Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn từ rong biển có khả năng sinh enzyme chuyển hóa alginate từ rong nâu việt nam

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Nguyễn Xuân Viễn NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN TỪ RONG BI

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Xuân Viễn

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG

VI KHUẨN TỪ RONG BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME

CHUYỂN HÓA ALGINATE TỪ RONG NÂU

VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2021

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Xuân Viễn

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG

VI KHUẨN TỪ RONG BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME

CHUYỂN HÓA ALGINATE TỪ RONG NÂU

Hướng dẫn 1: TS Cao Thị Thúy Hằng

Hướng dẫn 2: PGS.TS Trần Thị Thanh Vân

Hà Nội - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới

sự hướng dẫn của TS Cao Thị Thúy Hằng và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân

Các số liệu nêu trong luận văn là kết quả làm việc của tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang

Nha Trang, ngày 14 tháng 12 năm 2021

Tác giả luận văn

Nguyễn Xuân Viễn

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Cao Thị Thúy Hằng và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân, những người đã tận tình hướng dẫn khoa học, giúp đỡ tôi và định hướng nghiên cứu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Và tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh, chị phòng Hóa phân tích

và Triển khai công nghệ, phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu

và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã giúp tôi hoàn thành tốt phần thực nghiệm của mình và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Phòng Đào tạo, Khoa Công nghệ sinh học và Quý Thầy Cô giáo đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn cũng như hoàn thành các thủ tục cần thiết

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang tạo nhiều điều kiện thuận lợi, hỗ trợ hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Nha Trang, ngày 14 tháng 12 năm 2021

Tác giả luận văn

Nguyễn Xuân Viễn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AOS Alginate oligosaccharide

CPC Cetyl pyridinium clorua

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

S mcc A Alginate chiết xuất từ rong Sargassum mcclurei

T o A Alginate chiết xất từ rong Turbinaria ornata

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng acid alginic (% Rong khô tuyệt đối) ở vùng biển

Khánh Hòa 11

Bảng 1.2 Nguồn phân lập một số vi khuẩn biển sinh alginate lyase 22

Bảng 1.3 Đặc tính xúc tác của một số alginate lyase từ vi khuẩn biển 24

Bảng 3.1 Kết quả thí nghiệm phân lập các chủng vi khuẩn biển 43

Bảng 3.2 Hoạt tính alginate lyase của chủng vi khuẩn biển phân lập từ các mẫu rong nâu thu thập tại vùng biển Khánh Hòa 52

Bảng 3.3 Trình tự tương đồng của các chủng vi khuẩn biển 56

Bảng 3.4 Kết quả sơ bộ thu nhận alginate lyase 61

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Nguồn gốc alginate 8

Hình 1.2 Cấu trúc của β-D-mannuronic acid (M), α-L-guluronic acid (G) của phân tử alginate 9

Hình 1.3 Cấu trúc của các block và liên kết (1- 4) glycoside giữa các uronic của phân tử alginate 10

Hình 2.1 Các mẫu rong thu được ở vùng biển Khánh Hòa 30

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát của đề tài 33

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn biển từ rong biển 35

Hình 2.4 Đường chuẩn albumin 38

Hình 3.1 Hình ảnh các khuẩn lạc phân lập từ mẫu rong S oligocystum mọc trên đĩa môi trường MBA 41

Hình 3.2 Đĩa môi trường MBA sau khi nhuộm bởi thuốc nhuộm Gram’s iodine 41

Hình 3.3 Số lượng chủng vi khuẩn biển phân lập được từ các nguồn rong nâu 42

Hình 3.4.Thống kê các nhóm kích thước khuẩn lạc của chủng vi khuẩn biển được phân lập từ các mẫu rong nâu thu tại vùng biển Khánh Hòa 48

Hình 3.5 Thống kê các nhóm màu sắc khuẩn lạc của chủng vi khuẩn được phân lập theo tỷ lệ % 49

Hình 3.6 Thống kê về tỷ lệ độ đục, độ cao khuẩn lạc của chủng vi khuẩn biển được phân lập 50

Hình 3.7 Thống kê về tỷ lệ các dạng bề mặt khuẩn lạc chủng vi khuẩn biển được phân lập 50

Hình 3.8 Hoạt tính alginate lyase của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên đĩa thạch MBA trong quá trình nhuộm (A) và sau khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Gram’s iodine (B) 52

Hình 3.9 Số lượng và tỷ lệ các chủng vi khuẩn sinh hoạt tính alginate lyase phân lập được từ các mẫu rong ở vùng biển Khánh Hòa 54

Hình 3.10 Cây phát sinh loài dựa vào trình tự đoạn gen 16S rRNA của

các chủng vi khuẩn biển 58

Hình 3.11 Hoạt tính dịch chiết nội bào và ngoại bào của chủng vi khuẩn B velezensis R8BF10 trên môi trường đĩa thạch alginate chiết từ rong S mcclurei, đối chứng âm là môi trường MB không chứa vi khuẩn, đối chứng dương là alginate lyase ngoại bào của chủng B velezensis AlgSm1 và alginate lyase của Sigma 60

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của BalyA 62

Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của BalyA 63

Hình 3.14.Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của BalyA 64

Hình 3.15.Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính của BalyA 64

Hình 3.16 Kết quả điện di C-PAGE của alginate chiết từ rong S mcclurei, T ornata và phản ứng giữa alginate và alginate lyase sau 24h phản ứng 65

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 TỔNG QUAN VỀ ALGINATE 8

1.1.1 Giới thiệu chung alginate 8

1.1.1.1 Nguồn gốc và cấu trúc của alginate 8

1.1.1.2 Đặc điểm về alginate của rong nâu Việt Nam 11

1.1.1.3 Hoạt tính sinh học của alginate và alginate KLPT thấp 12

1.1.1.4 Các ứng dụng của alginate và alginate KLPT thấp 13

1.1.2 Các phương pháp điều chế alginate KLPT thấp 15

1.1.2.1 Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp hóa học 15

1.1.2.2 Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp vật lý 15

1.1.2.3 Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp enzyme 16

1.2 TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE 17

1.2.1 Định nghĩa về alginate lyase 17

1.2.2 Phân loại alginate lyase 17

1.2.3 Nguồn thu nhận alginate lyase 18

1.2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính alginate lyase 19

1.2.4.1 Phương pháp đĩa thạch 19

1.2.4.2 Phương pháp đo độ đục 20

1.2.4.3 phương pháp đo độ nhớt 20

1.2.3.4 Phương pháp đường khử 21

1.2.3.5 Phương pháp đo độ hấp thụ bước sóng 21

1.3 TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE TỪ VI KHUẨN BIỂN 22

1.3.1 Nguồn phân lập vi khuẩn biển sinh alginate lyase 22

1.3.2 Đặc tính xúc tác của một số alginate lyase từ vi khuẩn biển 23

1.3.3 Tình hình nghiên cứu alginate lyase từ vi khuẩn biển ở Việt Nam 28 CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 30

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 30

2.2.1 Vật liệu thí nghiệm 30

2.2.1.1 Nguồn cơ chất 30

2.2.1.2 Nguồn phân lập vi khuẩn biển 30

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 31

2.2.3 Môi trường nuôi cấy 31

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.3.1 Xử lý mẫu 33

2.3.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn biển từ rong biển 34

2.3.3 Phương pháp sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh alginate lyase 35

2.3.4 Phương pháp định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn 36

2.3.5 Phương pháp xác định khả năng bẻ mạch alginate của enzyme

thu được từ chủng vi khuẩn tuyển chọn trên cơ chất alginate 36

2.3.5.1 Phương pháp lên men vi khuẩn biển để thu nhận alginate lyase 36 2.3.5.2 Phương pháp thu nhận alginate lyase từ chủng vi khuẩn tuyển

chọn 37

2.3.5.3 Phương pháp xác định đặc tính xúc tác của enzyme 38

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN 41

3.2 KẾT QUẢ SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN THEO ĐỊNH HƯỚNG SINH ALGINATE LYASE 51

3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN TUYỂN CHỌN 55

3.3.1 So sánh trình tự 16S rDNA của chủng vi khuẩn biển với các

chủng trên ngân hàng gen (NCBI) 55

3.3.2 Xây dựng cây phát sinh loài 58

3.4 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA ALGINATE LYASE TỪ CHỦNG VI KHUẨN BIỂN TUYỂN CHỌN 60

3.4.1 Kết quả chiết xuất sơ bộ alginate lyase từ chủng vi khuẩn biển

B velezensis R8BF10 60

3.4.2 Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của

BalyA 61

3.4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của BalyA 62

3.4.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của BalyA 63

3.4.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl đến hoạt tính của enzyme 64

