Nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn xanthomonas sp gây bệnh bạc lá trên lúa của vật liệu nano cu2o cu alginate

Tuy nhiên, việc sản xuất lúa với cường độ cao và liên tục trên quy mô lớn và chuyên canh đã dẫn đến sự thoái hóa đất, việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật BVTV tổng hợp hữu cơ độc

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN

XANTHOMONAS SP GÂY BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA CỦA

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Thành phố Hồ Chí Minh – 2021

VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

TRẦN PHƯỚC THỌ

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN

XANTHOMONAS SP GÂY BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA CỦA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS BÙI ĐÌNH THẠCH

Thành phố Hồ Chí Minh – 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu hoạt tính kháng vi

khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh bạc lá trên lúa của vật liệu nano Cu2

O-Cu/alginate” là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của

TS Bùi Đình Thạch Các số liệu, kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận

văn là trung thực, khách quan và chưa được công bố ở các đề tài cùng cấp hoặc

các công trình khoa học tương tự Nếu có gì sai xót tôi xin chịu hoàn toàn trách

nhiệm

Tác giả luận văn

Trần Phước Thọ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của cá nhân và tập thể Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:

TS Bùi Đình Thạch, thầy đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và giúp

đỡ tận tình để tôi hoàn thành luận văn này

TS Bùi Duy Du và NCS Lê Nghiêm Anh Tuấn, người đã giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện thí nghiệm và hoàn thiện nội dung của luận văn

Các Thầy, Cô giáo và cán bộ phòng Đào tạo sau đại học của Học viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình đào tạo Thạc sĩ

Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cung cấp

cơ sở hạ tầng, trang thiết bị giúp tôi thực hiện các thí nghiệm

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và các bạn học viên lớp cao học Sinh học thực nghiệm khóa 2019 đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ICP-MS Inductively coupled plasma

UV-vis Utra Violet-Visible Quang phổ tử ngoại khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Các phương pháp tổng hợp nano Cu2O 10

Bảng 2.1 Thang phân 9 cấp độc tính đối với cây trồng 33 Bảng 3.1 Kích thước hạt nano Cu2O và Cu tính qua phổ XRD 38

Bảng 3.2 Độc tính cấp LD50 qua đường miệng trên chuột của vật liệu nano

Cu2O-Cu/alginate 41

Bảng 3.3 Tỷ lệ nhạy cảm da của chuột với vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate 42

Bảng 3.4 Hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp của vật liệu nano Cu2Cu/alginate 44

O-Bảng 3.5 Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh bạc lá lúa trong thí nghiệm nhà lưới 46 Bảng 3.6 Hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá lúa trong thí nghiệm nhà lưới 48 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate đến năng suất lúa 49

Bảng 3.8 Độc tính của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate đối với cây lúa 50

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1 Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá 5

Hình 1.2 Đặc trưng cấu trúc của alginate 11

Hình 1.3 Cơ chế phòng trừ vi khuẩn E coli của CuO và Cu2O 14

Hình 2.1 Quy trình tổng hợp vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate 22

Hình 2.2 Chuột được nuôi trong hộp nhựa có gắn nắp lưới 28

Hình 2.3 Chuột được đánh số thứ tự và ghi nhận trọng lượng ban đầu 29

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm và chuẩn bị thuốc thử 32

Hình 3.1 Thay đổi màu sắc dung dịch trong quá trình khử Cu2+ 35

Hình 3.2 Ảnh chụp TEM và sự phân bố kích thước hạt nano Cu2O-Cu/alginate 36

Hình 3.3 Giản đồ XRD của alginate và nano Cu2O-Cu/alginate 37

Hình 3.4 Phổ FT-IR của alginate chiết xuất rong nâu và nano Cu2 O-Cu/alginate 38

Hình 3.5 Phổ UV-vis của alginate/phức Cu2+ và nano Cu2O-Cu/alginate 39

Hình 3.6 Sơ đồ mô phỏng mô phỏng phản ứng tạo cấu trúc nano lõi-vỏ Cu2O@Cu 40

Hình 3.7 Các cá thể chuột ở nhóm thử nghiệm sau 48 giờ bôi dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate 42

