Đánh giá đa dạng di truyền một số giống sả việt nam

Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các mẫu sả Việt Nam .... Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái các mẫu sả .... Kết quả nghiên cứu đặc điểm thân giả của cây sả .... Kết quả ảnh hưởng

Trang 1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

DƯƠNG HỮU TRƯỜNG

Tên đề tài:

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG SẢ VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy Ngành/chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa: Công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm Khóa học: 2017 - 2021

Thái Nguyên – năm 2021

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

DƯƠNG HỮU TRƯỜNG

Tên đề tài:

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG SẢ VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy Ngành/chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: K49 - CNSH

Khoa: Công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm Khóa học: 2017 - 2021

Người hướng dẫn: TS Bùi Tri Thức

Thái Nguyên – 2021

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực

hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền một số giống sả Việt Nam”

Trước hết em xin gửi tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa lời chúc sức khỏe và lời cảm ơn sâu sắc, với sự chỉ bảo, quan tâm và đã tạo điều kiện thuận lợi cho

em hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS Bùi Tri Thức,

giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã chỉ bảo, quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn em hoàn thành tốt trong quá trình thực hiện đề tài

Đồng thời, em xin cảm ơn các giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ và đồng hành với tôi trong suốt thời gian qua

Trong quá trình thực tập, cũng như làm báo cáo thực tập với điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm còn hạn chế không thể tránh được những sai sót Em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn để em có điều kiện

bổ sung, nâng cao ý thức của mình để đề tài được hoàn thiện hơn và phục vụ tốt hơn công tác thực tế sau này

Sau cùng, em xin kính chúc quý thầy, cô trong nhà trường, trong khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm dồi dào sức khỏe, tiếp tục sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ sau

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày… tháng ….năm 2021

Sinh viên thực hiện

Dương Hữu Trường

Trang 4

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

(cả tiếng Anh và tiếng Việt)

Trang 5

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hoá học trong tinh dầu sả 5

Bảng 2.2.Thành phần hoạt tính sinh học trong sả 5

Bảng 3.1 Trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu 13

Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 14

Bảng 3.3 Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu 14

Bảng 3.4 Các mẫu sả nghiên cứu 16

Bảng 3.5 Thang điểm đánh giá màu sắc bẹ 17

Bảng 3.6 Tổng thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol 19

Bảng 3.7 Số lần sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol 20

Bảng 3.8 Thành phần PCR 20

Bảng 3.9 Chu trình phản ứng của RAPD 21

Bảng 4.1 Kết quả sưu tầm các mẫu sả tại các địa phương 22

Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu động thái tăng trưởng chiều cao các mẫu sả 23

Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu đặc điểm bẹ cây sả 24

Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu hình thái lá 26

Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu tạo sinh khối các mẫu sả 28

Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu hàm lượng tinh dầu tổng số của các mẫu sả 29

Bảng 4.7 Tỷ lệ mẫu hiện DNA khi thực hiện thí nghiệm tổng thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol trong quá trình tách mẫu 30

Bảng 4.8 Tỷ lệ mẫu hiện DNA khi thực hiện thí nghiệm số lần sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol trong quá trình tách mẫu 31

Trang 6

DANH MỤC HÌNH

Hình 4.1 Kết quả nghiên cứu động thái tăng trưởng chiều cao các mẫu sả 23

Hình 4.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm bẹ cây sả 25

Hình 4.3 Kết quả nghiên cứu hình thái lá 27

Hình 4.4 Kết quả phương pháp tách chiết DNA tổng số từ các mẫu sả

và điện di trên gel 32

Hình 4.5 Kết quả điện di kiểm tra PCR với mẫu sả SAN 34

Hình 4.6 Kết quả điện di kiểm tra PCR với mẫu sả SHN 35

Hình 4.7 Kết quả điện di kiểm tra PCR với mẫu sả SĐL 36

Hình 4.8 Kết quả điện di kiểm tra PCR với mẫu sả SBS 37

Hình 4.9 Kết quả điện di kiểm tra PCR với mẫu sả SBD 38

Hình 4.10 Kết quả điện di kiểm tra PCR với mẫu sả SATT 39

Hình 4.11 Kết quả điện di kiểm tra PCR với mẫu sả STH 40

Hình 4.12 Kết quả điện di kiểm tra PCR với mẫu sả SAX 41

Hình 4.13 Sơ đồ hình cây mô tả quan hệ di truyền của 8 mẫu sả nghiên cứu 42

Trang 7

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

MỤC LỤC v

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây sả 3

2.1.1 Đặc điểm cây sả 3

2.1.2 Phân bố 3

2.1.3 Phân loại 3

2.1.4 Giá trị của cây sả 4

2.2 Các kĩ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền 6

2.2.1 Giới thiêụ sơ lược về kỹ thuật RAPD 6

2.2.2 Giới thiệu về kỹ thuật ISSR 6

2.2.3 Một số kĩ thuật khác 7

2.3 Tình hình nghiên cứu cây sả trong nước và trên thế giới 7

2.3.1 Tình hình trong nước 7

2.3.2 Tình hình thế giới 9

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 13

Trang 8

3.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 13

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 13

3.1.3 Thiết bị nghiên cứu 14

3.1.4 Hoá chất 14

3.1.5 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 15

3.2 Nội dung nghiên cứu 15

3.2.1 Sưu tầm các mẫu sả tại Việt Nam 15

3.2.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các mẫu sả Việt Nam 15

3.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền kiểu gen các mẫu sả Việt Nam 16

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Sưu tầm các mẫu sả tại Việt Nam 16

3.3.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái các mẫu sả Việt Nam 17

3.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền kiểu gen các mẫu sả Việt Nam 18

3.4.1 Nội dung 4 : Tối ưu quy trình tách DNA từ các mẫu 18

3.4.2 Nội dung 5 : Lựa chọn các cặp mồi đánh giá đa dạng di truyền cây sả 20

3.5 Nội dung 6 : Phương pháp PCR - RAPD và phương pháp xây dựng cây

phân loại 20

3.5.1 Phương pháp PCR - RAPD 20

3.5.2 Phương pháp xây dựng cây phân loại 21

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 21

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Kết quả sưu tầm các mẫu sả tại các địa phương 22

4.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái các mẫu sả 22

4.2.1 Kết quả nghiên cứu động thái tăng trưởng chiều cao các mẫu sả 22

4.2.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thân giả của cây sả 24

4.2.3 Kết quả nghiên cứu hình thái lá 26

4.2.4 Kết quả nghiên cứu tạo sinh khối các mẫu sả 28

4.3 Kết quả nghiên cứu hàm lượng tinh dầu tổng số của các mẫu sả 29

4.4 Kết quả tối ưu quy trình tách DNA từ các mẫu 30

Trang 9

4.4.1 Kết quả ảnh hưởng thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol

trong quá trình tách mẫu 30

4.4.2 Kết quả ảnh hưởng số lần sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol

trong quá trình tách mẫu 31

4.4.3 Kết quả phương pháp tách chiết DNA tổng số từ các mẫu sả và điện di

trên gel 32

4.5 Kết quả lựa chọn các cặp mồi đánh giá đa dạng di truyền cây sả 33

4.6 Kết quả phương pháp PCR - RAPD và xây dựng cây phân loại 34

4.6.1 Kết quả phương pháp PCR - RAPD 34

4.6.2 Kết quả phương pháp xây dựng cây phân loại 41

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

Trang 10

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cây Sả (Cymbopogon nardus Rendl) thuộc họ lúa (Poaceae) được trồng nhiều

ở Việt Nam theo tính chất gia đình, trên thế giới phân bố tại Indonesia, Xrilanca, Ấn Độ, Trung Quốc Rễ hoặc toàn thân cây sả được sử dụng làm nguyên liệu trong nấu

ăn và là một vị thuốc dân gian Tinh dầu sả được dùng như một loại nguyên liệu phục vụ cho y học hiện đại, là thành phần tạo nước hoa [6]

