KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE CÔNG NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE CÔNG NGHIỆP Xác định hoạt tính enzyme pectinase công nghiệp. Xác định được pH, nhiệt độ hoạt động tối ưu cho chế phẩm enzyme pectinase. Hiện nay, hệ thống enzyme pectinase được chia thành 2 nhóm chính: Hydrolase và transeliminase với đặc điểm chung nhất là làm giảm độ nhớt của dung dịch pectin và làm giảm phân tử lượng của các sản phẩm tạo thành. Cũng như các loại enzyme khác, enzyme pectinase cũng nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt độ và pH môi trường. Nhiệt độ, pH của môi trường ở mỗi mức độ khác nhau sẽ có mức độ ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzyme khác nhau. Và mỗi loại enzyme sẽ có ngưỡng nhiệt độ, pH tối ưu khác nhau mà tại đó enzyme hoạt động cao nhất. Ngoài ra, còn nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hoạt động của các chế phẩm enzyme như các ion kim loại, ánh sáng, sóng siêu âm, phương thức và thời gian bảo quản enzyme.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ ENZYME

ĐỀ TÀI KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE CÔNG NGHIỆP

GVHD: Nguyễn Thị Nam Phương

Sinh viên thực hiện: Nhóm 3

LTH MSSV: 2008190334

THỰC HÀNH CHỦ ĐỘNG: KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM

ENZYME PECTINASE CÔNG NGHIỆP

1 Mục đích

 Xác định hoạt tính enzyme pectinase công nghiệp

 Xác định được pH, nhiệt độ hoạt động tối ưu cho chế phẩm enzyme pectinase

2 Cơ sở lý thuyết

- Pectinase là enzyme xúc tác sự thủy phân pectin, sản phẩm tạo thành của quá trình này là acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol đây là nhóm ezyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau protease và amylase

- Pectinase có tác dụng làm tăng hiệu suất chất chiết, làm trong và lọc dịch quả rất dễ dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm nên pectinase thường đươc ứng dụng trong sản xuất rượu vang, nước trái cây và nước uống không có cồn, nước trái cây cô đặc, mứt nhừ, mứt đông, nước giải khát, sản xuất cà phê và cà phê hòa tan,…Không những vậy, các chế phẩm pectinase còn được ứng dụng trong việc trích ly các hợp chất dược liệu, hợp chất tạo màu, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi,…

- Hiện nay, hệ thống enzyme pectinase được chia thành 2 nhóm chính: Hydrolase và transeliminase với đặc điểm chung nhất là làm giảm độ nhớt của dung dịch pectin và làm giảm phân tử lượng của các sản phẩm tạo thành

- Cũng như các loại enzyme khác, enzyme pectinase cũng nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt độ và pH môi trường Nhiệt độ, pH của môi trường ở mỗi mức độ khác nhau sẽ có mức độ ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzyme khác nhau Và mỗi loại enzyme sẽ có ngưỡng nhiệt độ, pH tối ưu khác nhau mà tại đó enzyme hoạt động cao nhất

- Ngoài ra, còn nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hoạt động của các chế phẩm enzyme như các ion kim loại, ánh sáng, sóng siêu âm, phương thức và thời gian bảo quản enzyme

3 Hóa chất - Dụng cụ - Thiết bị

3.1 Hóa chất

1 Pectinase công nghiệp Bột 100g

2 Pectin công nghiệp Bột 100g

3 3,5 - acid dinitrosalicylic (DNS) Rắn 5g

4 D-galacturonic acid 1% Rắn 2g

7 Potasium sodium tartrate

(KNaC4H4O6·4H2O)

10 Đệm acid citric - Na2HPO4 PH = 3, 4, 5 300 mL

14 Đệm Phosphate pH = 6, 7, 8 300 mL

17 Sodium acetate (CH3COONa) Rắn 15g

18 Acetic acid đặc (CH3COOH) Lỏng 3 mL

3.2 Dụng cụ

1 Bình tia

2 Cốc thủy tinh 100, 250, 500, 1000 mL

3 Bình tam giác 250 mL

5 Giá ống nghiệm Giá inox

9 Bình định mức 50, 100, 250, 500 mL

10 Xoong nhôm

11 Đũa thủy tinh

13 Phễu thủy tinh �60

14 Micropipette

15 Đầu típ

16 Quả bóp cao su

17 Đũa thủy tinh

3.3 Thiết bị

STT TÊN THIẾT BỊ Quy cách

1 Bếp điện

2 Bể ổn nhiệt

4 Cân kỹ thuật 2 số lẻ

5 Máy khuấy từ

6 Máy lắc

7 Máy vortex

8 Máy đo quang phổ Vùng UV - VIS

3.4 Cách pha hóa chất

- Pha dung dịch đệm acid citric - Na2HPO4 (Đệm citrate):

