Nghiên cứu thiết kế tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp osmc2 từ vi khuẩn cổ thermococcus kodakarensis KOD1 để đánh giá khả năng bảo vệ tế bào khỏi gốc oxy hóa

LÊ NGỌC ÁNH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP OSMC2 TỪ VI KHUẨN CỔ Thermococcus kodakarensis KOD1 ĐỂ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ TẾ BÀO KHỎI GỐC OX

LÊ NGỌC ÁNH

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN

TÁI TỔ HỢP OSMC2 TỪ VI KHUẨN CỔ Thermococcus kodakarensis KOD1

ĐỂ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ TẾ BÀO KHỎI GỐC OXY HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2017 - 2021

Thái Nguyên, năm 2021

LÊ NGỌC ÁNH

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN

TÁI TỔ HỢP OSMC2 TỪ VI KHUẨN CỔ Thermococcus kodakarensis KOD1

ĐỂ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ TẾ BÀO KHỎI GỐC OXY HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Khoa : CNSH & CNTP

Họ tên người hướng dẫn : TS Phạm Bằng Phương

Thái Nguyên, năm 2021

LỜI CẢM ƠN

Thực tập tốt nghiệp là một khâu rất quan trọng trong quá trình học tập của mỗi sinh viên nhằm hệ thống lại toàn bộ lượng kiến thức đã học, vận dụng lý thuyết vào thực tiễn.Qua đó sinh viên ra trường sẽ hoàn thiện hơn về liến thức lý luận, phương pháp làm

việc, năng lực công tác nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn của công việc sau này

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường, ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm cùng các thầy, cô trong Khoa đã giảng dạy và hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và rèn luyện tại trường, trong thời gian vừa qua các thầy, cô đã tạo

điều kiện cho em được thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thiết kế tạo dòng và biểu

hiện protein tái tổ hợp OsmC2 từ vi khuẩn cổ Thermococcus kodakarensis KOD1 để đánh giá khả năng bảo vệ tế bào khỏi gốc oxy hóa”

Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS.Phạm Bằng Phương giảng viên Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã trực tiếp

hướng dẫn, giúp đỡ em trong thời gian em thực hiện đề tài

Em cũng xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã động viên, tạo

điều kiện cả về vật chất lẫn tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập

Do trình độ có hạn mặc dù đã rất cố gắng song khóa luận tốt nghiệp của em không thể tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được những ý kiến chỉ bảo của thầy

cô, đóng góp của bạn bè để khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn

Lời cuối em xin được gửi tới thầy ,cô giáo, cùng với gia đình, bạn bè lời cảm

ơn và lời chúc sức khỏe thành đạt và hạnh phúc

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng 6 năm 2021

Sinh viên

Lê Ngọc Ánh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT vii

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

Phần 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 3

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3

2.2 Đặc điểm của vi khuẩn Thermococcus 6

2.3 Đặc điểm di truyền Thermococcus kodakerensis KDO1 6

2.4 Đặc điểm protein OsmC2 9

2.4.1 Giới thiệu 9

2.4.2 Đặc điểm của protein OsmC2 10

2.5 Đặc điểm chủng vi khuẩn E coli sử dụng trong tạo dòng và biểu hiện 11

2.5.1 E coli DH5α JM109 12

2.5.2 E coli BL21 12

2.5.3 E coli BL21 (DE3) pLysS 12

2.5.4 E coli M15 (pREP4) 14

2.6 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 14

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 14

2.6.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Đối tượng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 17

3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu: 17

3.1.2 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 17

3.1.3 Thiết bị , dụng cụ nghiên cứu 18

3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 19

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 19

3.3 Phương pháp nghiên cứu 19

3.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 19

3.3.2 Phương pháp khuếch đại gen PCR 21

3.3.3 Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến 22

3.3.4 Phương pháp gắn nối gen vào vecter 22

3.3.5 Phương pháp tách chiết plasmid 23

3.3.6 Phương pháp biến nạp 24

3.3.7 Phương pháp kiểm tra gắn nối gen 24

3.3.8 Phương pháp cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG 24

3.3.9 Phương pháp tinh sạch protein 25

3.3.10 Phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE 25

3.3.11 Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp Sắc ký ái lực 27

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Nghiên cứu khuếch đại OsmC2 từ vi khuẩn T.kodakarensis KDO1 28

4.1.1 Tách chiết DNA hệ gen của T.kodakarensis KOD1 28

4.1.2 Khuếch đại gen mã hóa OsmC2 bằng phương pháp PCR 29

4.2 Nghiên cứu tạo dòng gen mã hóa protein OsmC2 từ T kodakarensis KOD1 31

4.2.1 Gắn nối đoạn gen OsmC2 vào vector tạo dòng pGEM T-easy 31

4.2.2 Kiểm tra gắn nối bằng enzyme giới hạn 32

4.3 Thiết kế và tạo vector biểu hiện protein OsmC2 từ Thermococcus kodakarensis

KDO1 32

4.4 Nghiên cứu và đánh giá khả năng biểu hiện protein OsmC2 trên vi khuẩn

E coli 35

4.5 Tinh sạch protein chịu nhiệt OsmC2 36

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Phụ lục

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng trong đề tài 18

Bảng 3.2 Thiết bị nghiên cứu 19

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen OsmC2 21

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng 22

Bảng 3.5 Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NdeI và XhoI 24

Bảng 4.1 Kết quả đo độ tinh sạch và nồng độ ADN 29

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Nơi phân lập 3

Hình 2.2 Vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 4

Hình 2.3 Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus 5

Hình 2.4 Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococus kodakarensis KDO1 8

