12195 2 6 2018 001 jpg 12195 2 6 2018 002 jpg 12195 2 6 2018 003 jpg 12195 2 6 2018 004 jpg 12195 2 6 2018 005 jpg 12195 2 6 2018 006 jpg 12195 2 6 2018 007 jpg 12195 2 6 2018 008 jpg 12195 2 6 2018 0[.]
Trang 1TCVN TIEU CHUAN QUOCGIA
TCVN 12195-2-6:2018
Xuat ban lan 4
QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NÁM GÂY BỆNH THỰC VẬT PHAN 2-6: YÊU CÀU CỤ THẺ ĐÓI VỚI Phytophthora
boehmeriae Sawada
Procedure for identification of plant disease caused by fungi Part 2-6: Particular requirements for Phytophthora boehmeriae Sawada
HÀ NỘI - 2018
Trang 2Lời nói đầu
TCVN 12195-2-6: 2018 do Trung tâm Giám định Kiểm dịch thực vật - Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường
Chát lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bó
Bộ TCVN 12195 Quy trình giám định nắm gây bệnh thực vật gồm các phần sau đây:
Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với nắmGuignardia bidwelli (Ellis) Viala & Ravaz
Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với nắm Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr
Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với nám Claviceps africana Frederickson, Mantle & De
Milliano
- _ Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với nám Ciborinia camelliae Kohn
Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với nám Boeremia foveafa (Foister) Aveskamp, Gruyter &
Verkley
Phan 2-8: Yêu cầu cu thé déi voi Phytophthora boehmeriae Sawada
Trang 3TIEU CHUAN QUOC GIA TCVN 12195-2-6:2018
Quy trình giám định nắm gây bệnh thực vật
Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối voi Phytophthora boehmeriae
Sawada
Procedure for identification of plant disease caused by fungi
1 Pham vi 4p dụng
Tiêu chuẩn này quy định quy trình giám định Phytophthora boehmeriae Sawada gay bệnh thực vật
2 Tài liệu viện dẫn
Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp
dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bỗ sung (nếu có)
TCVN 8597: 2010, Kiểm dịch thực vật - Phương pháp luận vê việc lầy mẫu chuyền hàng
3 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị sau:
3.1 Túi lấy mẫu: sạch
3.2 Tủ lạnh: nhiệt độ từ 4 °C đến 8 "C
3.3 Giấy bản: thám nước, sạch
3.4 Kẹp ép mẫu thực vật: gồm 2 cặp mắt cáo (thường là bằng gỗ), dây buộc
3.5 Lọ đựng mẫu: Trơ với hóa chất, có nắp
Trang 43.16 Ban gia nhiét
3.17 Ong ly tam 1,5 ml: bằng nhựa, có nắp
3.18 Chày nhựa
3.19 Chày cối sứ
3.20 Máy chu trình nhiệt (PCR)
3.21 Kính hiển vi: có độ phóng đại 40x đến 100x
4 Hóa chất
Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác
4.1 Hóa chất điều chế môi trường: LBA, CA, V8, Oatmeal Agar,
4.2 Cồn (C;H;OH): 70 %, 90 %
4.3 Nước cắt 1 lần, nước cất vô trùng
4.4 Silicagel
4.5 Parafin
4.7 Axit Sunfuric (H,SO,) 10 %
4.8 Hóa chất cố định mẫu: chất kết dinh, keo Bôm Canada, Xylene
4.9 Hóa chất PCR: Natri clorit (NaCl) khan, Kali clorit (KCI), Natri hydro phosphat (Na;HPO,), Kali
dihydro phosphat (KH,PO,), Tris- HCl 1M, EDTA 0,5M, Natri clorit (NaCl) 5M, PVP 40, 2-
mercaptoethanol, phenol: chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), isopropanol, dry milk solution, SDS, ammonium acetate 7,5M, PCR Buffer 10x, dNTPs 2.0nM, Primers, Taq polymerase, agarose, loading dye
5 Phwong phap thu thap va bao quan mau
5.1 Lấy mẫu
5.1.1 Đối với hàng hoá xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước Lấy mẫu theo TCVN 8697:2010
5.1.2 Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng
~ Diện tích điều tra: phụ thuộc vào loại cây trồng, điều kiện cụ thể tại vùng điều tra và mục đích điều
tra
- Chọn điểm điều tra: Có thể chọn điểm điều tra theo một trong số các phương pháp sau + Chọn điểm theo đường chéo góc (hình 1)
Trang 5|
