(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào

Dịch c tính chu kỳ khoảng 3-5 n m N m 1979 tỷ lệ mắc bệnh ho gà rất cao với 134 trườnghợp mắc bệnh/100 000 d n Sự ra đời của vắc xin ho gà vào n m 1923 mang một ý ngh a lịch sử quantrọng

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Trần Ngọc Nhơn

NGHIÊN CỨU TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN

SỬ DỤNG TRONG ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU VẮC XIN HO

GÀ VÔ BÀO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2021

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Trần Ngọc Nhơn

NGHIÊN CỨU TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN

SỬ DỤNG TRONG ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU VẮC XIN HO

mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào” là côngtrình nghiên cứu của riêng cá nh n tôi và nh m nghiên cứu hông sao chép của

ai Do tôi và nh m nghiên cứu tự nghiên cứu đọc, dịch tài liệu, tổng hợp vàthực hiện Nội dung lý thuyết trong luận v n tôi c sử dụng một số tài liệu thamkhảo như đã trình bày trong phần tài liệu tham khảo Các số liệu, chương trìnhphần mềm và những kết quả trong luận v n là trung thực và chưa được công

bố trong bất kỳ một công trình nào hác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Học viện Khoa học và Côngnghệ nếu phát hiện bất cứ sự sai ph m hay sao chép trong đề tài này!

Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2021

Học viên

Trần Ngọc Nhơn

Lan Phương, người thầy đã tận t m hướng dẫn giúp đỡ tôi trong suốt quátrình hoàn thành luận v n Tôi xin ch n thành cảm ơn Viện trưởng TS DươngHữu Thái đã quan t m và t o điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập vàlàm luận v n t i viện IV C Cảm ơn các b n đồng nghiệp Khoa Mẫu chuẩn ViệnKiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (NICVB), phòng Kiểm Định(IVAC) đã hợp tác và giúp đỡ cho tôi trong quá trình nghiên cứu.

Tôi xin ch n thành cảm ơn Ban lãnh đ o Học viện Khoa học và Côngnghệ Phòng Đào t o Khoa Công nghệ Sinh học và quý thầy cô đã d y dỗ và

t o mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận v n

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình luôn động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin ch n thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2021

Học viên

Trần Ngọc Nhơn

STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Ý ngh a

01 CV Coefficient of variation Độ biến thiên

02 DĐVN Dƣợc điển Việt Nam

03 DPT Diptheria – Pertussis – B ch hầu – Ho gà –

05 FHA Filametous Haemagglutinin

06 GMP Good Manufacturing Thực hành sản xuất tốt

Practice

08 IVAC Institute of Vaccines and Viện Vắc xin và Sinh

Medical Biologicals phẩm Y tế

09 MCQG Mẫu chuẩn quốc gia

10 MCQT Mẫu chuẩn quốc tế

National Institute for Control

Viện Kiểm định Quốc

of Vaccines and Biologicals

17 VXMT Vắc xin mẫu thử

18 WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

hấp phụ 22

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn dự kiến của VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 24

Bảng 3.1 Kết quả nhận d ng háng nguyên FH và PT trong mẫu vắc xin RaP01 43

Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra cảm quan và tính chất vật lý của vắc xin RaP01 45 Bảng 3.3 Kết quả kiểm tra tính chất vật lý vắc xin ho gà vô bào RaP01 48

Bảng 3.4 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu về h a học của vắc xin RaP01 49

Bảng 3.5 Kết quả xác định đặc tính háng nguyên của vắc xin RaP01 50

Bảng 3.6 Kết quả xác định ĐVMD của vắc xin RaP01 t i IVAC 51

Bảng 3 7 Công hiệu của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ bảo quản (-40°C ± 2°C) 54

Bảng 3 8 Công hiệu của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ 5°C ± 3°C 55

Bảng 3.9 Kết quả xác định các chỉ tiêu cảm quan và tính chất vật lý theo thời gian của vắc xin RaP01 ở -40°C ± 2°C 56

Bảng 3.10 Kết quả xác định các chỉ tiêu cảm quan và tính chất vật lý theo thời gian của vắc xin RaP01 ở 5°C ± 3°C 57

Bảng 3 11 Tính ổn định của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ 25°C ± 2°C 58

Bảng 3 12 Tính ổn định của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ 37°C ± 2°C 58

Bảng 3 13 Tính ổn định của vắc xin RaP01 ở nhiệt độ 45°C ± 2°C 59

Bảng 3.14 Kết quả công hiệu RaP01 t i các thời điểm ủ mẫu ở nhiệt độ 45°C ± 2°C 60

Hình 1 2 Cấu trúc háng nguyên vi huẩn Bordetella pertussis 7

Hình 1 3 Ho gà và mức độ bao phủ tiêm vắc xin DPT3, Việt Nam, 12

Hình 1 4 Bản đồ tỷ lệ tiêm vắc xin ho gà ở trẻ n m 2019 12

Hình 1 5 Tỷ lệ tiêm chủng 3 mũi vắc xin ho gà trên toàn thế giới n m 1980 – 2019 13

Hình 1 6 Sơ đồ t m tắt quy trình sản xuất VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 23

Hình 2.1 VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 đƣợc sản xuất t i IVAC 24

Hình 2 2 Sơ đồ tổng quát của nghiên cứu 27

Hình 3 1 Kết quả kiểm tra vô trùng mẫu RaP01 42

Hình 3 2 Kết quả sau nhuộm của thí nghiệm nhận d ng háng nguyên PT và FH trong mẫu vắc xin RaP01 42

Hình 3 3 T ng trọng trung bình của chuột nhắt trong thử nghiệm an toàn chung VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 44

Hình 3 4 T ng trọng trung bình của chuột lang trong thử nghiệm an toàn chung VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 44

Hình 3 5 VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 đông hô 46

Hình 3 6 Độ ẩm tồn dƣ của các ống vắc xin RaP01 đông hô 47

Hình 3 7 Khối lƣợng hô của các ống vắc xin RaP01 đông hô 47

Hình 3 8 Số ĐVMD trung bình của 1 ống vắc xin ho gà RaP01 đông hô chuẩn độ t i IV C và NICVB 53

Hình 3 9 Đồ thị biểu diễn công hiệu của VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 ở -40°C ± 2°C 54

Hình 3 10 Đồ thị biểu diễn công hiệu của mẫu chuẩn RaP01 ở 5°C ± 3°C 55

Hình 3 11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc công hiệu của RaP01 bảo quản ở nhiệt độ 45°C ± 2°C theo các tuần 60

