Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào

Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào.Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào.Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào.Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào.Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào.Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào.Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào.Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào.Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào.

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Trần Ngọc Nhơn

NGHIÊN CỨU TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN

SỬ DỤNG TRONG ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU VẮC XIN

HO GÀ VÔ BÀO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2021

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Trần Ngọc Nhơn

NGHIÊN CỨU TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN

SỬ DỤNG TRONG ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU VẮC XIN

HO GÀ VÔ BÀO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS Nguyễn Thị Lan Phương

Hà Nội - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận v n Th c s “Nghiên cứu tính ổn định của vắcxin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào” làcông trình nghiên cứu của riêng cá nh n tôi và nh m nghiên cứu hông saochép của ai Do tôi và nh m nghiên cứu tự nghiên cứu đọc, dịch tài liệu, tổnghợp và thực hiện Nội dung lý thuyết trong luận v n tôi c sử dụng một số tàiliệu tham khảo như đã trình bày trong phần tài liệu tham khảo Các số liệu,chương trình phần mềm và những kết quả trong luận v n là trung thực và chưađược công bố trong bất kỳ một công trình nào hác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Học viện Khoa học và Côngnghệ nếu phát hiện bất cứ sự sai ph m hay sao chép trong đề tài này!

Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2021

Học viên

Trần Ngọc Nhơn

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho phép tôi ch n thành cảm ơn đến PGS.TS Nguyễn ThịLan Phương, người thầy đã tận t m hướng dẫn giúp đỡ tôi trong suốt quá trìnhhoàn thành luận v n Tôi xin ch n thành cảm ơn Viện trưởng TS Dương HữuThái đã quan t m và t o điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làmluận v n t i viện IV C Cảm ơn các b n đồng nghiệp Khoa Mẫu chuẩn ViệnKiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (NICVB), phòng Kiểm Định(IVAC) đã hợp tác và giúp đỡ cho tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin ch n thành cảm ơn Ban lãnh đ o Học viện Khoa học và Côngnghệ Phòng Đào t o Khoa Công nghệ Sinh học và quý thầy cô đã d y dỗ và

t o mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận v n

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình luôn động viên tôi trong suốt thờigian qua

Tôi xin ch n thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2021

Học viên

Trần Ngọc Nhơn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

01 CV Coefficient of variation Độ biến thiên

02 DĐVN Dược điển Việt Nam

03 DPT Diptheria – Pertussis –

Tetanus

B ch hầu – Ho gà – Uốn ván

04 ĐVMD Đơn vị miễn dịch

05 FHA Filametous Haemagglutinin

06 GMP Good ManufacturingPractice Thực hành sản xuất tốt

08 IVAC Institute of Vaccines and

Medical Biologicals

Viện Vắc xin và Sinhphẩm Y tế

09 MCQG Mẫu chuẩn quốc gia

10 MCQT Mẫu chuẩn quốc tế

11 NICVB National Institute for Control

of Vaccines and Biologicals

Viện Kiểm định Quốcgia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Công thức pha chế 1800 ml VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01

hấp phụ 22

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn dự kiến của VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 24

Bảng 3.1 Kết quả nhận d ng háng nguyên FH và PT trong mẫu vắc xin RaP01 43

Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra cảm quan và tính chất vật lý của vắc xin RaP01 45 Bảng 3.3 Kết quả kiểm tra tính chất vật lý vắc xin ho gà vô bào RaP01 48

Bảng 3.4 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu về h a học của vắc xin RaP01 49

Bảng 3.5 Kết quả xác định đặc tính háng nguyên của vắc xin RaP01 50

Bảng 3.6 Kết quả xác định ĐVMD của vắc xin RaP01 t i IVAC 51

Bảng 3 7 Công hiệu của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ bảo quản (-40°C ± 2°C) 54

Bảng 3 8 Công hiệu của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ 5°C ± 3°C 55

Bảng 3.9 Kết quả xác định các chỉ tiêu cảm quan và tính chất vật lý theo thời gian của vắc xin RaP01 ở -40°C ± 2°C 56

Bảng 3.10 Kết quả xác định các chỉ tiêu cảm quan và tính chất vật lý theo thời gian của vắc xin RaP01 ở 5°C ± 3°C 57

Bảng 3 11 Tính ổn định của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ 25°C ± 2°C 58

Bảng 3 12 Tính ổn định của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ 37°C ± 2°C 58

Bảng 3 13 Tính ổn định của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ 45°C ± 2°C 59

Bảng 3.14 Kết quả công hiệu RaP01 t i các thời điểm ủ mẫu ở nhiệt độ 45°C ± 2°C 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Khuẩn l c Bordetella Pertussis trên môi trường Bordert Gengou 7

Hình 1 2 Cấu trúc háng nguyên vi huẩn Bordetella pertussis 7

Hình 1 3 Ho gà và mức độ bao phủ tiêm vắc xin DPT3, Việt Nam, 12

Hình 1 4 Bản đồ tỷ lệ tiêm vắc xin ho gà ở trẻ n m 2019 12

Hình 1 5 Tỷ lệ tiêm chủng 3 mũi vắc xin ho gà trên toàn thế giới n m 1980 – 2019 13

Hình 1 6 Sơ đồ t m tắt quy trình sản xuất VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 23

Hình 2.1 VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 được sản xuất t i IVAC 24

Hình 2 2 Sơ đồ tổng quát của nghiên cứu 27

Hình 3 1 Kết quả kiểm tra vô trùng mẫu RaP01 42

Hình 3 2 Kết quả sau nhuộm của thí nghiệm nhận d ng háng nguyên PT và FH trong mẫu vắc xin RaP01 42

Hình 3 3 T ng trọng trung bình của chuột nhắt trong thử nghiệm an toàn chung VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 44

Hình 3 4 T ng trọng trung bình của chuột lang trong thử nghiệm an toàn chung VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 44

Hình 3 5 VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 đông hô 46

Hình 3 6 Độ ẩm tồn dư của các ống vắc xin RaP01 đông hô 47

Hình 3 7 Khối lượng hô của các ống vắc xin RaP01 đông hô 47

Hình 3 8 Số ĐVMD trung bình của 1 ống vắc xin ho gà RaP01 đông hô chuẩn độ t i IV C và NICVB 53

Hình 3 9 Đồ thị biểu diễn công hiệu của VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 ở -40°C ± 2°C 54

Hình 3 10 Đồ thị biểu diễn công hiệu của mẫu chuẩn RaP01 ở 5°C ± 3°C 55

Hình 3 11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc công hiệu của RaP01 bảo quản ở nhiệt độ 45°C ± 2°C theo các tuần 60