 Dung dịch acid citric 0.1M: Hòa tan 10.504g acid citric (C6H8O7) bằng nước cất

→ Định mức đến 500mL → Dung dịch A

 Dung dịch Na2HPO4 0.2M: Hòa tan 71.7g Na2HPO4.12H2O bằng nước cất → Định mức đến 500mL → Dung dịch B

 Dung dịch đệm acid citric - Na2HPO4 (Đệm citrate) có pH khác nhau phụ thuộc vào số mL dung dịch A và B với tổng thể tích 100 mL

Acid citric 0.1M (Dung dịch A)

Na 2 HPO 4 0.2M (Dung dịch B)

pH

79.45 mL 20.55 mL 3.0 61.45 mL 38.55 mL 4.0 48.50 mL 51.50 mL 5.0

- Pectine 1%: Cân 1g peptin cho vào cốc rồi hòa tan bằng nước ấm → Định mức đến 100mL

- Pectinase 2%: Cân 2g pectinase cho vào cốc rồi hòa tan trong 200mL dung dịch đệm citrate pH=5

- Thuốc thử DNS 1%:

 Cân 5g DNS cho vào cốc rồi hòa tan bằng nước cất ở 50oC → Định mức đến 200mL → Dung dịch A

 Cân 8g NaOH cho vào cốc rồi hòa tan bằng nước cất → Định mức đến 50mL → Dung dịch B

 Cân 150g muối Potasium sodium tartrate (KNaC4H4O6·4H2O) cho vào cốc rồi hòa tan bằng nước cất → Định mức đến 150mL→ Dung dịch C

 Cho lần lượt dung dịch B và C vào dung dịch A → Bổ sung nước cất cho đủ 500

mL rồi bảo quản dung dịch trong chai thủy tinh sẫm màu → Chuẩn lại DNS 1% bằng cách thêm 3 giọt phenolphtalein → Nhỏ từ từ dung dịch HCl 0.1N cho tới khi mất màu hồng của phenolphtalein (Nếu dùng hết 5 - 6 mL HCl 0.1N là được)

- Pha dung dịch đệm acetate pH = 5.5: Cân 13.6g sodium acetate hòa tan trong 25 mL nước cất ở 50oC → Cho từ từ 2.5 mL acetic acid đặc → Định mức bằng nước cất đến

50 mL

- D-galacturonic acid 1%: Cân 1g D-galacturonic acid hòa tan bằng nước cất và định mức đến 100mL

- Dung dịch đệm phosphate (pH 6, 7, 8):

 Dung dịch NaH2PO4 0.2M: Cân 27.8g NaH2PO4 cho vào cốc rồi hòa tan bằng nước cất → Định mức đến 500mL → Dung dịch a

 Dung dịch Na2HPO4 0.2M: Cân 71.7g Na2HPO4.12H2Ocho vào cốc rồi hòa tan bằng nước cất → Định mức đến 500mL → Dung dịch b

 Dung dịch đệm phosphat có pH khác nhau phụ thuộc vào số mL dung dịch a và

số mL dung dịch b với tổng thể tích là 200ml

NaH 2 PO 4 0.2M

(Dung dịch a)

Na 2 HPO 4 0.2M (Dung dịch b)

4 Nội dung thực hành

4.1 Xác định hoạt tính enzyme pectinase bằng phương pháp so màu

 Phương pháp so màu: Dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định

 Nguyên tắc: Enzyme Pectinase + Pectin → Acid galacturonic → Thêm thuốc thử DNS (dinitrosalicylic acid) → Đo mật độ quang ở bước sóng 575nm Dựa vào đồ thị đường chuẩn glucose với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