Hình 3.8 Sự phát triển của vi khuẩn Xanthomonas sp sau 24 giờ nuôi cấy ở các nghiệm thức 45

Hình 3.9 Sự phát triển của bệnh bạc lá trong thí nghiệm nhà lưới ở các nghiệm thức 46

Hình 3.10 Sự phát triển của bệnh bạc lá lúa ở các nghiệm thức có xử lý trong thí nghiệm nhà lưới 51

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ v

MỤC LỤC vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 BỆNH BẠC LÁ LÚA 4

1.1.1 Triệu chứng bệnh bạc lá lúa 4

1.1.2 Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa 5

1.1.3 Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh bạc lá lúa 6

1.1.4 Cách phòng trừ bệnh bạc lá lúa 7

1.2 VẬT LIỆU NANO Cu2O-Cu/ALGINATE 8 1.2.1 Nano Cu và nano Cu 2 O 8

1.2.2 Các phương pháp tổng hợp nano Cu và nano Cu 2 O 9

1.2.3 Alginate chiết xuất từ rong nâu Khánh Hòa 11

1.2.4 Cơ chế kháng vi sinh vật của vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate 12

1.2.5 Độc tính của nano Cu và nano Cu 2 O 14

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 15

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 17

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.2.1 Phương pháp tổng hợp vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate 21

2.2.2 Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 22

2.2.3 Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) 23

2.2.4 Phương pháp đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) 24

2.2.5 Phương pháp đo phổ tử ngoại – khả kiến (UV-vis) 25

2.2.6 Phương pháp khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS) 26

2.2.7 Đánh giá độ độc của vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate 27

2.2.7.1 Xác định độc tính qua đường miệng trên chuột 27

2.2.7.2 Xác định kích ứng da (nhạy cảm da) trên chuột 28

2.2.8 Nghiên cứu hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp của vật liệu nano Cu 2O-Cu/alginate trong thí nghiệm in vitro 30

2.2.9 Nghiên cứu hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá lúa của vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate trong thí nghiệm nhà lưới 31

2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 TỔNG HỢP VẬT LIỆU NANO Cu2O-Cu/ALGINATE 35

3.1.1 Kết quả xác định kích thước và sự phân bố kích thước hạt của vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate 35

3.1.2 Nghiên cứu cấu trúc tinh thể của vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate.36 3.1.3 Phổ FT-IR của vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate 38

3.1.4 Phổ UV-vis của vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate 39

3.1.5 Độc tính của vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate 41

3.1.5.1 Độc tính cấp đường miệng 41

3.1.5.2 Độc tính qua tiếp xúc da 41

3.2 HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN XANTHOMONAS SP GÂY BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA CỦA VẬT LIỆU Cu2O-Cu/ALGINATE 43

3.2.1 Nghiên cứu hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp của vật liệu nano Cu 2O-Cu/alginate trong thí nghiệm in vitro 43

3.2.2 Nghiên cứu hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa của vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate trong thí nghiệm nhà lưới 45

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

4.1 KẾT LUẬN 53

4.2 KIẾN NGHỊ 54

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 65

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, lúa là cây lương thực chủ lực trong sản xuất nông nghiệp Lúa gạo có vai trò quan trọng nhằm đảm bảo an ninh lương thực của Việt Nam nói riêng và nhiều quốc gia trên thế giới nói chung Trong nhiều năm vừa qua, sản lượng sản xuất nông nghiệp của Việt Nam đã đạt được những tiến bộ đáng

kể, trong đó cây lúa đóng vai trò chủ đạo, Việt Nam đã trở thành nước xuất khẩu gạo đứng thứ hai thế giới Tuy nhiên, việc sản xuất lúa với cường độ cao

và liên tục trên quy mô lớn và chuyên canh đã dẫn đến sự thoái hóa đất, việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) tổng hợp hữu cơ độc hại và thói quen

sử dụng không đúng liều lượng đã làm phát sinh nhiều loại dịch bệnh khó kiểm

soát, trong đó có bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas sp gây ra trên cây lúa