3.4.6 Kết quả xác định khả năng phân cắt alginate của enzyme thu

nhận được 65

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

4.1 KẾT LUẬN 66

4.2 KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Sắc ký đồ, bảng số liệu và các hinh ảnh thực nghiệm nghiên cứu

Phụ lục 2 Trình tự 16S rDNA của các chủng vi khuẩn biển tuyển chọn Phụ lục 3 Các dãy trình tự gen so sánh độ tương đồng 16S rDNA của

03 chủng vi khuẩn biển phân lập được bằng công cụ Blast tương ứng với các chủng vi khuẩn trên ngân hàng Genbank NCBI

MỞ ĐẦU

Alginate là một anion polysaccharide, phân bố rộng rãi trong thành tế

bào của rong nâu và một số loài vi khuẩn, bao gồm cả Pseudomonas

aeruginosa và Azotobacter vinelandii [1] Đây là polysaccharide dị trùng hợp

bao gồm hai axit uronic: α-L-guluronic (G) và β-D-mannuronic (M) sắp xếp với nhau thành các khối β-D-mannuronate (poly M), α-L-guluronate G (poly G) và heteropolymer (polyMG), các uronic acid này được liên kết với nhau thông qua liên kết 1,4-glycosidic [1], [2] Alginate đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm do các đặc tính vật lý độc đáo của nó là tạo thành gel Trong khi đó, rong nâu được xem là nguồn nguyên liệu chính để điều chế và chiết xuất alginate Ở rong nâu hàm lượng alginate chiếm tỷ lệ lên đến 40 % và có khối lượng phân

tử (KLPT) lớn Ở dạng muối alginate bán trên thị trường có KLPT từ 30.000 400.000 Da, độ nhớt cao nên nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu điều chế alginate KLPT thấp với mục đích tăng khả năng ứng dụng trong lĩnh vực

-y dược cũng như trong việc nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng[2], [3] Alginate KLPT thấp (alginate oligosaccharide) được điều chế bằng các phương pháp hóa học, vật lý hoặc phương pháp sinh học Trong đó, việc sử dụng các enzyme cắt mạch alginate được xem là “phương pháp xanh”

do hạn chế sử dụng hóa chất, sản phẩm alginate KLPT thấp không có độc tính sản phẩm tạo ra được kiểm soát bởi đặc tính xúc tác của enzyme

Alginate lyase là enzyme có khả năng xúc tác cắt mạch alginate bằng

sự khử liên kết glucoside để tạo ra các oligo alginate Vi khuẩn biển là nguồn chính để thu nhận enzyme vì có nhiều ưu điểm vượt trội về chất lượng cũng như khả năng sản xuất alginate lyase [4] Một số chủng vi khuẩn có thể kể

đến: gram dương là Bacillus circulans và gram âm là Azotobacter vinelandii,

Klebsiella aerogens, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa đã được nghiên cứu cho sản

xuất alginate lyase [5] Vi khuẩn là sinh vật có khả năng sinh sản nhanh, phát triển mạnh, thích ứng tốt với điều kiện công nghiệp Môi trường dinh dưỡng

để nuôi vi khuẩn đơn giản, dễ kiếm Do đó, enzyme thu được từ việc nuôi vi khuẩn sẽ nhanh hơn, giá thành rẻ hơn

Các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh alginate lyase chủ yếu được phân lập từ bộ phận tiêu hóa của động vật biển như cầu gai, san hô mềm, những loài động vật hai mảnh vỏ, nước biển và hải miên [6] Sở dĩ được tìm kiếm ở những vật chủ như vậy vì đây là những loài sử dụng rong tảo làm thức

ăn, hệ vi sinh vật đường ruột những loài này luôn có một hoặc một hệ vi khuẩn sinh alginate lyase để hỗ trợ chuyển hóa thức ăn Một nguồn phân lập

vi khuẩn biển sinh alginate lyase khác chính là vi khuẩn cộng sinh với rong nâu bởi vì alginate là thành phần chủ yếu trong cấu tạo thành tế bào rong nâu

Đã có những công bố về các chủng vi khuẩn biển cộng sinh với rong nâu có

khả năng sinh alginate lyase như Pseudoalteromonas elyakoii IAM 14594 phân lập từ rong Laminaria japonica [7], Pseudoalteromonas sp SM0524

phân lập tảo bẹ trong giai đoạn phân hủy [8] Do đó, nguồn rong nâu là nguồn tiềm năng để tìm kiếm vi khuẩn biển sinh alginate lyase

Ở Việt Nam, rong nâu với khả năng có thể tự tái tạo trong tự nhiên và sản lượng có thể khai thác lên tới 10.000 tấn khô/năm nên rong nâu là nguồn lợi rong biển tự nhiên lớn nhất [9] Các nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy trong các loài rong nâu ở vùng biển Việt Nam, hàm lượng alginate lên đến 35% và có cấu trúc phức tạp theo 3 dạng cấu trúc block gồm: block M, block

G và block MG sắp xếp khác nhau tùy vào từng loài rong [9] Trong khi đó, alginate lyase thương mại giá thành cao và xúc tác không hiệu quả lên alginate của rong nâu Việt Nam Vì vậy, khả năng ứng dụng enzyme thương mại vào việc điều chế alginate KLPT thấp ở Việt Nam là khó khăn nên việc nghiên cứu enzyme chuyển hóa alginate từ rong nâu Việt Nam vẫn là cần thiết

Do vậy, đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn từ rong biển có khả năng sinh enzyme chuyển hóa alginate từ rong nâu Việt Nam” được tiến hành nhằm tìm ra được chủng vi

khuẩn biển tiềm năng có khả năng sinh alginate lyase có hoạt tính trên cơ chất alginate chiết xuất từ rong nâu vùng biển Việt Nam

Mục tiêu của đề tài:

Tìm và định danh được chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ rong biển, có khả năng sinh alginate lyase

Xác định khả năng bẻ ngắn mạch alginate của enzyme thu nhận được trên cơ chất alginate chiết xuất từ rong nâu Việt Nam

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

- Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh alginate lyase được phân lập từ rong nâu thu nhận ở vùng biển Khánh Hòa

- Phạm vi nghiên cứu: Khả năng sinh alginate lyase trên cơ chất alginate chiết xuất từ rong nâu Việt Nam như các loài rong thuộc chi

Sargassum và Turbinaria

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:

Tìm kiếm các chủng vi khuẩn biển sinh alginate lyase có hoạt tính cao nhằm điều chế alginate KLPT thấp là cách tiếp cận mới có ý nghĩa khoa học cao bên cạnh các phương pháp hóa lý điều chế alginate KLPT thấp

Alginate lyase từ vi khuẩn biển cắt mạch alginate theo đặc hiệu cơ chất,

từ đó định hướng tạo ra các sản phẩm alginate KLPT thấp có hoạt tính sinh học ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, y tế

Các nội dung nghiên cứu chính:

Để thực hiện được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm:

- Phân lập các chủng vi khuẩn từ các loài rong nâu thu thập được ở vùng biển Khánh Hòa

- Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ các loài rong nâu thu thập được ở vùng biển Khánh Hòa theo định hướng sinh alginate lyase

- Định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn

- Xác định khả năng bẻ ngắn mạch alginate của enzyme thu nhận từ chủng vi khuẩn tuyển chọn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ ALGINATE