Hình 2.5 Cơ chế kiểm soát sự phiên mã của T7 promoter [51] 13

Hình 3.1 Chu kì nhiệt nhân gen OsmC2 21

Hình 4.1 Ảnh điện di ADN hệ gen được tách chiết từ Thermococcus kodakarensis KDO1 28

Hình 4.2 Hình ảnh điện di đoạn gen OsmC2 được khuếch đại từ AND hệ gen 30

Hình 4.3 Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch 30

Hình 4.4 Hình ảnh điện di vector tạo dòng tách chiết 31

Hình 4.5 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt các dòng plasmid có khả năng mang gen OsmC2 32

Hình 4.6 Tách chiết plasmid vector tạo dòng OsmC2 Tvector và vector biểu hiện pET21b 33

Hình 4.7 Cắt vector tạo dòng chứa gen OsmC2 và vector biểu hiện pET21b 34

Hình 4.8 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid nghi mang gen OsmC2 34

Hình 4.9 OsmC2 biểu hiện trong tế vào E.coli BL21 Giếng M: Marker protein M3913 Sigma 35

Hình ảnh 4.10 Tinh sạch protein OsmC2 bằng cột sắc kí Ni-NTA 36

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

EDTA : Etilendiamin tetraaxetic axit Etilendiamin tetraaxetic acid

Biotechnology Information

SDS –PAGE : Điện di SDS- polyacrylamide gel Sodium dodecyl sulfate -

polyacrylamide gel electrophoresis)

OsmC

: alactoside

5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-: Osmotically inducible protein C

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Sự thích nghi của tế bào sống với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường đã được nghiên cứu nhiều ở cả sinh vật nhân sơ lẫn sinh vật nhân chuẩn Khi điều kiện môi trường thay đổi, các sinh vật thích nghi bằng cách nhận biết những thay đổi và biểu hiện gen để tổng hợp một số lượng lớn protein và các chất chuyển hóa để có khả năng chống lại môi trường Vi khuẩn cổ ưa nhiệt đã sống trong môi trường khắc nghiệt và có các đặc điểm trao đổi chất và sinh lý độc đáo, được ứng dụng nhiều trong ngành công nghệ sinh học.Tuy nhiên, hiện nghiên cứu về những sinh vật này về khả năng đối phó với các yếu tố stress còn hạn chế

Thermococcus kodakarensis KDO1 là vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ

miệng núi lửa gần đảo Kodakara, Kagoshima, Nhật Bản Vi khuẩn này được các nghiên cứu tập trung vào các enzyme ổn định nhiệt của nó, việc dễ dàng xử lý và thao tác di truyền giúp nó trở thành một đối tượng hấp dẫn để nghiên cứu một số quá trình sinh học cũng như từng bước ứng dụng trong công nghiệp Để sống được

ở điều kiện nhiệt độ từ 60 – 100oC, nhiệt độ tối ưu 85oC, vi khuẩn T Kodakarensis KDO1 có các hệ enzyme, phức hợp protein proteasome có đặc tính đặc biệt Các

nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, protein OsmC được biểu hiện đã điều chỉnh đáng kể khả năng chống lại áp suất thẩm thấu Các peroxide có độc tính cao và có khả năng làm hỏng các phân tử tế bào, do vậy, việc giải độc peroxide rất quan trọng đối với sự tồn tại và sinh sôi của vi khuẩn

Vì vậy, việc nghiên cứu vai trò và chức năng của protein OsmC2 trong tế bào sẽ giúp chúng ta hiểu rõ cơ chế hoạt động cũng như khả năng thích nghi của vi khuẩn với với môi trường khắc nghiệt

Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thiết kế tạo dòng và

biểu hiện protein tái tổ hợp OsmC2 từ vi khuẩn cổ Thermococcus kodakarensis KOD1 để đánh giá khả năng bảo vệ tế bào khỏi gốc oxy hóa để tạo dòng và biểu hiện protein OsmC2”, từ đó là cơ sở để đánh giá chức năng của enzyme và hiểu rõ

khả năng chịu đựng của tế bào với áp suất thẩm thấu

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Đề tài thực hiện khuếch đại gen OsmC2, tạo dòng và biểu hiện protein OsmC2

từ vi khuẩn T kodakarensis KOD1 để làm tiền đề đánh giá chức năng của protein

OsmC2 với tế bào

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Nghiên cứu khuếch đại gen OsmC2 từ vi khuẩn T kodakarensis KOD1

- Nghiên cứu tạo dòng gen mã hóa protein OsmC2 từ T kodakarensis KOD1

- Nghiên cứu thiết kế và tạo vector biểu hiện protein OsmC2

- Nghiên cứu và đánh giá khả năng biểu hiện protein OsmC2 trên vi khuẩn E

coli BL21

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Trong học tập và nghiên cứu khoa học

+ Thực tập tốt nghiệp là cơ hội tốt để hệ thống và củng cố lại kiến thức đã được học trong nhà trường và áp dụng vào thực tiễn công việc

- Trong thực tiễn

+ Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn

+ Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho công tác sau này

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Đề xuất được quy trình thiết kế tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp

OsmC2 từ vi khuẩn cổ Thermococcus kodakarensis KOD1 để đánh giá khả năng

bảo vệ tế bào khỏi gốc oxy hóa

Phần 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

2.1.2.1 Nguồn gốc

Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 là một vi khuẩn chịu nhiệt sống

trong điều kiện, nhiệt độ cao từ 60ºC- 100ºC, nhiệt độ tối ưu là 85ºC, nó có khả năng sinh trưởng và phát triển trong khoảng pH rộng ( từ 5-9, tối ưu là 6,5 ), có độ muối cao ( từ 1-5% ) tối ưu ở 3%, được phát hiện đầu tiên ở khu vực miệng núi lửa gần bờ đảo Kodakara, Kagoshima, Nhật Bản, ban đầu vi khuẩn này được đặt tên là

Pyrococcus kodakarensis KOD1 sau đó được phân loại vào loài Thermococcus dựa

vào trình tự chuỗi 16sRNA giữa các loài khác nhau và chủng KDO1 là đại diện mới

của Thermococcus, được gọi là Thermococus kokadarensis KDO1

Hình 2.1 Nơi phân lập

(Vi khuẩn cổ lần đầu được khám phá ở những môi trường cực đoan, như suối

nước nóng hay trên miệng núi lửa)

Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 có kích thước trong khoảng từ

1- 2 µm, tồn tại chủ yếu ở dạng hình cầu, có cấu trúc dạng sợi [14], thiếu màng trong và bào quan, cấu trúc gồm màng sinh chất và thành tế bào, màng tế bào được tạo thành từ những phân tử phospholipid, lớp lipide kép thay bằng lớp lipide đơn và

2 phân tử lipide được nhập làm 1 tạo thành 1 phân tử lipide có 2 đầu cực, giúp tăng khả năng thích nghi với môi trường biến đổi

2.1.2.2 Phân loại

Đầu tiên, Fiala and Stetter 1986 [16] đã xây dựng một cây phát sinh loài với

các loài khác nhau, sử dụng Thermococcus Pyrococcus furiosus như một nhóm Các

trình tự gen 16S rRNA của chủng được thể hiện trong (hình 2.3) lựa chọn cho nhiều

liên kết và xây dựng một cây phả hệ bằng cách sử dụng phương pháp

neighbor-joining [17] Các vị trí phát sinh loài của giống KOD1 đã nằm trong chi

Thermococcus, với các trình tự KOD1 nhóm với T peptonophilus [18] và T stetteri

(99%) [19] Khi áp dụng phương thức maximum-likelihood [20], vị trí phát sinh

loài của một số chủng thay đổi, nhưng các phân nhóm trong T peptonophilus và T

stetteri và KOD1 thì không thay đổi gì

Kết quả chỉ ra rằng KOD1 là thành viên của Thermococcus và cho rằng nó có liên quan chặt chẽ với T peptonophilus và T stetteri [19] được thể hiện cụ thể bởi

cây phân loại

Hình 2.2 Vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1

Hình 2.3 Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus

Dựa vào các nghiên cứu phân loại [21] có thể thấy vi khuẩn Thermococcus

kodakarensis KOD1 được phân loại như sau:

- Loài : Thermococus kodakarensis KOD1

Do được phân loại trong giới Achaea nên Thermococcus kodakarensis KOD1

cũng mang những đặc trưng của khuẩn cổ Achaea , vi khuẩn, vi khuẩn cổ và sinh vật nhân chuẩn là những dòng giống riêng biệt được rẽ nhánh khởi đầu từ một tập hợp các cá thể tổ tiên sơ khai [22], tuy nhiên các nhà sinh vật học lại cho rằng vi khuẩn, vi khuẩn cổ và sinh vật nhân chuẩn được rẽ ra từ một nhóm vi khuẩn [23],

có thể tổ tiên của chúng cũng là một sinh vật ưa nhiệt đặc biệt trong điều kiện môi

trường thay đổi cực đoan như ngày nay [24] T.kodakarensis được phân loại dựa vào trình tự 16s DNA ribosome của loài Thermococcus khác nhau có sẵn từ các cơ

sở dữ liệu EMBL / GenBank / DDBJ Khu vực trải dài 1231 bp (giữa

83-GGCGGACGG và GCGTGTCAT-1313 trong chuỗi các Thermococcus

kodakaraensis) đã được sử dụng để tính toán phát sinh loài Các liên kết nhiều trình

tự DNA được thực hiện bằng cách sử dụng chương trình ALIGN chứa trong các chương trình ClustalW (Thompson et al., 1994) được cung cấp bởi ngân hàng dữ liệu ADN của Nhật Bản (DDBJ) Cây phát sinh loài được xây dựng theo phương

pháp neighbor-joining (Saitou và Nei 1987) và theo phương pháp tối đa likelihood

(Felsenstein, 1981) với chương trình fastDNAmL (Olsen et al., 1994) được thực hiện 1000 lần [11] Cây phát sinh loài đã được hình tượng với chương trình TreeView

