Chuyên đề ảnh hưởng của nano bạc đến cây hoa cẩm chướng in vitro

ảnh hưởng của nano bạc ĐẾN KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG MẪU VÀ NHÂN NHANH CHỒI hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L ) IN VITRO CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NÔNG HỌC Lâm Đồng, 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA NÔNG LÂM PHAN NHẬT BẢO TRÂM ảnh hưởng của nano bạc ĐẾN KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG MẪU VÀ NHÂN NHANH CHỒI hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L ) IN VITRO CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NÔNG HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA NÔNG LÂM

 PHAN NHẬT BẢO TRÂM

ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC ĐẾN KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG MẪU VÀ NHÂN NHANH CHỒI HOA

CẨM CHƯỚNG (Dianthus caryophyllus L.) IN VITRO

CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NÔNG HỌC

Lâm Đồng, 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA NÔNG LÂM

 PHAN NHẬT BẢO TRÂM

ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC ĐẾN KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG MẪU VÀ NHÂN NHANH CHỒI HOA

CẨM CHƯỚNG (Dianthus caryophyllus L.) IN VITRO

CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NÔNG HỌC

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: ThS TRƯƠNG THỊ LAN ANH

KHÓA 2017-2021

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Những kết quả và các số liệu trongchuyên đề chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào, tôi hoàn toàn chịu tráchnhiệm trước nhà trường về sự cam đoan này

Đà lạt, ngày tháng năm

Phan Nhật Bảo Trâm

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập và thực hiện chuyên đề tốt nghiệp này, tôi đã nhận được

rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ từ phía thầy cô, gia đình, bạn bè, Tôi xin chân thànhcảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Đà Lạt đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trongsuốt quá trình học tập tại trường và quý thầy cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức,

kỹ năng thực hành là hành trang cho công tác của tôi sau này

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Trương Thị Lan Anh đã chỉ bảo động viên, tậntình hướng dẫn, bỏ nhiều công sức để giúp tôi hoàn thành chuyên đề này

Xin gửi lời cảm ơn tới cha và mẹ, gia đình, bạn bè đã hết lòng yêu thương, lo lắng,động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập nghiên cứu để hoàn thành chuyên đềnày

Đà Lạt, ngày tháng năm

Phan Nhật Bảo Trâm

DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Các chất khử trùng được sử dụng trong việc khử trùng mẫu với nồng độ và

thời gian khác nhau 13

Bảng 2: Các nồng độ nano bạc khác nhau được bổ sung vào môi trường nuôi cấy 13 Bảng 3: Hiệu quả khử trùng mẫu chồi đỉnh sinh trưởng hoa cẩm chướng của nano bạc

ở các nồng độ khác nhau sau 25 ngày nuôi cấy 15

Bảng 4: Ảnh hưởng của nano bạc đến khối lượng tươi và khối lượng khô cây hoa cẩm

chướng nuôi cấy trong môi trường có bổ sung nano bạc sau 30 ngày nuôi cấy 22

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của các nồng độ nano bạc khử trùng khác nhau đến số chồi

trung bình đối với mẫu chồi đỉnh sinh trưởng hoa cẩm chướng sau 25 ngày nuôi cấy 17

Biểu đồ 2: Ảnh hưởng của các nồng độ nano bạc khử trùng khác nhau đến số chồi

trung bình đối với mẫu chồi đỉnh sinh trưởng hoa cẩm chướng sau 25 ngày nuôi cấy 18

Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của nano bạc đến chiều cao cây hoa cẩm chướng nuôi cấy trong

môi trường có bổ sung nano bạc sau 30 ngày nuôi cấy 20

Biểu đồ 4: Ảnh hưởng của nano bạc đến số chồi cây hoa cẩm chướng nuôi cấy trong

môi trường có bổ sung nano bạc sau 30 ngày nuôi cấy 21

DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH Hình 1: Mẫu cây hoa cẩm chướng tại vườn ở phường 11, Đà Lạt 3 Hình 2: Chồi đỉnh sau khi cắt 12 Hình 3: Hình ảnh mẫu chồi cẩm chướng 16

Hình 4: Sự sinh trưởng của chồi hoa cẩm chướng in vitro khi được xử lý ở các nồng

độ nano bạc khác nhau sau 25 ngày nuôi cấy 17

Hình 5: Sự sinh trưởng và phát triển của chồi hoa cẩm chướng nuôi cấy trong môi

trường bổ sung nano bạc ở các nồng độ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 21