5 Hình 1- Điểm điều tra lấy theo đường chéo góc
(NGUÒN: Viện Bảo vệ thực vật, 1997) + Chọn điểm theo ô bàn cờ (hình 2)
Hình 2- Điểm điều tra lấy theo ô bàn cờ (NGUÒN: Viện Bảo vệ thực vật, 1997) + Chọn điểm hình rẻ quạt (hình 3)
Hình 3- Điểm điều tra lấy theo hình rẻ quạt
(NGUÔN: Viện Bảo vệ thực vật, 1997)
Trang 6+ Chon điểm ngẫu nhiên (hình 4 )
Hình 4 - Điểm điều tra lấy theo ngẫu nhiên
(NGUÔN: Viện Bảo vệ thực vật, 1997)
+ Điều tra toàn bộ ruộng theo băng (hình 5) Tại ruộng điều tra, điều tra toàn bộ ruộng theo phương pháp cuốn chiếu theo băng Mỗi ruộng được chia ra làm các băng nhỏ, mỗi băng có chiều rộng 2 m, điều tra lần lượt từ đầu tới cuối băng và kiểm tra toàn bộ cây trồng trong mỗi băng điều tra
#-2m—* 2m 2m 2m 2m
Hình 5 ~ Điều tra toàn bộ ruộng theo băng
- Số lượng mẫu: số lượng mẫu phụ thuộc vào mục đích điều tra và phương pháp lấy mẫu + Cây ăn quả, cây lâu năm, cây công nghiệp: số lượng cây điều tra tại một điểm tối thiểu từ 3 cây đến 5 cây
+ Cây hàng năm, rau màu, cây ngắn ngảy: mỗi điểm có diện tích tối thiểu là 1 m?
Thu toàn bộ các bông có triệu chứng nghỉ bị nhiễm nắm P boehmeriae Sawada
Mẫu rễ và đất được lây của 4 cây mỗi điểm
Mẫu đắt: Lấy mẫu đất có độ sâu 5 cm đến 25cm
5.2 Bảo quản mẫu
Các bộ phận tươi khi thu được chứa trong các túi lầy mẫu (3.1) và bảo quản trong tủ lạnh (3.2) ở nhiệt
độ 4 °C đến 5 °C
Các mẫu tươi sau khi giám định hoặc gửi đi giám định có thể xử lý bằng phương pháp:
Ép khô
Trang 7Bộ phận nhiễm bệnh (quả) được ép khô bằng cách đặt giữa các lớp giấy bản (3.3) thường là từ 4 đến Siờ
Các lớp giấy bản (có chứa mẫu) được đặt giữa 2 miếng bìa các tông và đặt vào kẹp ép mẫu thực vật
(3.4) sau đó nén chặt bằng dây hoặc vật nặng
Trong quá trình làm khô mẫu giấy bản nên thay thường xuyên khoảng 1 lằn/ngày
Kẹp ép mẫu thực vật (có chứa mẫu) có thể phơi nắng, để trong phòng có điều hòa hoặc máy sưởi để
tăng hiệu quả làm khô mẫu
Thời gian làm khô mẫu hoàn toàn thông thường là từ 5 đến 10 ngày
Mẫu đạt tiêu chuẩn là các mẫu không bị mốc, khô hoàn toàn, không bị gập gãy hoặc nhăn nheo Các mẫu vật sau khi ép khô được đặt trong các túi lầy mẫu vô trùng, bên ngoài đề rõ các thông tin liên
quan như: ngày, tháng lấy mẫu, thông tin kí chủ; thông tin bệnh hại (hoặc nghỉ ngờ loại bệnh hại), địa
điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu)
Các túi chứa mẫu bằng giấy được lưu trữ trong các tủ lưu trữ mẫu (3.6) (hoặc các hộp lưu trữ mẫu (3.7) có độ ẩm thấp (có thể sử dụng các vật liệu chống ẩm như silicagel )
Ngâm mẫu:
Bộ phận nhiễm bệnh (cành, lá, quả tươi) được rửa nhẹ dưới vòi nước chảy sau đó rửa lại bằng nước
cất vô trùng
Mẫu được để chỗ thoáng để bề mặt khô hoàn toàn
Có thể ngâm mẫu vào dung dịch HạSO„ 10 % bổ sung thêm giycerol 0,01 % và cồn 90 % 0,01 % trong vòng 24 giờ
Vớt mẫu vật ra, rửa trong nước lạnh
Chuyển mẫu vào dung dịch bảo quản (Xem phụ lục C) và đậy chặt nắp
Thay dung dịch bảo tồn khi thấy hiện tượng dung dịch bị vẫn đục (hoặc 6 tháng 1 lần) cho đến khi dung dịch bảo tồn không bị vẫn đục nữa thì gắn chặt lọ mẫu bằng parafin
Dán nhãn bên ngoài hộp ngâm mẫu ghi rõ các thông tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu; thông tin
kí chủ; thông tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại); địa điểm (hoặc lô hàng lầy mẫu)
Các tiêu bản lam của nắm được dán nhãn, để trong hộp lưu trữ mẫu (3.7) và bảo quản ở nhiệt độ
phòng
Ảnh chụp của mẫu vật (ảnh mẫu vật, ảnh cấu trúc nắm ) được ghi rõ các thông tin và lưu lại trong máy tinh hoặc ảnh rửa
6 Phát hiện bệnh
Nắm gây hại trên cây con và quả bông, lá và thân cây gai, lá cây dướng, quả cây họ cam quýt, rễ
thông Trên mỗi bộ phận và loại cây nắm thể hiện các triệu chứng khác nhau:
