Tom tat luận án: Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.

Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

NGU N THỊ THÙ VÂN

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VÀ SINH TỔNG HỢP

CYCLOOLIGOMER DEPSIPEPTIDE CỦA NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG TẠI KHU BẢO TỒN THIÊN NHIÊN COPIA

VÀ VƯỜN QUỐC GIA XUÂN SƠN

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 9.42.01.07

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2022

Công trình được hoàn thành tại:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS TS Dương Minh Lam

2 GS.TS Ngô Sỹ Hiền

Phản biện 1: PGS TS Lê Thanh Bình

Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Phản biện 2: PGS TS Vũ Nguyên Thành

Viện Công nghệ thực phẩm Phản biện 3: PGS TS Trần Văn Tuấn

Đại học Quốc gia Hà Nội

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường

họp tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

vào hồi … giờ … ngày … tháng… năm 2022

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

Thư viện Quốc Gia, Hà Nội

Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

MỞ ĐẦU

Nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic fungi - EPF) hay nấm côn trùng (Insect fungi) là nhóm nấm gây bệnh cho côn trùng Đây là nhóm nấm có vai trò rất quan trọng đối với hệ sinh thái Cho đến nay có gần 2000 loài nấm ký sinh côn trùng được ghi nhận Nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp đa dạng các chất chuyển hóa thứ cấp như: Cyclic depsipeptide, peptide, dẫn xuất amino acid, polyketide, peptide hybrid, terpenoid Các chất chuyển hóa thứ cấp từ nấm ký sinh côn trùng có phổ hoạt tính mạnh đã và đang thu hút được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu Trong đó đáng chú ý là nhóm hoạt chất cyclooligomer depsipeptide

Cyclooligomer depsipeptide (COD) là một nhóm đặc biệt của nonribosomal peptid gồm 2, 3 hoặc 4 đơn phân Trong đó mỗi đơn phân được cấu tạo bởi ít nhất một 2-hydroxycarboxylic acid và một 2-amino acid COD được sinh tổng hợp nhờ hệ enzyme non-ribosomal peptide synthetase (NRPSs) COD là hoạt chất tự nhiên được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm, thực vật, tảo, hải miên, và một số loại sinh vật biển khác Trong các nhóm COD thì COD từ nấm

ký sinh côn trùng là một nhóm rất quan trọng, chiếm tỷ lệ lớn nhất

Cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng có phổ hoạt tính sinh học rộng, bao gồm khả năng gây độc ở thực vật, gây độc tế bào, kháng vi rút, diệt côn trùng, chống sốt rét, chống khối u, ức chế hoạt động của một số loại enzyme cũng như là hạn chế sự hình thành các amyloid ở bệnh Alzheimer Đặc biệt trong các nghiên cứu gần đây cho thấy COD từ nấm ký sinh côn trùng rất

có tiềm năng trong phòng chống ung thư, ức chế sự sinh trưởng của một số dòng ung thư khác nhau ở người Hiện nay, các hoạt chất COD từ nấm ký sinh côn trùng được coi là nguồn nguyên liệu tự nhiên mới rất tiềm năng ứng dụng trong y dược

Trên thế giới việc nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng cũng như COD từ nấm ký sinh côn trùng bắt đầu từ rất sớm Điển hình như nghiên cứu về tách chiết enniatin A từ nấm Fusarium orthocera var enniatinum của Gaumann (1947), nghiên cứu về sinh tổng hợp cyclodepsipeptide D- D-, L-L-, và D-L- Cyclodi- (β-seryloxy- propionyl) của Hassal và cộng sự (1967) hay nghiên cứu

về cấu trúc của beauvericin từ nấm của Hamill và cộng sự (1969), Trải qua hơn 70 năm, nấm ký sinh côn trùng và COD từ nấm ký sinh côn trùng vẫn thu hút được sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng và ứng dụng của chúng

