacillus subtilis là 40 C

3.2.2 Ảnh hưởng của pH

Chủng B20 được nuôi lắc 220 vòng/phút trên môi trường dịch thể với các pH khác nhau,

ta tìm ra được kết quả chủng B20 sinh trưởng và tổng hợp enzym phân giải tinh bột thích hợp ở pH 6,0-8,0

3.2.3 Ảnh hưởng của ion kim loại

Nuôi cấy chủng B20 trong môi trường và điều kiện thích hợp, ly tâm thu dịch enzym,

bổ sung CaCl2 với các nồng độ 2-4mM, xử lý ở nhiệt độ 85 C trong 15 và 30 phút Xác định ảnh hưởng của Ca2+ trong môi trường ảnh hưởng hoạt tính amylaza của chủng B20

Nồng độ Ca2+(mM) Thời gian xử

lý(phút)

Hoạt tính tương đối(%)

Nồng độ Ca phù hợp là 2mM trong thời gian xử lý nhiệt là 15 phút

3.3 Ảnh hưởng đến khả năng phân giải protein của chủng B15

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Chủng B15 được nuôi lắc trong môi trường dịch thể thích hợp ở các điều kiện khác nhau trong khoảng từ 25 đến 55 C, ta thấy khoảng nhiệt độ thích hợp tương đối rộng (30-50 C), nhiệt độ 35-45 C là thích hợp nhất (OD>0,2 và PA>0,8

HP/ml) Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng của B15 là ở 35 C còn PA đạt mức cao nhất ở

40 C Nhiệt độ này phù hợp ở giai đoạn 2-10 ngày đầ của quá trình xử lý chất thải chăn nuôi Sản phẩm quá trình phân giải protein tạo ra các axit amin là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho các vi sinh vật trong quá trình chuyển hóa tiếp theo