MỤC LỤC

LỜI C M ĐO N

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1 T NG QU N TÀI LIỆU 6

1 1 T NG QU N VỀ BỆNH HO GÀ 6

1 1 1 Tác nh n g y bệnh và cơ chế bệnh sinh 6

1.1.1.1 Vi khuẩn ho gà 6

1 1 1 2 Các yếu tố độc lực và háng nguyên bảo vệ 7

1 1 1 3 Cơ chế bệnh sinh 10

1 1 2 Đường l y và dịch tễ học bệnh Ho gà 11

1.2 VẮC XIN HO GÀ 12

1.2.1 Miễn dịch bảo vệ đối với ho gà 12

1 2 2 Các lo i vắc xin ho gà 13

1.2.3 Thử nghiệm xác định công hiệu ho gà 15

1.2.4 Vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01 16

1.2.4.1 Mẫu chuẩn quốc tế vắc xin ho gà vô bào 16

1.2.4.2 Nhu cầu tính cần thiết của vắc xin mẫu chuẩn quốc gia 16

1 2 4 3 Đặc điểm vắc xin mẫu chuẩn quốc gia 17

1 2 4 4 Đánh giá chất lượng vắc xin mẫu chuẩn 18

1.2.4.5 Chuẩn định với mẫu chuẩn quốc tế 19

1 2 4 6 Đánh giá tính ổn định 19

1.2.5 Sản xuất vắc xin mẫu chuẩn ho gà vô bào dự tuyển mẫu chuẩn quốc

gia 21 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU 24

2 1 ĐỐI TƯỢNG NGHI N CỨU 24

2.2 VẬT LIỆU NGHI N CỨU 25

2 2 1 Động vật thí nghiệm 25

2.2.2 Sinh phẩm – h a chất 25

2.2.3 Dụng cụ - thiết bị 26

2 3 PHƯƠNG PHÁP 27

2 3 1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 27

2 3 2 Phương pháp xác định các đặc tính ỹ thuật 28

2 3 2 1 Phương pháp iểm tra vô trùng 28

2 3 2 2 Phương pháp iểm tra nhận d ng háng nguyên PT FH 28

2 3 2 3 Phương pháp iểm tra an toàn chung 29

2 3 2 4 Phương pháp iểm tra cảm quan và tính chất vật lý 29

2 3 2 5 Phương pháp iểm tra các chỉ tiêu h a học 31

2.3.2.6 Kiểm tra các đặc tính háng nguyên 35

2 3 3 Phương pháp xác định đơn vị miễn dịch trong ống vắc xin mẫu chuẩn (nối chuẩn) 38

2 3 4 Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô

bào RaP01 39

2 3 4 1 Nghiên cứu tính ổn định ở nhiệt độ bảo quản (-40°C ± 2°C) 39

2 3 4 2 Nghiên cứu tính ổn định ở các dải nhiệt độ cao hơn nhiệt độ bảo quản 39

2.3.5 Dự đoán tuổi thọ sản phẩm theo nguyên lý Vant-Hoff 39

2 3 6 Phương pháp xử lý số liệu 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1 KẾT QUẢ KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG LÔ VẮC XIN RaP01 ĐÔNG KHÔ DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA VẮC XIN HO GÀ VÔ

BÀO 41

3.1.1 Kết quả kiểm tra vô trùng 41

3.1.2 Kết quả kiểm tra nhận d ng háng nguyên aP 42

3.1.3 Kết quả kiểm tra an toàn chung 43

3.1.4 Kết quả kiểm tra cảm quan và tính chất vật lý 45

3.1.5 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu h a học 49

3.1.6 Kết quả xác định đặc tính háng nguyên của vắc xin ho gà vô bào RaP0150 3.2 KẾT QUẢ CHUẨN ĐỊNH ĐƠN VỊ MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN HO GÀ VÔ BÀO RaP01 50

3.3 KẾT QUẢ NGHI N CỨU TÍNH N ĐỊNH CỦA VẮC XIN HO GÀ RaP01 53

3 3 1 Tính ổn định ở nhiệt độ bảo quản 53

3 3 1 1 Tính ổn định về công hiệu ở nhiệt độ -40°C ± 2°C và 5°C ± 3°C 53

3 3 1 2 Tính ổn định về cảm quan và tính chất vật lý của vắc xin RaP01 ở các nhiệt độ bảo quản 56

3 3 2 Tính ổn định ở nhiệt độ thúc đẩy nhanh và dự đoán tuổi thọ của vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01 58

3 3 2 1 Tính ổn định ở các nhiệt độ 25°C ± 2°C; 37°C ± 2°C và 45°C ± 2°C58 3.3.2.2 Dự đoán tuổi thọ của vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01 .59

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

4.1 KẾT LUẬN 62

4.2 KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ở Việt Nam, bệnh ho gà lưu hành ở tất cả các tỉnh thành trong cảnước Khi chưa thực hiện chương trình Tiêm chủng mở rộng (TCMR),bệnh ho gà thường xảy ra và t o thành dịch ở nhiều địa phương đặc biệtnghiêm trọng ở miền núi nơi c trình độ kinh tế - xã hội phát triển thấp.Bệnh thường diễn biến nặng, dễ tử vong do bị bội nhiễm g y biến chứngviêm phổi viêm phế quản - phổi, nhất là ở trẻ dưới 5 tuổi và trẻ suy dinhdưỡng Dịch c tính chu kỳ khoảng 3-5 n m N m 1979 tỷ lệ mắc bệnh ho

gà rất cao với 134 trường hợp mắc bệnh/100 000 d n

Sự ra đời của vắc xin ho gà vào n m 1923 mang một ý ngh a lịch sửquan trọng Các d ng vắc xin ho gà đang được sử dụng hiện nay là vắc xin ho

gà toàn tế bào bất ho t và vắc xin ho gà vô bào tinh chế từ các thành phần háng nguyên của vi khuẩn ho gà đều c hả n ng t o miễn dịch bảo vệchống l i bệnh Nghiên cứu sản xuất vắc xin ho gà t i Việt Nam c từ n m

1959 t i Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương nuôi cấy vi khuẩn ở d ng t nh

và sản xuất vắc xin theo phương pháp cổ điển N m 1990 Viện Vắc xin đãsản xuất thành công vắc xin ho gà toàn tế bào bất ho t trên d y chuyền lênmen do Quỹ Nhi đồng Liên hợp quốc (UNICEF) tài trợ Hiện nay ướctính hằng n m cả nước sử dụng từ 5 đến 7 triệu liều vắc xin ho gà Với nhucầu lớn về cung ứng vắc xin ho gà hằng n m như vậy thì việc kiểm soátchất lượng vắc xin là rất cần thiết Tuy nhiên hiện nay, Tổ chức Y tế thếgiới (WHO) chỉ cung cấp mẫu chuẩn quốc tế (MCQT) cho chuẩn địnhmẫu chuẩn quốc gia (MCQG) Do đ WHO huyến cáo các quốc gia đặc biệtcác quốc gia c ngành công nghiệp sản xuất vắc xin, phải tự sản xuấtMCQG để chủ động trong việc kiểm tra chất lượng vắc xin

Nhận biết tính cấp thiết về nhu cầu vắc xin mẫu chuẩn (VXMC) dùngtrong kiểm định trong huôn hổ dự án sản phẩm quốc gia vắc xin sử dụngcho người, viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (NICVB)phối hợp với các nhà sản xuất trong nước thực hiện dự án sản xuất 11 lo i

MCQG, trong đ Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) tham gia sản xuất

lô VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 từ n m 2019 và đã hoàn thành vào

n m 2020

Với ý ngh a như trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá chất lượng và tính ổn định của lô VXMC ho gà vô bào đông

hô RaP01

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Lô vắc xin ho gà vô bào đông hô RaP01 để dự tuyển MCQG dùng choxác định công hiệu vắc xin ho gà vô bào

4 Nội dung nghiên cứu

- Xác định đặc tính ỹ thuật của lô VXMC ho gà vô bào đông hôRaP01 dự tuyển MCQG

- Xác định đơn vị miễn dịch (ĐVMD) của lô VXMC ho gà vô bào đông

hô RaP01 theo MCQT

- Nghiên cứu tính ổn định và dự đoán tuổi thọ của lô VXMC ho gà vôbào đông hô RaP01