Đối với người dân, lá và thân được dùng để nấu ăn Cây xả được dùng để xông hơi, lá sả dùng làm thuốc pha nước uống cho mát và tiêu, củ xả có tác dụng thông tiểu tiện, ra mồ hôi, chữa cảm sốt [6]

Đối với các ngành công nghiệp và y học, tinh dầu xả có công dụng rất đa dạng Tuy nhiên, các loại sả và thành phần hoạt chất của tinh dầu thay đổi và có giá trị khác

nhau như tinh dầu sả các từ cây sả Cymbopogon nardus (L.) Rendl (sả Xrilanca) và cây Cymbopogon winterianus Jowitt (sả Java) có từ 20 đến 40% geraniola và citronellola, 40 đến 60% xitronellala Sả chanh Cymbopogon fexuosus và Cymbopogon

citratus chứa từ 70 đến 80% xitral [6] Một số nghiên cứu dịch tế học đã chứng minh

rằng một số chất có trong cây sả có khả năng chống lại được một số các hoạt động chống oxy hóa, tăng sinh, chống viêm và trong ngành công nghiệp mỹ phẩm [16], [21]

Vì thế nhu cầu về tinh dầu sả trên thế giới khoảng 3.000 – 4.000 tấn/ năm mới đáp ứng đủ nhu cầu cho thị trường Trên thế giới giá trị của tinh dầu sả là 6,48 USD tương đương 149,688 đồng, tinh dầu sả chanh có giá 7,50 USD tương đương 173,250 đồng [6], [20]

Thực tế, số lượng các mẫu sả rất đa dạng và phong phú do được phân bố rộng khắp Việt Nam Có những mẫu sả đã được công bố có thể sử dụng phục vụ nhiều mục đích như cho nhiều tinh dầu, làm thuốc, thức ăn Nhưng, rất nhiều mẫu sả khác chưa được nghiên cứu cụ thể, các thông tin như đặc điểm hình thái, sự đa dạng di truyền còn chưa được biết đến

Trang 11

Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền một số giống sả Việt Nam” Với mục tiêu nhằm chăm xác định đặc điểm của các mẫu sả Việt Nam Từ đó phục vụ các nghiên cứu tiếp theo về công tác giống và sản xuất

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

- Sưu tầm các mẫu sả tại Việt Nam

- Xác định đặc điểm của các mẫu sả tại Việt Nam

- Đánh giá sự đa dạng di truyền của các mẫu sả

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Sưu tầm được các mẫu sả tại các địa phương

- Xác định được đặc điểm hình thái và hàm lượng tinh dầu tổng số của các mẫu

sả

- Xác định sự đa dạng về đặc điểm di truyền của cây sả

1.3.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Có tên các mẫu sả phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo Các đặc điểm sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng tinh dầu của các mẫu sả phục vụ định hướng nghiên cứu các sản phẩm khác Bộ dữ liệu về đa dạng di truyền của các mẫu sả phục vụ cho công tác về giống

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Cung cấp thông tin về đặc điểm hình thái của các mẫu sả phục vụ công tác giống cũng như truy xuất nguồn gốc tinh dầu sả của các địa phương

Trang 12

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây sả

2.1.1 Đặc điểm cây sả

Cây sả là cây thân thảo, thuộc họ hoà thảo và mọc thành các bụi có chiều cao khoảng 1 mét đến 1,5 mét Lá cây hẹp dài, mép lá hơi bị nhám Thân cây có màu trắng hoặc hơi tím Bẹ lá ôm chặt với nhau rất chắc tạo thành một thân giả mà người

ta thường gọi là củ sả Rễ cây sả là kiểu rễ chùm, mọc sâu vào đất phát triển mạnh khi đất tơi và xốp Sả sinh sản bằng cách nảy chồi ở nách tạo thành nhánh như nhánh lúa, vì thế từ một nhánh trồng có thể sinh sôi phát triển ra nhiều nhánh tạo thành bụi sả [10]

2.1.2 Phân bố

Trên thế giới, chi sả có khoảng 55 loài sả khác nhau, được phân bố ở các vùng nhiệt đới như Châu Phi, Nam Á, Đông Á, Australia Ở Trung Quốc và Đông Nam Á phổ biến loài Cymbopogon citratus [10]

Tại Việt Nam, cây sả có 15 loài trong đó 11 loài có mùi thơm Về mặt hoá học

có ba nhóm chính [5]:

- Sả chi xitronelal: Sả Java còn gọi là sả xoè (Cymbopogon winterianus Jawitt),

sả Xrilanca còn gọi là sả bẹ (Cymbopogon nardus (L.) Rendle Hai loài này được để trống nhiều ở Việt Nam

- Sả chi geraniol: Sả hoa hồng (Cymbopogon martinii var motia Burk) Đang được nghiên cứu và trồng lớn để khai thác

- Sả chi xitral: Sả chanh gồm hai loài: Cymbopogon tortilis A.Camus và Cymbopogon flexnosus Stapf Các chủng loại này cũng đang được nghiên cứu để đưa vào trồng trọt

2.1.3 Phân loại

Trang 13

Bộ (ordo): Hoà thảo (Poales)

Các loài quan trọng trong chi sả gồm [10]:

- Cymbopogon ambiguus: Sả chanh Úc (bản địa Úc)

- Cymbopogon citratus: Sả ta hay sả chanh Tàu (bản địa Trung Quốc)

- Cymbopogon citriodora: Sả chanh Tây Ấn Độ (bản địa Ấn Độ)

- Cymbopogon flexuosus: Sả Đông Ấn Độ (bản địa Ấn Độ)

- Cymbopogon martinii: Sả Palmarosa

- Cymbopogon nardus: Cỏ sả Thái (Ta-khrai Hom)

- Cymbopogon Proximus: Sả Ai Cập

- Cymbopogon schoenanthus: Sả hoang mạc (miền Nam Châu Á và Bắc Phi)

2.1.4 Giá trị của cây sả

Theo nghiên cứu của Christopher E Ekpenyong và cộng sự (2015) đã chỉ ra rằng sả được sử dụng trong y học trên toàn thế giới cho nhiều ứng dụng bao gồm kháng khuẩn, kháng nấm, chống nhiễm trùng, chống ung thư, chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ tim mạch, chống ho, sát trùng và chống thấp khớp Nó cũng đã được sử dụng trong dự phòng tiểu cầu trong điều trị bệnh tiểu đường, rối loạn mỡ máu, rối loạn tiêu hóa, lo lắng, sốt rét, cúm, sốt và viêm phổi trong liệu pháp mùi hương và thẩm mỹ được đưa ra thông qua bảng 2.1 và bảng 2.2 ngoài công dụng chữa bệnh, sả còn được thêm vào đồ uống có cồn và không cồn, thực phẩm nướng, làm hương liệu, chất bảo quản trong bánh kẹo và ẩm thực [24]

Trang 14

a) Thành phần hoá học trong tinh dầu sả [24]:

Bảng 2.1 Thành phần hoá học trong tinh dầu sả

5-9-10-dehydro Levo--elemenne

Isolongifolene-4-t-Muurolol

3-carvomenthenone

pimelyl dihydrazide Germacrene-D Geraniol

Methyl-n-nonylketone 1-Octyn-3-ol Allo-o-cimene Sesquiphellandrene

Farnesene Dextro-carvone Geranyl-acetate

b) Thành phần hoạt chất sinh học trong sả [24]

Bảng 2.2.Thành phần hoạt chất sinh học trong sả

Trang 15

Phytonutrients Chất khoáng Vitamins

2.2 Các kĩ thuật sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền

2.2.1 Giới thiêụ sơ lược về kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD (Random amplified polymorphic DNA) là kỹ thuật khuếch đại

đa hình sản phẩm DNA sử dụng các cặp mồi ngẫu nhiên Kỹ thuật này được William phát triển năm 1900 và Welsh và cộng sự năm 1991 dựa trên nền tảng của kỹ thuật PCR [32]

Kỹ thuật này sử dụng các đoạn mồi ngắn có kích thước dao động trong khoảng

10 nucleotide với trình tự biết trước bắt cặp và nhân bản một cách ngẫu nhiên các đoạn DNA có trình tự bổ sung tạo các các khác nhau tùy thuộc vào trình tự DNA đích Do

đó, các cá thể giống nhau sẽ hình thành các sản phẩm có kích thước như nhau, các cả thể khác nhau sẽ hình thành các sản phẩm khuếch đại khác nhau

Kỹ thuật RAPD gồm 4 bước như sau:

+ Tách chiết DNA tổng số

+ Nhân bản DNA bằng phương pháp PCR

+ Điện di trên gel agarose

+ Dùng phần mềm thông dụng để xác định tính đa dạng di truyền [18]

RAPD đang được ứng dụng phổ biến sử dụng dấu hiệu đa hình DNA trong sinh thái học phân tử để xác định phân loại, đánh giá các mối quan hệ họ hàng, phân tích các mẫu bộ gen không giống nhau, xác định đa hình cây tái sinh từ mô sẹo nhằm mục đích phân loại và lai tạo giống [25]

2.2.2 Giới thiệu về kỹ thuật ISSR

Kĩ thuật ISSR dựa trên cơ sở của phản ứng PCR dùng để nhân đoạn gen nằm giữa hai vùng lặp lại giống hệt nhau và ngược chiều nhau liền kề có kích thước 100-3000

bp Kĩ thuật này sử dụng các tiểu vệ tinh như các mồi trong phản ứng PCR với một mồi cho nhiều locus đích để nhân bản chủ yếu các chuỗi lặp lại đơn giản với độ dài khác nhau Các tiểu vệ tinh sử dụng như mồi trong kĩ thuật ISSR có thể là 2, 3, 4, hoặc

5 nucleotide Các mồi sử dụng có thể không phải mồi neo hoặc là mồi neo ở đầu 3’ hoặc 5’ với 1 đến 4 nucleotide thoái hóa kéo đến các chuỗi bên cạnh Kĩ thuật ISSR

Trang 16

được sử dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền, nghiên cứu đặc điểm di truyền trong quần thể, lấy dấu di truyền, đánh dấu gene, xác định cây trồng, phân tích nguồn gốc, xác định sự thay đổi genome và đánh giá con lai [1]

2.2.3 Một số kĩ thuật khác

2.2.3.1 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài các đoạn khuếch đại Đây

là kỹ thuật được sử dụng trong phát hiện ra đa hình DNA AFLP được kết hợp với PCR và RFLP bằng việc gắn các chuỗi nhận biết vào mồi Các căp mồi thường được tạo từ 50-100 băng trong một phân tích Kỹ thuật AFLP cho phép lấy dấu DNA từ

bất kỳ nguồn gốc nào [26]

Kỹ thuật AFLP tạo ra các nhóm đa hình DNA gọi là đa hình chiều dài đoạn khuếch đại hay AFLP Bước đầu tiên (phần A) là cắt DNA hệ gen bằng enzyme giới

hạn; ví dụ này sử dụng enzyme EcoRI với vị trí giới hạn là 5-GAATTC-3’ Phản ứng phân cắt tạo ra số lượng lớn đoạn giới hạn với hai đầu chứa vị trí cắt của EcoRI

Trong bước tiếp theo (phần B), gắn nối các oligonucleotide mạch kép gọi là adaptor (adaptor này có đầu treo mạch đơn bổ sung với đầu treo của đoạn giới hạn) với sản phẩm cắt giới hạn sử dụng enzyme DNA ligase Sau đó, có thể sử dụng PCR để khuếch đại các đoạn thu được (C) Chú ý rằng dùng một loại adaptor để gắn vào mỗi đầu, nên một trình tự primer đơn sẽ gắn với cả hai đầu và khuếch đại Kỹ thuật này

có ưu điểm là độ tin cậy và lặp lại cao [26]

2.2.3.2 Kỹ thuật SSLP (Single Sequence Length Polymorphism)

Là kỹ thuật chỉ thị tạo các chuỗi lặp lại với độ dài khác nhau nằm giữa 2 gen Các chuỗi có độ dài khác nhau có độ dài khác nhau là do số lượng trình tự lăp lại trong chuỗi khác nhau do quá trình trao đổi chéo không cân hoặc do sự giảm nucleotide trong quá trình sao chép Sự khác nhau về độ dài của SSLP được sử dụng

để đánh giá sự thay đổi di truyền giữa các cá thể trong loài [26]

2.3 Tình hình nghiên cứu cây sả trong nước và trên thế giới

2.3.1 Tình hình trong nước

2.3.1.1 Đặc điểm cây sả

Ở nước ta, những công trình nghiên cứu về cây sả còn ít, chủ yếu tập trung vào điều tra và phân tích những đặc điểm sinh vật học, sinh thái học và giá trị sử dụng

Trang 17

Những nghiên cứu về các thành phần hoạt chất có trong cây sả

Theo Phạm Hoàng Hộ (1999): Sả thuộc họ Hà Thảo (danh pháp khoa học: Poaceae hay Gramineae), còn được gọi bằng nhiều tên khác như họ Lúa, họ Cỏ là một họ thực vật một lá mầm Tuy nhiên, tùy theo từng vùng mà đặc điểm và thành phần tinh dầu khác nhau Tuỳ theo vùng sinh thái khác nhau mà các giống sả khác nhau được phát triển, có thể phân các giống sả ra thành 7 nhóm khác nhau:

- Sả Java (Cymbopogon winterianus J.) có nguồn gốc từ Nam Ấn Độ được trồng

để sản xuất tinh dầu với tên thương phẩm là Citronella oil, thành phần chính của tinh dầu là geraniol (85 - 90%), citronella (35 - 40%)

- Sả Sri Lanka (Cymbopogon nardus R.) có nguồn gốc từ Sri Lanka, cho tinh dầu

có tính chất và thành phần hóa học tương tự Sả Java nhưng chất lượng kém hơn

- Sả hoa hồng (Cymbopogon martinii Stapf var Motia) được trồng để sản xuất tinh

dầu với tên thương phẩm là Palmarosa oil, thành phần chính là geraniol (75 - 95%)

- Sả gừng (Cymbopogon martinii Stapf var Sofia) được trồng để sản xuất tinh

dầu với tên thương phẩm là Gingergrass oil

- Sả dịu (Cymbopogon flexuosus Stapf.) có nguồn gốc từ Ấn Độ, được trồng để

sản xuất tinh dầu Sả dịu với tên thương phẩm là East Indian Lemongrass oil, thành phần tinh dầu chứa hàm lượng citral cao (75 - 90%)

- Sả tía hay Sả Jammu (Cymbopogon pendulus (Nees ex Steud.) Wats.) được trồng để

sản xuất tinh dầu Sả Jammu với tên thương phẩm là Jammu Lemongrass oil

- Sả chanh (Cymbopogon citratus Stapf.): loài sả có nguồn gốc Tây Ấn Độ, thường

trồng để lấy tinh dầu, thành phần chính chứa hàm lượng citral cao (80 - 90%) [2]

2.3.1.2 Tinh dầu sả

Theo Phạm Thị Kim Thanh và cs (2017): Tinh dầu sả có chứa các chất như: citral, geraniol, citronellal và piperitone, là những chất có hoạt tính sinh học rất cao, có khả năng kháng khuẩn, diệt nấm, diệt men, trừ sâu và các hoạt tính làm giảm sưng tấy trong thời gian dài [11]

Theo Hoàng Thị Kim Vân và cs (2016): Thân và lá của Cymbopogon citratus L

được thu hái từ hai vùng của tỉnh Phú Thọ (Thanh Sơn và Phù Ninh) để làm nguyên liệu chiết xuất tinh dầu Dầu thu được được chưng cất bằng hơi nước, phân tích thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào chống lại ba dòng tế bào ung thư

Trang 18

khác nhau Phân tích GC / MS cho thấy citral là hàm lượng chính của tinh dầu chưng cất bằng hơi nước, nằm trong khoảng 64,15-76,22% Trong một thử nghiệm độc tính

tế bào, bốn loại tinh dầu của thân và lá C citratus từ Thanh Sơn và Phú Ninh cho thấy

hoạt tính mạnh chống lại dòng tế bào A549 (ung thư biểu mô phổi ở người) với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 4,01 ± 0,39 đến 6,3 ± 0,54 µg / ml Tinh dầu (thân và lá) từ Phù Ninh có tác dụng vừa phải đối với tế bào Hela (ung thư biểu mô tuyến cổ tử cung

ở người) với giá trị IC50 lần lượt là 19,43 ± 1,16 và 42 ± 2,41 µg / ml Tuy nhiên, chúng không hoạt động chống lại dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan Hep3B ở người Tinh dầu từ Thanh Sơn có hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với dòng tế bào Hela và Hep3B với giá trị IC50 dao động từ 1,18 ± 0,26 đến 8,91 ± 0,32 µg / ml Kết

quả chỉ ra rằng tinh dầu của cây sả C citratus từ Thanh Sơn, Phú Thọ có thể được coi

là một ứng cử viên đầy hứa hẹn cho các nguồn tự nhiên của chất chống ung thư [14] Theo Nguyễn Thị Thanh Mai và cs (2020): Hàm lượng một số hoạt chất chính trong tinh dầu sả chanh trồng tại Hòa Bình cao hơn so với tinh dầu thu được từ sả chanh trồng tại Hà Nam và Nam Định với hàm lượng citral đạt 79,71% (thân) và 80,73% (lá) Tinh dầu thu được cả ở thân và lá cây sả chanh đều có hàm lượng DPPH đạt 89,31% (thân) và 69,31% (lá) Tinh dầu sả chanh trồng tại Hòa Bình có khả năng ức chế mạnh

nhất sự phát triển của 02 chủng vi khuẩn S flexneri và S pneumoniae với đường kính vòng vô khuẩn đạt 20 mm và 20,5 mm; đối với vi khuẩn S pneumoniae là 19 mm ở

mẫu tinh dầu thân và lá Sả chanh Tinh dầu Sả chanh có khả năng kháng 06/07 chủng

vi khuẩn kiểm định sử dụng bao gồm cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương [7]

2.3.2 Tình hình thế giới

2.3.2.1 Đặc điểm cây sả

Cây Sả có tên khoa học là Cymbopogon, thuộc họ Hòa Thảo (Poaceae) có nguồn

gốc ở vùng nhiệt đới và ôn đới ấm Cây Sả là cây gia vị phổ biến được sử dụng trong văn hoá ẩm thực, dược liệu và chiết xuất tinh dầu Trên thế giới, họ Sả có khoảng 140 loại, phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như ở các nước Châu Á, Châu Mỹ, Châu Phi và một số nước nhiệt đới khác Mỗi loại Sả có đặc điểm và tác dụng khác nhau Cây Sả thuộc nhóm cây có chu kỳ quang hợp C4, chúng có khả năng tổng hợp hợp chất hữu cơ mạnh, đặc biệt trong điều kiện nhiều nắng và có đủ nước Cây Sả có khả năng tổng hợp một số loại hợp chất thứ cấp, chất hương liệu có vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm [22]

Trang 19

2.3.2.2 Tinh dầu sả

Trên thế giới chủ yếu nghiên cứu về các thành phần hợp chất và ứng dụng của

các chất đối với y học và công nghiệp mỹ phẩm của cây sả

Theo Diki Prayugo Wibowo và cs (2018): Tinh dầu thu được bằng cách chưng

cất hydro từ lá của Cymbopogon nardus từ Lembang Tây Java Khối lượng sắc ký khí

phân tích quang phổ (GC - MS) cho thấy sự hiện diện trong số 53 hợp chất với các thành phần chính, bao gồm cây sả (26,27%), cadinene (6, 97), metyl isoeugenol (5,87%), geranyl axetat (4,41%) và citronellyl propionat (4,97%) Chất chống oxy hóa các hoạt động của tinh dầu được xác định bằng cách sử dụng Xét nghiệm 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Các kết quả chứng minh rằng tinh dầu có hoạt động chống oxy hóa với EC50% 2,44 µg mL - 1 Cuối cùng, tinh dầu cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại Gram dương và Gram âm đã thử nghiệm vi khuẩn Nồng độ ức chế tối thiểu của tinh dầu dao động 250 µg mL – 1 đến 1000 µg mL - 1 Hàm lượng tinh dầu của cây trồng ở các vùng cao nguyên như Lembang được khuyến khích

cho cần thiết tối đa để chống oxy hóa và hoạt động kháng khuẩn [31]

Theo Undri Rastuti và cs (2020):Việc xác định các thành phần chính từ tinh dầu

sả cô lập và các phân đoạn được thực hiện bằng phương pháp sắc ký khí - khối phổ (GC-MS) Trong khi đó, thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa được thực hiện bằng phương pháp 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Quá trình phân đoạn tinh dầu sả chanh tạo ra thành công bốn phần, tức là Phần 1 (F1), Phần 2 (F2), Phần 3 (F3) và cặn (R) Kết quả xác định hợp chất chiếm ưu thế có trong tinh dầu sả, các phân đoạn F1, F2, F3 và R là citronellal (36,63%), limonene (67,07%), citronellal (92,39%), geraniol (62,41%) và geraniol (47,03%) ), tương ứng Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa cho thấy hoạt tính chống oxy hóa (IC50) của tinh dầu sả, cũng như phân đoạn F1, F2, F3

và dư lượng lần lượt là 488, 14.254, 305, 253, và 93 µg / mL và geraniol (47,03%), tương ứng Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa cho thấy hoạt tính chống oxy hóa (IC50) của tinh dầu sả, cũng như phân đoạn F1, F2, F3 và dư lượng lần lượt là 488, 14.254, 305, 253, và 93 µg / mL và geraniol (47,03%), tương ứng Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa cho thấy hoạt tính chống oxy hóa (IC50) của tinh dầu sả, cũng như phân đoạn F1, F2, F3 dư lượng lần lượt là 488, 14.254, 305, 253, và 93 µg / mL [27] Theo NA Saputra và cs (2019) : Điều tra đã được tiến hành để xác định thành phần

hóa học của dầu Cymbopogon nardus (CNO) Thứ nhất, lá của CNO được đặc trưng

Trang 20

bởi chất dinh dưỡng vĩ mô của nó Chưng cất được thực hiện trên lá C nardus đã được

sấy khô trong không khí trong 24 giờ trước đó CNO sau đó được phân tích bằng cách

sử dụng GCMS Pyrolysis Type Shimadzu QP2010 Thử nghiệm trong phòng thí

nghiệm dinh dưỡng cho thấy C.nardus lá có hàm lượng nước 11,15%, C hữu cơ

25,30%, tổng N 0,77%, tỷ lệ C / N (33,00%), tổng P (0,40%) và tổng K (1,08%) Nghiên cứu tài liệu về việc sử dụng lợi ích đã được thực hiện trong nghiên cứu trước đó Tổng số 29 hợp chất hoạt động đã được xác định và định lượng bởi GCMS Shimadzu QP2010 Thành phần chủ yếu trong số đó: amoni cacbamat (18,26%), carbinol (13,57%), neophytadiene (11,65%), transgeraniol (6,92%), phenol-metoxy (6,15%), norolean (4,93%), benzofuran (3,9%), guaiacol (3,23%), hexadecen-phytol (3,1%), beta-citronellol (2,69%), trans-caryophyllene (2,61%), alpha.-humulene (2,45%) và valerol (2,38%) Một phổ lợi ích đa dạng bao gồm: hoạt động diệt khuẩn (BA), chống nấm, chống gốc tự do, phân hủy chất thải (nông nghiệp, phân), chất đuổi côn trùng và bảo quản chủ yếu tự nhiên Các thành phần của hợp chất hoạt tính CNO khác nhau có liên quan đến môi trường sống, phương pháp chưng cất và phân tích Thỏa thuận giữa các nhà nghiên cứu về các hợp chất chủ yếu: citral, citronellal, geranyl acetate, geraniol và citronellol là các hợp chất có trách nhiệm trên nhiều mặt lợi ích [29]

2.3.2.3 Đa dạng di truyền

Theo Serap và cs (2020): sử dụng kỹ thuật RADP và ISSR để xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài thuộc chi Salvia – một chi thực vật thuộc họ Hoa Môi (Lamiaceae) Nghiên cứu cho thấy điểm đánh dấu đại diện cho công cụ mạnh mẽ để đánh giá được sự đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các loài Salvia trong nghiên cứu [21] Kết quả cho thấy, việc sử dụng kỹ thuật RADP và ISSR đã phân nhóm được

15 loài Salvia ở Iran thành 6 nhóm khác nhau Nhóm thứ nhất gồm các loài S

cryptantha, S candidissima, S sclarea, S multicaulis, S limbata, S aethiopis, S virgate, S pachhystachya và S divaricata; nhóm thứ 2 có 1 loài là S verticillata; nhóm

thứ 3 có 1 loài là S nemorosa; nhóm thứ 4 gồm 2 loài là S staminea và S verticillata

subsp Amasiaca; nhóm 5 có 1 loài S caespitosa và nhóm 6 có 1 loài S rosifolia [30]

Theo Adhikari và cs (2013): Mười giống sả ưu tú của Ấn Độ, các loại cỏ thơm thuộc loại buôn bán tinh dầu, cây palmarosa và cây sả, được phân lập đặc trưng từ các

mô lá tươi được khuếch đại với mười hai mồi tùy ý 10 - mer Sự khuếch đại đã tạo ra

Trang 21

tổng thể 64 dải băng trong các giống cây trồng được nghiên cứu Trong đó 52 đơn chất và 12 đơn chất Các điểm đánh dấu RAPD được chứng minh là hệ thống đánh dấu hiệu quả liên quan đến việc phát hiện tính đa hình, số lượng locus được ghi và các giá trị PIC Tính đa hình khác nhau đáng kể trong các nhóm cây trồng rời rạc và xấp xỉ 71,88% ở palmarosa, 6,25% ở cây cỏ thơm và 46,88% ở sả Các biến thể di truyền được phát hiện giữa các giống cây trồng ưu tú có thể được sử dụng nhiều cho sự xâm nhập của các nhân vật mới từ các giống hoang dã sang các giống cây trồng, cô lập các dấu hiệu phân ly ổn định [15]

Theo Suman PS Khanuja và cs (2005): Mười đơn vị chín phân loại

Cymbopogon thuộc 11 loài, hai giống, một đơn vị phân loại lai và bốn loài không

xác định được phân tích thành phần tinh dầu và cấu hình RAPD của chúng tôi để xác định mức độ giống nhau về di chuyển và do đó mối quan hệ phát sinh giống nhau giữa họ Chú ý khác biệt đã được quan sát trong sản lượng dầu dao động từ

0,3% trong Cymbopogon travancorensis Bor đến 1,2% trong Cymbopogon

martinii (Roxb.) Wats var motia Citral, một thành phần chính của tinh dầu, được

sử dụng làm chất đánh dấu cơ sở để phân tích học nhóm Dựa trên phân tích di

truyền, độ cao của Cymbopogon flexuosus var microstachys (Hook f.) Soenarko về trạng thái và các thể loại riêng biệt đối với C travancorensis Bor., đã được hợp nhất dưới C flexuosus (Steud.) Wats được đề xuất hướng tới công việc phân tích hợp phân loại trong Cymbopogon Tình trạng đặc biệt của các giống C martinii

được xuất trước đó (motia và sofia) càng được chứng minh bằng những phân tích

này Cymbopogon loài không được xác định đã được quan sát thành dạng trung

gian trong quá trình phát triển mới phân loại đơn vị [19]

Trang 22

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu : Các mẫu cây sả được thu thập tại khu vực miền núi phía bắc và miền trung Việt Nam

3.1.2.Vật liệu nghiên cứu

Các mồi được sử dụng trong nghiên cứu được sử dụng trong nghiên cứu được thiết

kế dựa trên nghiên cứu của tác giả Oliveira E.C và cộng sự (2010) [23] được sản xuất bởi công ty PHUSA Biochem và sản xuất tại Việt Nam

Thông tin được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu

STT Ký hiệu mồi Trình tự (5’ - 3’) Giá trị Tm (ºC)

Trang 23

3.1.3 Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị được dùng trong quá trình nghiên cứu được liệt kê trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

6 Bộ chưng cất thủy tinh 1000 ml AGRITECH Việt Nam

Bảng 3.3 Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu

Trang 24

STT Tên hoá chất Hãng sản xuất

9 2-Mercaptoethanol Thermo scientific scientific

12 Mercapton ethanol Thermo scientific scientific

3.1.5 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.3.1 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các mẫu sả tại Thái Nguyên vào vụ xuân hè

- Nghiên cứu đa dạng di truyền của cây sả bằng phương pháp RAPD

3.1.3.2 Địa điểm nghiên cứu

Khoa CNSH&CNTP trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.1.3.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 01-09/2021

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Sưu tầm các mẫu sả tại Việt Nam

Nội dung 1 : Sưu tầm các mẫu sả tại các tỉnh

3.2.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các mẫu sả Việt Nam

Nội dung 2 : Nghiên cứu các đặc điểm hình thái của các mẫu sả

Nội dung 3 : Nghiên cứu đặc điểm hàm lượng tinh dầu tổng số của các mẫu sả

Trang 25

3.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền kiểu gen các mẫu sả Việt Nam

Nội dung 4 : Tối ưu quy trình tách DNA từ các mẫu

Nội dung 5 : Lựa chọn các cặp mồi đánh giá đa dạng di truyền cây sả

Nội dung 6 : Phương pháp PCR – RAPD và phương pháp xây dựng cây phân loại

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Sưu tầm các mẫu sả tại Việt Nam

3.3.1.1 Nội dung 1 : Sưu tầm các mẫu sả tại các địa phương

Trong nội dung này, chúng tôi tiến hành thu thập 8 mẫu sả tại các địa điểm sau :

xã A Xan, xã A Nông, xã TrˈHy huyện Tây Giang tỉnh Quảng Nam; xã Bắc Quỳnh huyện Bắc Sơn tỉnh Lạng Sơn ; xã Nam Tuấn, xã Đức Long huyện Hoà An tỉnh Cao Bằng ; xã An Thạch Thuỷ huyện Chợ Gạo tỉnh Tiền Giang, xã Ba Dinh huyện Ba Tơ tỉnh Quảng Ngãi Cây được lựa chọn là cây có sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh Các mẫu mẫu trình bày theo bảng 3.4 Các mẫu được trồng tại vương ươm giống khoa CNSH – CNTP Các mẫu được trồng riêng vào các luống, khoảng cách cây với cây từ

40 cm đến 45 cm, các mẫu sau trồng cần được tưới ẩm thường xuyên; độ ẩm tưới duy trì từ 80% - 90%

Tên mẫu và địa điểm thu mẫu mẫu sả trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Các mẫu sả nghiên cứu

chú

1 Sả A Nông SAN Xã A Nông huyện Tây Giang tỉnh Quảng Nam

2 Sả Cao Bằng SHN Xã Hồng Nam, huyện Hoà An, tỉnh Cao Bằng

3 Sả Cao Bằng SĐL Xã Đức Long, huyện Hoà An, tỉnh Cao Bằng

4 Sả Bắc Sơn SBS Xã Bắc Sơn, huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn

5 Sả Ba Dinh SBD Xã Ba Dinh huyện Ba Tơ tỉnh Quảng Ngãi

6 Sả An Thạch Thuỷ SATT Xã An Thạch Thuỷ huyện Chợ Gạo tỉnh Tiền Giang

7 Sả TrˈHy STH Xã TrˈHy huyện Tây Giang tỉnh Quảng Nam

8 Sả A Xan SAX Xã A Xan huyện Tây Giang tỉnh Quảng Nam

Trang 26

3.3.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái các mẫu sả Việt Nam

3.3.2.1 Nội dung 2 : Nghiên cứu các đặc điểm hình thái của các mẫu sả

a) Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm theo dõi sự phát triển của các mẫu sả được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 8 công thức tương ứng với các mẫu sả, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 03 khóm

b) Chỉ tiêu theo dõi

- Chiều cao cây: Chiều cao cây được định kỳ đo đạc sau 30 ngày 1 lần đo từ mặt đất đến chóp lá Đơn vị: cm (centimet)

