báo cáo thực hành nuôi cấy tế bào thực vật kỹ thuật cấy truyền mẫu mô thực vật in vitro

Khi nước được đun sôi sẽ bay hơi và bay kín buồng chứa mẫu, các dụng cụ và môi trường được tiếp xúc với nhiệt độ, áp suất cao sẽ khiến cho các vi sinh vật bị tiêu diệt.. 2 Bài 2 CHUẨN BỊ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT

Môn học : Nuôi cấy tế bào thực vật

Mã môn học : 211207

Họ và tên : Đinh Thuy Danh

Tp.HCM, Tháng 4 năm 2022

MỤC LỤC

Bài 1 GIỚI THIỆU TRANG THIẾT BỊ VÀ CÁCH SỬ DỤNG 1

1.Nồi hấp 1

1.1 Cấu tạo 1

1.2 Nguyên lý hoạt động 1

Bài 2 CHUẨN BỊ DUNG DỊCH GỐC (DUNG DỊCH STOCK) 2

2.1 Giới thiệu 2

2.2 Vật liệu – Trang bị 2

2.3 Phương pháp tiến hành 3

2.3.1 Pha stock môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) 3

2.3.2 Pha stock các chất điều hòa sinh trưởng 4

2.4 Pha cồn 70º 4

Bài 3 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 5

3.1 Giới thiệu 5

3.2 Thiết bị - Hóa chất sử dụng trong pha môi trường nuôi cấy 5

3.3 Cách tiến hành pha môi trường 5

3.3.1 Chuẩn bị đo môi trường nuôi cấy 5

Bài 4 KỸ THUẬT CẤY TRUYỀN MẪU MÔ THỰC VẬT in vitro 8

4.1 Vật liệu nuôi cấy 8

4.2 Cách tiến hành 8

4.3 Kết quả sau 7 ngày cấy 9

Bài 5 KỸ THUẬT VÔ TRÙNG MẪU CẤY 10

5.1 Vật liệu nuôi cấy 10

5.2 Cách tiến hành 10

5.2.1 Khử trùng tủ cấy 10

5.2.2 Khử trùng mẫu cấy 11 5.2.2.1 Thao tác bên ngoài tủ cấy 11 5.2.2.2 Thao tác bên trong tủ cấy 12

1

Bài 1 GIỚI THIỆU TRANG THIẾT BỊ VÀ CÁCH SỬ DỤNG

1 Nồi hấp:

1.1 Cấu tạo:

- Buồng tiệt trùng

- Bộ điều khiển chương trình gia nhiệt

- Lồng đựng dụng cụ, môi trường

- Vale xả hơi nước

- Đồng hồ đo áp suất

- Công tắc mở nguồn

1.2 Nguyên lý hoạt động:

Buồng tiệt trùng là một buồng kín bằng kim loại, phía dưới đáy nồi

có gắn điện trở giúp đun nóng nước tạo hơi nước và áp suất

Cho khoảng 3 lít nước vào nồi hấp (lưu ý nước phải vừa ngập điện trở) chúng ta tiến hành đậy nấp nồi, vặn kín các ốc xung quanh nấp và

mở công tắc gia nhiệt Khi nước được đun sôi sẽ bay hơi và bay kín buồng chứa mẫu, các dụng cụ và môi trường được tiếp xúc với nhiệt độ,

áp suất cao sẽ khiến cho các vi sinh vật bị tiêu diệt Sau một thời gian nhất định, thiết bị ngưng gia nhiệt và tiến hành mở vale xả hơi nước ra ngoài

Đèn chuông báo sẽ báo khi kết thúc quá trình, chúng ta sẽ chờ cho thiết bị xả hết khí, khi đồng hồ báo hiệu về 0 thì chúng ta mở nắp và lấy dụng cụ ra

2

Bài 2 CHUẨN BỊ DUNG DỊCH GỐC (DUNG DỊCH STOCK)

2.1 Giới thiệu:

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo từng loại cây và bộ phận nuôi cấy, thưowngc bao gồm 5 thành phần chính:

- Đường (nguồn carbon), các muối khoáng đa lượng, các muối

khoáng vi lượng, các vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng Ngoài ra còn có thêm một số thành phần khác như acid amin, EDTA, nước dừa, dịch chiết nấm men, khoai tây, chuối,…Có rất nhiều công thức môi trường đã được công bố và sử dụng, trong đó môi trường

MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng rộng rãi nhất

- Nhằm tiết kiệm thời gian và công sức, thường pha dung dịch stock (hay còn gọi là dung dịch gốc), dung dịch này đậm đặc gấp 10 – 100 lần, được bảo quản lạnh và có thể sử dụng lâu dài

2.2 Vật liệu – Trang thiết bị:

Hóa chất cần thiết; cân điện tử, máy khuấy từ và gia nhiệt; cốc thuỷ tinh, đĩa petri, ống đong, pipette, nước cất, dung môi HCl hoặc KOH

2.3 Phương pháp tiến hành:

2.3.1 Pha stock cho môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962):

- Stock đa lượng: Pha riêng chất CaCl2.2H2O và KH2PO4 vì dễ bị kết tủa do liều lượng đậm đặc khi pha stock

- Stock vi lượng

- Stock Fe-EDTA

- Stock vitamin

Các bước tiến hành:

- Tính khối lượng hoá chất cần sử dụng; kiểm tra và sắp xếp hoá chất theo thứ tự

- Cân riêng từng hoá chất bằng cân điện tử

- Hoà tan từng hoá chất với lượng nhỏ nước cất đủ để làm tan hoá chất

3

- Cho các dung dịch thành phần vào cân định mức

- Thêm nước cất vào bình định mức đến thể tích yêu cầu và khuấy đều

- Đổ dung dịch stock vào chai, ghi tên stock và nồng độ lên chai; bảo quản lạnh

Bảng 1 Thành phần môi trường MS

(mg/l) Khối lượng (g) Thể tích dd stock Thể tích dd stock/lít mt

Đa lượng

2 lít

H2O 20 ml/l

MgSO4.7H2O 370 37 CaCl2.2H2O 440 44 500 ml 5 ml/l

Vi lượng

CoCl2.6H2O 0,025 0,0025

500 ml 5 ml/l

CuSO4.5H2O 0,025 0,0025

MnSO4.4H2O 22,3 2,23

Na2MoO4.2H2O 0,25 0,025 ZnSO4.H2O 8,6 0,86 Fe-EDTA Na2EDTA.2H2O 37,3 3,73 500 ml 5 ml/l

FeSO4.7H2O 27,8 2,78

4

Vitamine

200 ml 2 ml/l Myo-Inositol 100 10

Nicotinic acid 0,50 0,05 Pyridoxine HCl 0,50 0,05 Thiamine-HCl 0,10 0,01 2.3.1 Pha stock các chất điều hoà sinh trưởng:

Pha stock nồng độ 1 mg/ml: cân 0,1g hoá chất, hoà tan trong một lượng nhỏ (1 - 50 ml) dung môi, sau đó thêm nước cất định mức lên 100 ml Bảo quản dung dịch stock chất điều hoà sinh trưởng trong lọ kín (riêng IAA, 2,4D; NAA cần lọ màu nâu để tránh ánh sáng) và đặt ở ngăn đá của tủ lạnh

2.4 Pha cồn 70°:

Pha dung dịch cồn 70° từ dung dịch cồn 96° theo tỉ lệ 78 ml cồn 96° : 22

ml nước

5

Bài 3 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

3.1 Giới thiệu

Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật mô phỏng điều kiện sống ở môi trường bên ngoài, bao gồm các thành phần dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon và giá thể

Với điều kiện như vậy, cây có thể sinh trưởng bình thường hoặc phát triển theo ý muốn của người nuôi cấy với sự bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Mỗi loại cây thích hợp với những công thức môi trường khác nhau