Hình 6: Sự phát triển bất thường cây hoa cẩm chướng ở nồng độ nano bạc 8 ppm .22

CÁC TỪ VIẾT TẮT

BA 6 – benzylaminopurine

IBA Indol – 3 – butyric acid

DNA Deoxyribonucleic acid

RNA Ribonucleic acid

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về hoa cẩm chướng 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Nguồn gốc 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái 4

1.1.4 Điều kiện ngoại cảnh 4

1.2 Các phương pháp nhân giống 6

1.2.1 Phương pháp nhân giống hữu tính 6

1.2.2 Phương pháp nhân giống vô tính 6

1.3 Nano bạc 7

1.3.1 Giới thiệu về nano bạc 7

1.3.2 Tổng quan về tình hình nghiên cứu áp dụng nano bạc vào nuôi cấy in vitro 8

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Địa điểm, thời gian, vật liệu nghiên cứu 11

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 11

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 11

2.1.3 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 11

2.2 Nội dung nghiên cứu 11

2.3 Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu 11

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 11

2.3.2 Chỉ tiêu theo dõi 13

2.3.3 Điều kiện nuôi cấy 14

2.3.4 Xử lý số liệu 14

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

3.1 Ảnh hưởng của nano bạc trong việc khử trùng mẫu chồi hoa cẩm chướng 15

3.2 Ảnh hưởng của các nồng độ nano bạc khác nhau sự nhân nhanh chồi đỉnh hoa cẩm chướng: 20

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO 26

PHỤ LỤC 30

MỞ ĐẦU

Cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) là một loại hoa đẹp được trồng phổ biến ở nhiều

nước có nguồn gốc xuất phát từ Địa Trung Hải và du nhập vào Việt Nam đầu thế kỷ 19.Hoa cẩm chướng luôn được thị trường ưa chuộng bởi nó có sự đa dạng về màu sắc, tươilâu và thuận lợi cho việc bảo quản, vận chuyển xa Đặc biệt Đà Lạt là một trong nhữngthành phố có diện tích trồng hoa cẩm chướng lớn, cho năng suất và chất lượng kinh tếcao, không chỉ sử dụng làm hoa cắt cành mà còn trồng làm hoa chậu chưng bày Để đápứng nhu cầu thị trường nhiều kỹ thuật nhân giống hoa cẩm chướng đã được áp dụng.Hình thức nhân giống truyền thống là phương pháp nhân giống hữu tính bằng cách gieohạt Tuy khả năng nhân giống nhanh cho số lượng nhiều nhưng do hạt hoa cẩm chướngnhỏ, không hoàn chỉnh nên tỷ lệ nảy mầm thấp dẫn đến cây con không đồng đều, năngsuất thấp Cây con mọc từ hạt thường không duy trì được đặc tính tốt của cây mẹ, tỉ lệbiến dị cao (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005) Vì vậy trong sản xuất, phươngpháp nhân giống phổ biến được sử dụng là phương pháp nhân giống vô tính Có 2 cáchnhân giống vô tính là giâm cành và nuôi cấy mô Đối với giâm cành hoa cẩm chướng tuy

có thời gian ngắn, thiết bị đơn giản nhưng liên tục giâm cành sẽ dẫn đến thoái hóa giốngcây sinh trưởng kém, tính chống chịu sâu bệnh giảm, sản lượng hoa thấp Để cho chấtlượng cây giống tốt nhất thì biện pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là nuôi cấy môhoa cẩm chướng Tuy nhiên việc nuôi cấy mô hoa cẩm chướng cần có kỹ thuật cao, thờigian dài và chi phí đầu tư ban đầu cao nhưng hệ số nhân giống cao, sạch bệnh, cây sinhtrưởng mạnh, tính chống chịu tốt, cây con nuôi cấy mô giống với cây mẹ và mang nhữngđặc tính tốt của cây mẹ