đã được công bố Các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào đa dạng nấm ký sinh côn trùng hoặc sử dụng sinh khối nấm để sản xuất các chế phẩm ứng dụng làm thuốc trừ sâu, tiêu biểu như nghiên cứu của các tác giả Nguyễn Thị Lộc (2006),

Phạm Thị Thùy (2010), Phạm Văn Nhạ (2013),… Nghiên cứu về COD từ nấm

ký sinh côn trùng là vấn đề rất mới mẻ, hiện chưa có một công trình nghiên cứu nào ở Việt Nam đề cập tới vấn đề này

Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn Quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ) là hai khu vực có độ đa dạng sinh học nổi bật ở miền Bắc Việt Nam Được thiên nhiên ưu đãi về điều kiện tự nhiên vì thế hệ động thực vật ở hai khu vực này rất phong phú, không chỉ có giá trị nghiên cứu khoa học, bảo tồn nguồn gen

mà còn có ý nghĩa trong phát triển kinh tế, khai thác tài nguyên thiên nhiên (đặc biệt là tài nguyên sinh vật) Với những khu rừng nhiệt đới và cận nhiệt đới, ở đây có rất nhiều loài động thực vật quý hiếm hiện hữu và đặc trưng cho vùng núi phía Bắc Tuy nhiên khu hệ nấm ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn Quốc gia Xuân Sơn còn chưa có nhiều nghiên cứu Những hiểu biết về đa dạng thành phần loài, đặc điểm sinh học và giá trị sử dụng còn đang rất hạn chế Đặc biệt, hầu như không có bất kỳ nghiên cứu nào về nấm gây bệnh côn trùng ở hai khu vực này

Nhằm bổ sung các hiểu biết về nấm ký sinh côn trùng và COD từ nấm ký sinh côn trùng cũng như góp phần xây dựng danh mục nguồn gen, bảo tồn đa dạng sinh học các loài nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia

và Vườn Quốc gia Xuân Sơn, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đa dạng và sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn Quốc gia Xuân Sơn”

Mục tiêu đề tài

Đánh giá được thành phần loài và khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của một số chủng nấm ký sinh côn trùng phân lập được ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ)

Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Nấm được phân lập từ các mẫu côn trùng thu thập

ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ)

- Phạm vi nghiên cứu: Phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm hình thái

và sinh học phân tử của chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp COD Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường và điều kiện nuôi cấy thu nhận COD, tách chiết, tinh sạch và khảo sát hoạt tính sinh học của COD từ chủng nấm đã tuyển chọn

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và nghiên cứu đa dạng nấm ký sinh côn trùng từ mẫu thu ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn

- Tuyển chọn các chủng nấm ký sinh côn trùng có khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide

- Nghiên cứu định loại chủng nấm đã tuyển chọn bằng phương pháp hình thái và sinh học phân tử

- Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy, sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide cho chủng nấm đã tuyển chọn ở quy mô phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu thu hồi, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của cyclooligomer depsipeptide

- Nghiên cứu khảo sát một số hoạt tính sinh học của các phân đoạn trong quá trình tách chiết cyclooligomer depsipeptide

Những đóng góp mới của luận án

- Là luận án đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện (từ khâu phân lập, tuyển chọn, định loại, nghiên cứu các đặc điểm lên men thu nhận, tách chiết, tinh sạch, khảo sát hoạt tính sinh học của COD) về một chủng nấm ký sinh côn trùng thuộc chi Cordyceps có khả năng sinh tổng hợp COD và có tiềm năng ứng dụng

- Đây là luận án đầu tiên công bố về đa dạng nấm ký sinh côn trùng và khả năng sinh tổng hợp COD của chủng nấm phân lập từ các mẫu côn trùng thu thập ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia (Sơn La) và Vườn quốc gia Xuân Sơn (Phú Thọ)

- Lần đầu tiên ghi nhận sự có mặt của loài nấm Cordyceps cateniannulata tại

Việt Nam

- Là công bố đầu tiên trên thế giới về Cordyceps cateniannulata có khả

năng sinh tổng hợp COD

Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 158 trang, bao gồm các phần sau:

Mở đầu: 4 trang

Chương 1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu: 37 trang

Chương 2 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 15 trang

Chương 3 Kết quả và Thảo luận: 71 trang

Kết luận và Kiến nghị: 2 trang

Tài liệu tham khảo: Luận án tham khảo được 12 tài liệu tiếng Việt, 209 tài liệu tiếng nước ngoài, 02 trang Web

Phụ lục: Luận án có 11 phụ lục các kết quả phân tích, trình tự ADN, phổ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

Trong chương này, sáu vấn đề liên quan đến các nghiên cứu trong luận án

này đã được tổng quan Đó là: (1.1) Nấm và nấm ký sinh côn trùng; (1.2) Nấm

ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide; (1.3) Nhu cầu dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy của nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide; (1.4) Tách chiết, tinh sạch và nghiên cứu cấu trúc cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng; (1.5) Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam

Trong phần (1.1) Nấm và nấm ký sinh côn trùng, giới thiệu về nấm (mục

1.1.1), sơ lược về nấm ký sinh côn trùng và các hoạt chất trao đổi chất thứ cấp

từ nấm ký sinh trùng (mục 1.1.2) đã được trình bày cụ thể

Trong phần (1.2) Nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer

depsipeptide, các nội dung về cấu trúc hóa học, các dạng COD từ nấm và hoạt

tính của COD đã được tổng quan (mục 1.2.1) Đa dạng nấm ký sinh côn trùng

sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide (Một số chi nấm ký sinh côn trùng phổ biến sinh tổng hợp COD, Nấm Cordyceps spp sinh tổng hợp COD - mục 1.2.2)

và con đường sinh tổng hợp COD ở nấm (mục 1.2.3) được trình bày cụ thể từ trang 18 đến trang 25

Phần (1.3) Nhu cầu dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy của nấm ký sinh

côn trùng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide, chúng tôi đã tổng quan

về: Lựa chọn môi trường nuôi cấy, độ pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ

Trong phần (1.4) Tách chiết, tinh sạch và nghiên cứu cấu trúc

cyclooligomer depsipeptide từ nấm ký sinh côn trùng, các bước tách chiết,

tinh sạch, các phương pháp trong nghiên cứu cấu trúc COD đã được tổng quan

và mô tả cụ thể

Trong phần (1.5) Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam, các

hướng nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng sinh tổng hợp COD trên thế giới và Việt Nam đặc biệt là ở khu vực nghiên cứu đã được tổng quan

CHƯƠNG II: NGU ÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

Trong chương này, các Nguyên vật liệu và đối tượng nghiên cứu được

trình bày trong mục (2.1) bao gồm: (2.1.1) Đối tượng nghiên cứu; (2.1.2)

Hóa chất và thiết bị; (2.1.3) Môi trường

Các Phương pháp nghiên cứu (mục 2.2) được chia thành 05 nhóm chính

như sau:

2.2.1 Phương pháp vi sinh vật học gồm các phương pháp: Phương pháp

phân lập, Phương pháp giữ giống, Phương pháp ho t h h ng n m t y n

h n, Phương pháp t y n h n h ng n m inh y looligom depsipeptide, Phương pháp ông khô, Phương pháp lự h n môi t ường dinh dưỡng và

iề kiện n ôi y phù hợp ho inh t ưởng và tí h lũy COD h ng t y n

h n, Đánh giá ho t tính gây ộ tế bào th o phương pháp MTT, Phương pháp ánh giá ho t tính kháng vi inh vật ki m ịnh, Đánh giá ho t tính hống oxi h

2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử gồm các phương pháp: Tá h hiết

ADN tổng ố, Nhân bội ADN, Phương pháp giải t ình tự

2.2.3 Phương pháp tách chiết và tinh sạch cyclooligomer depsipeptide

gồm các phương pháp: Phương pháp tá h hiết á hợp h t từ inh khối n m,

Phương pháp xá ịnh t ú h h á hợp h t h, Thự nghiệm tá h hiết, tinh h hợp h t COD từ inh khối n m C cateniannulata CPA14V

2.2.4 Phương pháp phân tích gồm các phương pháp: Phương pháp xá

ịnh inh khối khô (CDW), Phương pháp ịnh lượng COD t ong inh khối

n m

2.2.5 Phương pháp toán học

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đa dạng nấm ký sinh côn trùng phân lập từ mẫu thu ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn

3.1.1 Kết quả phân lập và nghiên cứu đặc điểm của nấm ký sinh côn trùng ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn

Kết quả từ 24 mẫu ký chủ thuộc các bộ côn trùng Blattodea, Hemiptera, Coleoptera, Hymenoptera và Lepidoptera, 24 chủng nấm đã được phân lập, thuần khiết và bảo quản cho các nghiên cứu tiếp theo Ký hiệu các chủng lần lượt là: CPA1, CPA3, CPA5, CPA13V, CPA14V, CPA15, CPA16, CPA31, CPA40, CPA44, XS01, XS07, XS12, XS36, XS37, XS38, XS57, XS65, XS66, XS67, XS69, XS71, XS77, XS83

Tiến hành phân loại 24 chủng nấm ký sinh côn trùng đã phân lập được dựa trên đặc điểm hình thái mẫu vô tính, hữu tính ngoài tự nhiên; đặc điểm nuôi cấy

và trình tự ITS của một số chủng các chủng nấm Kết quả xác định được các

chủng đã phân lập thuộc các chi Aschersonia (01 mẫu), Purpureocillium (01 mẫu), Beauveria (08 mẫu), Cordyceps (06 mẫu), Isaria (05 mẫu), và

Ophiocordyceps (03 mẫu) Kết quả cụ thể được thể hiện ở bảng 3.1, hình 3.25

dưới đây

Bảng 3.1 Thành phần nấm ký sinh côn trùng phân lập đƣợc

mẫu

Chủng Ký chủ

Hình 3.25 Mối quan hệ phát sinh chủng loại của các chủng nấm ký sinh

côn trùng phân lập tại khu vực nghiên cứu

3.1.2 Một số nhận xét về đa dạng các chủng nấm ký sinh côn trùng tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia và Vườn quốc gia Xuân Sơn

Kết quả 33,3% các chủng đã phân lập thuộc chi Beauveria, tiếp theo là chi

Cordyceps (25%) và Isaria (20,8%) Sự xuất hiện loài thuộc chi Aschersonia ký

sinh trên Hemiptera là lần đầu tiên được ghi nhận ở Việt Nam Trong 5 bộ ký chủ, Hymenoptera có số mẫu 07/24 mẫu thu thập được và là ký chủ của nhiều

chi nấm nhất trong nghiên cứu bao gồm Ophiocordyceps, Cordyceps,

Beauveria, và Isaria Tương tự bộ ký chủ Coleoptera có số mẫu 07/24 mẫu thu

thập được và là ký chủ của 3/6 chi nấm trong nghiên cứu (Beauveria,

Cordyceps và Purpureocillium) Trong nghiên cứu này, Cordyceps spp được

tìm thấy trên 4 bộ ký chủ nhưng không tìm thấy trên Hemiptera Chủng nấm

Isaria được tìm thấy ở bộ côn trùng Blattodae trong nghiên cứu là một ghi nhận

mới

Có sự khác biệt nhỏ giữa hai khu vực nghiên cứu Ở Khu bảo tồn thiên nhiên Copia, 10 mẫu nấm ký sinh côn trùng thu được trong 02 đợt thu mẫu được phân loại vào 4/6 chi nghiên cứu Trong khi ở Vườn quốc gia Xuân Sơn,