6.1 Triệu chứng trên chi bông (Gossypium sp.)
Trang 8Giai doan cay con: Trén la man hoặc lá thật nắm gây ra các vét bệnh có màu xanh đen, hình dang bat định, sũng nước Lá mầm hoặc lá thật nhiễm bệnh thường rụng đi hoặc bị héo khi gặp thời tiết lạnh và
ẩm ướt Phần cổ rễ thường có các sọc màu nâu sau đó thối đi cây con sau đó bị héo và chết
Trên quả: Các vết bệnh thường xuất hiện ở các vết nứt dưới đáy quả hoặc trên đầu quả Vết bệnh có dạng sũng nước màu xanh đậm, mô nhiễm bệnh sau đó bị thối Trong điều kiện thời tiết âm có thể
quan sát thấy một lớp "sương mai" mỏng trên bề mặt vết bệnh Bông bị bệnh thường bị thối hỏng 6.2 Triệu chứng trên cây gai (Boehmeria nivea)
Bệnh gây hại trên lá và thân Trên lá vết bệnh đầu tiên có màu xanh nhạt sau đó chuyển thành nâu đen
hoặc xanh đen Vết bệnh có dạng tròn hoặc bắt định, hơi sũng nước Trong giai đoạn nhiễm nặng tâm vết bệnh chuyển màu nâu vàng hoặc xám, rìa màu nâu Lá nhiễm bệnh thường rụng sớm Vết bệnh thường ở phần gốc thân, vết bệnh màu nâu đen hình ellip Khi nhiễm bệnh ở phần thân cây thường bị thối phần gốc thân
6.3 Triệu chứng trên cây Dướng (Broussonetia papyrifera) va cay coi (Pterocarya stenoptera C DC.)
Triệu chứng nắm gây hại trên cây dướng và cây cơi tương tự như triệu chứng của nắm trên lá và lá mầm của bông