- Số bẹ: Số bẹ của khóm được đếm sau khi trồng 6 tháng

- Chiều dài thân giả: Chiều dài thân giả được đo từ gốc thân giả đến cuống lá trên cùng sau khi trồng 6 tháng

- Đường kính thân giả: Đường kính thân giả được lấy giá trị trung bình đo theo 2 hướng của thân giả và được đo sau khi trồng 6 tháng

- Màu sắc thân giả : Quan sát màu sắc thân giả và đánh giá theo thang điểm bảng 3.5:

Bảng 3.5 Thang điểm đánh giá màu sắc bẹ

- Lông mọc trên trên thân giả : Lông mọc trên thân giả được quan sát và đánh giá sau khi trồng 6 tháng

- Chiều dài phiến lá : Chiều dài phiến lá được đo từ cuống lá đến chóp lá của lá thứ 3 Chiều dài phiến lá được xác định sau khi trồng 6 tháng

- Chiều rộng phiến lá : Chiều rộng phiến lá được đo ngang và chọn điểm rộng nhất Chiều rộng phiến lá được xác định sau khi trồng 6 tháng

- Số lá: Tổng số lá trên cây được xác định sau khi trồng 6 tháng

- Màu sắc lá : Màu sắc lá được quan sát trong quá trình sinh trưởng của cây sau khi trồng 6 tháng

Trang 27

- Tổng sinh khối : Tổng sinh khối là khối lượng của một ô thí nghiệm sau khi trồng 6 tháng

3.3.2.2 Nội dung 3 : Nghiên cứu hàm lượng tinh dầu tổng số của các mẫu sả

a) Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 8 công thức tương ứng với các mẫu

sả, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 03 khóm Thí nghiệm được tiến hành như sau: Lá của các mẫu sả được cắt vào buổi sáng và được đựng trong túi bóng Sau đó,

lá sả được băm nhỏ, các mẫu sả được đựng trong túi nilon riêng và được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh để chờ tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm được sử dụng 500 gam mẫu của từng mẫu sả, dùng nước làm dung môi

b) Chỉ tiêu theo dõi

- Thể tích tinh dầu : Thể tích tinh dầu có đơn vị : µl (microlit)

3.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền kiểu gen các mẫu sả Việt Nam

3.4.1 Nội dung 4 : Tối ưu quy trình tách DNA từ các mẫu

a) Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ các mẫu sả

Các mẫu sả thu thập được tách chiết DNA tổng số dựa trên phương pháp của Dolye và Dolye (1987) có một vài biến đổi nhỏ để phù hợp hơn với phòng thí

nghiệm[17]

Các bước tiến hành:

Bước 1: Cân 0,5g mẫu lá, cắt nhỏ đưa vào ống effendorft 2ml

Bước 2: Bổ sung 1ml Lysisbuffer, đưa mẫu đi nghiền trong máy nghiền mẫu Bước 3: Ủ mẫu trong bể ủ ở 65ºC trong 30 phút (10 phút đảo trộn nhẹ 1 lần) Bước 4: Ly tâm 10 phút ở tốc độ 12000 vòng/phút Bổ sung phenol chloroform isoamyl alcohol để làm sạch DNA

Bước 5: Hút dich nổi sang ống effendorft 1,5 ml Bổ sung 500µl Isopropanol Đảo trộn nhẹ Ly tâm 10 phút ở tốc độ 12000 vòng/phút Đổ bỏ dịch nổi Ly tâm 2 phút ở tốc độ 12000 vòng/phút Hút loại bỏ nốt dịch nổi

Bước 6: Bổ sung 1ml ETOH 70%, đảo trộn nhẹ, ly tâm 3 phút ở tốc độ 12000 vòng/phút Loại bỏ cồn Ly tâm 3 phút ở tốc độ 12000 vòng/phút, hút hết cồn, để khô tự nhiên

Trang 28

Bước 7: Bổ sung 80µl TE 1x để hoà tan DNA Ly tâm 3 phút ở tốc độ 10000 vòng/phút

Bước 8: Hút lấy dung dịch sang ống effendorf khác

Dung dịch DNA tổng số được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%

b) Phương pháp điện di trên gel

+ Phương pháp chuẩn bị bản gel 1%:

Bước 1: Hoà tan 1g agarose trong 100ml TAE 1X và đun sôi đến khi agarose hoà tan hết

Bước 2: Bổ sung 10µl ethidium promide vào gel đã đun sôi, lắc đều

Bước 3: Đổ gel vào khuôn đã chuẩn bị

Bước 4: Gel khô, rút lược ra khỏi gel, đưa khay gel ra ngoài thực hiện tra mẫu

+ Phương pháp tra mẫu và chạy điện di

Bước 1: Tra mẫu vào gel với tỉ lệ 10µl mẫu: 2µl loading dye 6x

Bước 2: Đưa gel vào bể điện di, chạy 30 phút, hiệu điện thế 120V

Bước 3: đưa gel lên máy soi gel và đọc kết quả

3.4.1.1 Tối ưu thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol

Thí nghiệm tối ưu thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 4 công thức được nhắc lại 3 lần, mỗi lần 8 mẫu ứng với các mẫu sả Các công thức được bố trí như sau :

Bảng 3.6 Thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol

3.4.1.2 Tối ưu số lần sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol

Thí nghiệm tối ưu thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 4 công thức được nhắc lại 3 lần, mỗi lần 8

Trang 29

mẫu Thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol là thời gian tối ưu nhất của thí nghiệm 3.4.1.1 Các công thức được bố trí như sau :

Bảng 3.7 Số lần sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol

Công thức Số lần sử dụng phenol chloroform isoamyl

alcohol (lần)

Thời gian sử dụng (phút)

Thời gian sử dụng hợp lý nhất ở bảng

3.4.2 Nội dung 5 : Lựa chọn các cặp mồi đánh giá đa dạng di truyền cây sả

Trong nội dung này, các cặp mồi phục vụ cho hoạt động đánh giá đa dạng di truyền của khoá luận được chúng tôi tiến hành lựa chọn dựa trên sự tham khảo từ những nghiên cứu đã được thực hiện thành công trên cùng đối tượng là cây sả hoặc các giống cây khác

3.5 Nội dung 6 : Phương pháp PCR - RAPD và phương pháp xây dựng cây phân loại

3.5.1 Phương pháp PCR - RAPD

Phản ứng RAPD được tiến hành trên máy máy PCR Master cycler X50s với tổng thể tích là 20 μL/phản ứng Thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng được trình bày ở Bảng 3.8 và 3.9 Sản phẩm RAPD được phân tách bằng điện di trên gel agarose 1,0% ở điện thế 120 V, 3 A trong 30 phút Sản phẩm RAPD được thể hiện thông qua máy chụp gel, kích thước của sản phẩm khuếch đại được xác định dựa trên kích thước của thang DNA chuẩn 1 kb

Trang 30

Thành phần Thể tích (µL)

Bảng 3.9 Chu trình phản ứng của RAPD

Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian (giây) Chu kỳ

Ghi chú: Tm: Tm là nhiệt độ gắn mồi của các cặp mồi

3.5.2 Phương pháp xây dựng cây phân loại

Các sản phẩm PCR- RAPD sau khi được khuếch đại và điện di trên gel agarose

sẽ cho xuất hiện các băng vạch sáng Băng sáng ở mẫu này nhưng không xuất hiện ở mẫu khác được gọi là phân đoạn đa hình, băng giống nhau ở tất cả các mẫu được coi là phân đoạn đồng hình Dựa trên kết quả của các phân đoạn DNA khi điện di sản phẩm PCR- RAPD của các mẫu sả thu được với các đoạn mồi ngẫu nhiên để làm cơ sở phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 với giá trị bootstrap 1000 lần để tăng độ tin cậy và theo phương pháp phân nhóm UPGMA trong chương trình SAHN để xây dựng nên

ma trận tương đồng và vẽ cây phân nhóm giữa các cặp mồi.theo quy ước :

+ Số 0: Không xuất hiện các đoạn DNA

+ Số 1: Xuất hiện các đoạn DNA

3.6 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu của các thí nghiệm được thu thập hàng tuần Số liệu tinh được phân tích sự sai khác theo phương pháp so sánh cặp đôi One-way ANOVA with post-hoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) trên phần mềm Excel

Trang 31

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả sưu tầm các mẫu sả tại các địa phương

Sau khi tiến hành thu thập các mẫu sả từ các địa phương khác nhau thuộc khu vực miền núi phía Bắc và các tỉnh miền Trung Việt Nam, chúng tôi đã thu thập được các mẫu

1 Sả A Nông SAN Xã A Nông, huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam

2 Sả Cao Bằng SHN Xã Hồng Nam, huyện Hoà An, tỉnh Cao Bằng

3 Sả Cao Bằng SĐL Xã Đức Long, huyện Hoà An, tỉnh Cao Bằng

4 Sả Bắc Sơn SBS Xã Bắc Sơn, huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn

5 Sả Ba Dinh SBD Xã Ba Dinh, huyện Ba Tơ, tỉnh Quảng Ngãi

6 Sả An Thạch Thuỷ SATT Xã An Thạch Thuỷ, huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang

7 Sả TrˈHy STH Xã TrˈHy, huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam

8 Sả A Xan SAX Xã A Xan, huyện Tây Giang, tỉnh Quảng Nam

Qua bảng 4.1 cho thấy:

Đã thu thập được 8 mẫu sả ở các tỉnh gồm: Tỉnh Quảng Nam có 3 mẫu sả được thu thập tại xã A Nông, xã TrˈHy, xã A Xan, Tỉnh Lạng Sơn có 01 mẫu được thu thập tại xã Bắc Sơn Tỉnh Cao Bằng có 2 mẫu sả được thu thập tại xã Hồng Nam và xã Đức Long.Tỉnh Quảng Ngãi có 1 mẫu sả được thu thập tại xã Ba Dinh huyện Ba Tơ tỉnh

Tỉnh Tiền Giang có 1 mẫu sả được thu thập tại xã An Thạch Thuỷ

4.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái các mẫu sả

4.2.1 Kết quả nghiên cứu động thái tăng trưởng chiều cao các mẫu sả

Nghiên cứu động thái tăng trưởng chiều cao của các mẫu sả thu được kết quả ở bảng 4.2 và hình 4.1

Trang 32

Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu động thái tăng trưởng chiều cao các mẫu sả

Tháng 3 Tháng 4 Tháng 5 Tháng 6 Tháng 7 Tháng 8 Chiều cao

(cm)

Chiều cao (cm)

(Ghi chú: a, b, c là các nhóm sai khác có ý nghĩa với mức ý nghĩa α = 0,05)

Hình 4.1 Kết quả nghiên cứu động thái tăng trưởng chiều cao các mẫu sả

Qua bảng 4.2 và hình 4.1 ta thấy:

Chiều cao cây của các giông sả giao động từ 82,9 cm đến 123,2 cm, cụ thể: Mẫu

sả SHN có tốc độ tăng trưởng mạnh nhất là 83,1 cm (từ 40,1 cm đến 123,2 cm) Mẫu

sả SBS tốc độ tăng trưởng là 82,7 cm (từ 33,5 cm đến 116,2) Mẫu sả SĐL tốc độ tăng

Trang 33

trưởng là 81,2 cm (từ 40,2 cm đến 121,4 cm) Sả STH có tốc độ tăng trưởng là 78 cm (từ 34,4 cm đến 112,4 cm) Sả SAX có tốc độ tăng trưởng là 77,4 cm (từ 33,1 cm đến 110,5 cm) Sả SBD có tốc độ tăng trưởng là 62 cm (từ 32,7 cm đến 94,7 cm) Sả SAN

có tốc độ tăng trưởng là 59,9 cm (từ 35,3 cm đến 95,2 cm) Tốc độ tăng trưởng chậm nhất là mẫu sả SATT 52,8 cm (từ 30,1 cm đến 82,9 cm) Chiều cao các mẫu sả trong

thí nghiệm có chiều cao gần tương đồng với giống sả Cymbopogon nardus có chiều

cao từ 80 – 150 cm theo công bố của Đỗ Tất Lợi (2004) [6], hoặc thấp hơn so với

chiều cao giống sả Cymbopogon citratus là 180 cm như công bố của Gagan Shah và

cs (2011) [28]

4.2.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thân giả của cây sả

Trong nghiên cứu này, đánh giá các đặc điểm về số lượng bẹ, chiều dài thân giả, đường kính thân giả, màu sắc thân giả, lông mọc trên thân giả của các mẫu sả Kết quả được thể hiện trong bảng 4.3 và hình 4.2

Bảng 4.3: Kết quả nghiên cứu đặc điểm thân giả cây sả

Mẫu

(ký hiệu) Số bẹ (bẹ)

Chiều dài thân giả (cm)

Đường kính thân giả (cm)

Màu sắc thân giả

Lông mọc trên thân giả

Trang 34

SĐL SHN STH SAN SAX SBS SBD SATT

Hình 4.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm bẹ cây sả

Kết quả thể hiện tại bảng 4.3 và hình 4.2 cho thấy:

Số lượng bẹ sả sau 6 tháng trồng phát triển giao động từ 6,7 bẹ đến 9,7 bẹ cụ thể: Mẫu sả SĐL có số lượng bẹ nhiều nhất trong các mẫu sả là 9,7 bẹ, mẫu sả SHN

có số lượng bẹ 9,3 bẹ, hai mẫu sả SAN và SAX có số bẹ mẫu nhau là 8,3 bẹ, mẫu sả SBD và mẫu sả STH đều có số bẹ mẫu nhau là 7,7 bẹ, mẫu sả SBS và mẫu sả SATT đều có số lượng bẹ nhỏ nhất là 6,7 bẹ Chiều dài thân giả sau 6 tháng trồng phát triển giao động từ 18,6 cm đến 22,8 cm, cụ thể: Mẫu sả SĐL có chiều dài thân giả lớn nhất

là 22,8 cm, mẫu sả SHN có chiều dài thân giả là 22,6 cm, mẫu sả STH có chiều dài thân giả là 21,9 cm, mẫu sả SAN có chiều dài thân giả là 21,8 cm, mẫu sả SAX có

chiều dài thân giả là 21,5 cm, mẫu sả SBS có chiều dài thân giả là 19,7 cm, mẫu sả

SBD có chiều dài thân giả là 19,5 cm, mẫu sả SATT có chiều dài thân giả nhỏ nhất là 18,6 cm Đường kính thân giả sả sau 6 tháng trồng phát triển giao động từ 1,1 cm đến 2,3 cm, cụ thể: Mẫu sả SĐL có đường kính thân giả lớn nhất là 2,3 cm, mẫu sả SHN

có đường kính thân giả là 1,8 cm, hai mẫu sả SBS và SAX có đường kính thân giả là 1,6 cm, hai mẫu sả SBD và SATT có đường kính thân giả là 1,5 cm, mẫu sả SAN có đường kính thân giả là 1,4 cm, mẫu sả STH có đường kính thân giả nhỏ nhất là 1,1 cm Các mẫu sả SAN, STH, SAX đều có màu sắc thân giả là tím nhạt; mẫu sả SHN có màu