14 mẫu nấm thu được trong 01 đợt thu mẫu được phân loại vào 6/6 chi nghiên cứu

3.2 Khả năng sinh tổng hợp cyclooligomer depsipeptide của các chủng nấm ký sinh côn trùng đã phân lập

Kết quả cho thấy, 19/24 (79%) chủng nấm phân lập được có khả năng sinh tổng hợp COD trung bình từ 0,11 - 4,98 mg/g Tất cả các chủng thuộc chi

Beauveria đều có khả năng sinh COD, trong khi 83.3% các chủng Cordyceps

và 60% các chủng Isaria có khả năng này Phát hiện này đã chứng minh rằng

các loài nấm thuộc họ Cordycipitaceae rất có tiềm năng trong sản xuất COD và

rất đáng để nghiên cứu Bốn chủng Isaria sp XS69, Isaria sp CPA40,

Cordyceps sp CPA14V và Beauveria sp CPA16 có khả năng sinh COD cao

nhất, đạt 3,48, 3,88, 4,81, và 4,98 mg/g, trong khi sinh khối CDW tích lũy lần lượt đạt 9,38, 10,42, 9,84, và 5,81 g/l Trong các chủng này thì chủng

Cordyceps sp CPA14V được tìm thấy trên ký chủ thuộc bộ côn trùng Blattodea

có khả năng sinh 47.29 mg/l sau 6 ngày nuôi cấy Chủng nấm Cordyceps sp

CPA14V rất có tiềm năng, cần phải có thêm các nghiên cứu về công nghệ nuôi cấy và sản xuất COD từ chủng này

Bảng 3.2 Khả năng sinh tổng hợp COD của các chủng nấm ký sinh côn

trùng phân lập đƣợc ở khu vực nghiên cứu Chủng CDW (g/l) COD (mg/g) COD (mg/l)

3.3 Định loại chủng nấm CPA14V bằng đặc điểm hình thái và sinh học phân tử

3.3.1 Đặc điểm hình thái của chủng nấm CPA14V

Hình 3.27 Đặc điểm hình thái của chủng Cordyceps sp CPA14V

a) Tr ng thái vô tính ngoài tự nhiên a ch ng n m Cordyceps sp CPA14V; b) Bào tử ch ng Cordyceps sp CPA14V; c) Khuẩn l c ch ng Cordyceps sp CPA14V t ên môi t ường Sabouraud; d) Khuẩn l c ch ng Cordyceps sp CPA14V t ên môi t ường Czapek-Dox; ) Bào tử và ống inh bào tử ch ng Cordyceps sp CPA14V t ên môi t ường Czapek-Dox ( l b : b, =10 µm;

c,d=2cm)

Đặc điểm hình thái trạng thái sinh sản vô tính của chủng nấm CPA14V đã

phân lập giống với các đặc điểm của chi Paecoelomyces, một trong những chi nấm ở trạng thái vô tính của các loài Cordyceps

3.3.2 Định loại chủng nấm CPA14V bằng phương pháp sinh học phân tử

Vật liệu di truyền của chủng nấm CPA14V đã tuyển chọn được tách chiết

để khuếch đại trình tự gen ITS, LSU và Rpb1 bằng phản ứng PCR, sản phẩm

được gửi sang công ty First BASE (Singapore) để tiến hành xác định trình tự nucleotide Trình tự nucleotide của chủng nấm CPA14V được sử dụng để so sánh với các trình tự liên quan có sẵn trong Ngân hàng gen NCBI cho thấy rằng

các trình tự tương tự nhất là các loài Cordyceps Cây phát sinh chủng loại của chủng nấm CPA14V được xây dựng dựa trên trình tự các vùng gen ITS, LSU và

Rpb1 bằng phương pháp Neighbor Joining với bootstrap 1000 sử dụng phần

mềm Mega X, lần được các kết quả như hình 3.28, 3.29, 3.30

Hình 3.28 Kết quả xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng gen ITS