6.4 Triệu chứng trên cây có múi (Cifrus spp.):
Nắm gây thối nâu quả và chảy mủ phần gốc ghép
6.5 Triệu chứng trên chỉ thông (Pinus sp.)
Nắm gây hiện tượng thối rễ trên cây thông
Như vậy các dầu hiệu cơ bản để nhận biết nhanh bệnh trên các loài cây kí chủ như sau: Cây: héo hoặc chết (chỉ bông)
Lá: Đốm trên lá (cây dướng, cây cơi), vét bệnh tròn sũng nước lá rụng (chi bông)
Thân: Chảy mủ (Cây có múi)
Rễ: thối rễ (cây có múi, chỉ thông, chỉ bông)
Khi kiểm tra lô hàng cần chú ý các quốc gia mà nắm có phân bồ (xem phy luc A) và các loài kí chủ mà
nắm gây hại (xem phụ lục A)
7 Giám định bệnh
7.1 Giám định bằng đặc điểm hình thái
7.1.1 Kiểm tra trực tiếp
7.1.1.1 Soi tươi
Dùng kim khêu nấm (3.8) hoặc dao cắt mẫu (3.9) thu nắm trực tiếp từ các phần nghi ngờ nhiễm bệnh
hoặc có triệu chứng điển hình, đặt lên lam kính (3.13) đã có một giọt lactophenol (xem phụ lục C) Đặt lam lên kính hiển vi (3.21), quan sát đặc điểm hình thái nắm và so sánh với đặc điểm hình thái của
nắm trong khóa phân loại hiện có
Đặc biệt chú ý thu nắm từ những bộ phận có triệu chứng bệnh điển hình
10
Trang 97.1.1.2 Cố định tiêu bản lam
~ Nắm được làm tiêu bản lam có định trước khi quan sát, đo đếm hình thái
~ Cách làm tiêu bản lam: có thể sử dụng một trong hai phương pháp sau:
Phương pháp 1: có định lam sử dụng chất kết dinh:
Nhỏ 1 giọt dung dịch soi kính (có thể sử dụng một trong hai loại dung dịch soi kính: axit lactic 85 %, lactoglycerol (Xem phụ lục C) hoặc lactophenol (Xem phụ lục C)) lên một lam kính (3.13) sạch
Dùng kim khêu nắm (3.8) hoặc dao cắt mẫu (3.9) lầy nắm trên bề mặt vết bệnh hoặc các lát cắt mỏng
của mẫu bệnh đặt vào giọt dung dịch soi kính
Đặt lamen (3.14) lên giọt dung dịch soi kính có chứa mẫu nám
Hơ nhanh qua ngọn lửa đèn cồn (3.15) để đuổi bọt khí
Nếu dịch soi kính tràn ra phía ngoài lamen (3.14) quá nhiều sử dụng giấy thắm lau khô trước khi gắn
cố định mẫu
Dùng chất kết dinh gắn chặt viền lamen (3.14) và lam kính (3.1)
Đặt lam kính đã cố định ở nơi khô ráo
CHÚ THÍCH: phương pháp này có thể lưu trữ tiêu bản lam trong vòng vài năm
Phương pháp 2: sử dụng keo Bôm Canada (Canada balsam)
Nhỏ 1 giọt dung dịch keo Bôm Canada-Xylene (Xem phụ lục C) lên một lam kính sạch
Dùng kim khêu nắm (3.11) hoặc dao cắt mẫu (3.12) lầy nắm trên bề mặt vết bệnh hoặc các lát cắt
mỏng của mẫu bệnh đặt vào giọt dung dịch keo Bôm Canada-Xylene
Đặt lamen (3.15) lên giọt dung dịch keo Bôm Canada-Xylene có chứa mẫu nám
Nếu trong lam có bọt khí có thể đuổi bọt khí bằng cách đặt lam lên một bàn gia nhiệt
CHÚ THÍCH: Đây là phương pháp có định lam lâu dài, thời gian lưu trữ có thể lên tới vài chục năm
- Đặt tiêu bản lam lên kính hiển vi (3.14), quan sát đặc điểm hình thái nắm và so sánh với đặc điểm
hình thái của nắm trong khóa phân loại hiện có
7.1.2 Lắc rửa ly tâm
7.1.2.1 Cách làm
Biện pháp lắc rửa ly tâm thường áp dụng đối với các hạt nghỉ ngờ nhiễm bệnh mà chủ yếu là hạt cây
bông Các bước tiến hành như sau:
Bước 1: cân 5 g hạt
Bước 2: Cho hạt vào bình tam giác (3.10) có sẵn 150 ml nước cắt vô trùng Lắc mạnh trong 5 phút
Bước 3: Lọc dung dịch nước và hạt qua vải lọc (chessecloth)
Bước 4: Ly tâm dịch thu được trong 5 phút ở tốc độ 3.000 vòng/phút
11
Trang 10Bước 5: Thu cặn ly tâm hòa tan vào 0,5 ml nước cát vô trùng
