PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN HIV TRONG PHÒNG XÉT NGHIỆM

CHẨN ĐOÁN THƯƠNG HÀN BẰNG PHẢN ỨNG WIDAL CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN HIV TRONG PHÒNG XÉT NGHIỆM Nguyễn Ngọc Điệp Khoa Vi sinh, bệnh viện Bạch Mai MỤC TIÊU BÀI HỌC Sau khi học xong bài này, học viên có khả năng 1 Trình bày được mục đích của xét nghiệm chẩn đoán HIV 2 Trình bày được các phương pháp chẩn đoán HIV trong phòng xét nghiệm 3 Rèn luyện tính cẩn thận, trung thực, chính xác, đảm bảo an toàn sinh học khi thực hiện xét nghiệm ĐẠI CƯƠNG ◼ HIV là vi khuẩn, virút hay ký sinh trùng ? HIV Human im.

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN HIV TRONG PHÒNG XÉT NGHIỆM

Nguyễn Ngọc Điệp Khoa Vi sinh, bệnh viện Bạch Mai

MỤC TIÊU BÀI HỌC

S au khi học xong bài này, học viên có khả năng:

chẩn đoán HIV

HIV trong phòng xét nghiệm

3. Rèn luyện tính cẩn thận, trung thực, chính

xác, đảm bảo an toàn sinh học khi thực hiệnxét nghiệm

ĐẠI CƯƠNG

◼ HIV là vi khuẩn, virút hay ký sinh trùng ?

HIV : Human immunodeficiency Virus

Là virus gây nhiểm trùng mãn tính tiến triểnchậm thuộc giống Lentivirus, họ Retrovirus

ĐẠI CƯƠNG

- Bao ngoài (envelop)

- Bao trong (capsid)

- Lõi: genom và các enzym

MỤC ĐÍCH XÉT NGHIỆM

1. An toàn trong truyền máu, cấy ghép mô, bộ

phận cơ thể, thụ tinh nhân tạo

2. Giám sát dịch tễ học

NGUYÊN TẮC XÉT NGHIỆM

1 Đảm bảo tính bí mật, tự nguyện.

2 Cung cấp thông tin trước và tư vấn sau XN.

3 Tuân thủ chiến lược, phương cách, quy trình XN

4 Đảm bảo chất lượng xét nghiệm và an toàn sinh học.

5 Kết nối với các chương trình dự phòng và chăm sóc điều trị.

Bao gồm các kỹ thuật sau:

◼ - Xét nghiệm HIV bằng kỹ thuật đơn giản;

◼ - Xét nghiệm HIV bằng kỹ thuật miễn dịch đánh dấu.

2 Phương pháp dùng xét nghiệm sinh học phân tử :phát hiện sự hiện diện ADN/ARN của HIV trong máu hoặc

các dịch tiết.

XÉT NGHIỆM BẰNG KT ĐƠN GIẢN

◼ Các thử nghiệm ngưng kết hạt vi lượng

NHỮNG LƯU Ý XÉT NGHIỆM BẰNG KT ĐƠN GIẢN

◼ - Mỗi loại sinh phẩm sử dụng cần có quy trình cụ thể bằng tiếng Việt.

◼ - Bảo quản Sinh phẩm, mẫu bệnh phẩm

◼ - Sinh phẩm.

◼ - Sơ đồ xét nghiệm/phiếu làm việc

◼ - An toàn sinh học: Sử dụng trang bị bảo hộ cá nhân, các chất thải lây nhiễm

◼ - Thực hiện xét nghiệm

◼ - Đọc kết quả: đồng hồ đếm ngược, thời gian, chứng, điền sơ đồ mẫu và sổ kết quả.

Kỹ thuật ngưng kết hạt (Agglutination)

Nguyên tắc :

◼ - Những hạt gelatin được gắn với các thành phần kháng nguyên

của virút HIV ½ sẽ cho phản ứng ngưng kết khi có sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu với HIV trong huyết thanh (hoặc huyết tương) bệnh nhân nhiễm HIV.

◼ - Trong phản ứng ngưng kết, mẫu thử được tiến hành đồng thời

trên hai giếng: với hạt gelatine không gắn kháng nguyên (giếng chứng âm) và các hạt gelatine có gắn kháng nguyên virút HIV 1/HIV2 (giếng phản ứng)

◼ * không có phản ứng ngưng kết khi các hạt gelatine tự động lắng

xuống, gom lại thành nút nhỏ dưới đáy giếng

◼ * có phản ứng ngưng kết khi các hạt gelatine kết hợp tạo thành

một mạng liên kết phủ đều trên

giếng-Kỹ thuật ngưng kết hạt (Agglutination)

◼ Kháng nguyên được gắn hạt gelatin:

◼ HIV 1 gp41 protein tái tổ hợp

◼ HIV 1 p24 protein tái tổ hợp

◼ HIV2 gp36 protein tái tổ hợp

Kháng nguyên kháng HIV 1/2

Hạt gelatin

Kháng nguyên HIV 1/2

KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH

◼ Phức hợp KKT gắn chất màu được phân bố đều

trên bản sắc ký KN được gắn cố định ở “vùng

phản ứng” Khi nhỏ huyết thanh, KT đặc hiệu

(nếu có) trong HT sẽ kết hợp với KKT gắn màu Phức hợp KT-KKT gắn màu này di chuyển trên

giấy sắc ký sẽ bị giữ lại ở “vùng phản ứng” do KT kết hợp với KN Kết quả vạch phản ứng hiện

màu Nếu trong HT không có KT đặc hiệu, KN

không thể giữ được KKT ở “vùng phản ứng”nên không hiện màu ở vùng này

Ưu điểm của các xét nghiệm đơn giản

C ÁC KỸ THUẬT NHANH

- Ưu điểm:

◼ + Thuận lợi khi số lượng mẫu ít

◼ + Dễ thực hiện, cho kết quả nhanh, có thể đọckết quả bằng mắt thường

◼ + Không đòi hỏi các trang thiết bị

◼ + Cán bộ xét nghiệm có thể được đào tạo

nhanh

Nhược điểm của các xét nghiệm đơn giản

◼ - Nhược điểm:

◼ + Không thuận lợi khi số mẫu xét nghiệm

nhiều

đọc

KỸ THUẬT MIỄN DỊCH MEN - ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay )

Nguyên lý:

Phức hợp KN-KT được phát hiện nhờ enzymgắn với KT hoặc KKT tác động lên cơ chấtđặc hiệu Kết quả được đánh giá qua sự biếnđổi màu

Mẫu xét nghiệm

E E

R Ử A

Ủ ở 37 °C

KỸ THUẬT ELISA GIÁN TIẾP

Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ KT HIV

R Ử A 5 X

cơ chât

30 phút/ 37 °C 30phút/ T o phòng

Ngưng phản ứng Đọc kết quả 450nm

E

Cộng hợp

+

KỸ THUẬT ELISA SANDWICH

Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ KT HIV

KỸ THUẬT ELISA CẠNH TRANH

Phản ứng màu tỷ lệ nghich với nồng độ KT HIV

R Ử A 5 X

cơ chât

Bước 2 : 30 phút/ T o phòng 30phút/ T o phòng

Ngưng phản ứng Đọc kết quả 450nm

Cộng hợp

+

Y E E

K Ỹ THUẬT HOÁ PHÁT QUANG

VÀ ĐIỆN HOÁ PHÁT QUANG

- Kỹ thuật miễn dịch men vi hạt:

+Kỹ thuật MD men vi hạt phát hiện KT HIV

+Kỹ thuật MD men vi hạt phát hiện cả KN và KT HIV

- Kỹ thuật hoá phát quang:

+Kỹ thuật hoá phát quang phát hiện KT HIV

+Kỹ thuật hoá phát quang phát hiện cả KN và KT HIV

- Kỹ thuật điện hoá phát quang

KỸ THUẬT MIỄN DỊCH MEN VI HẠT

◼ Kỹ thuật MD men vi hạt phát hiện KT HIV

Nguyên lý:

KT kháng HIV + KN (gắn vi hạt) + KN VR gắn Biotin.

Phức hợp gắn Biotin được phát hiện bởi cộng hợp

anti-Biotin: Alkaline Photsphatase.

Chất nền được thêm vào dd phản ứng là

4-Methylumbelliferyl Photsphat→ 4-methylumbelliferone (SP huỳnh quang) dưới tác dụng của men Alkaline

Photsphatase

Tín hiệu huỳnh quang được đo bằng bộ đo quang học của máy XN MD tự động.

KỸ THUẬT HOÁ PHÁT QUANG

◼ Kỹ thuật hoá phát quang phát hiện KT HIV

Nguyên lý:

KT kháng HIV + KN (gắn vi hạt) + KN VR gắn chất phát quang (acridinium)

Phát sáng dưới tác dụng của chất kích hoạt.

KQ được tính bằng đơn vị ánh sáng tương

đương (RLU)

KỸ THUẬT MIỄN DỊCH MEN VI HẠT

◼ Kỹ thuật MD men vi hạt phát hiện KN và KT HIV

Nguyên lý:

KT kháng HIV/KN P24 + KN/KT đơn dòng chuột (gắn vi

hạt) + KN/peptid TH/KT p24 đơn dòng chuột gắn Biotin.

Cộng hợp anti-Biotin: Alkaline Photsphatase.

Dưới tác dụng của men Alkaline Photsphatase,

4-Methylumbelliferyl Photsphat→ 4-methylumbelliferone (SP huỳnh quang)

Tín hiệu huỳnh quang được đo bằng bộ đo quang học của

máy XN MD tự động.

KỸ THUẬT ĐIỆN HOÁ PHÁT QUANG

Nguyên lý:

KT kháng HIV/KN P24 + KN tái tổ hợp, peptid

TH/KT đơn dòng gắn biotin + KN tái tổ hợp,

peptid TH/KT đơn dòng gắn ruthenium

Vi hạt có từ tính phủ streptavidin kết nối với phức hợp tạo LK Biotin-Streptavidin, sẽ được giữ lại ở

bề mặt điện cực

Dưới tác động của dòng điện, ruthenium bị kích

thích và phát ra các photon ánh sáng.