1.1.1 Giới thiệu chung alginate

1.1.1.1 Nguồn gốc và cấu trúc của alginate

Alginate là thuật ngữ chung để nói đến alginic acid, muối và dẫn xuất của nó Trong tự nhiên alginate tồn tại chủ yếu ở rong nâu, là thành phần cấu trúc của thành tế bào rong nâu (phaeophyceae), ngoài ra còn có ở vi khuẩn như Pseodomonas, Azotobacter,… (Hình 1.1) Ở vi khuẩn, alginate là polyme duy trì sự ổn định của màng sinh học và thành tế bào nhằm chống lại sự bất lợi của môi trường như độc tính của kim loại nặng Sản xuất và sử dụng alginate trên thị trường chủ yếu được chiết xuất từ rong nâu vì sinh khối alginate chiếm tỷ lệ cao lên đến 40% trọng lượng khô của rong nâu và thường tồn tại dạng muối natri alginate, KLPT alginate từ 30.000 Da đến 400.000 Da Năm 1883, Stanford đã khám phá ra alginate từ tảo bẹ, ông đã phát triển quy trình chiết xuất kiềm từ vật liệu có độ nhớt gọi là “Algin” [10]

Hình 1.1 Nguồn gốc alginate

Alginate được tạo thành bởi các monosaccharide β-D-mannuronic acid (M) và α-L-guluronic acid (G) thông qua liên kết thành từ liên kết (1→4)

Alginate

Macrocystis Sagassum Laminaria Azotobacter Pseodomonas

glycoside (hình 1.2) Trong phân tử alginate tỷ lệ, trình tự và sự phân bố của hai monomer thay đổi rất rộng tùy theo nguồn gốc của alginate Sự sắp xếp ngẫu nhiên của 2 monomer M và G trong mạch alginate theo 3 dạng cấu trúc block: Block homopolymeric guluronic (Poly-G) gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau; Block homopolymeric mannuronic (Poly-M) gồm các gốc acid mannuronic nối tiếp nhau; Block heteropolymeric ngẫu nhiên (Poly-MG) hai gốc acid guluronic và acid mannuronic luân phiên nối tiếp nhau (hình 1.3) [11, [12], [13], [14], [15] Độ dài trung bình của các khối, trình tự của chúng trong mạch phân tử cũng thay đổi tùy theo nguồn gốc của alginate Do cấu trúc của các gốc monomer G và M khác nhau nên hình dạng của các khối cũng khác nhau: Poly M có cấu tạo ít gấp khúc và tạo nên sự mềm mại của mạch phân tử, trong khi poly G gấp khúc mạnh hơn và có độ bền chặt hơn Chính sự khác nhau của mạch cấu trúc này nên hai loại uronic thể hiện các tính chất hóa học, sinh học khác nhau [16]

Hình 1.2 Cấu trúc các β-D-mannuronic acid (M), α-L-guluronic acid

(G) của phân tử alginate [16]

Hình 1.3 Cấu trúc của các block và liên kết (1→4) glycoside giữa các

uronic của phân tử alginate [16]

Hiện tại alginate được sử dụng trên thị trường có độ đồng nhất về mặt

lý hóa thấp, điều này làm ảnh hưởng đến chất lượng và hạn chế khả năng ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực của sự sống Tùy vào cấu trúc, thành phần của alginate mà chúng có những đặc tính lý hóa khác nhau như KLPT, độ nhớt, độ hòa tan Alginate có nguồn gốc khác nhau thì tỷ lệ block G và M khác nhau Khi alginate có chứa nhiều block G hơn, KLPT cao hơn thì khả năng tạo gel mạnh hơn và giòn hơn [19]

Acid alginic không tan trong nước và dung môi hữu cơ, trong khi muối đơn chất của alginate và ester alginate tan trong nước tạo thành các dung dịch nhớt, ổn định [20] Độ tan của alginate còn phụ thuộc vào pH (pH giảm thì alginate sẽ kết tủa), cường độ ion và hàm lượng của ion tạo gel [20], [21] Alginate có cấu trúc khối MG hòa tan ở pH thấp hơn so với các poly M hoặc poly G Ngoài KLPT, khả năng tạo dung dịch nhớt của alginate có thể thay đổi tùy theo nồng độ, pH dung môi, nhiệt độ và sự hiện diện của các ion hóa trị II Chính vì vậy mà mỗi loại alginate được lựa chọn để ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau

1.1.1.2 Đặc điểm về alginate của rong nâu Việt Nam

Ở Việt Nam, rong nâu là nhóm rong có kích thước lớn (macroalgae),

chủ yếu gồm 4 chi Sargassum, Turbinaria, Dictyota, Padina sản lượng tự

nhiên cao nhất so với các nhóm rong biển khác Alginate chiết xuất từ rong

nâu ở nước ta chủ yếu tập trung vào chi Sargassum, Turbinaria do hàm lượng

alginate và độ nhớt cao đạt yêu cầu về chất lượng alginate thương mại

Bảng 1.1 Hàm lượng acid alginic (% Rong khô tuyệt đối) ở vùng biển

thấp nhất ở loài S congkinhii (26,6%) [22] Chính vì vậy hai loài rong T

ornata và S mcclurei là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất alginate

(bảng 1.1) Như vậy, alginate chiếm tỷ lệ cao trong rong nâu, là nguồn nguyên liệu dồi dào có thể khai thác, sản xuất ở quy mô công nghiệp

1.1.1.3 Hoạt tính sinh học của alginate và alginate KLPT thấp

Alginate còn là đối tượng được các nhà khoa học quan tâm chú ý do hoạt tính sinh học đa dạng, tiềm năng lớn ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm Các nghiên cứu về alginate hoặc dạng acid của nó cho thấy alginate có tính kháng khuẩn [23] Các nhà nghiên cứu đang tìm kiếm các loại kháng sinh mới để chống lại tình trạng kháng đa thuốc ở vi khuẩn đang gia tăng trên toàn thế giới Sử dụng alginate oligosaccharide G (oligo G) khối lượng 2.600 Da

được điều chế từ loài Laminaria hyperborea alginate làm tăng hiệu quả của

kháng sinh thông thường (lên đến 512 lần) đối với 21 chủng vi khuẩn đa

kháng thuốc khác nhau bao gồm Pseudomonas, Burkholderia sp và

Acinetobacter spp [24] Khi có 10% Oligo G thì màng tế bào vi khuẩn bị tổn

thương, sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc bị suy yếu Như vậy oligo G

đã liên kết với bề mặt vi khuẩn điều chỉnh điện tích, gây ra sự kết tụ của vi khuẩn và ức chế khả năng vận động Alginate còn có khả năng kháng u [25], alginate ức chế sự vận chuyển và hấp thụ glucose qua thành ruột vào máu nên

là chất tiềm năng để ứng dụng làm thuốc trị tiểu đường [26] Nhờ vào muối natri alginate tăng cường khả năng bài tiết cholesterol vào phân và ngăn chặn

sự gia tăng nồng độ glucose hoặc insulin gây ra bởi khả năng dung nạp glucose [27]

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu về alginate và alginate KLPT thấp đều có hoạt tính chống oxy hóa Các tính chất này tăng khi alginate bị cắt ngắn thành oligomer [28], [29]

Alginate còn có khả năng tẩy xạ Khi cơ thể bị nhiễm chất phóng xạ strontium bằng con đường tiêu hóa, có thể dùng natri alginate để đưa chất phóng xạ này ra ngoài cơ thể Alginate tạo kết tủa bền với strontium do đó nó ngăn được sự hấp thụ strontium vào trong máu và phức hợp này sẽ được đào thải ra ngoài [30]

Ngoài các hoạt tính sinh học tác dụng có lợi cho sức khỏe đã nêu ở trên, Alginate oligosaccharide (AOS) cũng ảnh hưởng đến các khía cạnh khác của hoạt động tế bào bao gồm tác dụng điều hòa tăng trưởng tế bào, tác dụng bảo vệ thần kinh, ức chế sự tích tụ chất nhầy trong ruột,…[31]

Hoạt tính sinh học của alginate có mối quan hệ chặt chẽ với cấu trúc của nó, các hoạt tính sinh học tăng khi alginate có độ tinh sạch cao và KLPT thấp [32] Do đó, ngoài việc nghiên cứu chiết tách, tinh sạch alginate để đảm bảo cấu trúc tự nhiên, độ sạch cao, thì việc nghiên cứu bẻ ngắn mạch alginate