5 Ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của đề tài

Thành công của đề tài sẽ t o ra được lô mẫu chuẩn ho gà vô bào ở cấp

độ quốc gia Đ y là một mẫu chuẩn thiết yếu hông thể thiếu đối với việckiểm định và cấp phép sử dụng các lo i vắc xin ho gà vô bào Thành công này

g p phần vào thành công của dự án sản phẩm quốc gia sản xuất 11 lo i mẫuchuẩn dùng trong iểm định các vắc xin thiết yếu của chương trình TCMRquốc gia Sự ra đời của mẫu chuẩn ho gà vô bào quốc gia giúp chủ động trongquá trình iểm định chất lượng vắc xin và tiết kiệm ngo i tệ cho đất nước Do đ

đề tài c ý ngh a hoa học và thực tiễn rất lớn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

đã đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán xác định bệnh ho gà gồm 4 yếu tố sau:

(1) cơn ho ịch phát éo dài 21 ngày hoặc hơn (2) nuôi cấy xác nhận c vikhuẩn ho gà (3) háng thể háng háng nguyên ngưng ết hồng cầu d ng sợi(FHA) hoặc háng thể háng độc tố ho gà (PT) trong huyết thanh t ng và (4)

c tiền sử tiếp xúc trực tiếp hoặc c sự liên hệ chặt chẽ với bệnh nh n mắcbệnh ho gà [1]

Tác nh n g y bệnh là vi huẩn ho gà (Bordertella pertussis) Đ y là vi

khuẩn c hình thái cầu trực khuẩn hay hình bầu dục ích thước nhỏ 0,3 –

0 8 µm x 0 2 - 0 3 µm, gram m hông di động Vi khuẩn bắt màu thuốcnhuộm tốt với xanh Methylen, Phenol Toludin hay Fusin kiềm Khi bắtmàu thuốc nhuộm chung quanh và 2 cực của vi khuẩn c màu đậm hơn[2]

Vi khuẩn ho gà sống hiếu hí bắt buộc, nhiệt độ thích hợp từ 35°C –37°C, trong khoảng pH từ 7,0 – 7,2 Vi khuẩn mọc trên môi trường th ch máuđòi hỏi cả 2 yếu tố V và X Khuẩn l c nhỏ tròn bờ đều, lồi, ẩm ướt, mờ đụchoặc xanh nh t như xà cừ hoặc sáng b ng c ánh im Xung quanh huẩn l c cvòng tan máu Trên môi trường lỏng làm đục nhẹ môi trường ánh hơi sáng Vikhuẩn tương đối trơ hông lên men hầu hết các lo i đường Tính chất đề

háng yếu, bị bất ho t ở 56°C sau 30 phút Vi huẩn ém bền với tác nh n

h a học và chất sát huẩn [3]

Hình 1.1 Khuẩn l c Bordetella Pertussis trên môi trường Bordert Gengou 1.1.1.2 Các yếu tố độc lực và kháng nguyên bảo vệ

Vi khuẩn ho gà sở hữu một lo t các yếu tố độc lực, bao gồm các yếu tốbám dính và các độc tố trong đ một số là các háng nguyên c hả n ng

ích thích đáp ứng miễn dịch bảo vệ chống l i ho gà ( háng nguyên bảo vệ)

Hình 1.2 Cấu trúc háng nguyên vi huẩn Bordetella pertussis [4]

- FHA (Filamentous haemagglutinin adhesin: yếu tố ngưng ết hồng cầu

d ng sợi): FH là một protein diềm tua c trọng lượng ph n tử 220 kDa, baophủ bề ngoài vi huẩn FH c thể hấp phụ được trên bề mặt nhiều lo i tếbào và làm ngưng ết chúng đ ng vai trò thiết yếu trong quá trình bám dính

của vi khuẩn vào tế bào biểu mô đường hô hấp Bản th n FH hông cthành phần g y độc cho tế bào nhưng vai trò của n trong việc hình thành nênđộc lực của vi khuẩn là rất quan trọng Kháng thể háng FH c thể g y cảntrở quá trình nhiễm trùng bằng việc làm cho vi khuẩn hông bám dính đượcvào tế bào vật chủ FH là một thành phần háng nguyên quan trọng thường

c trong vắc xin ho gà vô bào [4]

- FIM hay GG (Fimbriae hay gglutinogen: ngưng ết nguyên 1 2 3):Các ngưng ết nguyên là các háng nguyên bề mặt ho gà hông chịu nhiệt,liên quan đến các type huyết thanh của vi khuẩn g y bệnh và sự ngưng ếtcủa vi khuẩn Chúng c vai trò trong việc giúp vi huẩn bám vào đường hôhấp vật chủ thông qua việc bám dính các tế bào biểu mô lông và tế bàođơn nh n Trong thực tế háng thể háng FIM t o miễn dịch bảo vệ thụ độngđối với chuột chống l i nhiễm trùng hô hấp với vi khuẩn ho gà [5]

- PRN (Pertactin hay protein màng ngoài tế bào hay protein 69kDa): Bên c nh các FIM một háng nguyên protein màng ngoài c trọnglượng ph n tử xấp xỉ 60 kDa cũng là một háng nguyên c ho t tính g y đápứng miễn dịch Pertactin được cho là c vai trò giúp vi huẩn bám dính vào

tế bào vật chủ tương tự FH và FIM [5]

- PT (Pertussis Toxin: độc tố ho gà): Đ y là một ngo i độc tố mangbản chất protein c cấu trúc phức hợp được tiết ra trong giai đo n vi khuẩn

nh n lên m nh PT c cấu trúc ngo i độc tố điển hình theo iểu A - B bao gồm

6 chuỗi, trọng lượng ph n tử 105 kDa Tiểu phần là chuỗi S (26 kDa) vàtiểu phần B là một phức hợp gồm 5 chuỗi từ S2 đến S5 theo tỷ lệ ph n tửlượng là 1:2:1:1 [3] PT chịu trách nhiệm g y nên một lo t các biểu hiệnbệnh lý đặc trưng của ho gà gồm: làm t ng m nh b ch cầu máu ngo i vitrong đ chủ yếu là Lymphocyte t ng nh y cảm với các amin hữu cơHistamine, ho t h a tế bào β của tụy làm giảm Glucose máu ích thích hay ứcchế hệ thống miễn dịch thông qua các tế bào mô lympho, PT tác động lên

tế bào nuôi và c thể làm tan máu thậm chí trên in vitro t o nên sự co cụm tếbào và ngưng ết hồng cầu Kháng

thể háng PT c thể trung hòa hay bất ho t các ho t tính sinh học của

PT trên in vivo và in vitro Ngoài ra PT còn c hả n ng tác động đến đápứng miễn dịch tế bào thông qua cơ chế điều hòa miễn dịch, t o nên sự t ngsản tế bào miễn dịch làm tế bào T tiết Interlekin IL-2 và Interferon γ (IFNγ) và làm t ng sự biểu thị ph n tử CD28 trên bề mặt của chúng Do đ PT

là thành phần

hông thể thiếu trong vắc xin ho gà vô bào [6]