KỸ THUẬT HOÁ PHÁT QUANG

◼ Kỹ thuật hoá phát quang phát hiện KN, KT HIV

Nguyên lý:

KT kháng HIV/KN P24 + KN/KT đơn dòng chuột (gắn vi hạt) + KN/peptid TH/KT p24 đơn dòng chuột gắn chất phát quang (acridinium)

Phát sáng dưới tác dụng của chất kích hoạt.

KQ được tính bằng đơn vị ánh sáng tương đương (RLU)

Phức hợp miễn dịch

Mẫu A Kháng thể kháng A

được gắn Ru

Kháng thể kháng A được biotin hóa

Kháng thể không gắn

Nguyên lý Sandwich

Vi hạt phủ Streptavidin

Phức hợp miễn dịch

vi hạt qua Biotin Nguyên lý Sandwich

KT không gắn

Nguyên lý Sandwich

Ưu điểm của các xét nghiệm miễn dịch đánh

dấu

C ÁC KỸ THUẬT MD ĐÁNH DẤU

-ƯU ĐIỂM

◼ + Thực hiện đồng thời nhiều mẫu

◼ + Có thể dùng máy tự động giảm bớt thao tác cho người làm xét nghiệm, tránh sai sót và lây nhiễm

◼ + Đọc kết quả bằng máy không phụ thuộc vào chủ quan

của người làm xét nghiệm.

◼ + Các máy hóa phát quang, điện hóa phát quang cho kết quả nhanh và có công suất lớn

◼ + Có thể lưu các bảng kết quả và các thông số kỹ thuật

thuận lợi cho việc kiểm tra đánh giá chất lượng xét nghiệm

Nhược điểm của các xét nghiệm miễn dịch

đánh dấu

◼ + Các sinh phẩm phải bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4-8 oC).

◼ + Thời gian thực hiện xét nghiệm ELISA từ 2-3 giờ

◼ + Chỉ thích hợp với những nơi có số lượng mẫu > 40

mẫu/ngày

◼ Nguyên tắc : là một kỹ thuật theo nguyên lý ELISA gián

tiếp thực hiện trên băng giấy, cho phép xác định KT kháng các thành phần khác nhau của proteins vi rút Có Western blot riêng cho HIV 1 và HIV 2.

thử có các KT kháng HIV thì chúng sẽ gắn đặc hiệu lên các protein là KN tương ứng và được phát hiện bằng cộng hợp

là KT kháng Immunoglobuline người đánh dấu bằng

enzyme cho phản ứng màu với cơ chất

virút gắn với KT đặc hiệu.

1 Chứng dương

2 Chứng âm

3 Mẫu bệnh nhân

CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG XN HIV

KỸ THUẬT REAL TIME PCR PHÁT HIỆN HIV

nhiễm

KỸ THUẬT PCR – LAI PHÂN TỬ PHÁT HIỆN HIV-DNA PROVIRUS

CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG XN HIV

◼ Nguyên tắc:

Phản ứng PCR là kỹ thuật cho phép khuếch đại một

lượng nhỏ phân tử DNA đích được tách chiết từ các

TB nhiễm hoặc được tổng hợp từ các RNA của VR nhờ enzym sao chép ngược RT

Dựa trên nguyên lý của phản ứng PCR, nhiều kỹ thuật

đã được triển khai cho phép định tính, bán định lượng hoặc định lượng HIV-DNA hoặc RNA

CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG XN HIV

đo tải lượng VR để chỉ định và theo dõi ĐT

- Các kỹ thuật PCR và PCR theo thời gian thực phát hiện DNA provirus trong TB nhiễm hoặc HIV-RNA trong huyết tương để chẩn đoán

sớm nhiễm HIV cho trẻ < 18 tháng

XÉT NGHIỆM TRỰC

TIẾP???

PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM TRỰC TIẾP

Phát hiện kháng nguyên p24 thông thường được

sử dụng trong:

◼ Chẩn đoán nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh:

◼ Theo dõi diễn tiến nhiễm HIV

◼ Theo dõi đáp ứng điều trị với thuốc kháng

virút

◼ Phát hiện có sự nhân lên của virút trong nuôi cấy tế bào

PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM TRỰC TIẾP

XÉT NGHIỆM TRỰC TIẾP

◼ Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ dưới 18 tháng tuổi Trẻ

cần được khẳng định sớm tình trạng nhiễm HIV để được điều trị sớm không cần chờ có các dấu hiệu lâm sàng hoặc suy giảm miễn dịch.

◼ Phát hiện tác nhân virút còn được dùng trong các

trường hợp chẩn đoán sớm nhiễm HIV ở người lớn trong giai đoạn cửa sổ chưa có sự chuyển đổi huyết thanh hoặc khi xét nghiệm bằng phương pháp gián tiếp tìm KT có kết quả không rõ ràng.