Các bình môi trường sử dụng phải được hấp tiệt trùng trước khi dùng 3.2 Thiết bị - Hóa chất sử dụng để pha môi trường nuôi cấy

Thiết bị, dụng cụ

- Nồi hấp (Autoclave)

- Máy cất nước

- Máy đo pH

- Máy khuấy từ - Cân điện tử

(Cân 2 số)

- Becher, ống đong (50 ml, 10

ml)

- Pipette thủy tinh (5ml, 2ml)

- Đũa thủy tinh

- Muỗng, vá

Hoá chất

- Dung dịch stock của môi trường cần chuẩn bị

- Đường

- Agar

- Dung dịch chuẩn độ (KOH 1N, HCl 1N)

3.3 Cách tiến hành pha môi trường:

3.3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

Cách pha 2 lít môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) được thực hiện như sau:

- Cho khoảng 200 ml nước cất vào becher 2 lít

- Lần lượt thêm các stock theo công thức môi trường cần pha với thể tích thích hợp (được ghi trên bình chứa stock) Sau mỗi lần thêm stock phải

6

tráng ống đong, pipet với nước cất; cho thêm nước cất để tránh hiện tượng kết tủa

- Hòa tan đường (60 g/l) với nước cất, đổ vào becher

- Thêm nước cất vào cho đủ 2 lít dung dịch

- Đo pH đạt 5,7 - 5,8 Nếu môi trường chưa đạt pH mong muốn thì dùng dung dịch chuẩn độ điều chỉnh pH (tăng pH thì nhỏ thêm vài giọt KOH, giảm pH thì nhỏ thêm vài giọt HCl)

7

- Thêm agar 16 g/l (agar được thêm vào khi đã chuẩn pH môi trường nuôi cấy xong)

- Khuấy đều hỗn hợp môi trường và chia đều ra các bình nuôi cấy (40 - 50 ml/bình)

- Đậy nút bình bằng nút bông, nút cao su hoặc nylon chịu nhiệt

- Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C và áp suất 1,0 atm

8

Bài 4

KỸ THUẬT CẤY CHUYỀN MẪU THỰC VẬT in vitro

4.1 Vật liệu nuôi cấy:

Mẫu cây in vitro có sẵn trong phòng thí nghiệm

4.2 Cách tiến hành:

- Bật đèn UV tủ cấy trong 15 phút, chờ 30 phút sau khi đèn tắt mới được

sử dụng

- Cột tóc, xắn tay áo (nếu mặc áo dài tay), tháo đồng hồ và các trang sức

- Rửa tay bằng xà bông sau đó lau tay lại bằng cồn 70°

- Mặc áo blouse

- Mở quạt, mở đèn tủ cấy, lau tủ cấy bằng cồn 70°

- Các dụng cụ phải được hấp khử trùng trước khi sử dụng Để tất cả các dụng cụ vào tủ cấy, ngâm pince, dao trong cồn 90° Hơ dụng cụ (pince, dao, dĩa) trên ngọn lửa đèn cồn Chú ý: không được chạm tay vào mẫu cấy, không được đưa tay qua nơi để dụng cụ và mẫu cấy

Ngâm pince vào cồn 90° và hơ trên ngọn lửa đèn cồn sau mỗi thao tác

- Lau bề mặt các chai môi trường trước khi đặt vào tủ cấy

- Hơ miệng bình chứa mẫu cây cần cấy chuyền, mở nắp bình

- Gắp cây từ bình để trên dĩa có để sẵn giấy cấy

9

- Dùng dao tách cây con ra, cắt bớt rễ (nếu rễ nhiều > 5 và dài > 3 cm)

và lá héo vàng Chú ý không làm tổn thương đến cây con sau đó chuyển cây sang bình môi trường mới Trong trường hợp tạo chồi từ protocom hoặc mô sẹo, cắt mẫu thành từng mảnh khoảng 0,5 cm rồi cấy vào môi trường mới

- Cấy vào chai môi trường, mỗi bình khoảng 5 cây hoặc 6 mẫu mô

- Ghi tên mẫu cấy, ngày cấy và người cấy lên chai, sau đó đặt vào phòng tăng trưởng