Vì thế đối với nghiên cứu này sẽ sử dụng kỹ thuật vi nhân giống hoa cẩm chướng để tạo

ra nguồn cây con sạch bệnh và đồng nhất Bước đầu tiên, một trong những bước quantrọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là tiến hành thu thập mẫu cây nuôi cấy từ cây mẹ

và khử trùng mẫu Việc khử trùng mẫu phải giữ được bản chất sinh học của nó vì thếkhông thể khử bằng nhiệt mà phải khử trùng bằng các dung dịch khử trùng Các dungdịch khử trùng thường dùng là hypochlorite calcium, hypochlorite sodium, chlorua thủyngân,… Với việc sử dụng các chất khử trùng này với nồng độ cao tùy vào từng loại mẫu

cấy sẽ đem lại hiệu quả khử trùng mẫu rất tốt nhưng khả năng gây tổn thương mẫu cũngtăng theo kèm theo đó là sự gây hại đối với người sử dụng đặc biệt là Chlorua thủy ngân,không những vậy các chất khử trùng còn gây ô nhiễm khi thải ra môi trường nước, đất.

Để khắc phục tình trạng đó, hiện nay trên nhiều nghiên cứu đối với môi trường nói chung

và cây trồng nói riêng rất nhiều nghiên cứu đã sử dụng nano bạc dùng làm chất khử trùng

và đã đem lại hiệu quả đáng mong đợi Theo Đỗ Mạnh Cường và cộng sự (2018) việc sửdụng nano bạc nồng độ 0,2 g/L trong 20 phút có thể thay thế các chất khử trùng thôngdụng (HgCl2, Ca(ClO)2) trong vi nhân giống cây dâu tây Trong nghiên cứu của Bùi ThịThanh Phương và cộng sự (2020), việc sử dụng dung dịch nano bạc với nồng độ 150 ppmtrong thời gian 40 phút để khử mẫu có thể thay thế hiệu quả các chất khử trùng khác trongnhân giống in vitro cây Trầu tiên Ngoài ra, nano bạc còn ảnh hưởng đến quá trình sinh

trưởng và phát triển của cây in vitro Bổ sung nano bạc kết hợp với BA hoặc IBA cho hiệu

quả tốt hơn việc sử dụng BA (2 mg/l) riêng lẻ trong nhân chồi và IBA (0,5 mg/l) riêng lẻ

trong tạo rễ, sinh trưởng và phát triển cây con hoa hồng in vitro (Dương Tấn Nhựt và cs.,

2015)

Vì vậy, nghiên cứu này đã được thực hiện, nhằm khảo sát và đánh giá khả năng thay thếcác chất khử trùng thông dụng Ca(ClO)2 hay HgCl2 bằng nano bạc trong giai đoạn khửtrùng mẫu cấy và nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc khác nhau lên sự sinh

trưởng và phát triển của chồi cây hoa cẩm chướng trong điều kiện nuôi cấy in vitro.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về hoa cẩm chướng

Loài: Dianthus caryophyllus

Hình 1: Mẫu cây hoa cẩm chướng tại vườn ở phường 11, Đà Lạt

1.1.2 Nguồn gốc

Cây cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) hay còn gọi là hoa Phăng, có nguồn ở Địa

Trung Hải, được bắt đầu nuôi trồng từ thế kỷ 16 Năm 1750, các nhà làm vườn Pháp đãtạo ra giống cẩm chướng Remontant cây cao ra hoa nhiều lần trong năm Đến 1846 họ đã

nuôi trồng được rất nhiều giống cẩm chướng hoang dại và điều khiển cho chúng ra hoaquanh năm Năm 1852, cẩm chướng từ Châu Âu được nhập vào nước Mỹ Tại đây, nhànước và rất nhiều công ty đã tạo ra hàng trăm giống hoa cẩm chướng với các hình dạng vàmàu sắc khác nhau Hoa cẩm chướng được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam từ đầuthế kỷ 19, chủ yếu trồng ở những nơi có khí hậu mát mẻ như Đà Lạt, SaPa và những nămgần đây đã được trồng ở khắp các địa phương trong cả nước (Đặng Văn Đông và ĐinhThế Lộc, 2005).