để thu nhận các AOS là hết sức cần thiết để tạo nên những sản phẩm có hoạt tính sinh học có tiềm năng ứng dụng trong y dược

1.1.1.4 Các ứng dụng của alginate và alginate KLPT thấp

Alginate không độc, không gây miễn dịch, có khả năng thích ứng và phân hủy sinh học cao nên được xem là vật liệu mới phục vụ cho các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, ngành dệt,

Trong nông nghiệp alginate có khả năng kích thích tăng trưởng ở cây trồng, giúp hạt nảy mầm sớm, nâng cao sức đề kháng của cây trồng, tăng năng suất cây trồng, kéo dài thời gian bảo quản và sử dụng, thúc đẩy sự hình thành rễ ở cây lúa [23] Trong ngành chăn nuôi lợn, bổ sung AOS giúp cải thiện hiệu quả protein thô và khả năng tiêu hóa chất béo do đó kích thích tăng trưởng lợn [31] Năm 2015 Wenhui Zhu và cộng sự chứng minh polymannuronate có khả năng chống oxy hóa, tình trạng miễn dịch ở chăn nuôi gà thịt [32]

Năm 2000, Iwasaki và cộng sự đã dùng alginate lyase điều chế Alginate KLPT thấp thành oligomer có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng sự phát triển của rau diếp (Lettuce) như: Trisaccharide, tetrasaccharide, pentasaccharide, hexasacharide đều kích thích sinh trưởng rễ cây rau diếp [33] Lê Quang Luân và cộng sự [34] dùng chiếu xạ điều chế alginate KLPT thấp, các oligosaccharide được điều chế có KLPT từ 1 kDa đến 3 kDa, ở nồng

độ 20 ppm là tác nhân kích thích sinh trưởng và phát triển của thực vật

Alginate được ứng dụng rộng rãi và phổ biến trong ngành công nghiệp Trong ngành công nghệ dệt, alginate dùng làm hồ vải cho sợi bền và chịu được cọ sát, giảm bớt tỷ lệ sợi đứt và nâng cao hiệu suất dệt Ngoài ra còn làm vải không thấm nước, in vải, alginate tạo cho thuốc nhuộm có độ dính cao đáng kể, in hoa không nhòe và rõ ràng, công nghiệp giấy và sơn [35]

Trong công nghệ thực phẩm alginate KLPT lớn được sử dụng chủ yếu như là chất phụ gia do tính không độc hại, khả năng tạo gel và tạo độ nhớt Natri alginate được sử dụng làm chất ổn định kem ly, làm cho kem mịn có mùi thơm, chịu nóng tốt chống tan chảy, ngoài ra còn được dùng trong quá trình làm các loại nước sốt mayonnaise [36]

Dựa vào đặc tính hóa sinh của alginate mà trong công nghệ dược phẩm, alginate thường được dùng làm chất nhũ hóa trong các dạng thuốc có cấu trúc nhũ tương và hỗn dịch, dùng trong tá dược, bao của viên nén hay tham gia vào thành phần của vỏ nang [2] Trong những năm gần đây, các ngành công nghiệp y khoa và công nghiệp dược đã không ngừng nghiên cứu các loại polymer sinh học nói chung và alginate nói riêng Điều thú vị là alginate không những được ứng dụng ở KLPT cao trong dược liệu, mà còn thể hiện rõ rệt khi chúng có KLPT thấp Các nhà khoa học đã tìm thấy các sản phẩm thủy phân alginate có KLPT từ 5 kDa đến 20 kDa có hoạt tính dược lý [37] Alginate còn được sử dụng để làm băng y tế, bông y tế, đồ bảo hộ y tế và các sản phẩm dệt may y tế do nhờ tính chất kháng khuẩn, ức chế sự sinh sản của

vi khuẩn, nấm và khả năng hấp thụ mùi [21]

Như vậy, alginate đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống từ công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm và y dược Tuy nhiên, với nhu cầu ngày càng cao, đặc biệt là nhu cầu alginate KLPT thấp cho lĩnh vực y dược và thực phẩm chức năng nên việc điều chế alginate KLPT thấp an toàn sinh học cao và tính đặc hiệu cơ chất đang được nhiều quan tâm chú ý và triển vọng

1.1.2 Các phương pháp điều chế alginate KLPT thấp

1.1.2.1 Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp hóa học

Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp hóa học là phương pháp phổ biến Các phương pháp hóa học bao gồm thủy phân alginate bằng acid, oxy hóa bằng H2O2, thủy phân bằng kiềm Các acid được sử dụng để thủy phân alginate thường là HCl, H2SO4, H3PO4 [38] Chandia và cộng sự [39] đã tiến hành thủy phân sodium alginate khi dùng HCl 0.3 M, pH 2,85 sau nhiều công đoạn gia nhiệt và ly tâm thu được các polymannuronic acid và polyguluronic acid

Thủy phân bằng acid là phương pháp đơn giản và hiệu quả, trong môi trường acid các liên kết glycoside dễ dàng được phân cắt dưới xúc tác H+ để tạo thành các oligomer không bằng nhau về trùng hợp Tuy nhiên, phản ứng cắt của acid là ngẫu nhiên và không có tính đặc hiệu Nhược điểm của phương pháp này là rất mất thời gian từ 10-12 giờ, dư lượng muối được tạo ra từ trung hòa acid với kiềm và chất lượng alginate oligosaccharide không đảm bảo [38]

Năm 2020, Soukaina và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu dùng chất xúc tác là H2O2 để thủy phân alginate thu từ rong nâu Bifurcaria bifurcata và kết

quả là sau 6h đã thu được các alginate oligosaccharide có KLPT nhỏ hơn 5,5 kDa [40]

1.1.2.2 Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp vật lý

Các phương pháp vật lý để điều chế alginate KLPT thấp gồm: Sử dụng tia gamma chiếu xạ [41], để tăng hiệu quả của quá trình điều chế alginate KLPT thấp bằng tia gamma thì nhiều công trình nghiên cứu đã kết hợp giữa chiếu xạ gamma và sử dụng H2O2 đã giảm liều lượng chiếu xạ cần thiết xuống

9 lần so với chỉ sử dụng tia gamma để điều chế alginate KLPT thấp [42]; phương pháp cắt mạch alginate bằng tia cực tím (UV) kết hợp với chất xúc tác titanium dioxide (TiO2) điều chế alginate [43]; ngoài ra còn có các phương pháp sử dụng sóng siêu âm, vi sóng và phương pháp thủy nhiệt cũng

được nghiên cứu và sử dụng trong việc điều chế alginate nhưng chỉ mang tính chất thử nghiệm

Điều chế alginate KLPT thấp bằng các phương pháp vật lý được sử dụng phổ biến hiện nay, ưu điểm của các phương pháp này là chi phí điều chế thấp, thời gian nhanh và được thực hiện ở quy mô công nghiệp Tuy nhiên, khả năng cắt mạch alginate không theo thứ tự các oligomer, sử dụng nhiều năng lượng, đòi hỏi về thiết bị và các điều kiện thí nghiệm nghiêm ngặt

1.1.2.3 Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp enzyme

Phương pháp pháp enzyme là phương pháp sử dụng xúc tác sinh học gọi là alginate lyase để cắt mạch alginate bằng phản ứng khử β của liên kết (1→4) glycoside giữa các monome tạo thành các oligomer Tùy theo đặc tính của mỗi loại enzyme khác nhau mà phản ứng khử tạo các sản phẩm AOS có đặc điểm khác nhau Quá trình khử β được thực hiện qua 3 bước: bước 1 là trung hòa điện tích âm của alginate carboxyl, khử proton H-5; bước 2 một phản ứng được xúc tác bởi chất nền thu hút proton trên vị trí C5 hình thành chất trung gian carboxylate dianion; bước 3 là tăng proton để hình thành liên kết đôi giữa C4 và C5 từ đó dẫn đến phản ứng khử β xảy ra ở liên kết (1→4) glycosidic tạo thành các acid mannuronic không no [31], [44]