4.3 Kết quả sau 7 ngày cấy:

10

Bài 5

KỸ THUẬT VÔ TRÙNG MẪU CẤY

5.1 Vật liệu nuôi cấy:

Các mẫu cấy thường được sử dụng: lá, hoa, thân, rễ, đỉnh sinh trưởng và hạt Cách chọn mẫu cấy: lấy mẫu cấy trên các cây khỏe mạnh, không bị sâu bệnh Mẫu cấy sinh viên tự chọn (Hoa, hạt, thân cây, cành cây…)

Bảng 2 Các chất khử trùng thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Tác nhân khử trùng Nồng độ sử dụng

(%)

Thời gian khử trùng

(phút)

5.2 Cách tiến hành:

5.2.1 Khử trùng tủ cấy:

- Bật đèn UV tủ cấy trong 15 phút, chờ 30 phút sau khi đèn tắt mới được sử dụng

- Cột tóc, xắn tay áo (nếu mặc áo dài tay), tháo đồng hồ và các trang sức

- Rửa tay bằng xà bông sau đó lau tay lại bằng cồn 70°

- Mặc áo blouse

- Mở quạt, mở đèn tủ cấy, lau tủ cấy bằng cồn 70°

- Các dụng cụ phải được hấp khử trùng trước khi sử dụng Để tất cả các dụng

cụ vào tủ cấy, ngâm pince, dao trong cồn 90° Hơ dụng cụ (pince, dao, dĩa) trên ngọn lửa đèn cồn Chú ý: không được chạm tay vào mẫu cấy, không được đưa tay qua nơi để dụng cụ và mẫu cấy Ngâm pince vào cồn 90° và hơ trên ngọn lửa đèn cồn sau mỗi thao tác

11

5.2.2 Khử trùng mẫu cấy:

5.2.2.1 Thao tác bên ngoài tủ cấy:

- Chọn mẫu cấy không bị sâu bệnh, cây khoẻ, sinh trưởng nhanh, mẫu vẫn sống sinh trưởng bình thường tạo cây con Mẫu không quá già hoặc quá non đối với mẫu cây, đối với mẫu hoa chọn hoa búp, còn đối với mẫu hạt chọn hạt chắc

- Rửa mẫu dưới vòi nước chảy khoảng 1 phút cho trôi hết bụi bẩn

- Rửa và ngâm mẫu vào xà phòng loãng (nước rửa tay hoặc rửa chén) khoảng 10 phút Đối với mẫu thân cây gỗ có thể tăng thời gian ngâm lên

15 - 20 phút

- Lấy bông lau sạch thân và rửa lại mẫu dưới vòi nước chảy khoảng 1 - 2 phút

- Dùng cồn 70° lau toàn bộ thân sau đó bỏ vào bình tam giác đã khử trùng

- Lau bình mẫu bằng cồn 70° và cho vào tủ cấy

12

5.2.2.2 Thao tác bên trong tủ cấy:

- Rửa mẫu bằng cồn 70°, lắc khoảng 30 giây

- Rửa mẫu lại bằng nước cất vô trùng 3 lần (1 lần/3 - 5 phút)

- Dùng kẹp chuyển mẫu sang bình tam giác mới đã hấp khử trùng

- Rửa mẫu bằng nước Javel với nồng độ khoảng 30% (Javel:H2O tỷ lệ 3:7) tùy mẫu, cách vài phút lắc vài lần để dung dịch ngấm thuốc khử trùng trong khoảng 20 phút

- Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần (1 lần/3 - 5 phút)

- Gắp mẫu từ bình để lên đĩa có sẵn giấy cấy

- Dùng kéo cắt bỏ các phần hoại tử màu trắng bỏ Cắt mắt nụ tiến hành cấy vào môi trường MS

- Ghi tên, ngày cấy lên chai, sau đó đặt vào phòng tăng trưởng

- Ghi nhận kết quả vô mẫu sau 5 - 7 ngày