- CT ( denylatecyclase: độc tố enzym): CT là một protein đơn ctrọng lượng ph n tử 177 Da và thuộc nh m độc tố c cấu trúc d ng A-Bgiống như độc tố b ch hầu Độc tố c cả 2 ho t tính Enzym: ho t tính

denylate Cyclase và ho t tính ly giải hồng cầu, nằm trên 2 vùnghác nhau của ph n tử CT Đ y là một độc tố quan trọng giúp vi khuẩn x mnhập vào biểu mô hô hấp Ngoài ra n còn c hả n ng ức chế đáp ứng miễndịch nhờ cơ chế g y độc tế bào và ức chế sự trình diện của các hángnguyên với tế bào Lympho T Các hiệu quả trên nhằm trốn tránh đáp ứng

miễn dịch và éo dài sự sống s t của Bordetella Pertussis trong tế bào vật

chủ [4]

- TCT (Traheal Cytotoxin: độc tố hí quản): Các cơn ho gà đặc trưng

c thể được quy cho TCT Đ y là một Disaccharide Tetrapeptide, trọnglượng ph n tử 921 Dalton được phát sinh từ lớp Petidoglycan ở vỏ của tếbào vi khuẩn TCT làm tổn thương lớp tế bào biểu mô của phổi và chịu

trách nhiệm về bệnh lý t i chỗ trong nhiễm trùng Bordetella Pertussis [5].

- DNT (Dermonecrotic Toxin: độc tố g y ho i tử da): DNT còn đượcgọi là độc tố g y chết hay độc tố hông bền với nhiệt (HLT: heat labittoxin), c trọng lượng ph n tử 102 Da được tìm thấy trong tất cả các loàiBordetella Độc tố thuộc về nh m các yếu tố g y ho i tử do tác động đến sựđiều hòa t ng trưởng hoặc ph n chia của vi khuẩn g y nên phản ứng viêmloét ho i tử xung quanh vùng vi huẩn x m nhập trên tế bào biểu mô hô hấp.DNT là độc tố c cơ chế họat động phức t p tác động của n đến các phảnứng sinh lý đối với vật chủ chưa rõ [6]

- LPS (Lipopolysacchaide) hay nội độc tố (endotoxin): LPS là thành phầnchính của màng ngoài vi huẩn hiện diện ở nhiều loài vi huẩn gram m Đốivới vi khuẩn ho gà LPS chịu trách nhiệm ích thích tế bào tiết các cyto ine háccủa phản ứng viêm đặc biệt là IL-1β được cho là đ ng vai trò chính trong phảnứng toàn th n và của hệ thần kinh khi bị nhiễm trùng hay sau tiêm vắc xin [4].LPS hông c vai trò trong miễn dịch bảo vệ đối với ho gà

1.1.1.3 Cơ chế bệnh sinh

Vi khuẩn x m nhập vào cơ thể qua đường hô hấp trên sau đ cácđộc tố của vi khuẩn g y ho i tử ở biểu mô đường hô hấp hay g y tổnthương ở lớp đáy và lớp giữa của tế bào biểu mô g y viêm cấp tính đường

hô hấp và ích thích sự t ng bài tiết của dịch rỉ nhầy của tế bào biểu mô hôhấp Thương tổn xảy ra chủ yếu ở phế quản và tiểu phế quản Khí quản vàthanh quản c thể bị tổn thương nhưng nhẹ hơn Dịch rỉ nhầy c thể làm tắcnghẽn các tiểu phế quản g y xẹp phổi hu trú hay g y bội nhiễm ở phổi đặcbiệt hay xảy ra ở trẻ sơ sinh Những thương tổn t i phổi chủ yếu do các độc

tố của vi khuẩn tác động đến thần kinh phế quản làm xuất tiết ở phế quảnhoặc làm giãn phế quản t m thời [7]

Ngo i độc tố do vi khuẩn tiết ra x m nhập vào máu g y nên các rối

lo n trao đổi chất của tế bào vật chủ do làm rối lo n sinh tổng hợp MP vòng

và là nguyên nh n của hàng lo t những biến đổi sinh học như: t ng b ch cầulympho ích thích tế bào β tiết insulin g y h đường huyết t ng sự thủy ph n lipidlàm biến đổi sự di trú của đ i thực bào ảnh hưởng đến hiệu lực miễn dịch,

Nội độc tố lipopolysaccharide (LPS) là một độc tố chịu nhiệt của vikhuẩn ít c ý ngh a trong sinh bệnh học của ho gà nhưng l i chịu trách nhiệm vềcác phản ứng toàn th n chung ở giai đo n đầu của bệnh Ngoài ra vi huẩn còn

c những thành phần c ho t tính sinh học hác như độc tố hông bền với nhiệt(HLT) độc tố hí quản (TCT) độc tố enzyme adenylcyclase (ACT), yếu tốngưng ết hồng cầu hình sợi (FH ) các ngưng ết nguyên bề mặt (FIM hay

GG 2 3) đều là các yếu tố độc lực giúp vi huẩn bám định vị và g y tổnthương tế bào biểu mô hô hấp và làm rối lo n các chức n ng sinh học của vậtchủ Những rối lo n hô hấp như ngưng thở, ng t thở c lẽ liên quan đến tổnthương trung t m hô hấp ở hành tủy do độc tố g y nên Một số ý iến cho rằngviêm não do ho gà xảy ra trong một số trường hợp c vai trò của độc tố [8].

1.1.2 Đường lây và dịch tễ học bệnh Ho gà

Bệnh l y truyền qua đường hô hấp, bởi các cơn ho từ bệnh nh n và sựtiếp xúc thường xuyên của người mang mầm bệnh với các cá thể chưa c miễndịch Trong quá trình g y bệnh, vi khuẩn bám và định vị vào phần trên củađường hô hấp nhờ các diềm tua nhanh ch ng nh n lên trên bề mặt tế bào biểu

mô hô hấp hông x m nhập qua niêm m c mô hay vào máu [3]

Trong suốt thập kỷ 60 - 80 của thế kỷ trước hàng n m trên thế giới sốngười mắc ho gà hoảng 20 - 40 triệu người, 90% xảy ra ở các nước đang pháttriển và số người chết hàng n m vì ho gà hoảng 200 000 đến 300.000 người

Tỷ lệ mắc bệnh đã giảm rõ rệt trong các thập kỷ qua chủ yếu nhờ chương trìnhTCMR T i các nước phát triển, tỷ lệ mắc ho gà ở trẻ từ 0,2 – 1% trước hi ápdụng TCMR, sau 20 n m tỷ lệ này đã giảm xuống 0,01% [8]

T i Việt Nam, trong những n m 70 của thế kỷ trước, số mắc trungbình hàng n m dao động từ 70 000 đến 100 000 trường hợp Sau hi đẩy m

nh việc TCMR trong đ c việc tiêm phòng vắc xin DPT, từ 1987 đến naybệnh ho gà hông còn là gánh nặng đối với các hoa l y của bệnh viện từtuyến huyện đến tuyến trung ương Kết quả giám sát bệnh cho thấy từ n m

1979 – 1988, thời kỳ triển hai TCMR còn thấp, tỷ lệ mắc bệnh trung bìnhhàng n m là 65 1/100 000 d n tỷ lệ chết 0 05/1 000 000 d n Từ n m 1989đến nay, tỷ lệ TCMR t ng cao nên tỷ lệ mắc trung bình hàng n m trongthời kỳ này là 5 1/100 000 d n giảm 12,8 lần (92 2%) Đồng thời tỷ lệ chếtgiảm 5 lần (80%) Đặc biệt từ n m 1995 đến nay bệnh đã được khống chế,

tỷ lệ mắc chỉ dưới 3/100 000 d n Trẻ sơ sinh chiếm 80 - 90% số ngườimắc bệnh [9]

Hình 1.3 Ho gà và mức độ bao phủ tiêm vắc xin DPT3, Việt Nam,

1981-2005 [10]

Hình 1.4 Bản đồ tỷ lệ tiêm vắc xin ho gà ở trẻ n m 2019 [11]

1.2 VẮC XIN HO GÀ

1.2.1 Miễn dịch bảo vệ đối với ho gà

Miễn dịch bảo vệ thu được sau khi khỏi bệnh hoặc sau tiêm vắc xin

ho gà Kháng thể được coi là một phần quan trọng trong miễn dịch bảo vệ

chống l i Bordetella Pertussis Trong đáp ứng miễn dịch dịch thể, sự

opsonin h a và cố định bổ thể đ ng vai trò quan trọng ngoài cơ chế trunghòa độc tố và ức chế sự bám của vi khuẩn bằng háng thể IgG Tuy nhiên

nhiễm trùng Bordetella Pertussis đã được chứng minh c 1 pha nhiễm

trùng nội bào vì vậy

đáp ứng miễn dịch tế bào đặc biệt cơ chế qua trung gian INFγ rất quan trọng

để lo i trừ vi khuẩn nội bào ng n chặn sự lan tràn của vi khuẩn ở đường hô hấptrên trong nhiễm trùng lần đầu ( hi chưa c háng thể) Những tế bào của hệthống miễn dịch tự nhiên đ ng vai trò trình diện háng nguyên cho tế bào T ở

h ch lympho t i chỗ và qua đ hởi động quá trình đáp ứng miễn dịch Ở người,khi mắc bệnh hay sau tiêm vắc xin đã t o ra một quần thể tế bào T đặc hiệu

đối với các háng nguyên của Bordetella Pertussis và người ta đã chứng minh

đ y là những quần thể dưới nh m tế bào TCD4 chịu sự điều hòa của nh mcyto ine nghiêng về phía Th1 đ i diện cho đáp ứng miễn dịch qua trung gian tếbào [4]

1.2.2 Các loại vắc xin ho gà

N m 1923 sự ra đời của vắc xin phòng bệnh ho gà mang một ý ngh alịch sử quan trọng Hiện nay c hai d ng vắc xin ho gà đang được sử dụng đ làvắc xin ho gà toàn tế bào và vắc xin ho gà vô bào hai d ng vắc xin này đều c

chuẩn h a Sau đ vi huẩn bị bất ho t bằng phương pháp h a học hoặc bằngnhiệt điều chỉnh đến một đậm độ nhất định, hầu hết được hấp phụ vào muốinhôm và thêm vào chất bảo quản Quy trình sản xuất và thành phần các chủnggiống c thể hác nhau giữa các nhà sản xuất Vắc xin ho gà toàn tế bào đượcđánh giá là một trong những vắc xin l u đời nhất và c hiệu quả bền vữngnhất Tuy nhiên vắc xin ho gà toàn tế bào vẫn c những phản ứng phụ như sốtcao nôn mửa chán n, trong đ c những biến chứng hiếm gặp liên quanđến não

Sự công nhận về vai trò của PT FH PRN và GG/FIM trong cơ chếsinh bệnh và miễn dịch chống l i bệnh ho gà cùng với những lo ng i về tính

an toàn của vắc xin ho gà toàn tế bào (wP) đã thúc đẩy sự phát triển của vắcxin ho gà vô bào (aP) N m 1981 Nhật chính thức giới thiệu vắc xin ho gà

vô bào thay thế hoàn toàn việc sử dụng vắc xin ho gà toàn tế bào, làm giảmđáng ể các phản ứng phụ so với vắc xin ho gà toàn tế bào Để sản xuất vắcxin ho gà vô bào, hai thành phần háng nguyên bảo vệ quan trọng là PT và

FH được tinh chế từ canh cấy ho gà (chủng Tohama hoặc chủng 509) bằng

kỹ thuật siêu ly t m ph n vùng hay sắc ý hay phối hợp cả 2 kỹ thuật Một sốháng nguyên thứ yếu hơn như FIM PRN cũng c thể được bổ sung trongcông thức của vắc xin ho gà vô bào Do đ mỗi một lo i vắc xin ho gà vô bàođều c những đặc tính rất hác nhau tùy thuộc vào chủng sản xuất môi trườngnuôi cấy tác nh n bất ho t, kỹ thuật tinh chế, tỷ lệ phối trộn giữa các hángnguyên ho gà đơn Tuy nhiên giống như tất cả các vắc xin

hác dù được sản xuất bởi công nghệ nào thì tất cả các vắc xin aP đều phải

đ t tiêu chuẩn về vô huẩn an toàn công hiệu và độ tinh s ch đáp ứng tiêuchuẩn của WHO cho lo i vắc xin này

WHO đã chính thức ban hành các v n bản hướng dẫn và iểm định vắcxin ho gà vô bào và cho phép vắc xin này tồn t i song song với vắc xin ho gàtoàn tế bào Cả hai lo i vắc xin này đang được sử dụng rộng rãi để phòngngừa c hiệu quả bệnh ho gà và được dùng phối hợp với vắc xin giải độc tốuốn ván b ch hầu, Hib, viêm gan B [12]

Kiểm định vắc xin, trong đ c vắc xin ho gà là một l nh vực phức t p

vì phải thực hiện trên sản phẩm ở nhiều công đo n hác nhau của quy trìnhsản xuất, từ kiểm định nguyên liệu đầu vào bán thành phẩm trung gian bánthành phẩm cuối cùng và thành phẩm Các tiêu chí iểm định phương pháp ph

n tích và tiêu chuẩn đánh giá đều phải tu n thủ theo hướng dẫn của WHO và

cơ quan kiểm định quốc gia

Các tiêu chí iểm định chất lượng vắc xin ho gà thành phẩm, bao gồm:Nhận d ng công hiệu, an toàn đặc hiệu an toàn chung vô trùng các tiêu chí

h a lý (pH cảm quan, hàm lượng Thiomersal hàm lượng nhôm ) Trong đ thửnghiệm công hiệu bằng phương pháp thử thách trên não chuột cần phải thựchiện song song giữa vắc xin mẫu thử (VXMT) và VXMC

1.2.3 Thử nghiệm xác định công hiệu ho gà

N m 1940 Kendric và cộng sự đã x y dựng phương pháp xác địnhcông hiệu của vắc xin dựa vào việc đánh giá bảo vệ trên chuột nhắt hi chúngđược thử thách bằng đường tiêm não với chủng ho gà độc lực N m 1950-

1955, Hiệp hội Y học Hoàng gia nh chứng minh mối tương quan của cônghiệu vắc xin xác định trên chuột với hiệu lực bảo vệ trên trẻ em được tiêm vắcxin Từ đ đến nay phương pháp xác định công hiệu ho gà do Kendric phátminh (còn gọi là phương pháp thử thách) vẫn là chuẩn vàng trong iểm địnhxuất xưởng vắc xin ho gà để công nhận một vắc xin ho gà c hiệu lực hay hông [13]

Thử nghiệm xác định công hiệu của vắc xin ho gà nhất thiết phải tiếnhành song song với VXMC nên còn được gọi là công hiệu tương quan(relative potency) Nguyên lý của phương pháp là so sánh liều bảo vệ 50%của VXMT so với mẫu chuẩn VXMT và mẫu chuẩn được miễn dịch cho các

nh m chuột hác nhau sau một thời gian nhất định (thường 2-3 tuần) chuộtđược thử thách bằng đường tiêm não với chủng ho gà độc lực Công hiệu củavắc xin được tính toán bằng phần mềm WHO program dựa trên độ pha loãng

và số lượng chuột sống s t của nh m được tiêm VXMC và VXMT sau khi thửthách

Theo quy định của WHO công hiệu vắc xin ho gà dù ở d ng toàn tếbào hay vô bào nhưng nếu sử dụng miễn dịch cho trẻ em dưới 5 tuổi phải đ ttiêu chuẩn lớn hơn hoặc bằng 4 IU trong 1 liều đơn giới h n dưới khoảng tincậy (P = 0,95) của công hiệu ≥ 2 IU/liều tiêm Đối với các d ng vắc xin ho gà

vô bào dùng để tiêm nhắc l i cho trẻ lớn tiêu chuẩn công hiệu c thể thấp hơnnhưng phải được chứng minh là c hiệu lực bảo vệ trên l m sàng

1.2.4 Vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01

1.2.4.1 Mẫu chuẩn quốc tế vắc xin ho gà vô bào

Tiêu chuẩn công hiệu của vắc xin ho gà biểu thị bằng IU vì vậyWHO đưa ra một chuẩn chung nhất cho kiểm tra công hiệu vắc xin ho gà

vô bào, MCQT vắc xin ho gà vô bào lần thứ nhất do Viện Biken Kanonji,Nhật Bản sản xuất Các ống đông hô ban đầu được giữ bởi Viện Huyếtthanh Statens (Statens serum institute) Copenhagen Đan M ch và sau đđược chuyển giao cho NIBSC WHO phối hợp với các thành viên từ Việncác bệnh truyền nhiễm Quốc gia (Nhật Bản), Viện Kiểm định Quốc giaDược phẩm và Sinh phẩm (Trung Quốc) và Cục Quản lý Thực phẩm vàDược phẩm (Hàn Quốc) thực hiện nghiên cứu liên phòng thí nghiệm(PTN) đã xác định được đơn vị của mẫu chuẩn này là 34 IU/ml Dựa trên

ết quả nghiên cứu n m 2008 WHO đã thiết lập JNIH-3 làm MCQT lần thứnhất cho vắc xin ho gà vô bào với đơn vị 34 IU/ống Mẫu chuẩn này đượcbảo quản t i NIBSC ở nhiệt độ - 20°C và cho đến nay mẫu chuẩn vẫn cònhiệu lực sử dụng nhưng với số lượng rất h n chế [14]

1.2.4.2 Nhu cầu, tính cần thiết của vắc xin mẫu chuẩn quốc gia

Vắc xin ho gà vô bào dưới d ng các vắc xin 3 4 5 và 6 thành phần nhưAdacel, Boostrix, Tetraxim, Pentaxim, Hexaxim, Infarix Hexa với hiệu quảbảo vệ cao và tính an toàn của n đối với mọi đối tượng đã trở nên phổ biếntrên toàn thế giới Ở Việt Nam hàng n m một lượng lớn các lo i vắc xin ho gà

vô bào dưới d ng các vắc xin phối hợp đã được nhập khẩu để phục vụ nhu cầutiêm chủng cho trẻ em và phụ nữ mang thai Ngoài ra các dự án nghiên

cứu phát triển vắc xin ho gà vô bào cũng như vắc xin phối hợp c thànhphần ho gà vô bào đã được phê duyệt hiện đang triển khai bởi các nhà sảnxuất trong nước là IV C và V BIOTECH Nhu cầu kiểm định vắc xin ho gà

vô bào là rất lớn và theo đ số lượng các ống VXMC ho gà vô bào cũng t

ng tương ứng Theo thống ê của NICVB, số lượng VXMC ho gà vô bàocần thiết để kiểm định khoảng 200 ống/lọ (34 IU/lọ) mỗi n m Trong hi đmỗi n m WHO/NIBSC chỉ cung cấp cho mỗi quốc gia 3 lọ MCQT ho gà

vô bào vì sự h n chế về số lượng các MCQT ho gà vô bào và chính sách

ph n phối MCQT của WHO

1.2.4.3 Đặc điểm vắc xin mẫu chuẩn quốc gia

Vắc xin MCQG được sản xuất dựa trên quy trình sản xuất vắc xinthương m i và ít nhiều hác so với sản xuất vắc xin thương m i Một số VXMC

c cùng d ng và c quy trình sản xuất tương tự vắc xin thương m i như: viêmgan B sởi rota Tuy nhiên một số VXMC ở d ng hác so với vắc xinthương m i ví dụ vắc xin uốn ván b ch hầu ho gà thương m i ở d ng lỏngnhưng VXMC b ch hầu ho gà uốn ván được sản xuất ở d ng đông hô để ctính ổn định cao hơn sử dụng được trong nhiều n m [5], [14]

Mục tiêu của vắc xin thương m i để phòng bệnh cho người còn mụctiêu của VXMC để thực hiện thử nghiệm Một số các đặc điểm của mẫuchuẩn như sau:

- Mẫu chuẩn c đặc tính tương tự/gần nhất c thể với mẫu thử

- Mẫu chuẩn hông cần tinh khiết nhưng phải xác định được giá trị cônghiệu

- Không cần giống mẫu thử về công thức hoặc dung môi hồi chỉnh

- Phải giống mẫu thử về đặc điểm liều đáp ứng

- C thể sản xuất ở d ng đông hô/đông b ng/d ng lỏng

- Đơn vị đ ng ống phải đủ dùng cho một lần làm thử nghiệm công hiệu (trừ một số trường hợp đặc biệt)

- Số lượng sản xuất đủ dùng trong ít nhất 5 n m

- Đồng nhất về thể tích đ ng ống

- Tính an toàn của VXMC đa số trường hợp hông bắt buộc phải đánhgiá do hông sử dụng cho người mà chỉ cần thiết áp dụng trong một số mẫuchuẩn cụ thể khi sử dụng trên động vật thí nghiệm [15].

1.2.4.4 Đánh giá chất lượng vắc xin mẫu chuẩn

Mẫu chuẩn cần ổn định về công hiệu để dùng trong thời gian dài đồngnhất về thể tích đ ng ống đơn vị đ ng ống phải đủ dùng cho một lần làm thửnghiệm công hiệu (trừ một số trường hợp đặc biệt) Mẫu chuẩn c thể hácvới vắc xin thương m i về độ tinh khiết công thức hoặc dung môi hồi chỉnh,liều/d ng đ ng ống Vì vậy đánh giá chất lượng VXMC c những tiêu chí chungvới vắc xin thương m i như: cảm quan độ đồng đều của khối lượng/thể tích đ

ng ống pH độ ẩm tồn dư (vắc xin đông hô) vô trùng công hiệu Khác với vắcxin thương m i, VXMC hông cần đánh giá tính an toàn chất g y sốt, nội độc tố

do hông phải dùng trên người

Kiểm tra cảm quan là iểm tra toàn bộ những đặc tính của mẫu mà ta

c thể quan sát được bằng mắt thường, bao gồm kiểm tra nhãn mác sự nguyênvẹn của bao bì tr ng thái sản phẩm màu sắc bánh đông hô cũng như độ trongđục và thời gian hoàn nguyên

Độ lệch khối lượng được thực hiện để xác định mức độ đồng đều giữacác lọ VXMC trong cùng một lô Độ lệch khối lượng giữa các ống càng nhỏchứng tỏ độ đồng đều của các ống cao

Độ ẩm tồn dư một thông số quan trọng gắn với mức độ ổn định củamẫu chuẩn hi được bảo quản thời gian dài

Vô trùng: VXMC cũng như VXMT yêu cầu hông được nhiễm vikhuẩn, nấm, mycoplasma trong quá trình sản xuất

Công hiệu là tiêu chí quan trọng nhất để đánh giá chất lượng VXMC.Thử nghiệm công hiệu ban đầu nhằm xác định vắc xin c đ t yêu cầu MCQGđặt ra hay hông

Thử nghiệm đánh giá tính ổn định nhằm đánh giá mẫu chuẩn đ c phùhợp với mục đích sử dụng l u dài hay hông

1.2.4.5 Chuẩn định với mẫu chuẩn quốc tế

MCQG (chuẩn thứ cấp) sử dụng bởi các nhà sản xuất hác nhau và các

cơ quan iểm định quốc gia cần được chuẩn định với MCQT c hiệu lựcthông qua hợp tác liên PTN Các đơn vị tham gia trong hợp tác liên PTN sẽđược xác định trong từng trường hợp cụ thể Các PTN sẽ c n nhắc lựa chọnphương pháp thí nghiệm Nếu kết quả thử nghiệm c độ biến thiên lớn thì sốlượng PTN tham gia phải đủ lớn để c đủ số liệu cho ph n tích thống ê Tuynhiên trong nhiều trường hợp, số PTN tham dự chỉ c hai PTN gồm nhà sảnxuất và cơ quan iểm định quốc gia Trong những trường hợp này số lần lặp l

i thử nghiệm sẽ nhiều hơn để đảm bảo độ chính xác của công hiệu mẫu chuẩn[17], [18]

Sau hi c đủ số lần thử nghiệm cần thiết, tiến hành tính giá trị trungbình và giới h n tin cậy xác định số ĐVMD của MCQG

Do đặc thù của Việt Nam, mỗi vắc xin chỉ c một nhà sản xuất vì vậychỉ c 2 PTN tham gia trong phần chuẩn định MCQG vắc xin ho gà vô bàovới MCQT (NICVB và IV C)

1.2.4.6 Đánh giá tính ổn định

Tính ổn định của mẫu chuẩn được đánh giá qua tỷ lệ giảm công hiệuhoặc ho t tính ở các nhiệt độ bảo quản hác nhau [5], [15], [16], [17], [18]

Các nghiên cứu/đánh giá tính ổn định nhiệt gồm hai lo i:

- Nghiên cứu sự ổn định dài h n (long term stability, real time – realcondition stability): Xác định tính ổn định của công hiệu theo thời gian khimẫu chuẩn được bảo quản ở nhiệt độ khuyến cáo Nghiên cứu sự ổn định dài h

n c ưu điểm đưa ra h n sử dụng chính xác Tuy nhiên nhược điểm của nghiêncứu này là mất thời gian hông c ngay ở giai đo n đầu của nghiên cứu

- Nghiên cứu tính ổn định ngắn h n (accelerated stability testing):Nghiên cứu tính ổn định ở các dải nhiệt độ cao hơn nhiệt độ bảo quảnkhuyến cáo còn gọi là nghiên cứu thúc đẩy nhiệt Nghiên cứu này đượcthiết kế nhằm t ng nhanh tốc độ ph n hủy vật lý hoặc h a học của cácthành phần trong vắc xin để xác định tỷ lệ thay đổi các đặc tính của mẫutheo thời gian ở các nhiệt độ cao hơn nhiệt độ bảo quản thông thường Kếtquả nghiên cứu tính ổn định ngắn h n c thể sử dụng để dự đoán h n dùngcủa VXMC.

 Tính ổn định phải được xác định vì ba mục đích sau:

- Ước lượng thời gian sử dụng trong điều kiện lưu trữ nhất định

- Xác định điều kiện vận chuyển thích hợp

- Xác định thời gian giữ được công hiệu sau khi hồi chỉnh mẫu chuẩn

 H n dùng của mẫu chuẩn được dự đoán dựa vào:

- Kinh nghiệm sử dụng mẫu chuẩn

- Nghiên cứu tính ổn định dài h n ở các hoảng thời gian phù hợp

- Theo dõi giá trị công hiệu của mẫu chuẩn

- Kiểm tra công hiệu mẫu chuẩn thường kỳ bằng chuẩn quốc tế

Nếu mẫu chuẩn dự tuyển c nguồn gốc từ một mẻ vắc xin thương m i thì

hồ sơ nghiên tính ổn định của vắc xin thương m i đ sẽ là một tài liệu thamkhảo tính ổn định của mẫu chuẩn Trong trường hợp sử dụng mẫu chuẩn dàihơn h n sử dụng thông thường của vắc xin thương m i thì tính phù hợp và ổnđịnh c thể được đánh giá bằng MCQT hoặc soát xét l i dữ liệu trong quá trình

sử dụng nếu hông c MCQT

Cần phải làm nghiên cứu thúc đẩy nhiệt trên các mẫu bảo quản ở nhiềuđiều kiện hác nhau để dự đoán h n dùng Phương pháp thúc đẩy nhiệt đượcdùng để ước lượng h n dùng ở nhiệt độ lưu trữ và những nhiệt độ c thể gặpphải trong quá trình vận chuyển Một số mẫu chuẩn đông hô c thể ổn địnhđến mức phương pháp thúc đẩy nhiệt hông dùng để xác định dự đoán h ndùng được Do đ phương pháp đánh giá tính ổn định phải được lựa chọn tuỳđiều kiện thực tế Một số vắc xin đông hô như sởi, MR, MMR, khi vận

chuyển ph n phối được khuyến cáo bảo quản ở 2-8°C nhưng hi lưu trữ ở cácnhiệt độ thấp hơn như -20°C -70°C c thể éo dài thêm h n dùng và thíchhợp để cất giữ chuẩn thứ cấp nếu chất lượng sản phẩm được đảm bảo.