Điều chế alginate KLPT thấp bằng phương pháp enzyme so sánh với phương pháp vật lý, phương pháp hóa học thì nhược điểm là phải tinh sạch enzyme nên chi phí cho việc phân tách và tinh sạch cao, enzyme thu nhận từ động vật thân mềm thì khó tách khỏi đường tiêu hóa của chúng nên quá trình công nghiệp hóa gặp khó khăn [4] Nhưng các enzyme cắt mạch alginate có tính đặc hiệu, tùy thuộc mỗi loại enzyme khác nhau thì cắt mạch ở những monome khác nhau và khả năng cắt mạch thực hiện theo trình tự, các vị trí cắt được thực hiện chính xác Chính sự đặc hiệu này đã phân ra các loại poly M lyase, poly G lyase, poly MG lyase và tạo ra các oligo G, oligo M, oligo MG Mặt khác trong quá trình thực hiện enzyme không sử dụng đến hóa chất nên sản phẩm không tồn dư hóa chất, quá trình thực hiện ngoài việc duy trì độ pH

và nhiệt độ thì tiêu thụ ít năng lượng Công nghệ enzyme trong điều chế

alginate KLPT thấp được đánh giá là công nghệ sạch và an toàn sinh học cao đặc biệt sản phẩm được ứng dụng trong lĩnh vực y dược và thực phẩm [31] 1.2 TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE

1.2.1 Định nghĩa về alginate lyase

Alginate lyase là một nhóm các enzyme xúc tác quá trình khử alginate thành oligosaccharide Alginate lyase xúc tác quá trình khử β phá vỡ các liên kết glycoside giữa các monome và tạo ra liên kết đôi tại C4 và C5 của các vòng đường cacbon, trong quá trình đó liên kết 4 – O – glycoside sẽ bị loại bỏ

và tạo thành các oligosaccharide [4], [31], [45] Alginate lyase đã được ứng dụng trong quá trình sản xuất oligosaccharide và phân tích cấu trúc polysaccharide

Alginate lyase có KLPT dao động từ 24 kDa -110 kDa, là đồng trùng hợp của α-L-guluronate (G) và C5 epimer β D-mannuronate (M) của nó, được sắp xếp như các khối G homopolymer, khối M, xen kẽ GM hoặc dị trùng hợp ngẫu nhiên G / M kéo dài

1.2.2 Phân loại alginate lyase

Alginate lyase gồm nhiều loại khác nhau được thu nhận từ các nguồn vi sinh vật, virus, nấm,… nên có nhiều cách phân loại:

Dựa vào đặc hiệu cơ chất, alginate lyase được chia làm 3 loại với tính đặc hiệu với G-block (EC4.2.2.11), đặc hiệu với M-block (EC4.2.2.3) và một nhóm enzyme đặc hiệu với poly M và cả poly G là MG-block (EC4.2.2.-) [4]

Dựa vào cơ chế hoạt động, alginate lyase được chia làm 2 nhóm là alginate lyase endolytic và alginate lyase exolytic Alginate lyase endolytic tách các liên kết glycoside bên trong phân tử alginate và giải phóng các oligoalginate, đó có thể là các disacharide, trisacharide, tetrasacharide… Trong khi alginate lyase exolytic có thể tách nhỏ phân tử alginate và các đoạn oligoalginate thành các monosacharide [4]

Dựa vào cấu trúc sơ cấp của enzyme, alginate lyase chia vào 7 họ của polysaccharide lyase là 5, 6, 7, 14, 15, 17 và 18 Hầu hết, exolytic alginate

lyases nằm trong họ polysaccharide lyase số 15 và 17 Phần lớn alginate lyase thu nhận từ vi khuẩn được chia vào các họ polysaccharide lyase số 5, 7, 15 và

17 Alginate lyase thu từ động vật thân mềm và virus thuộc họ polysaccharide lyase số 14 Alginate lyase đa chức là enzyme có khả năng cắt liên kết G-M block được chia riêng vào họ polysaccharide lyase số 18 [4], [44], [46] Theo Cheng và công sự [47] ngoài 7 họ alginate lyase trên thì còn chia vào thêm 5

1.2.3 Nguồn thu nhận alginate lyase

Alginate lyase khác nhau được thu nhận từ nhiều nguồn bao gồm: Vi khuẩn biển, động vật thân mềm biển, vi nấm biển, vi khuẩn trên cạn, nấm và

virus Một số chủng vi khuẩn có thể kể đến: gram dương là Bacillus circulans

và gram âm là Azotobacter vinelandii, Klebsiella aerogens, Klebsiella

pneumonia, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas putida, and

Pseudomonas aeruginosa đã được nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn

này có khả năng sản xuất alginate lyase [5]

Shiraiwa và cộng sự [48] đã nghiên cứu về nguồn thu nhận alginate

lyase từ tảo biển của một số loại: Spatoglossum pacificum, Colpomenia

sinuosa, Endarachne binghamiae, Undaria pinnatifida, Sargassum sagamianun, Ishige spp., Ông nhận thấy rằng hoạt tính của alginate lyase thu

từ tảo thay đổi theo mùa và nhiều alginate lyase từ tảo biển đặc hiệu cả poly

M và poly G [48] Alginate lyase thu nhận từ gan, tụy của các động vật thân mềm như bào ngư, ốc bàn tay, … thì thường là enzyme endolytic, đặc hiệu với poly M [6] Vi khuẩn đất gram âm và gram dương cũng là đối tượng được

nghiên cứu nhiều như Azotobacter vinelandii, A chrococcum đã được giải

trình tự nhận dạng acid amin [6]

Vi khuẩn biển là nguồn thu nhận alginate lyase được nghiên cứu nhiều

nhất như Alteromonas sp., Pseudomonas sp., Vibrio harveyi, Vibrio sp., Các

chủng vi khuẩn biển đều có liên quan đến tảo biển hoăc các động vật thân mềm như cầu gai, hải sâm,… vì chúng sử dụng nguồn alginate làm nguồn cacbon chính Chính vì vậy, vi khuẩn biển là nguồn tiềm năng nhất để thu nhận alginate lyase

1.2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính alginate lyase

Alginate lyase có nguồn gốc từ vi sinh vật có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp, y học, nông nghiệp và công nghệ sinh học Do đó, các nhóm vi sinh vật khác nhau cần được sàng lọc để chọn được đối tượng tiềm năng sản xuất alginate lyase Đề giải quyết vấn đề này, đã có những phương pháp sàng lọc định tính rất tốt nhằm xác định khả năng sản xuất alginate lyase của vi sinh vật

1.2.4.1 Phương pháp đĩa thạch

Phương pháp đĩa thạch alginate là một trong những phương pháp phổ biến Lợi ích của phương pháp này là thân thiện, đơn giản, dễ thực hiện, có thể sử dụng để sàng lọc lượng lớn vi sinh vật và tiết kiệm thời gian

Nguyên tắc của phương pháp đĩa thạch có chứa alginate: là nuôi cấy vi sinh vật lên đĩa thạch có chứa cơ chất là alginate Vi sinh vật nếu sản sinh alginate lyase, enzyme này sẽ bẻ ngắn mạch alginate tạo các sản phẩm có KLPT thấp, sản phẩm này không bị bắt màu bởi các loại thuốc thử đặc trưng, tạo ra vòng phân giải trong suốt xung quanh khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch Vùng bị nhuộm màu là alginate KLPT cao Có nhiều loài thuốc thử khác nhau

để phát hiện sàng lọc alginate lyase từ vi sinh vật được các nhà khoa học sử dụng và công bố

Năm 1990, Peter Gacesa đã sử dụng 0,1% polyguluronate và polymannuronate từ alginate để làm cơ chất trong môi trường đĩa thạch, sau

đó cho vi khuẩn phát triển trên đĩa môi trường Chủng vi khuẩn được cho là

có khả năng sinh alginate lyase là chủng mà tạo ra được vòng phân giải trên đĩa thạch sau khi nhuộm với cetyl pyridinium clorua (CPC) hoặc đỏ

ruthenium [49] Takeshita và cộng sự [50] đã phát triển một phương pháp cải tiến dựa trên việc sử dụng song song thuốc thử phổ biến hơn đó là canxi clorua cùng với 70% etanol nhằm kết tủa alginate không bị phân giải bởi enzyme trong môi trường thạch đĩa Baron và cộng sự [51] đã sử dụng 1,5%

agarose và 1% natri alginate giàu G chiết xuất từ loài từ loài rong Laminaria

hyperborea nhằm xác định tính đặc hiệu của alginate lyase đối với poly G từ

loài vi khuẩn Klebsiella pneumoniae được biểu hiện trên Escherichia coli

Với việc sử dụng các thuốc thử nêu trên khó quan sát bằng mắt thường Đến năm 2015, Sawant và cộng sự đã phát triển phương pháp này bằng cách sử dụng thuốc thử Gram’s iodine Gram’s iodine tạo thành phức màu đen hơi xanh với alginate KLPT cao nhưng không tạo phức với alginate bị thủy phân, tạo ra các vùng sắc nét, rõ ràng xung quanh các khuẩn lạc vi sinh vật chỉ trong vòng 2-3 phút nhuộm Phương pháp sử dụng Gram’s iodine được phát hiện có hiệu quả hơn phương pháp sử dụng CPC làm thuốc thử về hình ảnh và dễ

dàng đo kích thước vùng phân giải [52]

1.2.4.2 Phương pháp đo độ đục

Là một phương pháp so màu đơn giản để xác định hoạt động của alginate lyase dựa trên sản phẩm là các axit uronic không bão hòa được tạo ra bởi tác dụng của alginate lyase Các sản phẩm tạo phức với axit thiobarbituric được phát hiện bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 548 nm Đơn vị enzyme được biểu thị dưới dạng micromol ß-formyl pyruvate tạo ra trong một phút đối với một ml enzyme.Phương pháp này nhạy và đặc hiệu, và nó ít bị nhiễu bởi các hợp chất thường có trong dịch chiết thô Tuy nhiên, đường không bão hòa có thể có trong một số môi trường nuôi cấy như muối amoni sulfate hoặc sucrose có thể làm gia tăng độ hấp thụ, do đó, khi sử dụng phương pháp này cần loại bỏ các đường này bằng thẩm tách [53]

1.2.4.3 phương pháp đo độ nhớt

Dung dịch alginate ở nồng độ thích hợp cho thấy độ nhớt đáng kể, độ nhớt này bị giảm do sự phân hủy alginate Do đó, độ nhớt là một chỉ số đánh giá hoạt động của alginate lyase Có thể làm rõ phương thức hoạt động của alginate lyase bằng cách theo dõi và vẽ biểu đồ độ nhớt tương đối (ηr) theo

thời gian Khi alginate bị phân hủy theo cách nội phân, độ nhớt bị giảm nhanh chóng ở giai đoạn đầu của phản ứng Phương pháp này cần phải có lượng lớn alginate và enzyme, cũng như cần có máy đo chuyên dụng để kiểm soát nhiệt

độ của alginate

1.2.3.4 Phương pháp đường khử

Phương pháp đường khử hay gọi là phương pháp Nelson – Somogyi [40] dung để định lượng hoạt tính Hoạt tính enzyme cắt mạch polysaccharide được đánh giá là sự tăng đường khử trong hỗn hợp phản ứng Sản phẩm tạo thành bởi sự xúc tác của alginate lyase có chứa đầu khử và đầu không khử có nối đôi, do đó, các nghiên cứu về alginate lyase cũng thường sử dụng phương pháp đo đường khử trong sản phẩm phản ứng để định lượng hoạt tính Một đơn vị hoạt tính được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 μmol đường khử trong 1 phút Phương pháp thường sử dụng là 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS)

Phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm 0,1 ml enzyme đã chuẩn bị vào 0,9 ml natri alginate 1% hòa tan trong 50 mM dung dịch đệm sodium phosphate (ở pH 7,5) Sau khi ủ ở 40oC trong 20 phút, phản ứng dừng lại bằng thêm 0,5ml thuốc thử DNS và đun nóng ở 100oC trong 5 phút Sau khi làm mát đến nhiệt độ phòng, hoạt động được đo bằng cách theo dõi độ hấp thụ tăng lên của các sản phẩm phản ứng (giảm đường) ở bước sóng 540 nm Một đơn vị hoạt động của alginate lyase (U) được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để tạo ra 1mg đường khử (tương đương glucose) mỗi phút [40] Ngoài ra còn sử dụng phương pháp Nelson – Somogyi dựa trên độ hấp thụ ở bước sóng

570 nm của một hợp chất màu được hình thành giữa đường oxy hóa đồng và arsenomolybdate [54]

1.2.3.5 Phương pháp đo độ hấp thụ bước sóng

Hoạt tính alginate lyase còn được tính bằng phương pháp đo quang phổ trực tiếp các sản phẩm axit uronic không bão hòa được tạo ra bởi alginate lyase trên cơ chất alginate [53] Phương pháp này để xác định hiệu của uronic, phản ứng alginate lyase trên alginate dẫn đến sự hình thành liên kết đôi giữa C4 và C5 ở đầu không tạo ra sản phẩm phân hủy và hỗn hợp phản ứng cho

thấy đỉnh hấp thụ ở 235 nm Do đó, sự gia tăng độ hấp thụ ở bước sóng 235

nm là một chỉ số của hoạt tính alginate lyase

1.3 TỔNG QUAN VỀ ALGINATE LYASE TỪ VI KHUẨN BIỂN

1.3.1 Nguồn phân lập vi khuẩn biển sinh alginate lyase

Các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh alginate lyase chủ yếu được phân lập từ cầu gai, san hô mềm, rong biển và những loài động vật hai mảnh

Sở dĩ được tìm kiếm ở những vật chủ như vậy vì đây là những loài sử dụng rong tảo làm thức ăn, hệ vi sinh vật đường ruột những loài này luôn có một hoặc một hệ vi khuẩn sinh alginate lyase để hỗ trợ chuyển hóa thức ăn Ngoài

ra, nước biển và hải miên cũng là nguồn để phân lập vi sinh vật sản sinh alginate lyase [6] Các chủng vi khuẩn phổ biến sinh alginate lyase như:

Sphingomonas sp., Flavobacterium sp., Saccharophagus sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp.,….(được trình bày ở Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Nguồn phân lập một số vi khuẩn biển sinh alginate lyase

Nguồn tài liệu tham khảo

5 Vibrio furnissii H1 Rong biển thối rửa [64]

Đáng chú ý năm 1976 I W Davidson và cộng sự thuộc trường đại học Edinburgh, vương quốc Anh đã tiến hành nghiên cứu alginate lyase từ vi khuẩn biển thuộc họ Pseudomonadaceae Đây là enzyme ngoại bào thuộc

EC4.2.2.3 đã mở ra hướng nghiên cứu mới các chủng vi khuẩn biển được phân lập từ rong biển sống trong môi trường giàu alginate [55]

Mỗi chủng vi khuẩn thường sinh mỗi loại enzyme và đa số là enzyme Endolytic Tuy nhiên, cũng có nhiều chủng vi khuẩn tạo ra nhiều hơn một enzyme như Pseudomonas alginovora có cả enzyme poly G và poly M [56] Doubets và cộng sự [58] đã công bố alginate lyases (EC 4.2.2.3) thu từ 2 loài

vi khuẩn biển A3, W3 được phân lập từ rong nâu Fucus Trong đó, chủng vi

khuẩn biển A3 sinh alginate lyase ngoại bào đặc hiệu Poly M và W3 sinh alginate lyase nôi bào đặc hiệu poly G [58]

Vi khuẩn là sinh vật có khả năng sinh sản nhanh, phát triển mạnh, thích ứng tốt với điều kiện công nghiệp Môi trường dinh dưỡng để nuôi vi khuẩn

rẻ tiền, dễ kiếm Nên enzyme thu từ việc nuôi vi khuẩn sẽ nhanh hơn, rẻ hơn giúp tăng lợi nhuận Bên cạnh đó, việc tìm kiếm alginate lyase mới từ vi khuẩn giúp dễ dàng hơn trong việc xác định gen mã hóa enzyme do bộ gen của vi khuẩn biển nhỏ hơn sơ với các sinh vật khác như vi nấm hay động vật biển, dẫn đến dễ dàng hơn trong việc nghiên cứu enzyme tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong quy mô công nghiệp [68]

Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng các alginate lyase có khả năng kém trong ổn định nhiệt độ, hiệu suất xúc tác thấp

để sản xuất AOS ở quy mô công nghiệp Vì vậy, hiện nay các nhà khoa học tập trung vào tìm kiếm các alginate lyase từ vi khuẩn biển có hiệu suất cao, hoạt tính cao ứng dụng tiềm năng trong sản xuất alginate oligosaccharide như

chủng vi khuẩn biển Bacillus sp Alg07 [3]

1.3.2 Đặc tính xúc tác của một số alginate lyase từ vi khuẩn biển

Hầu hết alginate lyase được công bố từ vi khuẩn biển là enzyme ngoại

bào như Pseudoalteromonas atlantica AR06 [69], Bacillus sp TAG8 [5]

Điều này có thể được giải thích là do alginate là hợp chất đại phân tử, khó có thể hấp thu qua thành tế bào vi khuẩn Do đó, các chủng vi khuẩn biển cần phải tiết ra môi trường enzyme chuyển hóa alginate thành alginate oligosaccharide để dễ dàng sử dụng cho hoạt động sống của chúng Tuy

nhiên, một số vi khuẩn biển cũng được tìm thấy có sản xuất alginate lyase nội

bào như Alteromonas sp [61] Điều này chứng tỏ, vi sinh vật biển có những

cơ chế đặc biệt để có thể sử dụng các chất dinh dưỡng ở môi trường nhằm mục đích cung cấp nguồn năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng Vì vậy, khi tìm kiếm, nghiên cứu alginate lyase từ vi khuẩn biển cần phải tiến hành kiểm tra dịch chiết nội bào và ngoại bào để xác định đúng vị trí sản xuất của alginate lyase Nhiều yếu tố, chẳng hạn như nguồn cacbon, nguồn nitơ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật và sản xuất alginate lyase Tuy nhiên, chỉ có một vài báo cáo liên quan đến tối ưu hóa quá trình lên men, điều kiện nuôi cấy và vi sinh vật sản xuất alginate lyase [70], [71] Hầu hết các công bố liên quan đến alginate lyase từ vi khuẩn biển đều sử dụng môi trường biển có bổ sung alginate là nguồn carbon cảm ứng vi khuẩn sinh enzyme [3], [70], [72], [73] Do đó, khi nghiên cứu vi sinh vật sinh alginate lyase thì cần nghiên cứu ảnh hưởng của chất cảm ứng (bảng 1.3)

Bảng 1.3 Đặc tính xúc tác của một số alginate lyase từ vi khuẩn biển

STT Vi khuẩn biển Đặc hiệu

enzyme

Khối lượng phân

tử (kDa)

pH

Nhiệt

độ (t o C)

Đặc tính xúc tác, ảnh hưởng của các ion kim loại

Nguồn tài liệu tham khảo

1 Vibrio furnissii H1 Poly M/

5 Flavobacterium sp

NaCl 100 mM, MgCl 2 , CoCl 2 , NiCl 2 5mM

[7]

, EDTA, CaCl 2 , AlCl 3 , MnCl 2 ,

Các alginate lyase thu nhận từ các vi khuẩn biển Vibrio sp được nghiên

cứu phân lập, công bố có đặc trưng về điều kiện nhiệt độ từ 16oC – 40oC, pH 6,5-8,5 và ảnh hưởng bởi nồng độ muối NaCl cũng như các ion kim loại hóa

trị II Trong đó, Alginate lyase từ Vibrio furnissii H1 có KLPT 35,8 kDa, hoạt

động tối đa ở nhiệt độ 40oC được xem hoạt động nhiệt độ cao nhất trong số

các các enzyme từ Vibrio sp và ổn định nhiệt ở 30oC, pH 7,5, nồng độ NaCl tối ưu cho alginate lyase hoạt động là 300 mM Hoạt động của enzym bị ức chế bởi Zn2+, Fe2+, Cu2+, Mn2+ và Ag+ Tuy nhiên, K+ và Mg2+ thể hiện tăng cường hoạt động enzyme [64]

Mỗi loài vi khuẩn sinh ra alginate lyase có những đặc tính khác nhau như KLPT, điều kiện hoạt động và tính đặc hiệu cơ chất Alginate lyase có

nguồn gốc từ chủng vi khuẩn biển Bacillus sp Alg07 có KLPT khoảng 60

kDa, hoạt động tối ưu ở 40oC, pH 7,5, nồng độ NaCl tối ưu cho alginate lyase

là 200 mM, Mg2+, Ca2+ tăng cường sự hoạt động của enzyme Là một alginate lyase đặc hiệu poly M và trong điều kiện tối ưu đạt tới 8306,7 U/mg và được

lyase có nguồn gốc từ chủng vi khuẩn biển Bacillus sp Alg07 được đánh giá

là có tiềm năng rất lớn để sản xuất quy mô công nghiệp

Alginate lyase từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens NJ – 07 được

Benwei Zhu và công sự (2019) công bố, Aly NJ-07 chỉ đặc hiệu với poly M

có KLPT 25 kDa và thể hiện mức hoạt động tối đa 2742,5 U/mg đối với muối natri alginate, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 40oC, pH 9, NaCl từ 100 – 300

mM Tác giả nhận thấy rằng Na+ có thể tăng cường hoạt động của enzyme, trong khi một số ion hóa trị hai như: Zn2+, Cu2+, Mn2+, Co2+ ức chế hoạt động của enzyme Aly NJ-07 là endolytic có khả năng nhận biết trisaccharide và phân cắt các trisaccharide thành monosaccharide và disaccharide [74]

Alginate lyase đặc hiệu poly M và poly G được thu nhận từ chủng vi khuẩn Isoptericola halotolerans NJ-05 phân lập từ rong nâu có KLPT 25,32

kDa, enzyme hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 40oC, pH 7, các ion kim loại Na+,

Mg2+, Ca2+ có thể tăng cường sự hoạt động của enzyme trong khi các ion

Cu2+, Co2+, Fe3+ lại ức chế sự hoạt động của alginate lyase Do enzyme đặc hiệu cả poly M và poly G nên nó có thể thủy phân alginate giải phóng một loạt các oligosaccharide như disaccharide, trisaccharide và tetrasaccharide [75]

Alginate lyase thuộc họ polysaccharide lyase số 7 đặc hiệu poly M từ

loài vi khuẩn biển Flavobacterium sp UMI-01 có KLPT 30 kDa, điều kiện

hoạt động tối ưu của enzyme ở nhiệt độ 55oC, pH = 7,7, NaCl 100mM và MgCl2 5mM tăng cường hoạt động của enzyme thêm 30% trong khi CoCl25mM và NiCl2 5mM thì có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của enzyme Đây

là chủng vi khuẩn biển sinh enzyme alginate được đánh giá có khả năng cao trong sản xuất alginate oligosaccharide vì chúng có hiệu suất xúc tác cao [76]

Chủng vi khuẩn Pseudoalteromonas sp SM0524 được phân lập từ tảo

bẹ biển bị thối rữa sinh alginate lyase đặc hiệu poly M và poly G KLPT enzyme 32 kDa hoạt động trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ 50oC, pH 8,5 Nồng độ NaCl tối ưu là 0,2 M và chịu tác động của ion kim loại Na+, K+,

Mg2+, Ca2+, Co2+, Ba2+, Ni2+ và Sr2+ Đây là enzyme tiềm năng để sản xuất alginate KLPT thấp [7]