 Hoạt tính enzyme pectinase được đo bởi lượng đường khử được cắt ra từ pectin bằng phương pháp dinitrosalicylic acid (DNS) Một đơn vị hoạt độ enzyme pectinase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1mol acid D- galacturonic từ pectin trong một phút ở 37oC, pH=5.5

 Cách tiến hành:

 Xây dựng đường chuẩn D-galacturonic acid ở 5 nồng độ khác nhau (0, 1, 2, 3, 4, 5) bằng cách pha dd D-galacturonic acid 1% với nước cất theo tỷ lệ tương ứng Sau đó, thêm lần lượt vào mỗi ống 3ml thuốc thử DNS:

D-galacturonic acid 1% mL 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nước cất mL 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Nồng độ D-galacturonic acid mg/mL 0 1 2 3 4 5 Thuốc thử DNS 1% mL 3mL

Lắc đều và để yên 20 phút

Đo OD tại λ=575nm 0 0.127 0.326 0.534 0.731 0.938

- Dùng phần mềm Microsoft Excel để vẽ đường chuẩn với trục tung y là giá trị đo OD

ở bước sóng 575nm, trục hoành x là nồng độ D-galacturonic acid, hệ số tương quan

R2, đồ thị có dạng đường thẳng y= ax + b

 Xác định hoạt tính enzyme pectinase: Lấy 0,5 ml enzymepectinase 2% + 0.5 ml pectin 1% → Thêm 0.5ml đệm acetate 0.1M → Để yên ở 37oC trong 60 phút → Thêm 3ml thuốc thử DNS 1% → Đun sôi trong 15 phút (để thuốc thử hiện màu)

→ Đo OD ở bước sóng 575 nm → Xác định hoạt độ enzyme pectinase

 Một đơn vị hoạt tính enzyme pectinase được đo bởi 1µmol galacturonic acid giải phóng trong 1 phút trên 1mL

4.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme pectinase

- Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị 7 ống nghiệm và tiến hành như sau:

4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme pectinase

- Tiến hành thí nghiệm:

 Chuẩn bị 7 ống nghiệm với các dung dịch đệm pH tương ứng từ 3 - 8 đã được

chuẩn bị ở 6.3.4.

 Tiến hành như sau:

vị

Các ống nghiệm

Dung dịch đệm với các khoảng

pH khác nhau

mL 1.0

Để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng

Bịt đầu ống nghiệm bằng giấy nhôm rồi đun cách thủy trong 15 phút

Để nguội ở nhiệt độ phòng

Đo OD tại λ=575nm 0.241 0.226 0.246 0.279 0.244 0.257

5 Kết quả

5.1 Xác định hoạt độ enzyme pectinase bằng phương pháp so màu

 Đồ thị đường chuẩn D-galcturonic:

vị

Các ống nghiệm

Pectin 1% mL 1.0

Dung dịch đệm acetate mL 1.0

Để yên ở 37oC trong 10 phút

Pectinase 2% 1.0

Giữ ở nhiệt độ 25oC 30oC 37oC 40oC 45oC 50oC 55oC

Để yên trong 15 phút

Bịt đầu ống nghiệm bằng giấy nhôm, lắc đều rồi đun ở 100oC trong 15 phút

Để nguội ở nhiệt độ phòng

Đo OD tại λ=575nm 0.401 0.277 0.205 0.185 0.153 0.117 0.401

 Đường chuẩn D-galcturonic có dạng: y = 0.2027x - 0.0769 với R2 = 0.9999

 Từ đường chuẩn D-galacturonic, ta có:

 X là nồng độ acid D-galcturonic (mg/ml), X = 4,829 (mg/ml)

 Y là giá trị OD đo được tại λ=575nm, Y = 0,902nm

 Hoạt độ enzyme pectinase:

HđPe = (UI/mL) Trong đó:

 X là lượng acid D-galcturonic được suy ra từ đường chuẩn (mg)

 V là tổng thể tích hỗn hợp enzyme phản ứng (mL)

 v là thể tích dịch lọc đem phân tích (mL)

 K là độ pha loãng của mẫu

 t là thời gian phản ứng (phút)

 là hệ số chuyển đổi đơn vị

 HđPe là hoạt độ enzyme pectinase (UI/mL)

- Ta có:

 Lượng acid D-galcturonic (X) = 4,829 (mg/ml)

 Tổng thể tích hỗn hợp enzyme phản ứng (V) = Thể tích dịch lọc đem phân tích (v) = 1.5mL

 Mẫu được pha loãng 3 lần trước khi đo OD nên độ pha loãng của mẫu là 3

 Thời gian phản ứng là 60 phút nên t=60.