Đối với vắc xin thương m i d ng đông hô cần phải xác định tính ổn địnhsau hi đã hoàn nguyên Tuy nhiên VXMC dùng một lần ngay sau khi hoànnguyên nên hông nghiên cứu tính ổn định này

Mẫu chuẩn được cấp phép chính thức sử dụng c n cứ vào dữ liệu đã cbao gồm: Kết quả chuẩn định với MCQT nghiên cứu tính ổn định nhiệt(stability)

1.2.5 Sản xuất vắc xin mẫu chuẩn ho gà vô bào dự tuyển mẫu chuẩn quốc gia

IV C là nhà sản xuất được chỉ định sản xuất VXMC ho gà vô bào dựtuyển MCQG trong huôn hổ dự án cấp Quốc gia, sản xuất 11 lo i VXMC.Vắc xin ho gà vô bào dự tuyển MCQG của IV C được sản xuất c n bản dựatrên qui trình sản xuất vắc xin ho gà vô bào MCQT gồm 3 giai đo n: (1) sảnxuất háng nguyên ho gà tinh chế; (2) phối trộn vắc xin ho gà vô bào hấp phụ

và (3) đông hô vắc xin ho gà vô bào

Kháng nguyên ho gà vô bào tinh chế c nguồn gốc từ canh cấy chủng

ho gà BP 509, tinh chế bằng công nghệ siêu ly t m ph n đo n Đ y làphương pháp đồng tinh chế thu các ph n đo n chứa 2 háng nguyên chính là

PT và FHA Sản phẩm sau tinh chế được bất ho t, thẩm tích và lọc vôhuẩn để t o

háng nguyên ho gà aP tinh chế làm nguyên liệu để phối trộn vắc xin ho gà

vô bào ở d ng hấp phụ với tá chất nhôm

Giai đo n sản xuất vắc xin ho gà vô bào hấp phụ sử dụng tá chất GelHydroxyt nhôm của hãng Croda làm tá chất Công thức thành phần pha chế

1800 ml vắc xin ho gà vô bào hấp phụ được chỉ ra ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Công thức pha chế 1800 ml VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01

Ở giai đo n sản xuất vắc xin ho gà vô bào thành phẩm, vắc xin ho gà

vô bào hấp phụ được ph n liều vào các ống thủy tinh 5 ml (màu n u) củahãng Schott, mỗi ống 1 ml vắc xin và đông hô trên máy đông hô CNME -GZL2 Vắc xin sau đông hô được hút ẩm bằng Silicagel sau đ được chuyểnđến máy hàn ch n hông KUM BE – ES100 (Nhật) để hàn ống Kỹ thuậthàn sử dụng thanh đốt Siliconic, nhiệt độ 700oC trong điều kiện ch n hông

≤ -750 mm Hg (≤ -100 Pa)

Lô vắc xin dự tuyển MCQG ho gà vô bào đã được đông hô thành côngvới số lượng 1500 ống và mang mã số RaP01 trong n m 2020 Các qui trìnhtiếp theo gồm đánh giá chất lượng, nối chuẩn với MCQT để công nhậnMCQG và nghiên cứu tính ổn định là nội dung thực hiện trong luận v n nàySau đ y là sơ đồ tổng quát của quy trình sản xuất vắc xin dự tuyển MCQG ho

gà vô bào

Hình 1.6 Sơ đồ t m tắt quy trình sản xuất VXMC dự tuyển ho gà vô bào

RaP01

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHI N CỨU

Lô vắc xin ho gà vô bào đông hô RaP01 (ngày sản xuất: 24/03/2000) được sử dụng để thiết lập mẫu chuẩn công hiệu ho gà vô bào

Hình 2.1 VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 được sản xuất t i IVAC

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn dự kiến của VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01

STT Chỉ tiêu

chất lượng Phương pháp Tiêu chuẩn dự kiến

1 Cảm quan Quan sát bằng

mắt thường

Dạng khô: Bánh đông hô màu

trắng bong hông teo

Sau hoàn nguyên : T o thành hỗndịch đồng nhất hông lẫn tiểu phần

l màu trắng đục Khi để lắng t othành 2 lớp: Phần trên là dung dịchtrong hông màu hoặc màu vàng

nh t, phần lắng cặn màu trắng đục

5 Vô huẩn Cấy trực tiếp

Không c sự phát triển của vikhuẩn và nấm trên môi trường TSB

và TGF

chung

Thử trên chuộtlang và chuộtnhắt

Chuột sống, khỏe m nh sau hết thời

- Tủ l nh m -40°C, MDF – U334 – PE, Panasonic.

- Máy lắc tube, MS1, IKA

- Bể ổn nhiệt Julabo Đức

- Máy ly t m Rotina 380 Đức

- Kính hiển vi phản pha, IM-3, Nhật

- C n điện tử, BP221S, Sartorius

- Máy huấy từ, REO BC, IKA

- Pipet nhựa vô huẩn 10 ml, Corning

- Pipetman lo i 100, 200, 1000 l, BioHit

- Micropipet 8-12 ênh BioHit

- Bơm tiêm nhựa vô huẩn lo i 1 ml, 3 ml (Vinahankook)

- Tuýp nhựa vô trùng lo i 50 ml

- Chai thủy tinh nắp xanh 50, 100, 250 ml, Schott Duran

2.3 PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm

Hình 2.2 Sơ đồ tổng quát của nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp xác định các đặc tính kỹ thuật

2.3.2.1 Phương pháp kiểm tra vô trùng

Môi trường dùng cho thử nghiệm:

- Môi trường Thioglycolate: Dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu hí và nấm

- Môi trường TSB (Tryptone Soya Broth): Dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu hí và ị hí

Mỗi lo t môi trường phải kiểm tra chất lượng về tính vô trùng tính

t ng sinh trước khi sử dụng

- Sau khi cấy mẫu thử xong ủ các ống môi trường Thioglycolate ở nhiệt độ30°C – 35°C và các ống môi trường TSB ở nhiệt độ 20°C – 25°C trong 14 ngày

Đọc kết quả:

- Hàng ngày theo dõi và ghi chép Đọc kết quả cuối cùng vào ngày thứ 14

- Mẫu chuẩn được coi là vô trùng hi hông c ống môi trường nào bịnhiễm (c vi sinh vật phát triển)

2.3.2.2 Phương pháp kiểm tra nhận dạng kháng nguyên PT, FHA

VXMC ho gà vô bào đông hô được hồi chỉnh với nước cất sau đgiải hấp phụ Al(OH)3 bằng Natri Citrate Nhận d ng háng nguyên PT FHdựa trên sự kết hợp đặc hiệu với háng thể tương ứng trong gel th ch theonguyên lý của phản ứng miễn dịch khuếch tán vòng ép (Ouchterlony)Kháng nguyên PT FH từ các giếng được khuếch tán ra xung quanh sẽphản ứng với háng thể đặc hiệu t o thành đường kết tủa trên gel th ch:

- T i chứng dương: Xuất hiện đường tủa của háng thể PT, FHA với háng nguyên PT FH chuẩn.

- T i chứng m (PBS): Không xuất hiện đường tủa

Vắc xin được coi là đ t tiêu chuẩn khi t i vị trí iểm tra dung dịch xuấthiện đường tủa màu xanh của háng thể PT, FHA với háng nguyên PT FH ctrong vắc xin

2.3.2.3 Phương pháp kiểm tra an toàn chung

Phương pháp: Thử nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt và chuộtlang Mỗi chuột nhắt được tiêm ổ bụng với liều tiêm hông quá 1 liều đơn chongười và mỗi chuột lang được tiêm ổ bụng với liều tiêm hông quá 5 liều đơncho người Thể tích tiêm hông quá 1 ml cho một chuột nhắt và hông quá

5 ml cho một chuột lang Chuột phải được quan sát ỹ 2 giờ đầu sau hi tiêm vàtrong thời gian ít nhất 7 ngày thử nghiệm C n trọng lượng chuột vào ngày thứ

- Kiểm tra chân không: phát ánh sáng xanh hi iểm tra trên máy Tesla Coil

(Nhật) Yêu cầu: ống vắc xin ho gà vô bào đông hô phải đ t được độ ín

- Kiểm tra độ ẩm tồn dư:

Số lượng mẫu: 6 ống

Phương pháp kiểm tra: C n -sấy