2.2 Đặc điểm của vi khuẩn Thermococcus

Bộ gen Thermococcus kodakaraensis chứa 2,09 triệu cặp ba (bp) và được dự

đoán có khoảng 2357 gen Kích thước trung bình của bộ gen vi khuẩn được biết là

khoảng 4 Mb, gấp đôi kích thước của cặp nhiệt điện kodakaraensis Nhiễm sắc thể

có một màu sắc thể tròn và hàm lượng GC được ước tính là 38% mol Bảy gen cho transposase có thể xảy ra và bốn vùng liên quan đến virus được tìm thấy trong bộ gen (Fukuri F và cộng sự)

Cặp nhiệt điện kodakarensis có cấu trúc tế bào cocci không đều (đường kính 1-2 μm) và di chuyển với một số flagella cực T kodakarensis có một màng lipid

ether duy nhất Sinh vật khử lưu huỳnh và kỵ khí nghiêm ngặt này sử dụng axit amin, peptide, pyruvate và tinh bột làm nguồn carbon và năng lượng của nó Con

đường trao đổi chất của T kodakarensis bao gồm gluconeogenesis và glycolysis và

các sản phẩm trao đổi chất là khí hydro và hydro sunfua (Fukuri F và cộng sự)

2.3 Đặc điểm di truyền Thermococcus kodakerensis KDO1

Để có thể tồn tại trong điều kiện môi trường khắc nghiệt thì bản thân vi khuẩn

Thermococcus kodakarensis KOD1 phải có những đặc điểm khác biệt nhất là hệ

gen, 7 hệ gen của Thermococcus kodakarensis được ước lượng khoảng 2,09 triệu bp chứa khoảng 2434 gen, toàn bộ trình tự genome của Thermococcus kodakarensis

KOD1 đã được nhóm tác giả thuộc Viện Nghiên Cứu Hóa Sinh Tổng Hợp và Hóa Sinh Học thuộc Đại Học kỹ thuật Kyoto, Nhật Bản nghiên cứu và giải trình tự [12]

Một số nghiên cứu mô tả sự so sánh giữa hai loài Archaea hyperthermophilic có quan hệ họ hàng là Thermococcus barophilus chủng MP và Thermococcus

kodakarensis KOD1 đã cho thấy có tổng cộng có 378 gene khác nhau được biểu

hiện trong tế bào của T barophilus tăng trưởng 0,1, 40 và 70 MPa, trong khi 141 gen khác trong tế bào T kodakarensis tăng trưởng 0,1 và 25 MPa Trong T

Barophilus- tế bào nuôi cấy trong điều kiện (0,1 và 70 MPa), 178 gen được phân bố

trong ba cụm thuộc nhóm Orthologous (COG): Sản xuất năng lượng và chuyển đổi (C); vận chuyển ion vô cơ và trao đổi chất (P); vận chuyển carbohydrate và trao đổi chất (G), trong khi 156 gen được phân bố trong 3 nhóm: Vận chuyển axit amin và trao đổi chất (E); sao chép, tái kết hợp và sửa chữa (L); vận chuyển nucleotit và trao

đổi chất (F) Những biểu hiện của 141 gen đã được quy định trong các tế bào T

kodakarensis phát triển trong điều kiện khắc nghiệt (25 MPa); 71 gen thuộc về ba

COG: Sản xuất năng lượng và chuyển đổi (C); vận chuyển axit amin và trao đổi chất (E); phiên mã (K), trong khi đó 70 gen được kết hợp với sao chép, tái kết hợp

và sửa chữa (L), vận tải coenzyme (H ) và cơ chế phòng vệ (V) [25], như vậy

genome của Thermococcus kodakarensis KOD1 có vai trò vô cùng quan trọng trong việc tham gia các hoạt động chuyển hóa và trao đổi chất Thermococcus

kodakarensis KOD1, đã thích nghi với sự phát triển tối ưu trong điều kiện nhiệt độ

cao và độ mặn Tuy nhiên, các điều kiện môi trường cho sự tác động không phải luôn luôn ổn định, và tác động này có thể phải đối mặt với tác động khác nhau trong cùng môi trường Nghiên cứu của Lamosa và cs, 1998 [26] đã so sánh phản ứng

chịu nhiệt, oxy hóa protein của T kodakarensis và ảnh hưởng của muối bằng cách

điện di hai chiều, và các điểm protein đã được xác định thông qua MALDITOF /

MS Năm mươi chín, bốn mươi hai, hai mươi chín điểm đã gây ra dưới nhiệt, oxy hóa, và ảnh hưởng của muối tương ứng Trong số các protein dưới họ hàng có bốn