7.1.2.2 Quan sát đặc điểm hình thái của nắm
7.1.2.2.1 Soi tươi
- Quan sát hình thái sợi nắm: Dùng kim khêu nắm (3.8) thu nắm trên mẫu đã để ẩm đặt lên lam trong
có một giọt lactophenol rồi đậy lamen (3.14) lên Đặt lam lên kính hiển vi tìm và quan sát, đo đếm các
đặc điểm hình thái của nắm (bào tử, sợi nắm, tản nắm ) và so sánh với đặc điểm hình thái nắm trong
khóa phân loại
T.1.2.2.2 Có định tiêu bản lam
- Thu mẫu nắm hoặc mẫu cắt lát mỏng tiêu bản nắm từ mẫu để ẩm để làm tiêu bản lam cố định
- Làm tiêu bản lam cố định như mục 7.1.1.2
- Đặt tiêu bản lam lên kính hiển vi (3.21), quan sát đặc điểm hình thái nám và so sánh với đặc điểm
hình thái của nắm trong khóa phân loại hiện có
7.1.3 Phương pháp để ẳm
7.1.3.1 Cách làm
Biện pháp để ẩm sử dụng khi đối tượng nghi ngờ nhiễm bệnh là mô cây tươi Các bước tiền hành như Sau:
Bước 1: Phần mô cây nghỉ nhiễm bệnh (cành, thân , lá, quả ) được rửa sạch dưới vòi nước chảy
Bước 2: Để phần mô cây này vào buồng để ẩm (thường là các thầu thủy tinh (3.11) đã được khử trùng bằng cồn, kín hơi)
Bước 3: Để Am trong điều kiện 25 °C ẩm độ 95 % đến 100 % trong điều kiện sáng
7.1.3.2 Quan sát đặc điểm hình thái của nắm
7.1.3.2.1 Soi tươi
- Quan sát hình thái sợi nắm: Dùng kim khêu nắm (3.8) thu nắm trên mẫu đã để 4m đặt lên lam trong
có một giọt lactophenol rồi đậy lamen (3.14) lên Đặt lam lên kính hiển vi tìm và quan sát, đo đếm các
đặc điểm hình thái của nấm (bảo tử, sợi nắm, tản nắm ) và so sánh với đặc điểm hình thái nắm trong
khóa phân loại
7.1.3.2.2 Có định tiêu bản lam
~ Thu mẫu nắm hoặc mẫu cắt lát mỏng tiêu bản nắm từ mẫu để ẩm để làm tiêu bản lam cố định
- Làm tiêu bản lam cố định như mục 7.1.1.2
- Đặt tiêu bản lam lên kính hiễn vi (3.21), quan sát đặc điểm hình thái nắm và so sánh với đặc điểm hình thái của nắm trong khóa phân loại hiện có
7.1.4 Phân lập và nuôi cấy trên môi trường nhân tao
7.1.4.1 Cách làm
12
Trang 117.4.1 Phan lập nắm từ các mô cây nghỉ ngờ nhiễm bệnh
Bước 1: Phần mô cây nghỉ nhiễm bệnh (cành, thân , lá ) được rửa sạch dưới vòi nước chảy
Bước 2: Khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong cồn 70 % trong 30 giây, rửa lại 2 lần bằng nước cắt
vô trùng
Bước 3: Đặt 1 mẫu nhỏ (5x5) mm) phần mô nghỉ ngờ nhiễm bệnh lên dia petri (3.12) có chứa môi
trường LBA hoặc V8 có bổ sung thêm chất kháng sinh (Xem phụ lục B)
Bước 4: Đặt các đĩa petri môi trường có chứa nám ở điều kiện phòng trong 3 ngày
Bước 5: Cầy chuyển nắm lên các môi trường LBA, V8, CA (Xem phụ lục B) nuôi cấy ở 25 °C trong điều
kiện tối trong 1 đến 3 ngày
7.4.2 Nuôi cấy dé quan sat bọc bào tử (sporangium)
Bước 1: Cấy chuyển 1 mẫu thạch nhỏ có chứa nắm (đường kính 3 đến 5mm) thu được từ bước phân
lập (xem 7.1.4.1) vào một đĩa petri (3.12) có chứa môi trường V8 (Xem phụ lục B) đặt đĩa petri trong
bóng tối ở nhiệt độ 25 °C
Bước 2: Khi nắm phủ kính 1⁄2 đường kính của đĩa petri chuyển 10 mẫu thạch nhỏ (đường kính 3 đến
5mm) lén 1 dia petri sạch
Bước 3: Rót nước cất vô trùng vào đĩa petri ở bước 2 sao cho nước cất hoặc dung dịch phủ kín các
mẫu thạch (thông thường là từ 7 ml đến 10 mi nước cắt hoặc dung dịch)
Bước 4: Đặt các đĩa petri ở bước 3 trong điều kiện chiều sáng liên tực ở nhiệt độ phòng (22 °C đến 25
°c)