MỤC LỤC

LỜIC MĐO N

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1 T NG QU N TÀI LIỆU 6

1 1 T NG QU N VỀ BỆNH HO GÀ 6

1 1 1 Tác nh n g y bệnh và cơ chế bệnh sinh 6

1.1.1.1 Vi khuẩn ho gà 6

1 1 1 2 Các yếu tố độc lực và háng nguyên bảo vệ 7

1 1 1 3 Cơ chế bệnh sinh 10

1 1 2 Đường l y và dịch tễ học bệnh Ho gà 11

1.2 VẮC XIN HO GÀ 12

1.2.1 Miễn dịch bảo vệ đối với ho gà 12

1 2 2 Các lo i vắc xin ho gà 13

1.2.3 Thử nghiệm xác định công hiệu ho gà 15

1.2.4 Vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01 16

1.2.4.1 Mẫu chuẩn quốc tế vắc xin ho gà vô bào 16

1.2.4.2 Nhu cầu tính cần thiết của vắc xin mẫu chuẩn quốc gia 16

1 2 4 3 Đặc điểm vắc xin mẫu chuẩn quốc gia 17

1 2 4 4 Đánh giá chất lượng vắc xin mẫu chuẩn 18

1.2.4.5 Chuẩn định với mẫu chuẩn quốc tế 19

1 2 4 6 Đánh giá tính ổn định 19

1.2.5 Sản xuất vắc xin mẫu chuẩn ho gà vô bào dự tuyển mẫu chuẩn quốc gia 21

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU 24

2 1 ĐỐI TƯỢNG NGHI N CỨU 24

2.2 VẬT LIỆU NGHI N CỨU 25

2 2 1 Động vật thí nghiệm 25

2.2.2 Sinh phẩm – h a chất 25

2.2.3 Dụng cụ - thiết bị 26

2 3 PHƯƠNG PHÁP 27

2 3 1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 27

2 3 2 Phương pháp xác định các đặc tính ỹ thuật 28

2321 Phương pháp iểm tra vô trùng 28

2322 Phương pháp iểm tra nhận d ng háng nguyên PT FH 28

2323 Phương pháp iểm tra an toàn chung 29

2324 Phương pháp iểm tra cảm quan và tính chất vật lý 29

2325 Phương pháp iểm tra các chỉ tiêu h a học 31

2.3.2.6 Kiểm tra các đặc tính háng nguyên 35

2 3 3 Phương pháp xác định đơn vị miễn dịch trong ống vắc xin mẫu chuẩn (nối chuẩn) 38

2 3 4 Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01 39

2341 Nghiên cứu tính ổn định ở nhiệt độ bảo quản (-40°C ± 2°C) 39

2342 Nghiên cứu tính ổn định ở các dải nhiệt độ cao hơn nhiệt độ bảo quản 39

2.3.5 Dự đoán tuổi thọ sản phẩm theo nguyên lý Vant-Hoff 39

2 3 6 Phương pháp xử lý số liệu 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1 KẾT QUẢ KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG LÔ VẮC XIN RaP01 ĐÔNG

KHÔ DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA VẮC XIN HO GÀ VÔ

BÀO 41

3.1.1 Kết quả kiểm tra vô trùng 41

3.1.2 Kết quả kiểm tra nhận d ng háng nguyên aP 42

3.1.3 Kết quả kiểm tra an toàn chung 43

3.1.4 Kết quả kiểm tra cảm quan và tính chất vật lý 45

3.1.5 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu h a học 49

3.1.6 Kết quả xác định đặc tính háng nguyên của vắc xin ho gà vô bào RaP01 50

3.2 KẾT QUẢ CHUẨN ĐỊNH ĐƠN VỊ MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN HO GÀ VÔ BÀO RaP01 50

3.3 KẾT QUẢ NGHI N CỨU TÍNH N ĐỊNH CỦA VẮC XIN HO GÀ RaP01 53

3 3 1 Tính ổn định ở nhiệt độ bảo quản 53

3 3 1 1 Tính ổn định về công hiệu ở nhiệt độ -40°C ± 2°C và 5°C ± 3°C 53

3 3 1 2 Tính ổn định về cảm quan và tính chất vật lý của vắc xin RaP01 ở các nhiệt độ bảo quản 56

3 3 2 Tính ổn định ở nhiệt độ thúc đẩy nhanh và dự đoán tuổi thọ của vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01 58

3 3 2 1 Tính ổn định ở các nhiệt độ 25°C ± 2°C; 37°C ± 2°C và 45°C ± 2°C58 3.3.2.2 Dự đoán tuổi thọ của vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01 59

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

4.1 KẾT LUẬN 62

4.2 KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Khi chưa thực hiện chương trình Tiêm chủng mở rộng (TCMR), bệnh ho gà thườngxảy ra và t o thành dịch ở nhiều địa phương đặc biệt nghiêm trọng ở miền núi nơi ctrình độ kinh tế - xã hội phát triển thấp Bệnh thường diễn biến nặng, dễ tử vong do bịbội nhiễm g y biến chứng viêm phổi viêm phế

quản - phổi, nhất là ở trẻ dưới 5 tuổi và trẻ suy dinh dưỡng Dịch c tính chu

kỳ khoảng 3-5 n m N m 1979 tỷ lệ mắc bệnh ho gà rất cao với 134 trườnghợp mắc bệnh/100 000 d n

Sự ra đời của vắc xin ho gà vào n m 1923 mang một ý ngh a lịch sử quantrọng Các d ng vắc xin ho gà đang được sử dụng hiện nay là vắc xin ho gàtoàn tế bào bất ho t và vắc xin ho gà vô bào tinh chế từ các thành phần hángnguyên của vi khuẩn ho gà đều c hả n ng t o miễn dịch bảo vệ chống l i bệnhNghiên cứu sản xuất vắc xin ho gà t i Việt Nam c từ n m 1959 t i Viện Vệsinh Dịch tễ Trung ương nuôi cấy vi khuẩn ở d ng t nh và sản xuất vắc xintheo phương pháp cổ điển N m 1990 Viện Vắc xin đã sản xuất thành côngvắc xin ho gà toàn tế bào bất ho t trên d y chuyền lên men do Quỹ Nhi đồng

Liên hợp quốc (UNICEF) tài trợ Hiện nay ước tính hằng

n m cả nước sử dụng từ 5 đến 7 triệu liều vắc xin ho gà Với nhu cầu lớn vềcung ứng vắc xin ho gà hằng n m như vậy thì việc kiểm soát chất lượng vắc xin làrất cần thiết Tuy nhiên hiện nay, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) chỉ cung cấp mẫuchuẩn quốc tế (MCQT) cho chuẩn định mẫu chuẩn quốc gia

(MCQG) Do đ WHO huyến cáo các quốc gia đặc biệt các quốc gia c ngành công nghiệp sản xuất vắc xin, phải tự sản xuất MCQG để chủ động trong việc kiểm tra chất lượng vắc xin

Nhận biết tính cấp thiết về nhu cầu vắc xin mẫu chuẩn (VXMC) dùngtrong kiểm định trong huôn hổ dự án sản phẩm quốc gia vắc xin sử dụng chongười, viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (NICVB) phốihợp với các nhà sản xuất trong nước thực hiện dự án sản xuất 11 lo i

MCQG, trong đ Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) tham gia sản xuất lôVXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 từ n m 2019 và đã hoàn thành vào n m2020

Với ý ngh a như trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính ổn định của vắc xin mẫu chuẩn sử dụng trong đánh giá công hiệu vắc xin ho gà vô bào”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá chất lượng và tính ổn định của lô VXMC ho gà vô bào đông

hô RaP01

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Lô vắc xin ho gà vô bào đông hô RaP01 để dự tuyển MCQG dùng cho xác định công hiệu vắc xin ho gà vô bào