protein (một loại protein giả, sinh tổng hợp lyase pyridoxal, peroxiredoxin, và protein disulphide oxidoreductase) có liên quan với cả ba protein, phân tích Gene Ontology cho thấy các protein này được chuyển hóa chủ yếu tham gia vào các quá trình của tế bào Các phân tích cho rằng con đường chuyển hóa chính liên quan đến các enzyme có liên quan đến quá trình chuyển hóa carbohydrate, tổng hợp chất chuyển hóa cơ sở, và sinh tổng hợp axit amin Những dữ liệu này có thể nâng cao sự hiểu biết của chúng ta về các chức năng và cơ chế phân tử của ưa nhiệt Archaea để tồn tại và thích ứng trong môi trường khắc nghiệt Trình tự genome của

Thermococcus đã được phân loại cụ thể với trên 2.000 gen khác nhau có chung đặc

điểm của Achaea và những chức năng tổng hợp mã hóa quan trọng khác được trình bày trong NCBI

Hình 2.4 Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococus kodakarensis KDO1

Chú thích:

- Vòng tròn ngoài cùng: Bản đồ vật lý thu nhỏ trong dữ liệu cơ sở

- Vòng tròn thứ 2: Dự đoán các vùng mã hóa protein trong chiều kim đồng hồ

- Vòng tròn thứ 3: Dự đoán các vùng mã hóa ngược chiều kim đồng hồ

- Các gen biểu thị được phân màu theo nhóm phân loại chức năng, cụ thể: + Màu hồng: Phiên mã 9

+ Màu hồng nhạt: Sao chép DNA, tái tổ hợp hoặc sửa chữa

+ Xanh lá cây: Vùng phân chia tế bào, nhiễm sắc thể

+ Vàng nhạt: Lớp bên ngoài tế bào

+ Xanh da trời: Thực hiện hóa sinh tổng hợp, dị hóa

+ Xanh nhạt: Tế bào nhu động, vận chuyển ion, trao đổi chất

+ Xanh lam: Cơ chế truyền tín hiệu, trao đổi các coenzyme

+ Màu tím: Sản xuất năng lượng, chuyển đổi

+ Tím nhạt: Chuyển hóa lipide

+ Màu xám: Chức năng chỉ mới được đề xuất

+ Màu đen: Không rõ chức năng

- Vòng tròn thứ 4: Dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều kim đồng hồ (màu đỏ trong vòng thứ 4)

- Vòng tròn thứ 5: Dự đoán các tRNA mã hóa theo chiều ngược chiều kim đồng hồ (màu xanh vòng tròn thứ 5)

- Vòng tròn thứ 6: Dự báo các yếu tố di động theo chiều kim đồng hồ (màu đỏ vòng thứ 6)

- Vòng tròn thứ 7: Dự báo các yếu tố di động theo chiều ngược kim đồng hồ (màu xanh vòng thứ 7)

- Đường thẳng đứng thể hiện việc dự đoán gen chuyển và chỉ ra vùng virus liên quan

- Vòng tròn trong cùng: % (G+C) trong vòng 10 kb và thay đổi gia tăng tới các

giá trị cao hơn trong khoảng ít nhất là 38 %

2.4 Đặc điểm protein OsmC2

2.4.1 Giới thiệu

Protein C cảm ứng thẩm thấu (OsmC2) tham gia vào cơ chế bảo vệ tế bào chống lại stress oxy hóa do tiếp xúc với hyperoxit hoặc nồng độ thẩm thấu cao

OsmC2 được xác định bằng phân tích điện di hai chiều (2DE) là một loại protein biểu hiện quá mức khi phản ứng với áp suất thẩm thấu, nhưng không biểu hiện dưới

sự xuất hiện của oxy hóa Đây là một Gen OsmC2 từ T.kodakarensis KDO1 được

nhân bản và biểu hiện ở Escherichia coli TkOsmC2 cho thấy cấu trúc homotetrameric dựa trên quá trình lọc gel và kính hiển vi điện tử phân tích TkOsmC2 có hoạt tính peroxidase đáng kể với cả hữu cơ và vô cơ peroxit ở nhiệt độ cao, nhưng không ở nhiệt độ thấp

Sự thích nghi của các tế bào sống với áp lực môi trường khác nhau đã được nghiên cứu trong nhiều năm với nhiều sinh vật nhân chuẩn và sinh vật nhân sơ Khi điều kiện môi trường thay đổi dần dần, các sinh vật có thể thích nghi bằng cách cảm nhận những thay đổi và gây ra sự biểu hiện của gen để tổng hợp lại số lượng lớn của protein và các chất chuyển hóa có liên quan đến sức đề kháng chống lại căng thẳng môi trường Chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học

2.4.2 Đặc điểm của protein OsmC2

Vì vi khuẩn cổ ưa nhiệt đã tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt môi trường có sự trao đổi chất và sinh lý độc nhất đặc điểm, chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học ngành công nghiệp cho các ứng dụng đa dạng [35-37] Tuy nhiên, hiện tại sự hiểu biết về các cơ chế thích nghi của những sinh vật này trong phản ứng với căng thẳng là không đầy đủ Do đó, các nghiên cứu sâu hơn được thực hiện nhằm tìm hiểu cơ chế sống sót của những sinh vật trong môi trường khắc nghiệt là cần thiết Tập chung vào điều này, đã thực hiện phân tích các mô hình biểu hiện quá mức của các protein chịu ứng suất khác nhau bởi gel hai chiều

Kết quả chỉ ra rằng protein OsmC2 đã được điều chỉnh một cách đáng kể bởi ứng suất thẩm thấu Nói chung, peroxit rất độc và có thể làm hỏng tế bào đại phân tử ở vi khuẩn Do đó, việc giải độc cho mỗi oxit rất quan trọng đối với sự tồn tại và sinh sôi của vi khuẩn trong tổ chức

Gen OsmC2 lần đầu được chứng minh từ Escherichia coli để phản ứng với sốc thẩm thấu [38] và protein tạo thành được gọi là protein cảm ứng thẩm thấu C Một số loài vi khuẩn có một hoặc hai bản sao của gen này [39] Gen này được bảo tồn

cao trong Bascillus (một bản sao), Mycoplasma (một bản sao), Xanthomonas (một

bản sao), Pseudomonas (hai bản sao) và Deinococcus (hai bản sao) Quy định của gen này đã được phát hiện là phức tạp ở cả Bacillus subtilis[39] và E.coli[40] Gần đây, cấu trúc tinh thể của OsmC2 từ Mycoplasma pneumoniae và E.coli đã được

báo cáo và cho thấy có cấu trúc dạng hạt, bao gồm hai monome sắp xếp theo hướng từ đầu đến đuôi Hai cys-teine được bảo tồn nằm trong vùng giao diện dimer đã được xác định

Trong nghiên cứu hiện tại chúng tôi đã xác định được protein OsmC2 biểu

hiện trên chỉ khi bị stress muối ở Thermococcus kodakaraensis KDO1 sử dụng

phương pháp tiếp cận proteomic Cấu trúc tứ phân của OsmC2 được tiết lộ bằng sắc ký lọc gel cũng như phân tích bằng kính hiển vi điện tử và nó chỉ thể hiện hoạt tính peroxidase ở nhiệt độ cao

Chúng tôi đã xác định đặc điểm gen OsmC2 của E.coli Không có sự tương

đồng đáng kể nào được tìm thấy giữa OsmC2 và các protein khác bằng cách quét ngân hàng dữ liệu trình tự protein EMBL và chức năng của 14 kDa này protein vẫn chưa được biết Tuy nhiên gen này đã được xác định dựa trên khả năng cảm ứng của nó bằng cách tăng áp suất thẩm thấu trong môi trường sinh trưởng và nó có thể được nghiên cứu như một mô hình để nâng cao kiến thức của chúng ta về các cơ chế liên quan đến phản ứng di truyền đối với căng thẳng thẩm thấu Một phản ứng tổng hợp operon OsmC2, -1acZ đã được xây dựng Nó cho thấy biểu hiện được kích thước thẩm thấu, cũng như trường hợp của tất cả các gen được kích thích thẩm thấu tạo ra OsmC2 biểu hiện ở cấp độ phiên mã

2.5 Đặc điểm chủng vi khuẩn E coli sử dụng trong tạo dòng và biểu hiện

Từ đầu thập niên 1990 đến nay, hầu hết người ta sử dụng E coli làm tế bào chủ

để sản xuất các protein tái tổ hợp do chúng có tốc độ tăng trưởng nhanh với mật độ tế bào cao trên cơ chất, không đắt tiền cũng như các đặc điểm di truyền đã được nghiên

cứu đầy đủ [27], [30] Đồng thời, nhiều chủng E coli khác nhau đã được nghiên cứu

để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp, bằng các vector khác nhau Vì vậy, khi

lập phương án sản xuất protein tái tổ hợp trong E coli, cần phải lựa chọn hệ thống vector tạo dòng, biểu hiện và chủng E coli thích hợp với protein mục tiêu

2.5.1 E coli DH5α JM109

Vi khuẩn E.coli DH5α, JM109 [recA1, supE44, endA1, hsdR17, gyrA96,

relA1, thi, Δ(lac-proAB), F′ [traD36, proAB+ , laqI qZΔM15] thường được dùng cho việc biến nạp các vector M13, pGEM® và Bacteriophage, nhằm lưu trữ và sao chép các đoạn gen kích thước đa dạng Dòng vi khuẩn này có khả năng tiếp nhận gen và phát triển tốt cùng với khả năng biểu hiện hiệu quả Bởi vì alen recA1- thiếu

hệ thống ức chế phiên mã nên rất thích hợp cho việc biến nạp và lưu trữ do ít xuất hiện sự sao chép làm sai khung đọc của ADN nguyên bản hoặc ADN tái tổ hợp, ngoài ra, đột biến endonuclease A – cũng giúp cải thiện năng suất và chất lượng của ADN plasmid được phân lập