 Hoạt độ enzyme pectinase:

HđPe = (UI/mL)

= = 1,245 (UI/mL)

5.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme pectinase

 Đường chuẩn D-galcturonic có dạng: y = 0.2027x - 0.0769 với R2 = 0.9999

 Hoạt độ enzyme pectinase:

HđPe = (UI/mL)

 Kết quả đo OD ở các nhiệt độ khảo sát:

OD 0.401 0.277 0.205 0.185 0.153 0.117 Nồng độ acid

D-galcturonic

1.599 0.987 0.632 0.533 0.375 0.198

Hoạt độ

enzyme 0.549 0.339 0.217 0.183 0.129 0.068

 Đồ thị ảnh hưởng nhiệt độ:

 Nhận xét:

- Hoạt tính enzyme mạnh nhất ở 30°C và nhiệt độ càng tăng thì hoạt tính enzyme càng giảm Vậy hoạt tính enzyme tối ưu ở 30°C (0.549 UI/ml)

- Có thể thấy, đa số enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70°C và phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 30-40°C

5.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme pectinase

 Đường chuẩn D-galcturonic có dạng: y = 0.2027x - 0.0769 với R2 = 0.9999

 Hoạt độ enzyme pectinase:

HđPe = (UI/mL)

 Kết quả đo OD ở các nhiệt độ khảo sát:

OD 0.241 0.226 0.246 0.279 0.244 0.257 Nồng độ acid

D-galcturonic

1.568 1.494 1.593 1.765 1.583 1.647

Hoạt độ

enzyme 2.694 2.567 2.737 3.033 2.720 2.830

 Đồ thị ảnh hưởng pH :

 Nhận xét: Hoạt tính enzyme đạt giá trị lớn nhất ở pH 6 (3.033 UI/ml) và hoạt tính enzyme thấp nhất khi ở pH 4 (2.567 UI/ml) Vậy pH tối ưu cho enzyme pectinase hoạt động là pH 6

6 Kết luận

 Hoạt tính enzyme pectinase phụ thuộc vào ảnh hưởng của nhiệt độ và pH:

 Pectinase hoạt động tối ưu trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa (30°C) Mặc dù, nhiệt

độ càng cao thì tốc độ phản ứng xúc tác hóa học càng lớn nhưng enzyme sẽ không bền đối với tác dụng nhiệt và do đó sẽ bị mất hoạt tính ở nhiệt độ cao

→ Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạn xác định mà ở đó phân tử enzyme vẫn còn bền chưa bị biến tính

 pH tác dụng vào trạng thái ion của phân tử enzyme (nhất là trung tâm hoạt động của enzyme), cơ chất và độ bền vững của phân tử enzyme do ảnh hưởng của sự kết hợp giữa phần protein (enzyme) và phần phụ không phải protein (coenzyme)

pH quá cao hay quá thấp cũng đều có thể làm ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme, làm biến tính enzyme và ảnh hưởng đến điện tích của phân tử enzyme

và cơ chất Mỗi enzyme sẽ có một giới hạn pH nhất định mà tại đó enzyme hoạt động tối ưu Pectinase hoạt động tối ưu trong điều kiện pH=6

 Cần xác định nhiệt độ cũng như pH tối ưu cho một enzyme hoạt động để có thể ứng dụng enzyme trong sản xuất một cách hiệu quả và mang lại giá trị kinh tế cao nhất

có thể

7 Tài liệu tham khảo

[7.1] Lê Thanh Mai và cộng sự (2009) Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men

[7.2] Hiền, đ T., & trang, h P P (2019) Bước đầu nghiên cứu tạo enzyme pectinase dạng bột từ aspergillus niger và khảo sát một số đặc tính của chế

phẩm Tạp chí khoa học đại học mở thành phố hồ chí minh-kỹ thuật và công

nghệ, 14(1), 27-38.

[7.3] Đỗ Thị Hiền (2021) Giáo trình “Kiểm nghiệm các chế phẩm enzyme”.

Trường đại học Công nghiệp Thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh