Nghiên cứu ba dược liệu hướng tác dụng điều trị sỏi thận chuối hột kim tiền thảo rau om

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hệ thống phân loại thực vật theo Takhtajan 11 Bảng 1.2 Một số các hợp chất có trong những dược liệu thuộc chi Desmodium 16 Bảng 1.3 Một số các hợp chất có tr

BÙI MỸ LINH

NGHIÊN CỨU BA DƯỢC LIỆU

HƯỚNG TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ SỎI THẬN

Chuối hột-Kim tiền thảo-Rau om

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

TP Hồ Chí Minh - 2007

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong Luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả Luận án

Bùi Mỹ Linh

Trang phụ bìa

Lời cam đoan I

Mục lục II – III

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt IV-V

Danh mục các bảng VI-VII

Danh mục các hình, sơ đồ VIII-X

Danh mục các hợp chất phân lập, định danh XI

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về sỏi thận 3

1.1.1 Định nghĩa và phân loại sỏi thận 3

1.1.2 Cấu trúc hòn sỏi, nguyên nhân ảnh hưởng lên sự hình thành 4

1.1.3 Diễn biến của sỏi 6

1.1.4 Tình hình nghiên cứu, điều trị sỏi tiết niệu 6

1.2 Giới thiệu các dược liệu nghiên cứu 10

1.2.1 Chuối hột (CH) 10

1.2.2 Kim tiền thảo (KTT) 13

1.2.3 Rau om (RO) 19

1.3 Ứng dụng HPLC vào nghiên cứu hợp chất flavonoid 24

1.3.1 Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao vào nghiên cứu flavonoid 25 1.3.2 Phân lập flavonoid bằng kỹ thuật HPLC bán điều chế 26

1.3.3 Định tính flavonoid bằng phương pháp HPLC 28

1.3.4 Định lượng flavonoid bằng phương pháp HPLC 30

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu : Chuối hột, Kim tiền thảo, Rau om 32

2.2 và 2.3 Trang thiết bị và súc vật nghiên cứu 33

2.4 Dung môi - Hóa chất 34

2.5 Phương pháp nghiên cứu 34

2.5.1 Nghiên cứu về thực vật 34

2.5.2 Nghiên cứu về dược lý 35

2.5.3 Nghiên cứu về hóa học 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 44

3.1 Khảo sát thực vật học 44

3.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu: chuối hột, kim tiền thảo, rau om 44

3.1.2 Độ tinh khiết 55

3.2 Kết quả nghiên cứu thăm dò tác dụng sinh học 55

3.2.1 Thử nghiệm tác dụng lợi tiểu 55

3.2.2 Thử nghiệm tác động giãn cơ 58

3.2.3 Thử nghiệm tác động mòn sỏi 62

3.2.4 Thử nghiệm tác động kháng khuẩn 66

3.3 Kết quả khảo sát hoá học 67

3.3.1 Xác định hàm lượng K+ trong dược liệu 68

3.3.2 Thành phần hoá học và quy trình chiết xuất tổng quát 68

3.3.3 Khảo sát hoá học Chuối hột 70

3.3.4 Khảo sát hoá học Kim tiền thảo 73

3.3.5 Khảo sát hoá học Rau om 76

3.4 Xác định cấu trúc 80

3.4.1 Xác định cấu trúc các chất tinh khiết trong Chuối hột 80

3.4.2 Xác định cấu trúc các chất tinh khiết trong Kim tiền thảo 82

3.4.3 Xác định cấu trúc các chất tinh khiết trong Rau om 91

3.5 Định lượng và xây dựng tiêu chuẩn các dược liệu 102

3.5.1 Định lượng các dược liệu 102

3.5.1.1 Xác định hàm lượng chất tan trong cồn của Chuối hột 102

3.5.1.2 Định lượng isoschaftosid /Kim tiền thảo 102

3.5.1.3 Định lượng nevadensin /Rau om 106

3.5.2 Xây dựng tiêu chuẩn các dược liệu 110

3.5.2.1 Xây dựng tiêu chuẩn CH 110

3.5.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn KTT 111

3.5.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn RO 114

3.6 Thử nghiệm dược lý 117

3.6.1 Thử nghiệm dược lý các chất tinh khiết 117

3.6.2 Thử nghiệm độc tính cấp diễn 121

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 121

4.1 Bàn luận về thực vật và hoá phân loại thực vật 122

4.2 Bàn luận về kết quả thực nghiệm sinh học 122

Tác dụng lợi tiểu 123

Tác động giãn cơ 124

Tác động mòn sỏi và kháng khuẩn 125

Độc tính cấp diễn 127

4.3 Bàn luận về khảo sát hoá học 127

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 134

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ a TÀI LIỆU THAM KHẢO i - xii

PHỤ LỤC PL 1 - 9

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chloroform Acetonitril Carbon nuclear magnetic resonance

Doublet

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

Dimethyl sulfoxide Deuterated dimethyl sulfoxide Double quantum filtered correlation spectroscopy

Eau distillée Electron Impact Mass Spectrum Electro-Spray Ionization Mass Spectrum Ether ethylic

Ethyl acetate Ethanol Gas chromatography-mass spectrometry Glucose

Heteronuclear Multiple Bond Correlation Proton nuclear magnetic resonance Acidum aceticum

High performance liquid chromatography

Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển

Đường arabinose Giãn rộng

Butanol Cloroform deuterium hóa Chuối hột

Cloroform Acetonitril Phổ carbon Ký hiệu chuyển dịch hóa học Đỉnh đôi

Phổ DEPT Dimethyl sulfoxid (DMSO) DMSO deuteri-hóa

Phổ DQF-COSY

Diện tích đỉnh Nước cất Phổ khối EI Phổ khối EIS Ether ethylic Ethyl acetat Cồn

Sắc ký khí-khối phổ Đường glucose Phổ HMBC Phổ proton Acid acetic Sắc ký lỏng hiệu năng cao

part per million semipreparative-HPLC quartet

Reversed phase C-18 Retention time singlet

Solid phase extraction triplet

TetraMethyl Silane

Ultraviolet Xylose

Phổ HSQC

Hằng số ghép J Kim tiền thảo Sắc ký lỏng - Khối phổ Đỉnh đa

Aceton Metanol Khối phổ Cộng hưởng từ hạt nhân Detector dãy diod quang Phụ lục

Phân đoạn Phương pháp Phần triệu Sắc ký lỏng hiệu năng cao bán điều chế

Đỉnh 4 Rau om Pha đảo C-18 Thời gian lưu Đỉnh đơn Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng Chiết xuất pha rắn Đỉnh 3

Tetramethylsilan Thuốc thử

Phổ tử ngoại Đường Xylose

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại thực vật theo Takhtajan 11

Bảng 1.2 Một số các hợp chất có trong những dược liệu thuộc chi Desmodium

16

Bảng 1.3 Một số các hợp chất có trong dược liệu thuộc chi Limnophila

22 Bảng 1.4 Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm của L gratissima

23 Bảng 1.5 Một vài ví dụ phân lập flavonoid bằng PP HPLC bán điều chế

27 Bảng 1.6 Dãy hấp thu UV-Vis của flavonoid

29 Bảng 2.7 Đặc điểm các cao dược liệu trong thử nghiệm tính mòn sỏi

39

Bảng 2.8 Đặc điểm các cao dùng trong thử nghiệm tính kháng khuẩn

40

Bảng 3.9 Độ tinh khiết của Chuối hột, Kim tiền thảo và Rau om (%)

55 Bảng 3.10 Kết quả khảo sát tính lợi tiểu các phân đoạn dung môi/Chuối hột

56 Bảng 3.11 Kết quả khảo sát tính lợi tiểu phân đoạn dung môi/Kim tiền thảo

57 Bảng 3.12 Kết quả khảo sát tính lợi tiểu các phân đoạn dung môi/Rau om

58 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của Co, C1 và C7 /Chuối hột trên ruột cô lập

59

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của K1 , K2 và K7 /Kim tiền thảo trên / ruột cô lập

60

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của R1, R2 và R7 của Rau om trên ruột cô lập 61

Bảng 3.16 Số liệu thử nghiệm của các viên sỏi ngâm trong cao nước CH

Bảng 3.24 Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của Ds3 phân lập từ Kim tiền thảo 87

Bảng 3.25 Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của Ds5 phân lập từ Kim tiền thảo

88

Bảng 3.26 Số liệu phổ 13C và 1H-NMR của phần đường trong flavon C-

Glycosid từ Kim tiền thảo (400 MHz,500, MHz DMSO-d6,  ppm) 89

Bảng 3.27 Sự tương tác cộng hưởng trong phổ 1H và 13C-NMR của Ds 6 90

Bảng 3.28 Thành phần và hàm lượng các chất trong tinh dầu Rau om (S1)*

92

Bảng 3.29 Bảng so sánh chuyển dịch hoá học carbon của L 1và acid betulinic 93

Bảng 3.30 Những số liệu phổ H C-NMR của L 4 95

Bảng 3.31 Những số liệu phổ 1H 13C-NMR của L 2 97

Bảng 3.32 Những số liệu phổ 1H 13C NMR của L 5 99

Bảng 3.33 Chuyển dịch hoá học 13C-NMR của L 4 , L 2 , L 5 và Nevadensin 99

Bảng 3.34 Cấu trúc của các flavonoid chiết xuất từ Rau om

100

Bảng 3.35 Các dữ liệu phân tích các flavonoid trong dịch chiết EtOH/RO 101

Bảng 3.36 Kết quả xác định chất tan trong cồn của Chuối hột

102

Bảng 3.37 Kết quả HPLC của dung dịch isoschaftosid đối chiếu

104

Bảng 3.38 DTĐ trung bình hàm lượng isoschaftosid đối chiếu / mẫu tiêm

104

Bảng 3.39 Hàm lượng isoschaftosid (iso.) trong dịch chiết Kim tiền thảo

105

Bảng 3.40 Kết quả phân tích DD nevadensin đối chiếu trên máy HPLC

108 Bảng 3.41 DTĐ trung bình tương ứng với hàm lượng nevadensin đối chiếu 108

Bảng 3.42 Hàm lượng nevadensin trong dịch chiết Rau om 109

Bảng 3.43 Kết quả thử nghiệm tính lợi tiểu của các chất M 1 , Ds 1 , Ds 2 , L 2

118

Bảng 3.44 Ảnh hưởng của các mẫu M 1 và Ds 2 trên ruột cô lập

119

Bảng 3.45 Ảnh hưởng của các mẫu L 1 , L 2 và L 3 trên ruột cô lập

120

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Chuối hột A Cây Chuối hột B Hoa chuối (cắt dọc) C Hoa chuối

12

Hình 1.2 Các bộ phận của cây Kim tiền thảo 15

Hình 1.3 Cây Rau om A Cành mang hoa B Hoa C Nhị D Bầu nhụy

21

Hình 2.4 Lồng biến dưỡng

36

Hình 2.5 A Chuột được mổ bụng để lấy phần ruột dùng cho thử nghiệm B

Đoạn ruột cô lập được nhúng vào dung dịch nuôi (DD Tyrode)

38

Hình 3.6 A Nải chuối hột B Quả chuối hột cắt ngang C Hạt Chuối hột 43

Hình 3.8 Cây Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium) 45

Hình 3.9 Hình chụp vi phẫu lá và thân Kim tiền thảo 47

Hình 3.10 Lông tiết và lông che chở đa bào của Kim tiền thảo 47

Hình 3.11 Tinh thể calci oxalat hình trụ của thân Kim tiền thảo 47

Hình 3.12 Hình vẽ vi phẫu lá Kim tiền thảo 48

Hình 3.13 Hình vẽ vi phẫu thân Kim tiền thảo 49

Hình 3.15 Cây Rau om (Limnophila aromatica) 51

Hình 3.16 Vi phẫu Rau om A Vi phẫu lá B Vi phẫu thân C Vi phẫu thân

(phần tủy) D Lông tiết tinh dầu ở lá E Mảnh biểu bì mang lông…

52

Hình 3.17 Soi bột Rau om 53

Hình 3.18 Hình vẽ vi phẫu lá Rau om 53

Hình 3.19 Hình vẽ vi phẫu thân Rau om 54

Hình 3.20 SK đồ HPLC và phổ UV của Ds3 (1), Ds5 (2), Ds6 (3) 76

Hình 3.21 Công thức cấu tạo của M 1 (sitosterol 1 và stigmasterol 2) 81

Hình 3.22 Công thức cấu tạo của propelargonidin (M2) từ Chuối hột 82

Hình 3.23 Các flavon C-glycosid phân lập từ Kim tiền thảo 90

Hình 3.24 Sự tương tác HMBC của proton với các vòng A, B và C của L4

95 Hình 3.25 Sự tương tác HMBC của proton với các vòng A, B và C của L2/RO 97 Hình 3.26 Cấu trúc của các flavonoid chiết xuất từ Rau om 100

Hình 3.27 Tương tác HMBC giữa proton và vòng A của L5 /RO 100

Hình 3.28 Sắc ký đồ HPLC của isoschaftosid trong DD đối chiếu

103 Hình 3.29 Sắc ký đồ HPLC của các flavonoid có trong dịch chiết KTT

104 Hình 3.30 Đường cong chuẩn của isoschaftosid 105

Hình 3.31 Sắc ký đồ HPLC của nevadensin chuẩn trong DD đối chiếu 107

Hình 3.32 Sắc ký đồ HPLC của các flavonoid có trong dịch chiết Rau om 107

Hình 3.33 Đường cong chuẩn của nevadensin

108

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết xuất chung của 3 dược liệu Chuối hột, Kim tiền thảo,

MỞ ĐẦU

Sỏi thận là một trong những bệnh thường gặp ở nước ta và một số nước khác trên thế giới Mỗi năm ước tính có khoảng 1/5000 dân số thế giới bị phát hiện có sỏi Bệnh xuất hiện ở nhiều nơi đặc biệt ở vùng nhiệt đới, tuy nhiên lại ít gặp ở Châu Phi Ở châu Mỹ tỷ lệ mắc bệnh trung bình là 2/1000 Bệnh cũng có tỷ lệ khá cao ở phía Nam Trung Quốc, Indonesia, Thái Lan, Ấn Độ, Pakistan, Hy Lạp, Anh Quốc và bán đảo Scandinavi [31]

Tùy theo tính chất lý hóa, kích thước và vị trí của viên sỏi mà có nhiều cách điều trị khác nhau, có thể dùng nội khoa hoặc ngoại khoa Dựa vào sự phân tích thành phần hoá học cuả viên sỏi và xác định nguyên nhân từng loại sỏi người ta có thể dùng một số thuốc để điều trị như thuốc mòn sỏi, thuốc lợi tiểu, thuốc giãn cơ v.v Các trường hợp không dùng thuốc được thì phải can thiệp bằng ngoại khoa như: nội soi tiết niệu, tán sỏi qua da, tán sỏi ngoài cơ thể, mở bể thận lấy sỏi… Tuy nhiên các phương pháp này đều ít nhiều để lại biến chứng tổn hại cho bệnh nhân và bệnh rất hay bị tái phát [53]

Bên cạnh các phương pháp và thuốc điều trị đã có, các nhà nghiên cứu vẫn tiếp tục tìm kiếm các chất có tác dụng điều trị sỏi từ nguồn gốc thiên nhiên, vì đây là một xu hướng có nhiều ưu điểm như hiệu quả, ít phản ứng phụ, giảm thiểu tái phát và nhất là phổ biến dễã dàng đến mọi tầng lớp trong xã hội

Tình hình kinh tế nước ta và khả năng tài chính cuả đa số bệnh nhân chưa cho phép áp dụng một cách đại trà các thành tựu cuả y học thế giới trong lãnh vực điều trị bệnh sỏi, người dân vẫn thường dựa vào kinh nghiệm dân gian với các cây thuốc sẵn có trong nước như Kim tiền thảo, Râu mèo, Trạch tả, Rau om, Chuối hột, Cỏ tranh v.v [25] Các dược liệu này được sử dụng khá rộng rãi và đã mang lại nhiều kết quả Kim tiền thảo và Rau om đã được một số xí nghiệp

trong và ngoài nước bào chế thành các chế phẩm để cung cấp cho người bệnh Tuy nhiên, thành phần hoạt chất trong cây, các phương pháp kiểm nghiệm của những dược liệu này vẫn chưa được nghiên cứu nhiều Để nâng cao hiệu quả điều trị, các cây thuốc này vẫn phải cần nhiều nghiên cứu để chứng minh tác dụng, thành phần hoạt chất cũng như dạng dùng thích hợp

Với truyền thống “Nam dược trị Nam nhân” [30], nhằm góp phần chứng minh thành phần tác dụng và công dụng của các cây thuốc điều trị sỏi thận trong kho tàng cây thuốc phong phú của Việt Nam bằng các thực nghiệm khoa học hiện đại, trong khuôn khổ của một luận án tiến sĩ chuyên ngành Đông dược và

Thuốc Nam, chúng tôi đặt vấn đề “Nghiên cứu ba dược liệu hướng tác dụng điều

trị sỏi thận Chuối hột, Kim tiền thảo và Rau om” với các nội dung chính như sau:

1 Khảo sát về mặt thực vật học giúp nhận định chính xác dược liệu

2 Khảo sát tác dụng sinh học giúp xác định các phân đoạn có hoạt tính

3 Khảo sát thành phần hóa học của các dược liệu bao gồm: phân lập, xác định cấu trúc các chất nằm trong các phân đoạn có tác dụng, làm cơ sở cho việc xây dựng phương pháp kiểm nghiệm, thử tác dụng sinh học và nghiên cứu chế phẩm sau này

4 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm và phương pháp thử cho các dược liệu

Các nội dung nêu trên được thực hiện nhằm góp phần chứng minh và nâng cao hiệu quả điều trị của các dược liệu sẵn có trong nước, phát triển nguồn dược liệu cho nước nhà

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ SỎI THẬN

1.1.1 Định nghĩa và phân loại sỏi thận

Bệnh sỏi đường tiết niệu nói chung và bệnh sỏi thận nói riêng là bệnh thường hay gặp ở đường tiết niệu Bệnh do các thành phần hòa tan trong nước tiểu-ở các điều kiện lý hóa nhất định, hay do những rối loạn về mặt sinh lý bệnh học có kèm theo những yếu tố thuận lợi như giảm lưu lượng nước tiểu, nhiễm khuẩn tiết niệu, dị dạng đường tiết niệu hoặc có yếu tố di truyền-sẽ kết tinh từ một nhân nhỏ rồi lớn dần thành sỏi [31]

Về mặt phân loại người ta chia sỏi thận ra làm nhiều nhóm do sự khác nhau về cấu tạo và sinh bệnh học [1], [31]

- Sỏi calci: hầu hết các sỏi có chứa calci thường kết hợp với oxalat, phosphat

hay đôi khi với acid uric Các loại sỏi này có tính cản quang, sỏi calci oxalat và calci phosphat thường có màu đen, xám hay trắng, kích thước nhỏ (dưới 1 cm), nặng, có cạnh sắc

- Sỏi acid uric: thành phần gồm acid uric và urat, sỏi này thường tròn, nhẵn, màu

vàng cam gần như không cản quang trừ khi hỗn hợp với sỏi calci hay sỏi struvit

- Sỏi struvit: đây là chất kết tinh tạo ra từ magnesi amoni phosphat Sỏi

thường có kích thước to, hình san hô, màu trắng ngà, có tính cản quang

- Sỏi cystein: thành phần chính là cystein, thường tròn, có màu vàng lục, tính

cản quang trung bình

Trong các nhóm này thì sỏi calci oxalat thường chiếm tỷ lệ cao nhất, khoảng 70-90% Sỏi acid uric thường gặp ở các quốc gia có nền công nghiệp phát triển

Cũng có tài liệu phân sỏi thận-tiết niệu ra làm 2 nhóm: sỏi có calci và sỏi không có calci Đối với nhóm sỏi có calci thì nguyên nhân chính là do nước tiểu quá bão hoà muối calci do tăng hấp thu calci trong thức ăn ở ruột hoặc tăng tái hấp thu calci ở ống thận Xét nghiệm nước tiểu sẽ thấy calci niệu tăng rất cao Nguyên nhân thứ hai là nước tiểu quá bão hoà oxalat trong trường hợp dùng quá nhiều rau chút chít, đại hoàng, hoặc ngộ độc vitamin C Nguyên nhân thứ ba là giảm citrat niệu khi bị toan máu, nhiễm khuẩn tiết niệu, hạ kali máu Citrat niệu có tác dụng ức chế kết tinh các muối calci Sỏi không có calci là sỏi cystein, sỏi acid uric, sỏi struvit Sỏi cystein là do cystein bị đào thải nhiều ra nước tiểu nhưng ít hoà tan nên dễ đọng thành sỏi Sỏi struvit là do đường tiết niệu bị nhiễm khuẩn lâu dài, vi khuẩn phóng thích men urease gây phân giải ure, gia tăng sự tổng hợp amoniac trong nước tiểu

Thuật ngữ “sỏi tiết niệu” được dùng để gọi chung sỏi ở hệ tiết niệu bao gồm sỏi ở thận, niệu quản, bàng quang và niệu đạo tuỳ theo vị trí hình thành Thận là cơ quan bị sỏi nhiều nhất, thận còn là nơi khởi phát của sỏi niệu quản hay sỏi bàng quang v.v…

Do đó trong tài liệu này sỏi tiết niệu được gọi chung là sỏi thận

1.1.2 Cấu trúc của hòn sỏi và những nguyên nhân ảnh hưởng lên sự hình thành sỏi [31]

Người ta nhận thấy cấu trúc đặc thù của một hòn sỏi gồm 2 thành phần:

- Mucoprotein: tác dụng như chất keo kết dính các tinh thể với nhau để tạosỏi

- Các chất hình thành nên tinh thể chủ yếu là calci và oxalat Bên cạnh đó còn có các chất như magnesi, phosphat, urat, cystein

Khi nước tiểu bị cô đặc hoặc khi pH của nước tiểu thay đổi thì các chất hòa

tan trong nước tiểu sẽ kết tinh lại thành các tinh thể, các tinh thể này sẽ bị thải trừ theo dòng nước tiểu Khi có chất mucoprotein thì các tinh thể sẽ liên kết được với nhau để tạo ra hòn sỏi

Những nguyên nhân ảnh hưởng lên sự hình thành sỏi [31]

- Sự hiện diện quá nhiều của những chất tương đối kém hòa tan trong nước tiểu như: calci, oxalat, acid uric, cystein

- Giảm lưu lượng nước tiểu: thường gặp ở những người có thói quen uống ít nước, không dám uống nhiều nước vì lý do bệnh lý (nằm liệt giường), thường xuyên mất nước qua mồ hôi và hơi thở vì làm việc trong môi trường nóng bức

(vận động viên, công nhân ) [6], [8], [84]

- Bế tắc đường tiểu do nhiều nguyên nhân: bướu lành tiền liệt tuyến, bị di chứng hẹp niệu đạo sau một chấn thương, bị bế tắc đường tiểu do bẩm sinh

- Dị vật trong đường tiểu như: ống thông bọng đái hoặc ống thông thận để lâu ngày, chỉ khâu loại không tan

- Rối loạn thành phần nước tiểu: mỗi loại sỏi hình thành trong một môi trường

pH khác nhau Nếu môi trường nước tiểu bị kiềm hóa quá độ (người bị loét bao tử dùng kéo dài các loại thuốc chống acid, nhiễm trùng đường tiểu kéo dài bởi vi

khuẩn Proteus .) thì dễ bị sỏi calci phosphat, magnesi amoni phosphat Ngược

lại, nếu pH nước tiểu trở nên acid thì thuận lợi cho sỏi uric và urat kết tinh

- Kết thể Carr: ở những người hay bị sỏi tái phát, Carr nhận thấy ở đầu những ống tập trung xung quanh gai thận có những hạt sỏi nhỏ, tròn, cứng Các kết thể này được cấu tạo bởi calci phosphat và mucoprotein, có thể là nhân của viên sỏi sau này [87]

- Đám Randall: bình thường tháp đài thận nhẵn nhụi do đó sỏi khó kết hợp Khi thận bị tổn thương như viêm đài bể thận, viêm thượng bì đài thận, tháp đài thận

bị mòn lở thì tinh thể bị kết lại ở tháp đài thận và tạo thành những đám vôi hóa Sau đó đám vôi hoá bong ra và rớt xuống đài thận tạo thành sỏi nhỏ Sau khi đám vôi bong ra khỏi tháp đài thận làm cho tháp đài thận trở nên xù xì, đây là nơi để sỏi mới tiếp tục hình thành [87]

- Hoại tử tế bào thận: khi tháp đài thận bị hoại tư,û đám tế bào này bong ra tạo

những nhân khởi điểm đóng vai trò nòng cốt cho các chất hòa tan trong nước tiểu

như calci đóng xung quanh và tạo ra sỏi

Trên thực tế sự hình thành sỏi tiết niệu luôn luôn là sự phối hợp, bổ sung và hỗ trợ lẫn nhau của các cơ chế trên

Ngoài cơ chế chung hình thành sỏi như trên, mỗi loại sỏi còn có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến sự hình thành của chúng [102]:

- Sỏi cystein: hình thành do khuyết tật của việc tái hấp thu ở ống thận, do rối

loạn chuyển hóa, do chế độ ăn nhiều purin hay do pH nước tiểu xuống dưới 5,3

- Sỏi amoni magnesi phosphat: hình thành khi có sự tăng tiết calci phosphat và

amoni, kèm theo sự tăng pH nước tiểu (trên 7,2) thường do vi khuẩn tạo ra nên còn gọi là sỏi vi khuẩn

- Sỏi calci, hay gặp nhất là sỏi calci oxalat và calci phosphat: nguyên nhân của

sỏi này rất phức tạp còn nhiều khía cạnh chưa được rõ

1.1.3 Diễn biến của sỏi

Theo nhiều tác giả, sau khi hình thành, nếu hòn sỏi nhỏ (< 8 mm) thì thông thường sẽ đi theo dòng nước tiểu xuống bàng quang và được tống ra ngoài [1] Nhưng nếu hòn sỏi bị vướng lại ở một vị trí nào đó trên đường tiết niệu thì sẽ to dần ra tại chỗ, cản trở đường lưu thông nước tiểu, gây ứ đọng, căng chướng ở phía trên dòng Ngô Gia Hy và Nguyễn Thúc Tùng nhận thấy nhiều sỏi vẫn thoát ra ngoài được sau một thời gian điều trị Nếu điều trị bằng nội khoa thất bại thì sự ứ đọng của nước tiểu lâu ngày sẽ đưa đến biến chứng chướng nước tiểu, nhiễm trùng, phát sinh ra các hòn sỏi khác, suy thận cấp, suy thận mãn, vỡ thận [2],[22], [32]

1.1.4 Tình hình nghiên cứu và điều trị sỏi tiết niệu trên thế giới và trong nước

1.1.4.1 Trên thế giới

Sỏi đường tiết niệu đã được nhận biết từ rất lâu Richer có nêu là tìm thấy sỏi ở khung chậu (có lẽ là sỏi bàng quang) trên xác người Ai Cập cổ trên 7000 năm Hypocrate, ông tổ của y học (300-400 BC) đã có mô tả về bệnh sỏi thận Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20 đã phát minh ra X-quang và ứng dụng vào máy soi bàng quang, máy kẹp sỏi cơ học Năm 1932, Routree đã tìm ra phương pháp chụp UIV (chụp X-quang niệu đồ tĩnh mạch), ngoài đánh giá chức năng của hệ

tiết niệu, còn góp phần xác định vị trí sỏi

Giữa thế kỷ 20, Hamburger và Higgins đã có nghiên cứu về dịch tễ học với công trình vẽ bản đồ vùng sỏi trên thế giới Các tác giả khác cũng nhận thấy chế độ ăn có liên quan đến sự hình thành sỏi acid uric King và Prion (1974) đã khuyến cáo tần suất gia tăng sỏi tiết niệu ở những nước phát triển do ăn nhiều

chất bổ dưỡng

Năm 1980 đánh dấu một cuộc cách mạng trong điều trị sỏi thận bằng máy tán sỏi ngoài cơ thể (TSNCT) Chaussy C.H., Schmied E ứng dụng đầu tiên trên lâm sàng với kết quả là 80-90% trường hợp thành công Kỹ thuật này liên tục

được cải tiến và hoàn thiện [55], [106], [107]

Tuy nhiên mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng Theo Tveter thì

tán sỏi ngoài cơ thể có nguy cơ bị nhiễm trùng, ảnh hưởng đến chức năng thận Das G cho biết sau tán sỏi ngoài cơ thể thì tỉ lệ men N-acetylglycizaminadase (NAG) tăng lên sau 24 giờ đầu do tổn thương lớp biểu mô ống thận Sau tán sỏi đại đa số đi tiểu ra máu, tỉ lệ ra máu đi đôi với số lần phát sóng [39], [53] Ngoài ra, Kamihira còn cho biết tỷ lệ tái phát sau tán sỏi là 20,33% sau 6-

10 tháng; 41,8% sau 5 năm [39] Trần Đức Hòe cũng có báo cáo những tai biến sau phá sỏi ngoài cơ thể [21] Bên cạnh với việc điều trị bằng các thủ thuật, người ta cũng nghiên cứu nhiều phác đồ điều trị nội khoa “Bệnh của sỏi” VD: dùng piperazin citrat chữa sỏi thận [10], dùng Renacidin bơm vào niệu quản làm tan sỏi calci phosphat hay amoni magnesi phosphat Tuy nhiên Renacidin làm tổn thương mô niệu quản nên phương pháp này không được nhiều tác giả chấp nhận Yoshimasa H và cộng sự đã dùng dung dịch Thiopronin làm tan được sỏi

cystein [96] Năm 1987, Wei đã kết hợp điều trị dùng Hydrochlorothiazid,

Triamterene [52], Allopurinol và kiềm hóa nước tiểu ở những bệnh nhân bị sỏi

có pH thấp, kết quả 74% sỏi ở niệu quản và 60% sỏi thận đã biến mất [59],[90]

Năm 1997, Vaessen và cộng sự đã điều trị nội khoa sỏi tiết niệu cho biết dùng kháng sinh nên được ưu tiên hàng đầu, sau cơn đau nên dùng lợi tiểu nhẹ [90]ï

Việc dùng thuốc làm giảm co thắt cũng đã được bàn luận và sử dụng [87] Gần đây người ta dùng thuốc Magurlit, một chế phẩm dạng cốm của Hungary với thành phần chủ yếu là magie citrat, kali citrat, vitamin B6 để điều trị sỏi tiết niệu, với cơ chế làm tăng pH của nước tiểu (làm tan các sỏi acid uric hoặc kèm theo khoảng 20% sỏi calci oxalat) [103]

Trong việc điều trị sỏi bằng dược liệu, Galen đã dùng rượu vang, mật ong,

ngò tây và hạt Cà rum Tại Trung Quốc, trong sách “Thiên Gia Diệu Phương” đã

giới thiệu 11 bài thuốc chữa các bệnh về sỏi như Giáng Thạch Thang, Chân Kim Thang gia giảm, Kim Hải Bài Thạch Thang.v.v kết quả là bệnh nhân đi tiểu ra sỏi khoảng 56-70% [27]

Nhiều tác giả ở Nhật Bản đã nghiên cứu một số tập quán ăn uống có ảnh hưởng đến việc phòng và điều trị bệnh sỏi đường niệu [40], [56], [66] Một số khoa tiết niệu của bệnh viện kết hợp với các trường đại học ở Nhật nghiên cứu

đề tài “Tác dụng ức chế in vitro và in vivo trên sự kết tinh sỏi calci oxalat và sự

hình thành sỏi tiết niệu” Trong 16 vị thuốc nghiên cứu có 2 vị là trạch tả và hạ

khô thảo có tác dụng ức chế in vitro nhưng chỉ có trạch tả là có tác dụng in vivo

1.1.4.2 Sơ lược tình hình nghiên cứu và điều trị sỏi tiết niệu ở Việt Nam

Theo Ngô Gia Hy, Việt Nam cũng nằm trong bản đồ vùng sỏi do Hamburger và Higgins lập ra Việc nghiên cứu về sỏi tiết niệu chủ yếu tại 3 bệnh viện (BV) lớn ở nước ta (BV Việt Đức, BV Bình Dân, BV 108) Kết quả cho thấy tại phòng khám tiết niệu BV Việt Đức có tới 38% bệnh nhân tới khám bị sỏi niệu, 42% phẫu

thuật là do sỏi BV Bình Dân có 35% số bệnh nhân nội trú bị sỏi niệu [22]

Với những máy móc hiện đại hiện nay thì việc phân tích thành phần hoá học của sỏi tiết niệu đã được thực hiện rất nhiều như: Sỏi đường tiểu và pH nước tiểu của các tu sĩ Phật giáo (Nguyễn Đệ, Ngô gia Hy, 1968), Xác định thành phần hoá học sỏi (Đặng Hanh Phức, Đỗ Đình Hồ, 1973), Sỏi san hô (Trần Ngọc Sinh), Phân loại sỏi bằng phổ hồng ngoại và phổ tán xạ Raman (Trần Thanh Nhãn, 2004) … Tuệ Tĩnh với tác phẩm “Nam Dược Thần Hiệu” có đề cập đến một vài

vị thuốc có tác

dụng lợi tiểu giúp tiểu ra sỏi như cỏ tranh, trạch tả, hoạt thạch [30]

Trong kho tàng thuốc dân tộc và kinh nghiệm dân gian ở nước ta có rất nhiều cây thuốc và vị thuốc có tác dụng chữa sỏi thận như: [4], [7], [9], [24],[34]

- Dứa dại (quả) : Fructus Pandani

- Lá dang (lá và dây) : Folium et Ramulus aganonerionis

- Chuối hột (hạt) : Semen Musae balbisianae

- Chó đẻ (toàn cây) : Herba Phyllanthi

- Đu đủ (rễ) : Radix Caricae papayae

- Đơn kim (toàn cây) : Herba Bidentis pilosae

- Rau om (toàn cây) : Herba Limnophilae aromaticae

- Rau ngót (lá) : Folium Sauropi androgini

- Bí đao (quả) : Fructus Benicasae hispidae

- Kim tiền thảo (toàn cây) : Herba Desmodii styracifolii

Năm 1968, Ngô Gia Hy và cộng sự đã báo cáo về tác dụng điều trị sỏi niệu quản bằng truyền dịch ngọt kết hợp với khellin, hoạt chất được chiết từ cây

Ammis visnaga, có tác dụng làm giãn cơ trơn giúp giảm đau và bài xuất sỏi [22]

Năm 1985 bệnh viện Y Học Dân Tộc tỉnh Hậu Giang kết hợp với trường Đại học Cần Thơ nghiên cứu về cây Rau om trong chế phẩm Hoàn sạn thận dùng trị bệnh sỏi thận, thuốc rất được nhân dân tín nhiệm [13]

Năm 1999, Học viện Quân Y 103 có đề tài nghiên cứu tác dụng điều trị sỏi

niệu quản bằng thuốc thảo mộc (thành phần chủ yếu là Kim tiền thảo, Ngưu tất, Hoàng bá, Đan sâm) có kết quả trên 66% bệnh nhân

Năm 2001, Dương Minh Sơn trong luận án tiến sĩ: “Nghiên cứu tác dụng của bài thuốc Thạch kim thang trong điều trị sỏi niệu quản” đã nghiên cứu bài thuốc với các vị như Kim tiền thảo, Trạch tả, Râu mèo, Kê nội kim, Uất kim và Hoạt thạch trên 70 bệnh nhân, kết quả 70,59% bệnh nhân khỏi bệnh [16], [27]

1.2 GIỚI THIỆU CÁC DƯỢC LIỆU NGHIÊN CỨU

Các dược liệu nghiên cứu gồm có: Chuối hột, Kim tiền thảo và Rau om Trong tài liệu này chúng tôi chọn hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan để trình bày vị trí các loài trong hệ thống sinh thực vật (Bảng 1.1) [46],[92]

- Đặc điểm chi Musa: theo Gagnepain, chi Musa có 42 loài, phân bố chủ yếu ở

vùng nhiệt đới, mọc hoang hay trồng tại nhiều nơi ở Châu Á ( Đông Dương), Châu Mỹ (Trung và Nam Mỹ) [104]

Chi Musa gồm những cây thân thảo lớn, có thân rễ mọc ngầm dưới đất, sống

nhiều năm Lá mọc xoắn ốc gồm các bẹ lớn ôm lấy nhau tạo thành thân giả, cuống lá dài, phiến lá nguyên, gân lá lông chim, có gân phụ song song Cụm hoa là 1 bông có nhiều lá bắc rất to màu đỏ mọc ở ngọn cây Hoa ở kẽ mỗi lá bắc, có

khoảng 20 hoa xếp thành 1 “nải” có 2 tầng Hoa không đều, lưỡng tính Những hoa ở phần gốc là hoa cái, phần giữa là hoa lưỡng tính, phần trên là hoa đực Bao

hoa có màu gồm 2 vòng với 3 lá đài, 2 cánh hoa thừơng và 1 cánh hoa biến đổi thành cánh môi, 5 nhị, 3 lá noãn, bầu hạ 3 ô, đính noãn trung trụ, vòi dài Quả mọng, nạc, còn mang dấu vết của vòi nhụy Hạt có ngoại nhũ và nộâi nhũ [9],[105]

- Ở Việt Nam, chi Musa có 11 loài và thêm1 loài phụ, đó là:

M acuminata Colla : Chuối hoang nhọn

M bakeri Hook f

M balbisiana Colla : Chuối hột

M chiliocarpa Back : Chuối trăm nải

M coccinea Andr (= M uranoscopes Lour.) : Chuối sen

M glauca Roxb (= M martini R de Noter) : Chuối cô đơn

M nana Lour : Chuối già lùn

M ornata Roxb ( M rubra Wall) : Chuối kiểng đỏ

M paradisiana L : Chuối xiêm

M paradisiana L spp normalis : Chuối ngự

M sanguinea Hook f : Chuối kiểng đỏ

M textilis Nees : Chuối sợi [9], [19]

- Cây Chuối hột

Tên khác: Chuối chát

Tên khoa học: Musa balbisiana Colla, Musaceae

Đồng danh : Musa brachycarpa Back [34], Musa seminifera Lour [98]

Chuối hột có thân giả cao 2-4 m, to, màu xanh, lá có thể dài đến 1 m, có phiến to hơi mốc, bẹ xanh Phát hoa to mọc từ giữa thân giả “Mo” màu đỏ sẫm, hình bẹ

“không quấn ngược lên” Quả có cạnh đính thẳng góc với trục, thịt quả nạc

chứa nhiều hạt, hạt hình cầu to 4-5 mm

Hàng năm từ gốc cây mẹ thường mọc lên 1-3 chồi Ngoài ra hạt chuối hột còn có khả năng nảy mầm để tạo thành cây con

Cây thường mọc hoang nơi đất thấp và được trồng để lấy lá, quả và hạt thu hái quanh năm Về giá trị nguồn gen, chính Chuối hột là xuất xứ của một vài loài chuối trồng hiện nay Do đó Chuối hột là đối tượng đáng lưu ý trong kế hoạch bảo tồn nguồn gen [18], [34], [109][110]

1.2.1.2 Hoá học

Các tài liệu nghiên cứu cho thấy trong hạt Chuối hột có:

- Phytosterol: cycloartenol, cycloeucalenol, 24-methylen cycloartenol, stigmasterol,

sitosterol; trong đó sitosterol chiếm 72% [54], cyclomusalenon (Trương Bích Ngân), sitosterol-3-O-β-D glucopyranosid (Đỗ Quốc Việt) Năm 1992, Ali M., Asari S H phát

β-hiện 1 sterol mới là 24-methyl choles 1-(2)-7-dien-3-on-5-ol [36], [37]

- Diterpenoid (cấu trúc neocleodan): năm 1992, Ali & cộng sự cũng đã tìm ra 3

chất có cấu tạo diterpenoid là Musabalbisianes I, II, III

- Hydrocarbon: cũng trong năm 1992 ông và cộng sự công bố 1 hydroxy ceton

là n-octacosan 1-ol-22-on

- Proanthocyanidin: trong Chuối hột có proanthocyanidin [109]

1.2.1.3 Tác dụng dược lý-công dụng

Chuối hột có tác dụng giải độc, lợi tiểu, giảm đau và sát trùng Quả chuối hột chín được cán mỏng đem phơi khô hoặc sao vàng hạ thổ vài ngày rồi đem sắc hoặc hãm hay ngâm rượu để uống, có thể dùng dạng thuốc bột Có người chỉ dùng hạt phơi khô tán thành bột uống Công dụng chữa bệnh sỏi thận, sỏi mật,

một số bệnh đường ruột Trị đau lưng, sỏi thận bằng cách dùng chuối hột (hạt),

ngày uống 4-6 gam, dạng thuốc bột, hay thuốc rượu [9]

1.2.2 Kim tiền thảo (KTT)

1.2.2.1 Thực vật học

- Vị trí phân loại: Kim tiền thảo thuộc thực vật bậc cao, ngành Ngọc lan, lớp

Ngọc lan, phân lớp Hoa hồng, liên bộ Đậu, bộ Đậu, họ Đậu, chi Desmodium [9],

[24], [34], [46]

- Đặc điểm chi Desmodium: Theo Lecomte chi Desmodium có 130 loài, hơn 50 loài ở Aán Độ thuộc Anh (cũ), 30 loài ở Châu Á [104] Theo Dy Phon chi

Desmodium có khoảng 300 loài phân bố khắp nơi ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới

Châu Phi, Trung Mỹ (Mexique), Nam Mỹ, Châu Á và Châu Đại Dương đến tận Tân Guinée Riêng ở Châu Á thấy có ở Miến Điện, Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Sri Lanca, Thái Lan và Việt Nam [101]

Chi Desmodium Desv chủ yếu là cây thân thảo, cây nửa bụi, cây bụi, cây

leo, lá thường là lá kép, luôn luôn có lá kèm Hoa lưỡng tính hợp thành chùm, tán hoặc bông Hoa đều, 4-5 lá đài thường hợp thành ống (đều hay không đều) Tràng hình cánh bướm gồm 5 cánh tiền khai cờ Bộ nhị gồm 10 nhị, có 9 nhị dính nhau thành hình lồng máng, quả thắt lại giữa các hạt Hạt có cây mầm congï, không có nội nhũ Cây ưa sáng, ưa ẩm nhưng cũng có thể chịu được khô hạn Cây thường mọc thành đám ven rừng, độ cao dưới 600 mét Về mùa đông cây có hiện tượng rụng lá hoặc tàn lụi [34]

Theo Phạm Hoàng Hộ, ở Việt Nam chi Desmodium có 58 loài phân bố nơi

ẩm, bình nguyên, khắp nơi có độ cao đến 600 m [19]

Một số loài thuộc chi Desmodium thường gặp ở Việt Nam:

D biarticulatum (L.) Muell : Hàn the cây

D blandum Van Meeuwen : Đồng tiền lông

D cephalotes (Roxb.) Wight & Arn : Niễng đực

D elegans (Lour.) Benth : Chuỗi tiền

D gangeticum (Lour.) DC : Thóc lép

D gyrans (L f) DC : Điện tính, Hồng đậu dao động

D heterophyllum (Willd.) DC : Cây hàn the

D pulchellum Benth : Chuỗi tiền

D polycarpum DC : Phấn tàu

D reticulatum Champ.ex Benth : Thóc lép mạng

D styracifolium (Osb.) Merr : Kim tiền thảo

D triangulare (Retz.) Merr : Ba chẽ

D triquetrum DC : Cây mũi mác

- Cây Kim tiền thảo [9], [24], [34], [101]

Tên khác : Kim tiền, Vẩy rồng, Mắt trâu

Tên khoa học: Desmodium styracifolium (Osb.) Merr., Fabaceae

Đồng danh: Hedysarum styracifolium Osb (1757), Hedysarum retroflexum L (1767), Desmodium retroflexum (L.) DC (1825), Desmodium capitatum (Burm f.)

DC (1825), Nicolsonia styracifolia (Osb.) Desvaux (1826), Pseudathria capitata (Burm f.) Hassk., Uraria retroflexa (L.) Drake (1891), Meibomia capitata (Burm

f.) O Kuntze (1891), Desmodium celebicum Sch (1925) [34], [98],[104],[108]

Cây Kim tiền thảo thuộc loại cây nhỏ 40-80 cm, mọc bò Thân rạp xuống đâm rễ ở gốc và mọc đứng Cành non hình trụ, khía vằn và có lông nhung màu

gỉ sắt Lá kép mọc so le gồm 3 lá chét dài 2,5-4,5 cm; rộng 2-4 cm Lá chét giữa hình mắt chim, các lá chét 2 bên hình bầu dục, mặt trên lá nhẵn mặt dưới có lông trắng mượt và mềm Cụm hoa là chùm ở nách lá hay ở ngọn, có lông mềm màu hung, thường có lá kèm Hoa màu hồng xếp 2-3 cái một Quả thõng (tràng quả) có 4-6 đốt

Hoa tháng 6-9, quả tháng 9-10 [9]

Cây mọc hoang ở các vùng núi, thường gặp ở những chỗ sáng, trên đất cát pha Ở Việt Nam cây thường mọc vùng đồi núi ở Hải Dương, Hà Tây, Tây Ninh, Sông Bé.… Thường thu hái vào mùa thu, dùng tươi hay phơi khô

1.2.2.2 Hóa học

Các tài liệu nghiên cứu cho thấy các dược liệu thuộc chi Desmodium chứa các hợp

chất thuộc nhóm flavonoid, alcaloid, steroid… được trình bày trong bảng 1.2 [60]

Bảng 1.2: Một số các hợp chất có trong những dược liệu thuộc ch i Desmodium

D gangeticum (Lour.) DC

Dalbergioidin, desmocarpin, diphysolon, gangetin, gangetinin, genistein, 2’ OH genistein, kieviton

D gangeticum (Lour.) DC

Apigenin, flavosativasid vitexin, isovitexin, 2’-O--D-xylosylvitexin

D triflorum (Lour.) DC

Vicenin-1, vicenin-3, schaftosid D.styracifolium (Osb.) Merr

Alcaloid Bufotenin, bufotenin-N-oxid,

Candicin, - carbolin, hordenin, D gangeticum (Lour.) DC

Hình 1.2 Các bộ phận của cây Kim tiền thảo 1 Cành mang hoa, lá

2 Lá (mặt dưới) 3 Cụm hoa 4 Nụ hoa 5 Quả 6 Quả khô

“Nguồn: Dy Phon, P; Oshahi, H & Vidal J E 1994” [101]

1

4

leptocladin, O-methybufotenin Cholin, N-N-dimethyltryptamin, acid 1 H-indol-3-acetic

D triflorum (Lour.) DC

(Osb.) Merr

Soyasapogenin I, Soyasapogenol B, D.styracifolium

22ceton3O[Lrhamnopyranosyl (12)--D-galactopyranosyl-(12) -- D-glucoronopyranosid, lupeol, lupenon

Betain, N-N-dimethyl tryptophan, N-N imethyltryptophanmethocation methyl ester

D elegans DC

“Nguoàn: Harborne J B et al, 1994”

”Nguoàn: Harborne, J B et al, 1994” [60]

Me

Me OHC

O O

HO

1 2

3 4 5 6 7 8 9 10 19 11 12 13

14 15

17 18 20

23 24 25 26 28

Sitosterol

O

O

O HO

O OH

OH

CH 2 OH OH

O OH

OH

O HO

OH OH

HO HO HOH 2 C

OH

Vicenin - 3

O HO

O OH

OH

O

O HO OH

OH HO

HOH 2 C

OH

HO

Schaftosid

1.2.2.3 Tác dụng dược lý-công dụng

Tính vị và tác dụng: theo Đông y Kim tiền thảo có vị ngọt, nhạt, tính mát, có

tác dụng thanh nhiệt, tán thấp, lợi niệu, thông lâm [9]

Dược lý thực nghiệm cho thấy Kim tiền thảo có tác dụng: lợi tiểu và lợi mật,

kháng khuẩn, kháng viêm, giãn mạch hạ huyết áp [9], [26]

Vũ Văn Điền và cộng sự [26] đã thăm dò tác động dược lý của dịch chiết

nước, dịch chiết cồn, dịch flavonoid và dịch saponin toàn phần của Kim tiền

thảo, nhận thấy có những tác dụng sau: kích thích sự bài tiết mật, làm giảm cơn

đau nội tạng, ức chế một số vi khuẩn gram (+)

Hirayama & cộng sự đã nghiên cứu về tác dụng ức chế của hỗn hợp triterpen

từ D styracifolium (Ds-t) trên sự hình thành sỏi calci oxalat ở thận gây ra bởi

ethylen glycol (EG) , 1 (OH) D3 và 1 D3 trên chuột cống cho thấy:

- Trên nhóm chứng chỉ nhận EG và 1 D3: tỉ lệ hình thành sỏi là 81%

- Trên nhóm thử nhận EG và 1 D3 có bổ sung Ds-t tỉ lệ hình thành sỏi là 29%

- Hàm lượng calci trong huyết tương trong nhóm thử có Ds-t gia tăng, có nghĩa

là sự bài xuất calci trong nước tiểu giảm đáng kể

- Sự bài tiết citrat trong nước tiểu (chất này ngăn ngừa sự hình thành sỏi) gia

tăng nhiều trong nhóm thử Ds-t

- Thể tích nước tiểu trong nhóm Ds-t tăng nhiều hơn nhóm chứng, kết quả này

gợi ý rằng Ds-t có tác động ức chế sự hình thành sỏi thận ở chuột cống bởi cơ

chế: tăng bài xuất nước tiểu, giảm bài tiết calci và tăng bài tiết citrat ở đường

niệu Huizhi và cộng sự còn nhận thấy các polysaccharid có tác động ức chế sự

hình thành sỏi calci oxalat [64], [65]

Theo tài liệu [97] Kim tiền thảo có tác dụng sau:

- Các flavonoid trong cây làm tăng lưu lượng máu ở động mạch vành, não, thận, làm giảm sự thiếu máu cục bộ ở cơ tim và giảm nhịp tim, tăng khả năng chịu đựng giảm oxy ở mô trên động vật thí nghiệm

- Thử nghiệm dược lý cho thấy dịch chiết nước của Kim tiền thảo gây hạ huyết áp theo 2 tác động: kích thích receptor cholinergic và ức chế trên receptor

-adrenergic

Công dụng, cách dùng và một số bài thuốc [9],[24]

• Kim tiền thảo được nêu lần đầu trong “Bản thảo cương mục thập di” của Triệu Học Mẫn (1719-1805) với công dụng trừ phong tán độc, dùng rửa ghẻ ngứa rất công hiệu

• Theo kinh nghiệm dân gian Kim tiền thảo thường được dùng để chữa sỏi bàng quang, sỏi mật, nhiễm khuẩn niệu đạo, viêm thận, phù thũng, viêm gan vàng da

• KTT được đưa vào Dược Điển Trung Quốc với tên Thạch lâm thông là vị thuốc chủ lực để chữa sỏi tiết niệu [80]

Một số bài thuốc có kim tiền thảo [9]

- Sỏi thận-niệu đạo: Kim tiền thảo 60 g sắc đặc lấy nước uống như trà, thông

thường dùng điều trị trong 1 tháng

- Sỏi niệu quản:

Kim tiền thảo 25 g Mộc thông 0,4 g

Hải kim sa 20 g Cam thảo 0,4 g

Rễ cỏ tranh 20 g Kê nội kim 0,8 g

Bạch thược 12 g Sài đất 12,0 g

Sắc uống ngày 1 thang

- Chữa sỏi mật:

Kim tiền thảo 30 g Xuyên phá thạch 15 g

Nhân trần 30 g Uất kim 12 g

Xuyên quân 10 g (sắc sau)

Sắc uống ngày 1 thang

- Nhiễm trùng niệu đạo:

Kim tiền thảo 24 g Bòng bong 15 g

Mã đề 15 g Kim ngân hoa 15 g

Sắc uống ngày 1 thang

- Viêm thận cấp, phù thũng, viêm gan hay viêm túi mật:

Kim tiền thảo 60 g Ngưu tất 20 g

Mộc thông 20 g Dành dành 10 g

Chút chít 20 g

Sắc uống ngày 1 thang

1.2.3 Rau om (RO)

1.2.3.1 Thực vật học

- Vị trí phân loại: Cây Rau om thuộc thực vật bậc cao, ngành Ngọc lan, lớp

Ngọc lan, phân lớp Hoa môi, liên bộ Hoa môi, bộ Hoa mõm sói, họ Hoa mõm

sói, chi Limnophila [9], [46]

- Đặc điểm chi Limnophila: Theo Yamazaki, chi Limnophila có 16 loài phân bố

chủ yếu ở Châu Á: Ấn Độ, Srilanca, Trung Quốc, Triều Tiên, Lào, Thái Lan,

Indonesia, Việt Nam [98],[108] Theo Lecomte, chi Limnophila có khoảng 25 loài ở Châu Á [98],[104] Theo Philcox, chi Limnophila R Br có 35 loài phân bố

chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của Cựu Thế Giới, vùng nhiệt đới Châu Á, trải rộng từ Tây Phi Châu đến Samoa (Polynesia) [81]

Chi Limnophila R Br là những cây thân thảo thích sống gần nước, thân mọc

rễ ở gốc, mọc đứng, nằm hoặc đôi khi mọc nổi trên mặt nước và rất dài, nhẵn hay có lông nhung, phân nhánh hay không phân nhánh Lá mọc đối hay mọc vòng thường không cuống bám ôm thân, nguyên hay có khía hoặc chẻ thuỳ lông chim, khi thì có 2 dạng gồm những lá ló khỏi mặt nước có bìa nguyên hay có răng cưa, những lá ngập trong nước thì chia nhiều thuỳ dạng dải Hoa tự riêng

lẻ ở nách lá hay tụ thành chùm, xim, gié ở ngọn thân hay ngọn cành Lá đài rời hay dính ở gốc thành ống hình chuông, trên chia thành 5 thùy đều nhau Dưới gốc đài hoa có 2 lá bắc con dạng lông cứng Cánh hoa dính nhau bên dưới, trên chia thành 2 môi, môi trên do 2 cánh hoa, môi dưới do 3 cánh hoa Nhị 4 (hai nhị dài, hai nhị ngắn) mọc thụt trong ống tràng, chỉ nhị nhẵn, chung đới khá phát triển Vòi nhụy có mấu ở đỉnh, đầu nhụy chia 2 thùy Quả là nang, đôi khi dẹp mở thành 4 mảnh Hạt nhiều, nhỏ, mặt ngoài có hình mạng lưới, có cạnh và cắt cụt ở đỉnh

Theo Phạm Hoàng Hộ, ở Việt Nam có khoảng 17 loài thuộc chi Limnophila:

L aromatica (Lamk.) Merr : Rau om

L balsamea (Benth.) Benth : Om xoài

L chinensis (Osb.) Merr : Om Tàu

L chinensis (Osb.) Merr.subsp chevalieri Bonati Yam.: Om Chevalier

L connata (D Don.) Hand.Mazz : Om dính

L erecta Benth : Om đứng

L geoffrayi Bon : Om Geoffray

L glabra (Benj.) Kerr : Om không lông

L hayatae Yam : Om Hayata

L heterophylla Benth : Ngổ nước

L indica (L.) Druce : Om Ấn

L laxa Benth : Om thưa

L micrantha Benth : Cóc mẳn, Om hoa nhỏ

L polyantha Kun ex Hook f var brevipilosa (Yam.) Yam

L repens (Benth.) Benth : Om bò

L rugosa L : Quế đất, Hồi nước

L sessiliflora Bl : Ngổ hoa không cuống [19]

- Cây Rau om [34], [81]

Tên khác: Rau ngổ, Ngổ om, Ngò om [9]

Tên khoa học: Limnophila aromatica (Lamk.) Merr., Scrophulariaceae

Đồng danh: L gratissima Bl., L aromatica Lamk., Ambulia aromatica Lamk., L penetata Bl., L punctata Bl var subracemosa Benth in DC.,

Terebinthina aromatica (Lamk.) Kuntze, Ambulia gratissima (Bl.) Nakai ex Furumi

[81], [98], [108]

Cây Rau om là loại cỏ mọc bò, thân mập, dai, cao 20-30 cm, ruột xốp, mùi

rất thơm Lá đơn không cuống và có lông, mọc đối hay mọc vòng 3 lá, mép lá có răng cưa Hoa riêng rẽ mọc ở nách lá, không đều, có cuống dài 1-1,5 cm Đài

dính ở gốc thành hình chuông chia làm 5 thuỳ, dài 0,5-0,6 cm Tràng dài gấp đôi đài, chia 2 môi, cánh hoa màu tím nhạt Nhị 4, vòi nhụy nhẵn, đầu nhụy chẻ đôi Quả nang hình trứng, không lông nằm trong đài chứa nhiều hạt nhỏ Hạt nhẵn, hình trụ, màu đen nhạt có vân hình mạng

Ở Việt Nam cây mọc hoang ở ao, rạch và hay được trồng làm gia vị (cả ở nhiều nước châu Á) Toàn cây thu hái quanh năm [9], [19]

1.2.3.2 Hoá học

Việc nghiên cứu thành phần hoá học của các cây thuộc chi Limnophila đã

được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm và tìm hiểu [42], [44],[45],[76],[77] tập trung nhiều nhất là ở Ấn Độ [43],[48],[49] Thành phần được nghiên cứu chủ yếu là tinh dầu và flavonoid, được trình bày trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Một số các hợp chất có trong dược liệu thuộc chi Limnophila

Tinh dầu Hàm lượng 0,13% (d- limonen, d- L aromatica (Lamk.) Merr

Hình 1.3 Cây Rau om A Cành mang hoa B Hoa C Nhị D Bầu nhụy

“Nguồn: Phạm Hoàng Hộ, 1975” [18]

A

B

C

D

perillaldehyd) (Aán Độ) [48],[88]

4-MeOC6H4COOH 4-MeOC6H4CHO 4-MeOC6H4CH=CHCH3

5-hydroxy-6,8-dimethoxy-3’,4’-L indica (5-hydroxy-6,8-dimethoxy-3’,4’-L.) Druce [70]

5,7-dihydroxy 6,8,4’-trimethoxyflavon (nevadensin); 5-hydroxy 6,7,4’-trimethoxyflavon (salvigenin)

L aromatica (Lamk.) Merr [68], [69]

Triterpen Betulin, acid betulinic,

1.2.3.3 Tác dụng dược lý-công dụng

Từ kết quả thực tế lâm sàng đđiều trị sỏi thận thu được của hợp tác xã Y học Dân tộc Hải Thượng thành phố Cần Thơ, Lưu Thị Thu Cúc và Phó Đức Thuần đã thử nghiệm về mặt dược lý của cây Rau om cho thấy cây này có tác dụng:

- Giãn cơ, giãn mạch, chống co thắt

- Lợi tiểu, tăng lọc ở cầu thận

- Làm giảm cơn đau ở bụng [13]

- Hầu như không thấy độc tính Cây có tác dụng kháng viêm chống độc,

tiêu sưng Làm thuốc trị rắn cắn [9]

O HO

O OH

OCH 3

H3CO

Salvigenin

- Chữa sỏi thận: 20-30 g cây tươi, giả nát, vắt lấy nước Uống 2 lần/ngày [24]

- Theo Venkata Rao, tinh dầu Rau om L gratissima có tính kháng khuẩn khi

so với các chất đối chiếu như Streptomycin, Cloramphenicol Tinh dầu Rau om

tác động kháng nấm Aspergillus niger , Rhizopus oryzae, Candida albicans [88]

Tác động kháng khuẩn và kháng nấm của L gratissima được liệt kê ở Bảng 1.4

Bảng 1.4 Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm của L gratissima

Vi khuẩn (Bacteria) Đường kính của vòng ức chế (mm)

1.3 ỨNG DỤNG HPLC VÀO NGHIÊN CỨU HỢP CHẤT FLAVONOID

Trong lãnh vực nghiên cứu hiện nay, kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng rất nhiều để phân lập, định tính và định lượng các hợp chất tự nhiên có trong dược liệu

Qua phần tổng quan các dược liệu trong đề tài cho thấy thành phần hóa học của chúng đều có nhóm flavonoid Đây là những hợp chất tự nhiên có cấu trúc

cơ bản kiểu C6-C3-C6 (aglycon), gồm 2 vòng benzen (vòng A và vòng B) liên kết với nhau qua một mạch 3 carbon (mạch 3 carbon này có thể không đóng vòng, hay đóng vòng tạo một dị vòng oxy 5 hay 6 cạnh) Tại các vòng benzen có một hoặc nhiều nhóm -OH tự do hoặc đã bị thay thế một phần Bản chất của các flavonoid là các hợp chất polyphenol có tính acid

5 6

O ChalconHợp chất flavonoid có thể tồn tại trong tự nhiên ở dạng glycosid hay dạng tự do Những dẫn chất của flavonoid có thể được tạo ra dưới nhiều tác nhân [62],[83]:

 Sự hydroxy hoá hay dehydroxy hoá

 Sự methyl hoá từ nhóm hydroxy hay từ nhân flavonoid

 Sự isoprenyl hoá của nhóm hydroxy hay từ nhân flavonoid

 Sự trùng hợp hoá (để tạo ra bi-, triflavonoid)

 Sự tạo thành flavonoid bisulfat

– Quan trọng nhất là sự glycosyl hoá để tạo thành O-glycosid hay C-glycosid

Tính chất

- Các flavon thường có màu vàng nhạt, có khi không màu; flavonol thường có màu vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm đến đỏ cam Các chất thuộc nhóm isoflavon, isoflavanon, flavanonol, proanthocyanidin, flavan-3-ol do không có nối đôi liên hợp giữa vòng B với nhóm carbonyl nên không màu Các

dẫn chất anthocyanidin thì có màu đậm, thay đổi theo môi trường

- Các flavonoid glycosid thường tan tốt trong các dung môi phân cực (EtOH,

MeOH, EtOAc, n-butanol, H2O …) Các flavonoid aglycon thì tan được trong các dung môi hữu cơ có tính phân cực trung bình [28], [50],[61]

1.3.1 Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao vào nghiên cứu flavonoid [12]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật sắc ký được dùng để tách các hỗn hợp trên một cột, trong cột này chất nhồi cột có kích thước nhỏ, do đó cần phải có một bơm tạo áp suất cao để giúp pha động di chuyển qua cột

Đây là một phương pháp có độ phân giải cao có thể áp dụng một cách hiệu quả để tách các hỗn hợp phức tạp

O1 2 3 4 5 6 7

8 9 10

B 1' 2'

3' 4' 5' 6'

Tùy theo mục đích sử dụng trong thực tế HPLC được chia làm 3 mức độ:

 HPLC phân tích (analytical HPLC)

- Thường được sử dụng để phân tích thành phần các mẫu thử

- Cột thường dùng có kích thước 250 x 4,6 mm i.d hoặc nhỏ hơn (150 x 4,6 mm i.d hay 150 x 3,2 mm i.d.)

- Chất nhồi cột là những tiểu phân có kích thước 3-5 m Hiện nay (2005) kích thước tiểu phân có thể giảm xuống tới 1,7 m (UPLC)

- Lượng mẫu phân tích từ vài g đến mg

 HPLC bán điều chế (semi-preparative HPLC)

- Đây là phương pháp hữu hiệu để phân lập các chất tinh khiết ở qui mô nhỏ từ vài mg đến vài trăm mg

- Cột thường dùng có kích thước 250 x (8-10) mm i.d

- Chất nhồi cột là những tiểu phân có kích thước 5-30 m

- Lượng mẫu phân tích từ vài 10 mg đến 500 mg

Ngoài ra còn có HPLC điều chế và HPLC qui mô công nghiệp (preparative

and process-scale HPLC) Có thể phân lập chất tinh khiết qui mô lớn, kỹ thuật

tương tự semi-preparative HPLC Mẫu thử có thể đến hàng kg Tài liệu công bố

khá hạn chế vì bảo mật [51]

1.3.2 Phân lập flavonoid bằng kỹ thuật HPLC bán điều chế

Sau khi có được mẫu flavonoid tương đối “sạch”, để có được flavonoid tinh khiết cần phải tiến hành các công đoạn cụ thể như sau:

Dò tìm và xác định các thông số HPLC

- Cột: thường dùng cột pha đảo (RP-8, RP-18 )

- Dung môi: thường dùng là loại khá phân cực như MeOH, H2O, CH3CN, Các acid hữu cơ như HOAc, acid formic cũng được dùng như là một dung môi hay tác nhân acid hóa TFA (acid trifluoro acetic), H3PO4 đôi khi cũng được sử dụng như tác nhân acid hóa để tăng khả năng tách các chất trong hỗn hợp Hệ

dung môi thông thường có 2 thành phần, trong những hỗn hợp phức tạp hệ dung môi có thể gồm 3-4 thành phần Đối với proanthocyanidin, dung môi có pH acid có thể giúp cho sự tách và giúp chất này bền hơn (Bảng 1.5 là một số những ví dụ về cột tách và một số hệ dung môi)

- Bộ phận phát hiện (Detector): đối với flavonoid thì hay dùng detector hấp thu

tử ngoại (UV), tuy nhiên detector dãy diod quang (PDA) là sự chọn lựa ưu tiên Ngoài ra detector MS, detector NMR cũng mang lại rất nhiều hữu ích

- Chọn độ dài sóng thích hợp: dựa vào max của flavonoid, dò tìm trên máy

- Thể tích tiêm mẫu: thông thường từ 50-100 µl Đối với các đỉnh tách tốt (độ

chọn lọc cao) thể tích này có thể đến 150-200 µl/lần

- Tốc độ dòng: tuỳ thuộc vào mục đích sử dụng, thường là 1-5 ml/phút

- Nhiệt độ: tuỳ thuộc vào bản chất của từng loại flavonoid, thông thường là

30oC Có thể tăng nhiệt độ lên 45 oC hay 60 oC để giúp thêm sự phân giải

Bảng 1.5 Một vài ví dụ phân lập flavonoid bằng PP SK lỏng hiệu năng cao bán điều chế [12]:

-150 x 3mm i.d

10µm -250 x 4.6mm i.d

- Nước: aceton 45%

aceton/250mM NaH2PO4 pH3

- H2O-CH3CN-MeOH-HOAc [88 : 5 : 5 : 2]

(Fabaceae) Aqua Sil SN - 662N

150 x 8 mm i.d

-CHCl3 - MeOH - H2O (40 : 16 : 3)

- Genistein (hợp chất)

- Glycin soja (Fabaceae)

Nova Pak C-8 150 x 3.9 mm i.d.,

4 µm

CH3CN-0,05 M HCOONH4 (27 : 73) pH 4

250 x 4.6 mm i.d ,

5 µm

A (MeOH)

B (0,5%) o.H3PO4/H20 Gradient

1.3.3 Định tính flavonoid bằng phương pháp HPLC [51]

Việc định tính flavonoid bằng HPLC chủ yếu dựa vào 2 yếu tố là thời gian

lưu và các thông tin do detector chọn lọc cung cấp (ví dụ với detector PDA thì có

các max, với detector MS thì có những phân mảnh, với detector NMR thì có

những dịch chuyển hóa học đặc trưng của nhóm chức hóa học v.v )

Do khó khăn trong việc cung cấp chất chuẩn, trong một số trường hợp các chất chuẩn thay thế có Rt tương đương được sử dụng (chất chuẩn đối chiếu)

Trong trường hợp đó các thông tin như phổ UV, IR, MS, NMR cũng giúp cho

việc định tính chính xác

Việc sử dụng thời gian lưu (Rt) của những lần SK trước và nhất là Rt

trong các tài liệu chỉ có ý nghĩa tham khảo nếu không có các thông tin chọn lọc khác (phổ UV, MS, NMR )

Định tính flavonoid trong dược liệu bằng phương pháp HPLC được chia làm

2 trường hợp: định tính có chất chuẩn và định tính không có chất chuẩn

1.3.3.1 Định tính flavonoid có chất chuẩn

* Định tính flavonoid tinh khiết

Trong những điều kiện sắc ký nhất định (cột, pha động, nhiệt độ, tốc độ dòng, chương trình ) thì thời gian lưu Rt của một chất tan (ví dụ flavonoid) là một đại lượng không thay đổi

Phát hiện bằng PDA dựa vào max: phổ UV của hầu hết flavonoid [72], [93] gồm có hai đỉnh hấp thu chính, một đỉnh xuất hiện trong khoảng 240-285 nm (band II), đỉnh thứ hai trong khoảng 300-400 nm (band I, riêng anthocyanidin khoảng 450-580 nm) Band II được xem là do hệ thống benzoyl ở vòng A, band I là do hệ thống cinnamoyl ở vòng B

Độ hấp thu UV của các flavonoid được trình bày ở bảng 1.6

Dựa vào các số liệu, có thể phát hiện flavonoid hiện diện trên SK đồ, hệ thống phát hiện bằng dãy diod quang PDA cung cấp những thông tin về Rt và phổ UV-

Vis từng đỉnh trên SK đồ, thông số về max của các đỉnh được đặc biệt quan tâm

Bảng 1.6 Dãy hấp thu UV-Vis của flavonoid [72]

Flavon

Flavonol (không có-OH ở C3)

Flavonol (có-OH ở C3)