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Cẩm chướng là loại cây thân thảo, thân đứng thẳng phân nhánh nhiều, cây cao 70 – 100

cm và nửa hóa gỗ, lá hình lông chim, dầy, cuống hoa có từ 16 – 18 đốt đối với hoa to và

20 – 22 đốt đối với hoa nhỏ (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005)

Rễ cẩm chướng phân bố tập trung ở tầng đất mặt 20cm, một số ít ăn sâu tới 10-50cm Ởtrạng thái bình thường, rễ và tán cây phát triển theo tỷ lệ tương đương Nếu đất nhiềuphân, nhiều nước, rễ sinh trưởng không tốt Nhiệt độ đất cao cũng ảnh hưởng đến sự sinhtrưởng, phát triển của rễ

Sau khi ra được 10-20 đôi lá, trên đỉnh ngọn sẽ xuất hiện nụ hoa Mỗi nách trên thânchính thường có một mầm to, dài và một mầm nhỏ, ngăn (riêng Cầm Chưởng nhiều đầuhoa thì cả 2 nằm nách đều dài như nhau) Những mầm nách phía trên thường có nụ sớm

và phát triển thành cành hoa, những mầm nách phía dưới ra nụ sau và trở thành nhữngmầm dinh dưỡng Tốc độ sinh trưởng của lá phụ thuộc vào thời tiết: mùa xuân, mùa hèthường từ 1-5 ngày, mùa thu, mùa đông từ 7-10 ngày ra một đôi lá Trong đó 8 đôi lá đầu(sát gốc) có mầm nách ở trạng thái dinh dưỡng từ lá 15 đến lá 18 mầm nách có thể pháttriển thành nụ hoa

1.1.4 Điều kiện ngoại cảnh

Cẩm Chưởng là loại cây ưa sáng và thích hợp với thời gian chiếu sáng ngày dài Thời gianchiếu sáng trong ngày càng dài, cây càng nhanh phân hóa hoa Hoa nở đều, chất lượnghoa tốt Lượng chất khô và tốc độ sinh trưởng của cây tương quan thuận với cường độ ánhsáng Tuy nhiên, ở thời kỳ ra hoa rộ vào mùa nóng, lúc giữa trưa, cường độ áng sáng

mạnh, cần che bớt ánh sáng cho cây vì ánh sáng quá mạnh sẽ làm cho cánh hoa dễ bị nhạtmàu và cháy, ảnh hưởng đến chất lượng hoa Các thí nghiệm nghiên cứu cho thấy chiếusáng bổ sung không những kích thích đốt dài ra, ức chế cảnh nách mà còn làm tăng đườngkính hoa, làm cho màu hoa tươi hơn Trồng trong nhà lưới thì cần chọn nilon có độ thấuquang cao và thường xuyên rửa bụi bẩn để tăng cường độ chiếu sáng cho cây Ngoài ra,mật độ trồng, số cành nhiều, ít, lá to, nhỏ, dài, ngắn khác nhau cũng ảnh hưởng đến sựhấp thu ánh sáng của các tầng lá Vì vậy, để nâng cao chất lượng hoa ta phải bố trí mật độvừa phải và thường xuyên tỉa bớt cành lá cho cây.

Cẩm Chưởng là cây ưa khí hậu mát mẻ Nhiệt độ thích hợp cho cây từ 15-200C, nhưngtrong phạm vi từ 10-150C cây vẫn sinh trưởng bình thường và cho chất lượng hoa tươngđối tốt Nếu vượt quá 300C thì cây sinh trưởng kém, thân lá nhỏ, hoa nhỏ, sản lượng vàchất lượng hoa giảm, tuổi thọ hoa ngắn; dưới 100C cây sinh trưởng yếu, sản lượng giảm

rõ rệt Thông thường chênh lệch nhiệt độ ngày đêm lớn cây sinh trưởng tốt nhưng khôngphải chênh lệch nhiệt độ ngày đêm càng lớn thì càng tốt Nhìn chung nhiệt độ chênh lệchngày đêm khoảng 100C là tốt nhất, nếu không chất lượng hoa kém, số hoa mù cao Nhiệt

độ không khí và nhiệt độ lá thường không giống nhau Chiếu sáng mạnh, nhiệt độ lá caohơn nhiệt độ không khí: khi không khí khô ở nơi thoáng khí, nhiệt độ lá thấp hơn nhiệt độkhông khí Về mùa hè ánh sáng mạnh, sự thoát hơi nước của lá sẽ làm giảm nhiệt độ lá

Vì vậy, khi tăng lưu thông không khí cần phải đảm bảo độ ẩm đất để cung cấp đủ nướccho cây, có lợi cho sự thoát hơi nước của cây Khi nước trong đất không đủ, thoát hơinước giảm thì nhiệt độ sẽ tăng Vào ngày trời nắng, che bớt ánh sáng để hạ nhiệt độ sẽ cólợi cho sự sinh trưởng của Cẩm Chưởng, tăng chất lượng hoa, giảm số cành hoa có chấtlượng kém xuống mức thấp nhất

Hàm lượng nước trong lá Cẩm Chướng chiếm khoảng 70 – 80 %, trong cành là 68 – 70%,trong rễ 80% Vì vậy khi cây thiếu nước thì quang hợp giảm, nước điều hòa nhiệt lượngcho cây khi trời nắng nóng Sự thoát hơi nước của Cẩm Chưởng phụ thuộc vào cường độánh sáng Thông thường lượng hơi nước thoát qua lá chủ yếu từ 11 giờ đến 16 giờ bằng57,8% trong đó từ 12 13 giờ chiếm 12,6%, từ 18 giờ đến 6 giờ sáng hôm sau chỉ chiếm3,3% tổng lượng nước thoát hơi trong ngày Vì vậy, tưới vào lúc chiều tối là tất nhất

Độ pH thích hợp trong đất cho cẩm chướng là 6 – 6,5 Đối với đất liên tục trồng cẩmchướng thì phải khử trùng tiêu độc hoặc luân canh

1.2 Các phương pháp nhân giống

1.2.1 Phương pháp nhân giống hữu tính

Hình thức nhân giống truyền thống là phương pháp nhân giống hữu tính bằng cách gieohạt Tuy khả năng nhân giống nhanh cho số lượng nhiều nhưng do hạt hoa cẩm chướngnhỏ, không hoàn chỉnh nên tỷ lệ nảy mầm thấp dẫn đến cây con không đồng đều, năngsuất thấp Do tỉ lệ kết hạt của hoa cẩm chướng rất thấp, cây con mọc từ hạt thường khôngduy trì được đặc tính tốt của cây mẹ hạt giống đời sau biến bị lớn, cây con sinh trưởng rấtchậm Vì vậy trong sản xuất rất ít nhân giống bằng hạt (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc,2005)

1.2.2 Phương pháp nhân giống vô tính

1.2.2.1.Phương pháp giâm cành

Đối với cây cẩm chướng cần có vườn ươm cây mẹ lấy cành riêng, vì chất lượng cây mẹkhác nhau sẽ ảnh hưởng đến tỷ lệ và chất lượng cây giâm cũng khác nhau Khi cây mẹ cókhoảng 4 – 5 đốt thì tiến hành bấm ngọn để lấy cành giâm Chỉ lấy mầm nách từ đốt thứ 6trở xuống, tốt nhất là lấy mầm nách ở đốt thứ 2 Ở các đốt càng sát ngọn chính thì khảnăng ra rễ kém và sau này cây sinh trưởng yếu, hơn nữa từ đốt thứ 7 thường ở giai đoạnsinh thực sẽ cho hoa sau này Trước khi cắt cành 1 – 2 ngày phải phun thuốc phòng trừsâu bệnh cho cây mẹ Nên cắt cành vào chiều mát (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc,2005)

1.2.2.2.Phương pháp nuôi cấy mô

Đây là phương pháp khoa học hiện đại, phục vụ cho sản xuất với quy mô công nghiệplớn Ưu điểm của phương pháp này là hệ số nhân giống cao, các cây đều sạch bệnh, chấtlượng tương đối đồng đều, đồng nhất về mặt di truyền và hiệu quả trồng tăng 150-200%

so với phương pháp trồng thông thường

Để cho chất lượng cây giống tốt nhất thì biện pháp được sử dụng phổ biến hiện nay lànuôi cấy mô hoa cẩm chướng và đã có nhiều nghiên cứu đưa ra quy trình cụ thể Như theoAamir Ali và cộng sự (2008) đã tiến hành nuôi cấy mô hoa cẩm chướng với mẫu ban đầu

là chồi đỉnh và chồi nách của cây, sử dụng dung dịch khử trùng là natri hypoclorit 7,5 %trong 15 phút và tiến hành rửa sạch lại với nước cất 3 lần Sau đó tiến hành các thí nghiệmtìm ra nồng độ BAP thích hợp nhất để cây bật chồi và nhân nhanh Kết quả thu được,phản ứng hình thành chồi tốt nhất thu được sau 6 ngày nuôi cấy từ mô phân sinh đỉnh làmôi trường MS có bổ sung 4 mg/L BAP và cho hiệu quả nhân nhanh tốt nhất ở môitrường MS có bổ sung 1mg/L BAP Nghiên cứu của Khatun và cộng sự (2013) đã đưa ramột trình nuôi cấy mô hoa cẩm chướng, với việc khử trùng mẫu là chồi đỉnh và chồi náchcủa hoa cẩm chướng bằng dung dịch HgCl2 0,1%, bổ sung thêm 2 giọt Tween 20 trong 60phút sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 5 lần Tiếp tục làm các thí nghiệm tìm ranồng độ BAP thích hợp cho cây phát triển, ở bài nghiên cứu này cũng đã đưa ra nồng độBAP tốt nhất cho cây bật chồi và nhân nhanh tốt nhất ở môi trường MS có bổ sung 1mg/LBAP Đối với một nghiên cứu trong nước cũng đã đưa ra được quy trình nuôi cấy mô hoacẩm chướng, kết quả thí nghiệm tốt nhất khi khử trùng mẫu chồi đỉnh và chồi nách hoacẩm chướng là khử trùng 2 lần với dung dịch HgCl2 0,1% mỗi lần 5 phút và môi trườngnuôi cấy khởi đầu là MS bổ sung 0,3mg/1 Kinetin, 0,1mg/l NAA, 20g/1 đường, môitrường thích hợp cho nhân nhanh và kích thích tăng trường chối MS bổ sung 0,05mg/1BAP, 0,1mg/l Kinetin, 0,1mg/l NAA, 30g/1 đường ( Nguyễn Thị Thu Hằng, 2013)

1.3 Nano bạc

1.3.1 Giới thiệu về nano bạc

Nhờ vào hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cao, hạt nano bạc đã và đang thu hút đượcnhiều sự chú ý, đầu tư trong nghiên cứu và ứng dụng loại vật liệu này Các chế phẩm nano

bạc-chitosan chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ có hiệu lực ức chế nấm Phytophthora

capsici lên đến 100% tại nồng độ 40 ppm với kích thước hạt 5 nm (Lê Quang Luân và cs.,

2014) Nano bạc dạng keo kích thước trung bình 52 nm ở nồng độ 180 ppm đã ức chế trên

90% sự phát triển của nấm Phomopsis sp Trên hạt đậu tương (Mendes và cs., 2014) Vật

liệu nano Ag/CTS/bentonite ở nồng độ bạc 400 ppm có hiệu quả ức chế nấm Rhizoctonia

solani đạt 92,82% và nấm F Oxysporum đạt 66,70% (Nguyễn Hoài Châu và cs., 2017)

Các nhà khoa học cho rằng, khả năng ức chế của dung dịch nano bạc đối với sự phát triểncủa nấm bệnh là nhờ sự chuyển hóa từ Ag0thành ion Ag+ tấn công đồng thời nhiều vị trítrong tế bào vi sinh vật, vô hiệu hóa các tổ chức chức năng quan trọng trong tế bào, làmảnh hưởng đến quá trình tổng hợp thành tế bào, quá trình vận chuyển các chất qua màng,tổng hợp và dịch mã axit nucleic (RNA, DNA), tổng hợp protein cũng như vận chuyểnđiện tử qua màng Ion bạc có ái lực mạnh đối với các nhóm chức mang điện tích âm trênphân tử sinh học, đó là các nhóm -SH, -COOH, PO43 và các nhóm chức tích điện âm khácphân bố khắp trong tế bào vi sinh vật (Công Hồng Hạnh và cs., 2020) Chính phản ứngliên kết đó đã làm thay đổi cấu trúc của các đại phân tử, làm chúng trở nên mất tác dụngtrong tế bào

Trong những năm gần đây, dung dịch nano bạc với các hạt nano có diện tích bề mặt lớnlàm tăng khả năng tiếp xúc và sự bám dính trên bề mặt tế bào dẫn đến hiệu quả tác độngcao và đã được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô (Mahna và cs., 2013; Dương Tấn Nhựt

và cs., 2017; Đồng Huy Giới, Bùi Thị Thu Hương, 2019) Nhờ đặc tính kháng nấm, khángkhuẩn mà không gây ảnh hưởng đến sức khoẻ của con người và môi trường vì vậy nanobạc đang là một hướng nghiên cứu mới đang được mọi người hướng đến và áp dụng trongtương lai

1.3.2 Tổng quan về tình hình nghiên cứu áp dụng nano bạc vào nuôi cấy in vitro

Nhờ vào khả năng kháng nấm, khuẩn vượt trội của mình, nano bạc đã được lựa chọn làmđối tượng nghiên cứu cho nhiều nghiên cứu về khả năng khử trùng môi trường và mẫutrong nuôi cấy mô Theo Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2017), nghiên cứu nano bạc có

hiệu quả trong việc khử trùng môi trường nuôi cấy in vitro không hấp khử trùng, đặc biệt

đối với môi trường nuôi cấy cây cúc khi bổ sung 4 ppm nano bạc, không bổ sung thanhoạt tính và nồng độ đường từ 0 - 20 g/l vào môi trường nuôi cấy không cấy mẫu cho hiệuquả khử trùng 100% sau 4 tuần Theo Đỗ Mạnh Cường và cộng sự (2018) Việc sử dụngnano bạc nồng độ 0,2 g/L trong 20 phút có thể thay thế các chất khử trùng thông dụng

(HgCl2, Ca(ClO)2) trong vi nhân giống cây dâu tây Sử dụng dung dịch nano bạc với nồng

độ 150 ppm trong thời gian 40 phút để khử mẫu có thể thay thế hiệu quả các chất khử

trùng khác trong nhân giống in vitro cây Trầu tiên (Bùi Thị Thanh Phương và cs., 2020).

Ngoài khả năng khử trùng tốt, Nano bạc còn có tác động tích cực lên quá trình sinh

trưởng và phát triển của một số loài thực vật nuôi cấy in vitro Theo nghiên cứu của Hà

Thị Mỹ Ngân và cộng sự (2019), sử dụng nano bạc trong vi nhân giống hoa hồng đã giúpcải thiện hệ số nhân chồi, gia tăng sự sinh trưởng và phát triển của chồi nuôi cấy; bêncạnh đó, nano bạc còn hạn chế hiện tượng vàng lá, rụng lá chồi nuôi cấy thông qua ức chếhoạt động của khí ethylene và hoạt độ enzyme thủy phân cellulase và pectinase, đây là haienzyme quan trọng trong tiến trình cảm ứng sự rụng và già hóa của mô Cây con có nguồn

gốc từ nuôi cấy in vitro trên môi trường có bổ sung nano bạc cho tỷ lệ sống, khả năng

thích nghi cao ở giai đoạn vườn ươm

Các ion bạc ở dạng muối bạc nitrate, bạc thiosulphate được ứng dụng nhiều trong nuôicấy mô tế bào thực vật nhờ đặc tính kháng nấm, kháng khuẩn mà không gây ảnh hưởngđến sức khoẻ của con người (Abdi, 2012) Mặt khác, các ion bạc còn đóng vai trò quan

trọng trong sự phát triển của mô sẹo, tái sinh chồi trong nuôi cấy in vitro (Bais và cs.,

2000), hình thành rễ và tạo cây hoàn chỉnh trong vi nhân giống (Reddy và cs., 2001) Tuynhiên, các ion bạc luôn đi kèm với các cation tồn tại ở dạng muối (bạc nitrate, bạcthiosulphate); điều này ảnh hưởng đến hiệu quả khử trùng và hấp thu, chuyển hoá của ionbạc Để khắc phục tình trạng trên, dung dịch nano bạc với các hạt kích thước từ 1 đến20nm và với kích thước cực kỳ nhỏ này, các hạt nano có diện tích bề mặt lớn làm tăngkhả năng tiếp xúc và sự bám dính trên bề mặt tế bào dẫn đến hiệu quả tác động cao.Rostami và Shahsavar (2009) đã bổ sung nano bạc ở nồng độ 4 mg/l vào môi trường nuôicấy cây ôliu cho khả năng kháng khuẩn tốt nhất mà không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

và phát triển của cây Nano bạc có ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt Bacopa monnieri,

cảm ứng tổng hợp protein và carbohydrate, giảm lượng phenol tổng và hoạt động của cácenzyme peroxidase (Krishnaraj và cs., 2012) Hiệu quả của nano bạc trong việc tăngcường khả năng sinh trưởng, phát triển và giải quyết một số bất lợi không mong muốn

trên một số loại thực vật in vitro cũng đã được báo cáo Nano bạc cũng làm tăng cường

các chỉ tiêu sinh trưởng và các thuộc tính hóa học ở loài cây Brassica juncea, đậu và ngô