4 Nội dung nghiên cứu

- Xác định đặc tính ỹ thuật của lô VXMC ho gà vô bào đông hô

RaP01 dự tuyển MCQG

- Xác định đơn vị miễn dịch (ĐVMD) của lô VXMC ho gà vô bào đông

hô RaP01 theo MCQT

- Nghiên cứu tính ổn định và dự đoán tuổi thọ của lô VXMC ho gà vô bào đông hô RaP01

5 Ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của đề tài

Thành công của đề tài sẽ t o ra được lô mẫu chuẩn ho gà vô bào ở cấp

độ quốc gia Đ y là một mẫu chuẩn thiết yếu hông thể thiếu đối với việc kiểmđịnh và cấp phép sử dụng các lo i vắc xin ho gà vô bào Thành công này

g p phần vào thành công của dự án sản phẩm quốc gia sản xuất 11 lo i mẫuchuẩn dùng trong iểm định các vắc xin thiết yếu của chương trình TCMR

quốc gia Sự ra đời của mẫu chuẩn ho gà vô bào quốc gia giúp chủ động trongquá trình iểm định chất lượng vắc xin và tiết kiệm ngo i tệ cho đất nước Do

đ đề tài c ý ngh a hoa học và thực tiễn rất lớn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

đã đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán xác định bệnh ho gà gồm 4 yếu tố sau:

(1) cơn ho ịch phát éo dài 21 ngày hoặc hơn (2) nuôi cấy xác nhận c vi khuẩn

ho gà (3) háng thể háng háng nguyên ngưng ết hồng cầu d ng sợi

(FHA) hoặc háng thể háng độc tố ho gà (PT) trong huyết thanh t ng và (4)

c tiền sử tiếp xúc trực tiếp hoặc c sự liên hệ chặt chẽ với bệnh nh n mắc bệnh

ho gà [1]

Tác nh n g y bệnh là vi huẩn ho gà (Bordertella pertussis) Đ y là vi

khuẩn c hình thái cầu trực khuẩn hay hình bầu dục ích thước nhỏ 0,3 – 0 8

µm x 0 2 - 0 3 µm, gram m hông di động Vi khuẩn bắt màu thuốc

nhuộm tốt với xanh Methylen, Phenol Toludin hay Fusin kiềm Khi bắt màuthuốc nhuộm chung quanh và 2 cực của vi khuẩn c màu đậm hơn [2]

Vi khuẩn ho gà sống hiếu hí bắt buộc, nhiệt độ thích hợp từ 35°C –37°C, trong khoảng pH từ 7,0 – 7,2 Vi khuẩn mọc trên môi trường th ch máuđòi hỏi cả 2 yếu tố V và X Khuẩn l c nhỏ tròn bờ đều, lồi, ẩm ướt, mờ đụchoặc xanh nh t như xà cừ hoặc sáng b ng c ánh im Xung quanh huẩn l c cvòng tan máu Trên môi trường lỏng làm đục nhẹ môi trường ánh hơi sáng Vikhuẩn tương đối trơ hông lên men hầu hết các lo i đường Tính chất đề

háng yếu, bị bất ho t ở 56°C sau 30 phút Vi huẩn ém bền với tác nh n h a học

và chất sát huẩn [3]

Hình 1.1 Khuẩn l c Bordetella Pertussis trên môi trường Bordert Gengou 1.1.1.2 Các yếu tố độc lực và kháng nguyên bảo vệ

Vi khuẩn ho gà sở hữu một lo t các yếu tố độc lực, bao gồm các yếu tố bám dính và các độc tố trong đ một số là các háng nguyên c hả n ng

ích thích đáp ứng miễn dịch bảo vệ chống l i ho gà ( háng nguyên bảo vệ)

Hình 1.2 Cấu trúc háng nguyên vi huẩn Bordetella pertussis [4]

- FHA (Filamentous haemagglutinin adhesin: yếu tố ngưng ết hồng cầu

d ng sợi): FH là một protein diềm tua c trọng lượng ph n tử 220 kDa, bao phủ

bề ngoài vi huẩn FH c thể hấp phụ được trên bề mặt nhiều lo i tế bào và làmngưng ết chúng đ ng vai trò thiết yếu trong quá trình bám dính

của vi khuẩn vào tế bào biểu mô đường hô hấp Bản th n FH hông c thành

phần g y độc cho tế bào nhưng vai trò của n trong việc hình thành nên độc lựccủa vi khuẩn là rất quan trọng Kháng thể háng FH c thể g y cản trở quá trình nhiễm trùng bằng việc làm cho vi khuẩn hông bám dính được

vào tế bào vật chủ FH là một thành phần háng nguyên quan trọng thường

c trong vắc xin ho gà vô bào [4]

- FIM hay GG (Fimbriae hay gglutinogen: ngưng ết nguyên 1 2 3):Các ngưng ết nguyên là các háng nguyên bề mặt ho gà hông chịu nhiệt,liên quan đến các type huyết thanh của vi khuẩn g y bệnh và sự ngưng ếtcủa vi khuẩn Chúng c vai trò trong việc giúp vi huẩn bám vào đường hôhấp vật chủ thông qua việc bám dính các tế bào biểu mô lông và tế bào đơn nh

n Trong thực tế háng thể háng FIM t o miễn dịch bảo vệ thụ động đối vớichuột chống l i nhiễm trùng hô hấp với vi khuẩn ho gà [5]

- PRN (Pertactin hay protein màng ngoài tế bào hay protein 69 kDa):Bên c nh các FIM một háng nguyên protein màng ngoài c trọng lượng

ph n tử xấp xỉ 60 kDa cũng là một háng nguyên c ho t tính g y đáp ứng

miễn dịch Pertactin được cho là c vai trò giúp vi huẩn bám dính vào tế bàovật chủ tương tự FH và FIM [5]

- PT (Pertussis Toxin: độc tố ho gà): Đ y là một ngo i độc tố mang bản

chất protein c cấu trúc phức hợp được tiết ra trong giai đo n vi khuẩn nh n lên

m nh PT c cấu trúc ngo i độc tố điển hình theo iểu A - B bao gồm 6

chuỗi, trọng lượng ph n tử 105 kDa Tiểu phần là chuỗi S (26 kDa) và tiểuphần B là một phức hợp gồm 5 chuỗi từ S2 đến S5 theo tỷ lệ ph n tử lượng là1:2:1:1 [3] PT chịu trách nhiệm g y nên một lo t các biểu hiện bệnh lý đặctrưng của ho gà gồm: làm t ng m nh b ch cầu máu ngo i vi trong đ chủ yếu làLymphocyte t ng nh y cảm với các amin hữu cơ Histamine, ho t h a tế bào βcủa tụy làm giảm Glucose máu ích thích hay ức chế hệ thống miễn dịch thôngqua các tế bào mô lympho, PT tác động lên tế bào nuôi và c thể làm tan máuthậm chí trên in vitro t o nên sự co cụm tế bào và ngưng ết hồng cầu Kháng

thể háng PT c thể trung hòa hay bất ho t các ho t tính sinh học của PT trên invivo và in vitro Ngoài ra PT còn c hả n ng tác động đến đáp ứng miễn dịch tếbào thông qua cơ chế điều hòa miễn dịch, t o nên sự t ng sản tế bào miễn dịchlàm tế bào T tiết Interlekin IL-2 và Interferon γ (IFN γ) và làm t ng sự biểu thị

ph n tử CD28 trên bề mặt của chúng Do đ PT là thành phần

hông thể thiếu trong vắc xin ho gà vô bào [6]

- CT ( denylatecyclase: độc tố enzym): CT là một protein đơn c trọng lượng ph n tử 177 Da và thuộc nh m độc tố c cấu trúc d ng A-B giống như độc tố

Bordetella Pertussis trong tế bào vật chủ [4].

- TCT (Traheal Cytotoxin: độc tố hí quản): Các cơn ho gà đặc trưng

c thể được quy cho TCT Đ y là một Disaccharide Tetrapeptide, trọng lượng

ph n tử 921 Dalton được phát sinh từ lớp Petidoglycan ở vỏ của tế bào vi khuẩnTCT làm tổn thương lớp tế bào biểu mô của phổi và chịu trách nhiệm về bệnh lý t

i chỗ trong nhiễm trùng Bordetella Pertussis [5].

- DNT (Dermonecrotic Toxin: độc tố g y ho i tử da): DNT còn đượcgọi là độc tố g y chết hay độc tố hông bền với nhiệt (HLT: heat labit toxin), c trọnglượng ph n tử 102 Da được tìm thấy trong tất cả các loài Bordetella Độc tố thuộc

về nh m các yếu tố g y ho i tử do tác động đến sự điều hòa t ng trưởng hoặc ph nchia của vi khuẩn g y nên phản ứng viêm loét ho i tử xung quanh vùng vi huẩn x mnhập trên tế bào biểu mô hô hấp DNT là độc tố c cơ chế họat động phức t p tácđộng của n đến các phản ứng sinh lý đối với vật chủ chưa rõ [6]

- LPS (Lipopolysacchaide) hay nội độc tố (endotoxin): LPS là thành phầnchính của màng ngoài vi huẩn hiện diện ở nhiều loài vi huẩn gram m Đối

với vi khuẩn ho gà LPS chịu trách nhiệm ích thích tế bào tiết các cyto ine háccủa phản ứng viêm đặc biệt là IL-1β được cho là đ ng vai trò chính trongphản ứng toàn th n và của hệ thần kinh khi bị nhiễm trùng hay sau tiêm vắcxin [4] LPS hông c vai trò trong miễn dịch bảo vệ đối với ho gà

1.1.1.3 Cơ chế bệnh sinh

Vi khuẩn x m nhập vào cơ thể qua đường hô hấp trên sau đ các độc tốcủa vi khuẩn g y ho i tử ở biểu mô đường hô hấp hay g y tổn thương ở lớpđáy và lớp giữa của tế bào biểu mô g y viêm cấp tính đường hô hấp và íchthích sự t ng bài tiết của dịch rỉ nhầy của tế bào biểu mô hô hấp Thương tổnxảy ra chủ yếu ở phế quản và tiểu phế quản Khí quản và thanh quản c thể bịtổn thương nhưng nhẹ hơn Dịch rỉ nhầy c thể làm tắc nghẽn các tiểu phếquản g y xẹp phổi hu trú hay g y bội nhiễm ở phổi đặc biệt hay xảy ra ở trẻ sơsinh Những thương tổn t i phổi chủ yếu do các độc tố của vi khuẩn tác độngđến thần kinh phế quản làm xuất tiết ở phế quản hoặc làm giãn phế quản t mthời [7]

Ngo i độc tố do vi khuẩn tiết ra x m nhập vào máu g y nên các rối lo ntrao đổi chất của tế bào vật chủ do làm rối lo n sinh tổng hợp MP vòng và lànguyên nh n của hàng lo t những biến đổi sinh học như: t ng b ch cầu lymphoích thích tế bào β tiết insulin g y h đường huyết t ng sự thủy ph n lipid làmbiến đổi sự di trú của đ i thực bào ảnh hưởng đến hiệu lực miễn dịch,

Nội độc tố lipopolysaccharide (LPS) là một độc tố chịu nhiệt của vikhuẩn ít c ý ngh a trong sinh bệnh học của ho gà nhưng l i chịu trách nhiệm vềcác phản ứng toàn th n chung ở giai đo n đầu của bệnh Ngoài ra vi huẩn còn

c những thành phần c ho t tính sinh học hác như độc tố hông bền với nhiệt(HLT) độc tố hí quản (TCT) độc tố enzyme adenylcyclase (ACT), yếu tốngưng ết hồng cầu hình sợi (FH ) các ngưng ết nguyên bề mặt (FIM hay

GG 2 3) đều là các yếu tố độc lực giúp vi huẩn bám định vị và g y tổnthương tế bào biểu mô hô hấp và làm rối lo n các chức n ng sinh học của vật chủ.Những rối lo n hô hấp như ngưng thở, ng t thở c lẽ liên quan đến tổn

thương trung t m hô hấp ở hành tủy do độc tố g y nên Một số ý iến cho rằng viêm não do ho gà xảy ra trong một số trường hợp c vai trò của độc tố [8]

1.1.2 Đường lây và dịch tễ học bệnh Ho gà

Bệnh l y truyền qua đường hô hấp, bởi các cơn ho từ bệnh nh n và sự tiếp xúc thường xuyên của người mang mầm bệnh với các cá thể chưa c miễn dịch Trong quá trình g y bệnh, vi khuẩn bám và định vị vào phần trên của đường hô hấp nhờ các diềm tua nhanh ch ng nh n lên trên bề mặt tế bào biểu mô hô hấp hông x m nhập qua niêm m c mô hay vào máu [3]

Trong suốt thập kỷ 60 - 80 của thế kỷ trước hàng n m trên thế giới sốngười mắc ho gà hoảng 20 - 40 triệu người, 90% xảy ra ở các nước đangphát triển và số người chết hàng n m vì ho gà hoảng 200 000 đến 300.000người Tỷ lệ mắc bệnh đã giảm rõ rệt trong các thập kỷ qua chủ yếu nhờchương trình TCMR T i các nước phát triển, tỷ lệ mắc ho gà ở trẻ từ 0,2 –1% trước hi áp dụng TCMR, sau 20 n m tỷ lệ này đã giảm xuống 0,01% [8]

T i Việt Nam, trong những n m 70 của thế kỷ trước, số mắc trung bìnhhàng n m dao động từ 70 000 đến 100 000 trường hợp Sau hi đẩy m nh việcTCMR trong đ c việc tiêm phòng vắc xin DPT, từ 1987 đến nay bệnh ho gàhông còn là gánh nặng đối với các hoa l y của bệnh viện từ tuyến huyện đếntuyến trung ương Kết quả giám sát bệnh cho thấy từ n m 1979 – 1988, thời kỳtriển hai TCMR còn thấp, tỷ lệ mắc bệnh trung bình hàng n m là 65 1/100 000

d n tỷ lệ chết 0 05/1 000 000 d n Từ n m 1989 đến nay, tỷ lệ TCMR t ng caonên tỷ lệ mắc trung bình hàng n m trong thời kỳ này là 5 1/100 000 d n giảm12,8 lần (92 2%) Đồng thời tỷ lệ chết giảm 5 lần (80%) Đặc biệt từ n m 1995đến nay bệnh đã được khống chế, tỷ lệ mắc chỉ dưới 3/100 000 d n Trẻ sơsinh chiếm 80 - 90% số người mắc bệnh [9]

Hình 1.3 Ho gà và mức độ bao phủ tiêm vắc xin DPT3, Việt Nam, 1981-2005

[10]

Hình 1.4 Bản đồ tỷ lệ tiêm vắc xin ho gà ở trẻ n m 2019 [11]

1.2 VẮC XIN HO GÀ

1.2.1 Miễn dịch bảo vệ đối với ho gà

Miễn dịch bảo vệ thu đƣợc sau khi khỏi bệnh hoặc sau tiêm vắc xin ho

gà Kháng thể đƣợc coi là một phần quan trọng trong miễn dịch bảo vệ chống

l i Bordetella Pertussis Trong đáp ứng miễn dịch dịch thể, sự opsonin h a và

cố định bổ thể đ ng vai trò quan trọng ngoài cơ chế trung hòa độc tố và ức chế sựbám của vi khuẩn bằng háng thể IgG Tuy nhiên nhiễm trùng

Bordetella Pertussis đã đƣợc chứng minh c 1 pha nhiễm trùng nội bào vì vậy

đáp ứng miễn dịch tế bào đặc biệt cơ chế qua trung gian INFγ rất quan trọng

để lo i trừ vi khuẩn nội bào ng n chặn sự lan tràn của vi khuẩn ở đường hôhấp trên trong nhiễm trùng lần đầu ( hi chưa c háng thể) Những tế bào của hệthống miễn dịch tự nhiên đ ng vai trò trình diện háng nguyên cho tế bào T ở h

ch lympho t i chỗ và qua đ hởi động quá trình đáp ứng miễn dịch Ở người,khi mắc bệnh hay sau tiêm vắc xin đã t o ra một quần thể tế bào T đặc hiệu

đối với các háng nguyên của Bordetella Pertussis và người ta đã chứng minh

đ y là những quần thể dưới nh m tế bào TCD4 chịu sự điều hòa của nh m cytoine nghiêng về phía Th1 đ i diện cho đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào[4]

1.2.2 Các loại vắc xin ho gà

N m 1923 sự ra đời của vắc xin phòng bệnh ho gà mang một ý ngh a lịch sử quan trọng Hiện nay c hai d ng vắc xin ho gà đang được sử dụng đ là vắc xin ho gà toàn tế bào và vắc xin ho gà vô bào hai d ng vắc xin này đều

c hả n ng t o miễn dịch bảo vệ chống l i bệnh

Hình 1.5 Tỷ lệ tiêm chủng 3 mũi vắc xin ho gà trên toàn thế giới n m 1980 –

2019 [11]

Vắc xin ho gà toàn tế bào (wP) chứa toàn bộ tế bào vi huẩn đã được bất

ho t Tất cả các yếu tố háng nguyên và độc lực như PT CT LPS, FHA,

PRN và FIM đều c thể là thành phần của vắc xin wP Vắc xin wP được sản xuất bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường tổng hợp lỏng được tiêu

chuẩn h a Sau đ vi huẩn bị bất ho t bằng phương pháp h a học hoặc bằng nhiệtđiều chỉnh đến một đậm độ nhất định, hầu hết được hấp phụ vào muối nhôm

và thêm vào chất bảo quản Quy trình sản xuất và thành phần các chủng giống

c thể hác nhau giữa các nhà sản xuất Vắc xin ho gà toàn tế bào được đánh giá

là một trong những vắc xin l u đời nhất và c hiệu quả bền vững nhất Tuynhiên vắc xin ho gà toàn tế bào vẫn c những phản ứng phụ như sốt cao nônmửa chán n, trong đ c những biến chứng hiếm gặp liên quan đến não

Sự công nhận về vai trò của PT FH PRN và GG/FIM trong cơ chế sinhbệnh và miễn dịch chống l i bệnh ho gà cùng với những lo ng i về tính an toàncủa vắc xin ho gà toàn tế bào (wP) đã thúc đẩy sự phát triển của vắc xin ho gà

vô bào (aP) N m 1981 Nhật chính thức giới thiệu vắc xin ho gà vô bào thaythế hoàn toàn việc sử dụng vắc xin ho gà toàn tế bào, làm giảm đáng ể cácphản ứng phụ so với vắc xin ho gà toàn tế bào Để sản xuất vắc xin ho gà vôbào, hai thành phần háng nguyên bảo vệ quan trọng là PT và FH được tinhchế từ canh cấy ho gà (chủng Tohama hoặc chủng 509) bằng kỹ thuật siêu ly t

m ph n vùng hay sắc ý hay phối hợp cả 2 kỹ thuật

Một số háng nguyên thứ yếu hơn như FIM PRN cũng c thể được bổsung trong công thức của vắc xin ho gà vô bào Do đ mỗi một lo i vắc xin

ho gà vô bào đều c những đặc tính rất hác nhau tùy thuộc vào chủng sảnxuất môi trường nuôi cấy tác nh n bất ho t, kỹ thuật tinh chế, tỷ lệ phối trộngiữa các háng nguyên ho gà đơn Tuy nhiên giống như tất cả các vắc xinhác dù được sản xuất bởi công nghệ nào thì tất cả các vắc xin aP đều phải

đ t tiêu chuẩn về vô huẩn an toàn công hiệu và độ tinh s ch đáp ứng tiêu

chuẩn của WHO cho lo i vắc xin này

WHO đã chính thức ban hành các v n bản hướng dẫn và iểm định vắcxin ho gà vô bào và cho phép vắc xin này tồn t i song song với vắc xin ho gàtoàn tế bào Cả hai lo i vắc xin này đang được sử dụng rộng rãi để phòng ngừa

c hiệu quả bệnh ho gà và được dùng phối hợp với vắc xin giải độc tố uốn ván

b ch hầu, Hib, viêm gan B [12]

Kiểm định vắc xin, trong đ c vắc xin ho gà là một l nh vực phức t p vìphải thực hiện trên sản phẩm ở nhiều công đo n hác nhau của quy trình sảnxuất, từ kiểm định nguyên liệu đầu vào bán thành phẩm trung gian bán thànhphẩm cuối cùng và thành phẩm Các tiêu chí iểm định phương pháp ph n tích

và tiêu chuẩn đánh giá đều phải tu n thủ theo hướng dẫn của WHO và cơquan kiểm định quốc gia

Các tiêu chí iểm định chất lượng vắc xin ho gà thành phẩm, bao gồm:Nhận d ng công hiệu, an toàn đặc hiệu an toàn chung vô trùng các tiêu chí h a

lý (pH cảm quan, hàm lượng Thiomersal hàm lượng nhôm ) Trong đ

thử nghiệm công hiệu bằng phương pháp thử thách trên não chuột cần phảithực hiện song song giữa vắc xin mẫu thử (VXMT) và VXMC

1.2.3 Thử nghiệm xác định công hiệu ho gà

N m 1940 Kendric và cộng sự đã x y dựng phương pháp xác định cônghiệu của vắc xin dựa vào việc đánh giá bảo vệ trên chuột nhắt hi chúng đượcthử thách bằng đường tiêm não với chủng ho gà độc lực N m 1950-1955,Hiệp hội Y học Hoàng gia nh chứng minh mối tương quan của công hiệu vắcxin xác định trên chuột với hiệu lực bảo vệ trên trẻ em được tiêm vắc xin Từ

đ đến nay phương pháp xác định công hiệu ho gà do Kendric phát minh (còngọi là phương pháp thử thách) vẫn là chuẩn vàng trong iểm định xuất xưởngvắc xin ho gà để công nhận một vắc xin ho gà c hiệu lực hay

hông [13]

Thử nghiệm xác định công hiệu của vắc xin ho gà nhất thiết phải tiếnhành song song với VXMC nên còn được gọi là công hiệu tương quan(relative potency) Nguyên lý của phương pháp là so sánh liều bảo vệ 50% củaVXMT so với mẫu chuẩn VXMT và mẫu chuẩn được miễn dịch cho các nh

m chuột hác nhau sau một thời gian nhất định (thường 2-3 tuần) chuột đượcthử thách bằng đường tiêm não với chủng ho gà độc lực Công hiệu của vắcxin được tính toán bằng phần mềm WHO program dựa trên độ pha loãng và

số lượng chuột sống s t của nh m được tiêm VXMC và VXMT sau khi thửthách

Theo quy định của WHO công hiệu vắc xin ho gà dù ở d ng toàn tế bàohay vô bào nhưng nếu sử dụng miễn dịch cho trẻ em dưới 5 tuổi phải đ t tiêuchuẩn lớn hơn hoặc bằng 4 IU trong 1 liều đơn giới h n dưới khoảng tin cậy(P = 0,95) của công hiệu ≥ 2 IU/liều tiêm Đối với các d ng vắc xin ho gà vôbào dùng để tiêm nhắc l i cho trẻ lớn tiêu chuẩn công hiệu c thể thấp hơnnhưng phải được chứng minh là c hiệu lực bảo vệ trên l m sàng.

1.2.4 Vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển ho gà vô bào RaP01

1.2.4.1 Mẫu chuẩn quốc tế vắc xin ho gà vô bào

Tiêu chuẩn công hiệu của vắc xin ho gà biểu thị bằng IU vì vậy WHOđưa ra một chuẩn chung nhất cho kiểm tra công hiệu vắc xin ho gà vô bào,MCQT vắc xin ho gà vô bào lần thứ nhất do Viện Biken Kanonji, Nhật Bảnsản xuất Các ống đông hô ban đầu được giữ bởi Viện Huyết thanh Statens(Statens serum institute) Copenhagen Đan M ch và sau đ được chuyển giaocho NIBSC WHO phối hợp với các thành viên từ Viện các bệnh truyềnnhiễm Quốc gia (Nhật Bản), Viện Kiểm định Quốc gia Dược phẩm và Sinhphẩm (Trung Quốc) và Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (Hàn Quốc)thực hiện nghiên cứu liên phòng thí nghiệm (PTN) đã xác định được đơn vịcủa mẫu chuẩn này là 34 IU/ml Dựa trên ết quả nghiên cứu n m 2008 WHO

đã thiết lập JNIH-3 làm MCQT lần thứ nhất cho vắc xin ho gà vô bào với đơn

vị 34 IU/ống Mẫu chuẩn này được bảo quản t i NIBSC ở nhiệt độ - 20°C vàcho đến nay mẫu chuẩn vẫn còn hiệu lực sử dụng nhưng với số lượng rất h nchế [14]

1.2.4.2 Nhu cầu, tính cần thiết của vắc xin mẫu chuẩn quốc gia

Vắc xin ho gà vô bào dưới d ng các vắc xin 3 4 5 và 6 thành phần nhưAdacel, Boostrix, Tetraxim, Pentaxim, Hexaxim, Infarix Hexa với hiệu quảbảo vệ cao và tính an toàn của n đối với mọi đối tượng đã trở nên phổ biếntrên toàn thế giới Ở Việt Nam hàng n m một lượng lớn các lo i vắc xin ho gà

vô bào dưới d ng các vắc xin phối hợp đã được nhập khẩu để phục vụ nhucầu tiêm chủng cho trẻ em và phụ nữ mang thai Ngoài ra các dự án nghiên

cứu phát triển vắc xin ho gà vô bào cũng như vắc xin phối hợp c thành phần

ho gà vô bào đã được phê duyệt hiện đang triển khai bởi các nhà sản xuấttrong nước là IV C và V BIOTECH Nhu cầu kiểm định vắc xin ho gà vô bào

là rất lớn và theo đ số lượng các ống VXMC ho gà vô bào cũng t ng tươngứng Theo thống ê của NICVB, số lượng VXMC ho gà vô bào cần thiết đểkiểm định khoảng 200 ống/lọ (34 IU/lọ) mỗi n m Trong hi đ mỗi

n m WHO/NIBSC chỉ cung cấp cho mỗi quốc gia 3 lọ MCQT ho gà vô bào vì

sự h n chế về số lượng các MCQT ho gà vô bào và chính sách ph n phối MCQTcủa WHO

1.2.4.3 Đặc điểm vắc xin mẫu chuẩn quốc gia

Vắc xin MCQG được sản xuất dựa trên quy trình sản xuất vắc xinthương m i và ít nhiều hác so với sản xuất vắc xin thương m i Một số

VXMC c cùng d ng và c quy trình sản xuất tương tự vắc xin thương m inhư: viêm gan B sởi rota Tuy nhiên một số VXMC ở d ng hác so vớivắc xin thương m i ví dụ vắc xin uốn ván b ch hầu ho gà thương m i ở

d ng lỏng nhưng VXMC b ch hầu ho gà uốn ván được sản xuất ở d ngđông hô để c tính ổn định cao hơn sử dụng được trong nhiều n m [5], [14]

Mục tiêu của vắc xin thương m i để phòng bệnh cho người còn mụctiêu của VXMC để thực hiện thử nghiệm Một số các đặc điểm của mẫu chuẩnnhư sau:

- Mẫu chuẩn c đặc tính tương tự/gần nhất c thể với mẫu thử

- Mẫu chuẩn hông cần tinh khiết nhưng phải xác định được giá trị

công hiệu

- Không cần giống mẫu thử về công thức hoặc dung môi hồi chỉnh

- Phải giống mẫu thử về đặc điểm liều đáp ứng

- C thể sản xuất ở d ng đông hô/đông b ng/d ng lỏng

- Đơn vị đ ng ống phải đủ dùng cho một lần làm thử nghiệm công hiệu (trừ một số trường hợp đặc biệt)

- Số lượng sản xuất đủ dùng trong ít nhất 5 n m

- Đồng nhất về thể tích đ ng ống

- Tính an toàn của VXMC đa số trường hợp hông bắt buộc phải đánhgiá do hông sử dụng cho người mà chỉ cần thiết áp dụng trong một số mẫuchuẩn cụ thể khi sử dụng trên động vật thí nghiệm [15].

1.2.4.4 Đánh giá chất lượng vắc xin mẫu chuẩn

Mẫu chuẩn cần ổn định về công hiệu để dùng trong thời gian dài đồngnhất về thể tích đ ng ống đơn vị đ ng ống phải đủ dùng cho một lần làm thửnghiệm công hiệu (trừ một số trường hợp đặc biệt) Mẫu chuẩn c thể hác vớivắc xin thương m i về độ tinh khiết công thức hoặc dung môi hồi chỉnh,

liều/d ng đ ng ống Vì vậy đánh giá chất lượng VXMC c những tiêu chíchung với vắc xin thương m i như: cảm quan độ đồng đều của khốilượng/thể tích đ ng ống pH độ ẩm tồn dư (vắc xin đông hô) vô trùng cônghiệu Khác với vắc xin thương m i, VXMC hông cần đánh giá tính an toànchất g y sốt, nội độc tố do hông phải dùng trên người

Kiểm tra cảm quan là iểm tra toàn bộ những đặc tính của mẫu mà ta

c thể quan sát được bằng mắt thường, bao gồm kiểm tra nhãn mác sự nguyênvẹn của bao bì tr ng thái sản phẩm màu sắc bánh đông hô cũng như độ trongđục và thời gian hoàn nguyên

Độ lệch khối lượng được thực hiện để xác định mức độ đồng đều giữacác lọ VXMC trong cùng một lô Độ lệch khối lượng giữa các ống càng nhỏchứng tỏ độ đồng đều của các ống cao

Độ ẩm tồn dư một thông số quan trọng gắn với mức độ ổn định củamẫu chuẩn hi được bảo quản thời gian dài

Vô trùng: VXMC cũng như VXMT yêu cầu hông được nhiễm vikhuẩn, nấm, mycoplasma trong quá trình sản xuất

Công hiệu là tiêu chí quan trọng nhất để đánh giá chất lượng VXMC.Thử nghiệm công hiệu ban đầu nhằm xác định vắc xin c đ t yêu cầu MCQGđặt ra hay hông

Thử nghiệm đánh giá tính ổn định nhằm đánh giá mẫu chuẩn đ

hợp với mục đích sử dụng l u dài hay hông

c phù

1.2.4.5 Chuẩn định với mẫu chuẩn quốc tế

MCQG (chuẩn thứ cấp) sử dụng bởi các nhà sản xuất hác nhau và các

cơ quan iểm định quốc gia cần được chuẩn định với MCQT c hiệu lực

thông qua hợp tác liên PTN Các đơn vị tham gia trong hợp tác liên PTN sẽđược xác định trong từng trường hợp cụ thể Các PTN sẽ c n nhắc lựa chọnphương pháp thí nghiệm Nếu kết quả thử nghiệm c độ biến thiên lớn thì sốlượng PTN tham gia phải đủ lớn để c đủ số liệu cho ph n tích thống ê Tuynhiên trong nhiều trường hợp, số PTN tham dự chỉ c hai PTN gồm nhà sảnxuất và cơ quan iểm định quốc gia Trong những trường hợp này số lần lặp

l i thử nghiệm sẽ nhiều hơn để đảm bảo độ chính xác của công hiệu mẫu chuẩn [17], [18]

Sau hi c đủ số lần thử nghiệm cần thiết, tiến hành tính giá trị trung bình

và giới h n tin cậy xác định số ĐVMD của MCQG

Do đặc thù của Việt Nam, mỗi vắc xin chỉ c một nhà sản xuất vì vậy chỉ

c 2 PTN tham gia trong phần chuẩn định MCQG vắc xin ho gà vô bào vớiMCQT (NICVB và IV C)

1.2.4.6 Đánh giá tính ổn định

Tính ổn định của mẫu chuẩn được đánh giá qua tỷ lệ giảm công hiệuhoặc ho t tính ở các nhiệt độ bảo quản hác nhau [5], [15], [16], [17], [18]

Các nghiên cứu/đánh giá tính ổn định nhiệt gồm hai lo i:

condition stability): Xác định tính ổn định của công hiệu theo thời gian khi mẫu chuẩnđược bảo quản ở nhiệt độ khuyến cáo Nghiên cứu sự ổn định dài h n c ưu điểm đưa

ra h n sử dụng chính xác Tuy nhiên nhược điểm của nghiên cứu

này là mất thời gian hông c ngay ở giai đo n đầu của nghiên cứu

- Nghiên cứu tính ổn định ngắn h n (accelerated stability testing):

Nghiên cứu tính ổn định ở các dải nhiệt độ cao hơn nhiệt độ bảo quản khuyếncáo còn gọi là nghiên cứu thúc đẩy nhiệt Nghiên cứu này được thiết kế nhằm

t ng nhanh tốc độ ph n hủy vật lý hoặc h a học của các thành phần trong vắcxin để xác định tỷ lệ thay đổi các đặc tính của mẫu theo thời gian ở các nhiệt

độ cao hơn nhiệt độ bảo quản thông thường Kết quả nghiên cứu tính ổn địnhngắn h n c thể sử dụng để dự đoán h n dùng của VXMC

 Tính ổn định phải được xác định vì ba mục đích sau:

- Ước lượng thời gian sử dụng trong điều kiện lưu trữ nhất định

- Xác định điều kiện vận chuyển thích hợp

- Xác định thời gian giữ được công hiệu sau khi hồi chỉnh mẫu chuẩn

 H n dùng của mẫu chuẩn được dự đoán dựa vào:

- Kinh nghiệm sử dụng mẫu chuẩn

- Nghiên cứu tính ổn định dài h n ở các hoảng thời gian phù hợp

- Theo dõi giá trị công hiệu của mẫu chuẩn

- Kiểm tra công hiệu mẫu chuẩn thường kỳ bằng chuẩn quốc tế

Nếu mẫu chuẩn dự tuyển c nguồn gốc từ một mẻ vắc xin thương m i thì

hồ sơ nghiên tính ổn định của vắc xin thương m i đ sẽ là một tài liệu thamkhảo tính ổn định của mẫu chuẩn Trong trường hợp sử dụng mẫu chuẩn dàihơn h n sử dụng thông thường của vắc xin thương m i thì tính phù hợp và ổnđịnh c thể được đánh giá bằng MCQT hoặc soát xét l i dữ liệu trong quá trình

sử dụng nếu hông c MCQT

Cần phải làm nghiên cứu thúc đẩy nhiệt trên các mẫu bảo quản ở nhiềuđiều kiện hác nhau để dự đoán h n dùng Phương pháp thúc đẩy nhiệt đượcdùng để ước lượng h n dùng ở nhiệt độ lưu trữ và những nhiệt độ c thể gặpphải trong quá trình vận chuyển Một số mẫu chuẩn đông hô c thể ổn định đếnmức phương pháp thúc đẩy nhiệt hông dùng để xác định dự đoán h n dùngđược Do đ phương pháp đánh giá tính ổn định phải được lựa chọn tuỳ điềukiện thực tế Một số vắc xin đông hô như sởi, MR, MMR, khi vận

chuyển ph n phối được khuyến cáo bảo quản ở 2-8°C nhưng hi lưu trữ ở cácnhiệt độ thấp hơn như -20°C -70°C c thể éo dài thêm h n dùng và thích hợp

để cất giữ chuẩn thứ cấp nếu chất lượng sản phẩm được đảm bảo

Đối với vắc xin thương m i d ng đông hô cần phải xác định tính ổnđịnh sau hi đã hoàn nguyên Tuy nhiên VXMC dùng một lần ngay sau khihoàn nguyên nên hông nghiên cứu tính ổn định này

Mẫu chuẩn được cấp phép chính thức sử dụng c n cứ vào dữ liệu đã c bao gồm: Kết quả chuẩn định với MCQT nghiên cứu tính ổn định nhiệt

Kháng nguyên ho gà vô bào tinh chế c nguồn gốc từ canh cấy chủng ho gà

BP 509, tinh chế bằng công nghệ siêu ly t m ph n đo n Đ y là phương phápđồng tinh chế thu các ph n đo n chứa 2 háng nguyên chính là PT và FHA Sảnphẩm sau tinh chế được bất ho t, thẩm tích và lọc vô huẩn để t o háng nguyên

ho gà aP tinh chế làm nguyên liệu để phối trộn vắc xin ho gà

vô bào ở d ng hấp phụ với tá chất nhôm

Giai đo n sản xuất vắc xin ho gà vô bào hấp phụ sử dụng tá chất GelHydroxyt nhôm của hãng Croda làm tá chất Công thức thành phần pha chế

1800 ml vắc xin ho gà vô bào hấp phụ được chỉ ra ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Công thức pha chế 1800 ml VXMC dự tuyển ho gà

vô bào RaP01 hấp phụ

≤ -750 mm Hg (≤ -100 Pa)

Lô vắc xin dự tuyển MCQG ho gà vô bào đã đƣợc đông hô thành côngvới số lƣợng 1500 ống và mang mã số RaP01 trong n m 2020 Các qui trìnhtiếp theo gồm đánh giá chất lƣợng, nối chuẩn với MCQT để công nhậnMCQG và nghiên cứu tính ổn định là nội dung thực hiện trong luận v n nàySau đ y là sơ đồ tổng quát của quy trình sản xuất vắc xin dự tuyển MCQG ho

gà vô bào

Hình 1.6 Sơ đồ t m tắt quy trình sản xuất VXMC dự tuyển ho gà vô bào

RaP01

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHI N CỨU

Lô vắc xin ho gà vô bào đông hô RaP01 (ngày sản xuất: 24/03/2000) được sử dụng để thiết lập mẫu chuẩn công hiệu ho gà vô bào

Hình 2.1 VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01 được sản xuất t i IVAC

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn dự kiến của VXMC dự tuyển ho gà vô bào RaP01

STT

Chỉ tiêu

Phương pháp Tiêu chuẩn dự kiến chất lượng

Dạng khô: Bánh đông hô màu

trắng bong hông teo

Sau hoàn nguyên: T o thành hỗn

Quan sát bằng

mắt thường l màu trắng đục Khi để lắng t o

thành 2 lớp: Phần trên là dung dịchtrong hông màu hoặc màu vàng

nh t, phần lắng cặn màu trắng đục

Không c sự phát triển của vi

5 Vô huẩn Cấy trực tiếp khuẩn và nấm trên môi trường TSB

và TGF

n toàn Thử trên chuột Chuột sống, khỏe m nh sau hết thời

2.2 VẬT LIỆU NGHI N CỨU

2.2.1 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng (Swiss) trưởng thành hỏe m nh, cả 2 giới, trọnglượng trung bình 11-14g được cung cấp bởi Tr i Ch n nuôi Suối Dầu, ViệnVắc xin và Sinh phẩm Y tế

Chuột lang trọng lượng 250g – 350g, chuột khỏe m nh hông bệnh tật,được cung cấp bởi Tr i Ch n nuôi Suối Dầu, Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

- Tủ l nh m -40°C, MDF – U334 – PE, Panasonic.

- Máy lắc tube, MS1, IKA

- Bể ổn nhiệt Julabo Đức

- Máy ly t m Rotina 380 Đức

- Kính hiển vi phản pha, IM-3, Nhật

- C n điện tử, BP221S, Sartorius

- Máy huấy từ, REO BC, IKA

- Pipet nhựa vô huẩn 10 ml, Corning

- Pipetman lo i 100, 200, 1000 l, BioHit

- Micropipet 8-12 ênh BioHit

- Bơm tiêm nhựa vô huẩn lo i 1 ml, 3 ml (Vinahankook)

- Tuýp nhựa vô trùng lo i 50 ml

- Chai thủy tinh nắp xanh 50, 100, 250 ml, Schott Duran

27

2.3 PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm

Xác định đặc tính kỹ thuật của lô RaP01

Nghiên cứu tính ổn định

2.3.2 Phương pháp xác định các đặc tính kỹ thuật

2.3.2.1 Phương pháp kiểm tra vô trùng

Môi trường dùng cho thử nghiệm:

- Môi trường Thioglycolate: Dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu hí và nấm.

- Môi trường TSB (Tryptone Soya Broth): Dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu hí và ị hí

Mỗi lo t môi trường phải kiểm tra chất lượng về tính vô trùng tính

- Hoàn nguyên 10 ống mẫu chuẩn ho gà đông hô trong nước cất pha tiêm vô huẩn

- Cấy hỗn dịch mẫu thử đã hoàn nguyên ho gà của mỗi ống vào 1 ốngmôi trường Thioglycolate và 1 ống môi trường TSB Lượng mẫu cấy vào môitrường là 0 5%

- Sau khi cấy mẫu thử xong ủ các ống môi trường Thioglycolate ở nhiệt độ

30°C – 35°C và các ống môi trường TSB ở nhiệt độ 20°C – 25°C trong 14 ngày

Đọc kết quả:

- Mẫu chuẩn được coi là vô trùng hi hông c ống môi trường nào bịnhiễm (c vi sinh vật phát triển)

2.3.2.2 Phương pháp kiểm tra nhận dạng kháng nguyên PT, FHA

VXMC ho gà vô bào đông hô được hồi chỉnh với nước cất sau đ giảihấp phụ Al(OH)3 bằng Natri Citrate Nhận d ng háng nguyên PT FH dựatrên sự kết hợp đặc hiệu với háng thể tương ứng trong gel th ch theo nguyên

lý của phản ứng miễn dịch khuếch tán vòng ép (Ouchterlony) Kháng nguyên

PT FH từ các giếng được khuếch tán ra xung quanh sẽ phản ứng với háng thểđặc hiệu t o thành đường kết tủa trên gel th ch:

- T i chứng dương: Xuất hiện đường tủa của háng thể PT, FHA với

háng nguyên PT FH chuẩn

- T i chứng m (PBS): Không xuất hiện đường tủa

Vắc xin được coi là đ t tiêu chuẩn khi t i vị trí

hiện đường tủa màu xanh của háng thể PT, FHA với

c trong vắc xin

iểm tra dung dịch xuấtháng nguyên PT FH

2.3.2.3 Phương pháp kiểm tra an toàn chung

Phương pháp: Thử nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt và chuộtlang Mỗi chuột nhắt được tiêm ổ bụng với liều tiêm hông quá 1 liều đơn chongười và mỗi chuột lang được tiêm ổ bụng với liều tiêm hông quá 5 liều đơncho người Thể tích tiêm hông quá 1 ml cho một chuột nhắt và hông quá 5 mlcho một chuột lang Chuột phải được quan sát ỹ 2 giờ đầu sau hi tiêm vàtrong thời gian ít nhất 7 ngày thử nghiệm C n trọng lượng chuột vào ngày thứ

- Kiểm tra chân không : phát ánh sáng xanh hi iểm tra trên máy Tesla Coil

(Nhật) Yêu cầu: ống vắc xin ho gà vô bào đông hô phải đ t được độ ín

- Kiểm tra độ ẩm tồn dư:

Số lượng mẫu: 6 ống

Phương pháp kiểm tra: C n -sấy