Alginate lyase đặc hiệu poly G từ vi khuẩn được phân lập ở rong

Sargassum fluitans cho thấy chúng hoạt động mạnh khi có mặt của NaCl

0,5M, enzyme có KLPT 38 kDa và có pI = 4,5 [77] Hoặc đối với enzyme

alginate lyase đặc hiệu poly G từ Enterobacter cloacae M-1 có KLPT 38 kDa

và 32 kDa, pI = 8,9, pH = 7,8, nhiệt độ thích hợp là 30oC, enzyme không bền với nhiệt, EDTA hoàn toàn ức chế hoạt tính của enzyme, nhưng hoạt tính của enzyme phục hồi lại được khi xử lý với CaCl2, AlCl3, MnCl2, các ion Mg2+,

Ca2+, Cu2+, Co2+, Fe3 ức chế sự hoạt động của enzyme [78]

Enzyme alginate ngoại bào từ vi khuẩn Vibrio harveyi AL-128 có

KLPT 57 kDa, hoạt động tốt ở nồng độ NaCl từ 0,3-1M, các ion Zn2+, Hg2+,

Ag+, Cu2+, Mn2+, Pb2+, Fe3+, EDTA ức chế hoạt động của enzyme, [66]

Ngoài những alginate lyase hoạt động theo endolytic hay exolytic thì có những enzyme hoạt động cùng lúc cả endolytic và exolytic như enzyme

Alg2951 từ vi khuẩn Alteromonas portus HB161718T KLPT 60 kDa hoạt động tối đa ở nhiệt độ 25oC, pH 8 Cả NaCl 100 mM, KCl 100 mM đều thúc đấy sự hoạt động của enzyme Các ion kim loại Mg2+, Ca2+ và K+ làm tăng hoạt tính của enzyme trong khi Zn2+, Co2+ và Li+ ức chế mạnh Alg2951 đặc hiệu poly G thủy phân alginate thành các monosaccharide và trisaccharide [79]

Năm 2019, Zilda và cộng sự đã phân lập chủng vi khuẩn từ rong

Turbinaria, vi khuẩn phân lập thuộc loài Bacillus sp sinh alginate lyase

T513 Enzyme hoạt động tối ưu trong điều kiện nhiệt độ 50oC, pH 8, các ion kim loại ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme gồm: Mg2+, Ca2+, K+, Zn2+,

Co2+, Li+, nồng độ NaCl ở 1,2 M thì enzyme không hoạt động Đây là một trong ít chủng vi khuẩn phân lập từ rong Turbinaria được công bố [80]

1.3.3 Tình hình nghiên cứu alginate lyase từ vi khuẩn biển ở Việt Nam

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu alginate lyase vẫn còn trong giai đoạn tìm kiếm, bước đầu đã nghiên cứu tách chiết được enzyme từ một số nguồn vi khuẩn biển, vi khuẩn đất và động vật thân mềm

Nguyễn Ngọc Hữu [81] đã nghiên cứu tách chiết được enzyme thủy

phân alginate từ loài vi khuẩn Klebsiella sp có hoạt độ xác định theo phương

pháp độ nhớt là 12ml/20phút (nghĩa là với 12ml dung dịch enzyme thủy phân cắt mạch alginate làm cho độ nhớt dung dịch alginate 1% giảm xuống 50% trong 20 phút) Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme từ 30oC - 40oC Đây là nghiên cứu bước đầu về khả năng cắt mạch alginate của alginate lyase

từ vi khuẩn Klebsiella sp Các enzyme thu được chưa tinh sạch, chưa xác

định được đặc tính xúc tác đặc hiệu của enzyme

Ngô Thị Duy Ngọc [82] đã nghiên cứu thu nhận enzyme alginate lyase

từ ốc bàn tay (Lambis chiragra) và nhận thấy enzyme có KLPT khoảng 32

kDa, nhiệt độ thích hợp cho hoạt động là 40oC, pH thích hợp từ 7,5 ÷ 8,0, nồng độ NaCl 0,2M cho hoạt động cao nhất Các ion kim loại (Ca2+, Mg2+,

Mn2+) có tác dụng hoạt hóa enzyme, còn đối với các ion Ag+, Cu2+, Fe2+, Zn2+lại ức chế hoạt tính enzyme

Năm 2020, Võ Thị Diệu Trang và cộng sự đã nghiên cứu được 35 chủng vi khuẩn biển từ bọt biển sinh enzyme cắt mạch polysaccharide trên

chất nền alginate, fucoidan được chiết xuất từ rong nâu S mcclurei Trong đó,

có 68,6% chủng sinh alginate lyase trên chất nền alginate từ S mcclurei

Công trình nghiên cứu cho thấy tiềm năng lớn trong việc tìm kiếm các vi khuẩn biển sinh alginate lyase đặc hiệu ở Việt Nam [83]

Các công trình nghiên cứu về chủng vi khuẩn biển B velezensis

AlgSm1 đã được công bố có khả năng sinh alginate lyase bẻ mạch alginate

chiết từ rong S mcclurei thu nhận tại vùng biển Khánh Hòa [83] Cao Thị

Thúy Hằng và công sự [85] đã tiên hành khảo sát điều kiện lên men của chủng vi khuẩn này và xác định điều kiện sản sinh alginate lyase tốt nhất là

pH 5,5, nguồn carbon là alginate 5 mg/ml, nguồn nitơ là 0,8 mg/ml, thời gian lên men là 18 giờ, nuôi cấy ở 28-30°C Đây là cơ sở cũng như là tiềm năng nghiên cứu về vi khuẩn biển sinh alginate lyase ở nước ta nơi vùng biển có trữ lượng lớn về rong nâu để sản xuất alginate

Như vậy, ở Việt Nam hiện nay chúng ta cần phải tiếp tục tìm kiếm và xác định đặc tính xúc tác của alginate lyase nhằm cung cấp công cụ để sản xuất alginate oligosaccharide ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, thực phẩm chức năng và y dược

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Thời gian thực nghiệm: từ tháng 4/2021 đến tháng 9/2021

Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.2.1 Vật liệu thí nghiệm

2.2.1.1 Nguồn cơ chất

Alginate chiết xuất từ rong Sargassum mcclurei (S mcc A) và

Turbinaria ornata (T o A) được cung cấp bởi phòng Hóa phân tích và triển

khai công nghệ, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang S mcc

A có KLPT 505 kDa, T o A có KLPT 325 kDa được xác định bằng phương pháp sắc ký GPC (Phụ lục 1), hàm lượng uronic acid tổng số lớn hơn 90%

2.2.1.2 Nguồn phân lập vi khuẩn biển

Các mẫu rong nâu được thu ở các địa điểmcủa vùng biển Khánh Hòa ở

độ sâu 3-5m vào tháng 4/2021 (hình 2.1) Các mẫu rong biển sau khi được thu thập, phân loại được cho vào túi trữ mẫu, bảo quản ở nhiệt độ 4ºC và vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập vi khuẩn

Hình 2.1 Các mẫu rong thu được ở vùng biển Khánh Hòa

Quá trình thu mẫu đã thu được 05 mẫu rong ở vùng biển Khánh Hòa

(hình 2.1) gồm: (1) rong Hormophysa articulate, (2) rong Sargassum

oligocystum, (3) rong Turbinaria ornata, (4) rong Padina australis, (5) rong

- Nước biển vô trùng đựng trong bình tam giác

Thiết bị: Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

- Cân phân tích CP224S Sartorius 31

- Hệ thống sắc ký lọc gel GPC-2414 Waters-Mỹ

- Máy đo quang: SHIMADZU UV-VIS 1601PC SPECTROMETER

2.2.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường phân lập MBA: Các thành phần cho 01 lít nước bao gồm:

- pH 7,5-7,8 để phân lập vi khuẩn biển

Môi trường MB lỏng để lưu giữ giống: Các thành phần cho 01 lít

nước bao gồm:

- pH 7,5-7,8 để phân lập vi khuẩn biển

Môi trường MBA lỏng để lên men vi khuẩn: Các thành phần cho 01

- pH 7,5-7,8 để phân lập vi khuẩn biển

Thuốc thử Gram’s iodine để thử nghiệm hoạt tính enzyme:

Gram Iod (IX):

- Kali iodide (KI): 2g

- I2: 1g

- Nước cất: 300ml

- Cetavlon (hexadecyltrimethyl ammonium bromide) 10% (stock):

Khi sử dụng pha loãng thành 1% và gia nhiệt ở 40-50ºC