(Sharma và cs., 2012)

Với khả năng kháng nấm, kháng khuẩn không gây hại tới con người, kích thích sự sinh

trưởng và phát triển của cây in vitro Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo

sát và đánh giá khả năng thay thế chất khử trùng thông dụng Ca(ClO)2 bằng nano bạctrong giai đoạn khử trùng mẫu cấy và nghiên cứu ảnh hưởng của nano bạc khác nhau lên

sự sinh trưởng và phát triển của chồi cây hoa cẩm chướng trong điều kiện nuôi cấy in

vitro

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm, thời gian, vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ giống cây trồng, Khoa Nông Lâm,Trường Đại Học Đà Lạt

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 1 năm 2021 đến tháng 5 năm 2021

2.1.3 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu

Mẫu là chồi đỉnh được lấy từ vườn của nông hộ tại Đà Lạt (phường 11, đường Huỳnh TấnPhát, Đà Lạt) sau đó đem về phòng thí nghiệm

Dung dịch nano bạc với các hạt nano bạc có kích thước trung bình ≤ 20 nm doViện Công nghệ Môi trường (Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, 18Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội) cung cấp với nồng độ 500 ppm được pha thành cácnồng độ khác nhau: 25ppm, 50ppm, 75ppm, 100ppm, 125ppm để khử trùng mẫu

Môi trường nuôi cấy: môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung1,0mg/L BA, 30g/L đường và 8,6g/L agar Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh về pH5,8 trước khi hấp khử trùng

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Ảnh hưởng của nano bạc trong việc khử trùng mẫu chồi hoa cẩm chướng

- Ảnh hưởng của các nồng độ nano bạc khác nhau đến sự nhân nhanh chồi hoa cẩmchướng

2.3 Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu

2.3.3.1 Ảnh hưởng của nano bạc trong việc khử trùng mẫu chồi hoa cẩm chướng

Mẫu sau khi lấy tại vườn sẽ đem về tỉa gọn và cắt ngắn khoảng 2cm và tiến hành rửa mẫukhử trùng Nguồn mẫu (chồi đỉnh) được thu nhận từ những cây khỏe mạnh ngoài vườn và

rửa dưới vòi nước chảy 10 phút Sau đó mẫu được ngâm trong xà phòng 5 phút và rửa lạibằng nước máy 3 lần Tiếp theo mẫu được khử trùng bằng Ca(ClO)2 và nano bạc với nồng

độ và thời gian khác nhau tùy vào từng nghiệm thức (bảng 1) Tiếp đó, mẫu được đưa vào

tủ cấy vô trùng và tiến hành rửa mẫu lại với nước cất vô trùng 3 lần, mỗi lần 5 phút

Mẫu nuôi cấy là chồi đỉnh có kích thước 1mm được sử dụng làm mẫu cấy Mỗi nghiệmthức lập lại 3 lần, mỗi lần 20 mẫu

Hình 2: Chồi đỉnh sau khi cắt

Bảng 1: Các chất khử trùng được sử dụng trong việc khử trùng mẫu với nồng độ và thời

2.3.1.2 Ảnh hưởng của các nồng độ nano bạc khác nhau đến sự nhân nhanh của chồi hoa cẩm chướng:

Chồi hoa cẩm chướng thu nhận từ nghiệm thức tốt nhất của thí nghiệm trên Tiến hànhcấy truyền 3 lần trong môi trường nuôi cấy đủ số lượng mẫu bắt đầu thực hiện thí nghiệm

2 Mẫu cắt ngắn khoảng 1 – 1,5 cm cấy vào các môi trường nuôi cấy có bổ sung các nồng

độ nano bạc khác nhau (Bảng 2) Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần mỗi lần 20 mẫu

Bảng 2: Các nồng độ nano bạc khác nhau được bổ sung vào môi trường nuôi cấy

Nghiệm thức Dung dịch nano bạc (ppm)

2.3.2 Chỉ tiêu theo dõi

2.3.2.1 Ảnh hưởng của nano bạc trong việc khử trùng mẫu chồi hoa cẩm chướng

Số chồi/mẫu: đếm số chồi có trên mẫu

Chiều cao cây (cm): được xác định bằng cách đo chiều dài từ gốc đến lá cao nhất

Tỷ lệ nhiễm = × 100 (%)

Tỷ lệ tái sinh chồi = × 100 (%)