Bước 5: Kiểm tra sau mỗi 12 đến 24 giờ trong khoảng 3 ngày
7.4.3 Nuôi cấy để quan sát bao trứng (Oospore)
Bước 1: Cấy chuyển 1 mẫu thạch nhỏ có chứa nắm thu được ở bước phân lập (xem 7.1.4.1) vào một
đĩa petri (3.12) có chứa môi trường V8 hoặc CA (Xem phụ lục B)
Bước 2: Đặt đĩa petri ở bước 1 trong điều kiện tối hoàn toàn nhiệt độ 20 °C khoảng 6 tuần
Bước 3: Kiểm tra sự có mặt của giao tử đực (sau 1 tuần), giao tử cái (2 tuần) và bào tử trứng (2 đến 6 tuần)
7.4.4 Nuôi cấy để quan sát bào tử hậu (Chlamydospore)
Bước 1: Chuyển 1 mẫu thạch nhỏ nuôi cây trên môi trường CA vào bình thủy tinh có chứa 25ml dịch chiết cà rốt (Xem phụ lục B) nuôi cấy trong bóng tối nhiệt độ 25 °C trong 24 giờ
Bước 2: Lắc bình trong 5 phút, nuôi cấy tiếp tục trong điều kiện tối, nhiệt độ 25 °C trong 5 ngày Bước 3: Loại bỏ phần dịch chiết cà rốt, bỗ sung thêm 50ml nước cắt vô trùng, nuôi cấy trong điều kiện tối, nhiệt độ 18 °C trong 21 ngày
Bước 4: Theo dõi sự hình thành bào tử hậu
7.1.4.2 Quan sát đặc điểm hình thái của nám
7.1.4.2.1 Soi tươi
- Quan sát hình thái sợi nám: Dùng kim khêu nắm (3.8) thu nắm trên mẫu đã để ẫm đặt lên lam trong
có một giọt lactophenol rồi đậy lamen (3.14) lên Đặt lam lên kính hiễn vi tim va quan sat, do đếm các
13
Trang 12đặc điểm hình thái của nắm (bảo tử, sợi nắm, tản nắm ) và so sánh với đặc điểm hình thái nắm trong
khóa phân loại
7.1.4.2.2 Cố định tiêu bản lam
- Thu mẫu nắm hoặc mẫu cắt lát mỏng tiêu bản nám từ mẫu để ẩm để làm tiêu bản lam có định
- Làm tiêu bản lam cố định như mục 7.1.1.2
- Đặt tiêu bản lam lên kính hiển vi (3.21), quan sát đặc điểm hình thái nắm và so sánh với đặc điểm
hình thái của nam trong khóa phân loại hiện có
7.1.5 Bẫy bào tử trong đất
7.1.8.1 Cách làm
Nắm P boehmeriae có tồn tại trong đất, đề xác định sự tồn tại của nắm này trong đất chúng ta có thể kiểm chứng bằng cách bẫy bảo tử như sau:
Bước 1: Hòa tan 10 g đất vào 1 lít nước cất
Bước 2: Rót dung dich dat qua phu lam bằng giấy lọc Dung dịch nảy có thể bảo quản trong tủ lạnh
Bước 3: Rót dung dịch đất thu được ở bước 2 vào đĩa petri (3.12) có chứa đĩa lá của cây họ cam chanh (đĩa lá được tạo ra bằng cách đục lá bằng các ống kim loại tròn hoặc cắt nhỏ lá bằng kéo) đến
khi đĩa lá nỗi trên mặt dịch
Bước 4: Đậy nắp đĩa và theo dõi trong 24 giờ
7.1.5.2 Quan sát đặc điểm hình thái của nắm
7.1.5.2.1 Soi tươi
- Quan sát hình thái sợi nắm: Dùng kim khêu nám (3.8) thu nắm trên mẫu đã để 4m đặt lên lam trong
có một giọt lactophenol rồi đậy lamen (3.14) lên Đặt lam lên kính hiễn vi tìm và quan sát, đo đếm các
đặc điểm hình thái của nắm (bào tử, sợi nắm, tản nắm ) và so sánh với đặc điểm hình thái nắm trong khóa phân loại
7.1 2.2 Cố định tiêu bản lam
- Thu mẫu nắm hoặc mẫu cắt lát mỏng tiêu bản nắm từ mẫu để ẩm để làm tiêu bản lam cố định
- Làm tiêu bản lam cố định như mục 7.1.1.2
- Đặt tiêu bản lam lên kính hiển vi (3.21), quan sát đặc điểm hình thái nắm và so sánh với đặc điểm
hình thái của nắm trong khóa phân loại hiện có
7.1.6 Đặc điểm hình thái giám định của nám
Đặc điểm hình thái
Bọc bảo tử (hình 6) hình trứng tới hình tròn, có núm nhỏ trên đầu Bào tử dễ rụng ra khỏi cuống Kích
thước bào tử (35x30) im, núm cao khoảng 4,83 pm
Kích thước cành bào tử (2 đến 5) um, không phân nhánh
14