Trang 35

sắc thân giả là xanh nhạt; các mẫu sả SĐL, SBS, SBD, SATT đều có màu sắc thân giả

là tím pha xanh Các mẫu sả SAN, STH, SAX đều không có lông mọc trên thân giả; Các mẫu sả SHN, SĐL, SBS, SBD, SATT đều có lông mọc trên thân giả Các mẫu sả

được thu thập có màu sắc thân giả gần giống với giống sả Cymbopogon nardus thân

giả có màu tím theo công bố của Đỗ Tất Lợi (2004) [6]

4.2.3 Kết quả nghiên cứu hình thái lá

Trong nghiên cứu này, đánh giá các đặc điểm về số lá, kích thước lá, màu sắc

lá của các mẫu sả Kết quả được thể hiện trong bảng 4.4 và hình 4.3

Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu hình thái lá

Chiều rộng phiến lá (cm)

Đặc điểm phiến lá Màu sắc lá

Trang 36

SHN SĐL STH SAN SAX SBS SBD SATT

Hình 4.3 Kết quả nghiên cứu hình thái lá

Kết quả thể hiện tại bảng 4.4 và hình 4.3 ta thấy:

Số lá sả sau 6 tháng trồng phát triển giao động từ 5,7 lá đến 9,3 lá, cụ thể: Mẫu

sả SHN có số lá lớn nhất là 9,3 lá, mẫu sả SĐL có số lá là 9,0 lá, hai mẫu sả SAN và SAX đều có số lá là 7,7 lá, mẫu sả STH có số lá là 7,3 lá, hai mẫu sả SBS và SBD đều

có số lá là 6,3 lá, mẫu sả SATT có số lá nhỏ nhất chỉ 5,7 lá Chiều dài phiến lá sả sau

6 tháng trồng phát triển giao động từ 62,1 cm đến 103,5 cm, cụ thể: Mẫu sả SHN có chiều dài phiến lá lớn nhất là 103,5 cm, mẫu sả SĐL có chiều dài phiến lá là 101,2 cm, mẫu sả SĐL có chiều dài phiến lá là 101,2 cm, mẫu sả STH có chiều dài phiến lá là 92,2 cm, mẫu sả SAN có chiều dài phiến lá là 90,2 cm, mẫu sả SAX có chiều dài phiến

lá là 89,9 cm, mẫu sả SBS có chiều dài phiến lá là 79,0 cm, mẫu sả SBD có chiều dài phiến lá là 77,2 cm, mẫu sả SATT có chiều dài phiến lá nhỏ nhất là 62,1 cm Chiều rộng phiến lá sả sau 6 tháng trồng phát triển giao động từ 1,3 cm đến 2,3 cm, cụ thể: Mẫu sả SAX có chiều rộng phiến lá lớn nhất là 2,3 cm, mẫu sả STH có chiều rộng phiến lá là 2,2 cm, mẫu sả SAN có chiều rộng phiến lá là 2,1 cm, mẫu sả SĐL có chiều rộng phiến lá là 1,6 cm, mẫu sả SHN có chiều rộng phiến lá là 1,5 cm, hai mẫu sả SBS

Trang 37

và SBD có chiều rộng phiến lá là 1,4 cm, mẫu sả SATT có chiều rộng phiến lá nhỏ nhất là 1,3 cm Các mẫu sả SAN, STH, SAX có phiến lá to; các mẫu sả SHN, SĐL, SBS, SBD, SATT đều có phiến lá nhỏ Các mẫu sả SAN, STH, SAX có lá màu xanh đậm; các mẫu sả SHN, SĐL, SBS, SBD, SATT có lá màu xanh nhạt Các mẫu sả thu

thập có chiều dài phiến lá dài hơn giống sả Cymbopogon citrates là 90 cm, chiều rộng phiến lá các mẫu sả gần như tương đồng với giống sả Cymbopogon citrates có chiều

rộng phiến lá từ 1,3-2,5cm theo công bố của Gagan Shah và cs (2011) [28]

4.2.4 Kết quả nghiên cứu tạo sinh khối các mẫu sả

Trong nghiên cứu này, đánh giá sinh khối của các mẫu sả Kết quả được thể hiện trong bảng 4.5

Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu tạo sinh khối các mẫu sả

Kết quả thể hiện tại bảng 4.5 ta thấy:

Mẫu sả SHN có giá trị trung bình của tổng sinh khối lớn nhất là 516,3 gam Mẫu

sả SAX có giá trị trung bình của tổng sinh khối là 421,7 gam Mẫu sả STH có giá trị trung bình của tổng sinh khối là 416,3 gam Mẫu sả SĐL có giá trị trung bình của tổng sinh khối là 411,3 gam Mẫu sả SAN có giá trị trung bình của tổng sinh khối là 319,3

Trang 38

gam Mẫu sả SAX có giá trị trung bình của tổng sinh khối là 260,7 gam Mẫu sả SBS

có giá trị trung bình của tổng sinh khối là 213,3 gam Mẫu sả SATT có giá trị trung bình của tổng sinh khối nhỏ nhất là 211,3 gam

4.3 Kết quả nghiên cứu hàm lượng tinh dầu tổng số của các mẫu sả

Trong nghiên cứu này, đánh giá hàm lượng tinh dầu tổng số của các mẫu sả Kết quả được thể hiện trong bảng 4.6

Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu hàm lượng tinh dầu tổng số của các mẫu sả

Kết quả thể hiện tại bảng 4.6 ta thấy:

Mẫu sả STH có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số lớn nhất là 701,67µl Mẫu sả SAN có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số là 688,3µl Mẫu sả SAN có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số là 686,7µl Mẫu sả SĐL

có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số là 521,7µl Mẫu sả SHN có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số là 498,3µl Mẫu sả SBS có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số là 471,7µl Mẫu sả SBD có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số là 458,3µl Mẫu sả SATT có giá trị trung bình hàm lượng tinh dầu tổng số nhỏ nhất là 431,7µl Kết quả của thí nghiệm này thấp hơn kết quả đánh giá của

Trang 39

Trần Ngọc Sang (2018) là 140 – 250 ml/4kg hay Nguyễn Thành Phương (2020) là 15,5 ml/3kg [10], [9]

4.4 Kết quả tối ưu quy trình tách DNA từ các mẫu

4.4.1 Kết quả ảnh hưởng thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol trong quá trình tách mẫu

Trong nghiên cứu này, đánh giá thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol với các mẫu sả Kết quả được thể hiện trong bảng 4.7

Bảng 4.7 Tỷ lệ mẫu hiện DNA khi thực hiện thí nghiệm thời gian sử dụng

phenol chloroform isoamyl alcohol trong quá trình tách mẫu

Công thức

thí nghiệm

Thời gian (phút)

Số mẫu ban đầu (mẫu)

Chỉ tiêu đánh giá

Số mẫu hiện DNA (mẫu)

Tỷ lệ số

mẫu hiện DNA (%)

Chất lượng băng

Ghi chú : - 0 : không có băng

- 1 : băng sáng mờ, DNA không có nhiều trong băng

- 2 : băng sáng gọn, DNA có nhiều trong băng

- 3 : băng sáng phình to, DNA đứt gẫy

Kết quả thu được ở bảng 4.7 cho thấy : CT1 không có thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohoL nên không có mẫu hiện DNA CT2 sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol với thời gian 5 phút đã có tỷ lệ mẫu hiện DNA là 3,7 mẫu,

tỷ lệ phần trăm so với số mẫu ban đầu là 46,25%, băng mờ gọn nhưng DNA không có nhiều trong băng CT3 khi tăng thời gian sử dụng phenol chloroform isoamyl alcohol lên 10 phút có số mẫu hiện DNA là 6,3 mẫu có tỷ lệ hiện DNA là 78,75% băng sáng

Định dạng
Số trang	78
Dung lượng	2,53 MB