Tuy β-galactosidase hoạt động thiếu hiệu quả do thiếu thông tin di truyền từ

episome của gen lacZ, có thể chúng có thể được bổ sung bằng cách thêm một đoạn

mã hóa chức năng α-peptide qua việc biến nạp một pGEM®-Z hoặc pGEM®-Zf Vector Nếu sự bổ sung không xảy ra, các khuẩn lạc có màu trắng Điểm này một

phần gây nên sự hạn chế trong việc biểu hiện gene của E coli DH5α nên chủng này

đa phần chủ được sử dụng nhằm mục đích tạo dòng Ngoài ra, để duy trì F´, E coli

DH5α, JM109 nên được nuôi cấy trên môi trường tối thiểu (M-9) được bổ sung thêm 1mM thiamine [28]

2.5.2 E coli BL21

Chủng E coli BL21[F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal] là dạng đột biến khuyết

protease ompT và Lon và là chủng tốt nhất dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp dung hợp với GST [31]

Tuy nhiên, do có đặc tính biến nạp không tốt nên chủng này không được dùng

cho mục đích tạo dòng Chủng E coli DH5α là chủng mang alen recAl thuận lợi quá trình biến nạp và lưu trữ plasmid nên được dùng cho mục đích tạo dòng thay E

coli BL21

2.5.3 E coli BL21 (DE3) pLysS

Chủng E coli BL21 (DE3) pLysS [F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal, dcm(DE3)]

thường dùng trong biểu hiện protein dung hợp với 6xHis Hệ thống này cho phép biểu hiện vượt mức protein đồng thời hạn chế tối đa hiện tượng phiên mã rò rỉ khi không có

chất cảm ứng ADN hệ gene của chủng này có chứa đoạn gene T7 mã hóa cho T7 RNA

polymerase có nguồn gốc từ bacteriophage DE3 dạng tiềm tan Gene T7 chịu sự điều

khiển của promoter lac Gene lacI có khả năng tạo ra một lượng lớn repressol của lac

operon (lacO) tham gia kiểm soát sự phiên mã của T7 promoter

Sự ức chế phiên mã sẽ được hóa giải nhờ IPTG làm bất hoạt lacO [29], [30]

Ngoài ra chủng này có thể được thiết kế chứa thêm plasmid pLysS gọi là E coli

BL21 (DE3) pLysS giúp tế bào chủ tổng hợp được 1 lượng nhỏ T7 lysozyme có vai trò làm bất hoạt T7 RNA polymerase Các hệ thống biểu hiện nhờ T7 promoter chỉ hoạt động khi có mặt của T7 RNA polymerase của tế bào chủ Như vậy, chủng này có đặc điểm là hạn chế tối đa sự tổng hợp protein từ hệ thống vector biểu hiện khi

không được cảm ứng Cũng như một số chủng E coli BL21 khác, E coli BL21

(DE3) pLysS cũng bị đột biến khuyết sản phẩm protease OmpT và Lon nên luôn hạn chế tối đa sự phân hủy của protein tái tổ hợp

Hình 2.5 Cơ chế kiểm soát sự phiên mã của T7 promoter [51]

2.5.4 E coli M15 (pREP4)

E coli M15 (pREP4) cho phép biểu hiện protein vượt mức bằng hệ thống

vector biểu hiện pQE Chủng này có mang plasmid pREP4 mang gene lacI mã hóa cho repressor lacI có vai trò ức chế sự phiên mã của gene nằm sau promotor T5 theo cơ chế kiểm soát âm khi không có chất cảm ứng Chủng E coli M15 (pREP4)

có kiểu gene [Nals, Strs, Rifs, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-, RecA+, Uvr+, Lon+] Một chủng khác có đặc điểm tương tự như M15 (pREP4) là SG13009 (pREP4) Ngoài ra, có thể dùng một số chủng khác để biểu hiện hệ thống pQE như

E coli XL1 Blue, E coli TG1 Tuy nhiên, chỉ có các chủng mang pREP4 cho hiệu

quả biểu hiện cao và tránh được hiện tượng rò rỉ phiên mã [32]

2.6 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện các nghiên cứu trong nước về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis

KOD1 và các gen đặc trưng là không có, các nghiên cứu xuất hiện chỉ liên quan đến việc nghiên cứu tạo vector T bắt nguồn từ vi khuẩn suối nước nóng phục vụ cho việc biến nạp và tạo dòng, nổi bật trong các công trình nghiên cứu là sản phẩm chế tạo vector T-TUAF của TS Dương Văn Cường- Phó Khoa Công nghệ Sinh học và Công 14 nghệ Thực phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên

Một số công ty công ty hoạt động trong lĩnh vực công nghệ sinh học tập trung vào việc thiết kế mồi đặc hiệu cho việc bắt cặp đặc hiệu từng đoạn gen trong hệ gen

của Thermococcus kodakarensis KOD1 (công ty trách nhiệm hữu hạn một thành

viên sinh hóa Phù Sa, Tỉnh Vĩnh Long) Các nghiên cứu về gen OsmC2 và khả năng enzyme chịu đựng của tế bào với áp suất thẩm thấu hầu như là không có

2.6.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các sinh vật tăng thân nhiệt đã trở thành vi sinh vật mô hình được nghiên cứu rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau tập trung vào sự thích nghi của chúng với nhiệt độ khắc nghiệt, phát sinh loài và tiến hóa bộ gen, giải

mã phân tử các cơ chế sao chép DNA trong Archaea và các nguồn có giá trị của các sản phẩm công nghệ sinh học quan trọng

Đại học Dược Kyoritsu ở Nhật Bản đã đưa Thermococcus koadakarensis

vào một nghiên cứu liên quan đến mức độ acetylcholine trong các dạng sống sinh học thiếu hệ thần kinh Acetylcholine là một hợp chất hóa học được tìm thấy trong

hệ thần kinh Họ đo mức độ acetylcholine bằng cách sử dụng radioimmunoassays (RIA) Họ đã lấy mẫu nồng độ acetylcholine từ các sinh vật của từng miền của cây

phát sinh chủng loài của sự sống Cặp nhiệt điện kodakarensis đại diện cho vùng

Archaea Những phát hiện của nghiên cứu cho thấy biểu hiện phổ biến của acetylcholine đã là một "chất trung gian địa phương và bộ điều biến các chức năng sinh lý kể từ khi bắt đầu cuộc sống." (Kawashima K và cộng sự)

Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về Thermococcus và nghiên cứu hoàn thiện trình tự genome của vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1, của viện

nghiên cứu hóa sinh tổng hợp, Trường Đại Học Kyoto, thuộc Katsura, Nashikyo-

ku, Nhật Bản, tháng 3 năm 2005 Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chi Thermococcus, bao gồm các vi khuẩn cổ Hyperthermophilic, các thành viên của Thermococcus có

mặt ở khắp nơi trong môi trường nhiệt độ cao, và đóng một vai trò quan trọng trong

hệ sinh thái và trao đổi chất hệ vi sinh vật hoạt động trong hệ sinh thái nước nóng Fukui T và cs, 2005 đã xác định và ghi chú các bộ gen 2.088.737 - cơ sở hoàn chỉnh

của Thermococcus kodakaraensis KOD1, theo sau là sự so sánh với ba bộ gen hoàn chỉnh của Pyrococcus spp Tổng cộng có 2306 trình tự DNA mã hóa (CDS) đã được

xác định, trong đó một nửa (1165 CDS) là chú thích, trong khi các chức năng của 41% (936 CDS) không thể được dự đoán từ các cấu trúc chính Bộ gen chứa bảy gen chuyển có thể xảy ra và bốn khu vực có liên quan đến virus Một trong số

protein di truyền cho thấy sự tương đồng cao với nhóm Pyrococcus spp Sự sắp xếp

Thermococcales, genomics trong so sánh làm rõ sự có mặt 1.204 của protein khác

nhau, bao gồm những thông tin và trao đổi chất cơ bản, được chia sẻ giữa T

kodakaraensis và Pyrococcus spp Mặt khác, còn cho thấy nhiệm vụ của các protein

khác như tham gia vào quá trình chuyển hóa pyruvate, chuyển hóa nucleotide, vận chuyển kim loại ion [11] Gần đây nhất là nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc phòng thí nghiệm vi sinh, trường đại học Wageningen, Phần Lan vào tháng 7 năm

2015 [33] với nội dung 15 trình bày về số lượng nhiễm sắc thể của Thermococcus

kodakarensis KOD1, các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra nhận định rằng các

euryarchaeon Thermococcus kodakarensis là sinh vật kỵ khí dị dưỡng

Hyperthermophilic đặc trưng và do sự sẵn có của các hệ thống kỹ thuật di truyền nó đã trở thành một trong những sinh vật mẫu cho giới Archaea Mặc dù vai trò nổi bật này trong số các euryarchaeota, không sẵn có dữ liệu về mức độ sắp đặt trình tự của loài này Cấu tạo thể đa bội có nhiều trong euryarchaeota, đặc biệt là Halobacteria, số lượng bản sao nhiễm sắc thể của loài thuộc một trong các đơn vị trong đơn vị cấu

tạo nên giới đó, nghĩa là các Thermococcales (bao gồm Thermococcus spp và

Pyrococcus spp.) chưa bao giờ được xác định Trong nghiên cứu này, các nhà khoa

học chứng minh rằng T kodakarensis là sinh vật có cấu tạo đa bội với một số lượng

bản sao nhiễm sắc thể mà thay đổi trong khoảng 7-19 bản sao, tùy thuộc vào giai đoạn tăng trưởng [33] Còn rất nhiều các nghiên cứu khác trên thế giới về chủng vi

khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1, giải trình tự các đoạn gen của nó và ứng

dụng của nó trong nghiên cứu khoa học được đề cập trên các bài báo, tạp chí khoa học được công bố rộng trên các trang web đặc biệt là NCBI