Bệnh bạc lá lúa là một trong những dịch bệnh gây hại làm giảm năng suất nghiêm trọng, đặc biệt là đối với những giống lúa có năng suất cao ở Việt Nam và khu vực Đông Nam Á [1] Bệnh bạc lá lúa diễn ra thường xuyên, hàng năm đặc biệt là trong vụ mùa khi độ ẩm không khí ở mức cao tại vùng đồng bằng sông Cửu Long – vựa lúa lớn nhất cả nước Khi cây lúa bị nhiễm bệnh bạc lá thì năng suất có thể giảm lên đến 50%, thậm chí 100% tùy vào mức độ gây hại của bệnh [2] Để giảm thiểu thiệt hại của bệnh bạc lá trên lúa, nông dân thường sử dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp như canh tác thích hợp, bón phân hợp lý, vệ sinh đồng ruộng, sử dụng giống lúa kháng bệnh bạc lá,… trong

đó việc sử dụng thuốc BVTV là biện pháp quan trọng nhất được sử dụng phổ biến Hiện nay, việc sử dụng thuốc BVTV có nguồn gốc tổng hợp hữu cơ và thói quen dùng không đúng liều lượng gây ảnh hưởng rất lớn đến môi trường

và sức khỏe con người, đồng thời có khả năng làm xuất hiện các chủng vi sinh vật kháng thuốc nên ngày càng phải tăng liều lượng Vì vậy, việc nghiên cứu tổng hợp những loại vật liệu mới, đạt hiệu quả cao trong phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa nhưng không gây tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người là cần thiết và cấp bách để phát triển nền nông nghiệp an toàn, bền vững theo xu hướng hội nhập quốc tế

Ngày nay, việc ứng dụng công nghệ nano trong nông nghiệp nhằm kiểm soát các vi sinh vật gây hại trên cây trồng được xem là hướng đi mới để phát triển nền nông nghiệp bền vững, kinh tế và an toàn hơn Kim loại đồng (ký hiệu

Cu) và các hợp chất của kim loại Cu từ lâu đã được ứng dụng làm chất diệt

khuẩn, diệt nấm [3,4] Các hạt nano Cu có độc tính cao và chọn lọc với vi sinh

vật mà không gây độc đối với các tế bào của con người và động vật ở nồng độ

thấp [5], vì thế nó rất có tiềm năng sử dụng làm phân bón nano và thuốc BVTV

kháng vi sinh vật gây hại trong ngành nông nghiệp Nano kim loại Cu và các

hợp chất nano của kim loại Cu như nano Cu2O, CuO, CuCl đã được các nhà

khoa học nghiên cứu phát triển, định hướng làm chất kiểm soát vi sinh vật gây

hại cây trồng trong thời gian gần đây do chúng có hiệu quả cao và chi phí sản

xuất thấp

Cu2O-Cu ở kích thước nano có tính linh động, diện tích bề mặt riêng lớn

và thể hiện hoạt tính xúc tác mạnh trong các phản ứng hữu cơ như gắn lên các

nhóm chức enzyme của màng tế bào vi sinh vật (đặc biệt là nhóm sulfhydryl,

rất nhạy cảm với ion Cu+) làm bất hoạt tác nhân gây bệnh [6] Một số nghiên

cứu về độc tính cho thấy vật liệu nano Cu, nano Cu2O ít gây độc đối với động

vật máu nóng hơn các muối Cu2+ [7,8] Ngoài việc có hiệu quả kiểm soát vi

sinh vật gây hại trên cây trồng, vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate còn cung cấp

dinh dưỡng vi lượng Cu và hoạt chất điều hòa sinh trưởng alginate là một

polysaccharide cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng [9]

Trên thế giới, trong thập niên vừa qua, vật liệu nano Cu và hợp chất nano

của Cu đã được nghiên cứu định hướng ứng dụng làm phân bón nano và thuốc

BVTV nhằm gia tăng năng suất và bảo vệ cây trồng khỏi các loài vi sinh vật

gây hại Tuy nhiên, ở Việt Nam việc ứng dụng các hạt nano kim loại làm chất

kiểm soát vi sinh vật gây hại trên cây trồng hiện nay số công trình công bố vẫn

còn hạn chế Hạt nano kim loại Cu, nano oxit kim loại CuO, Cu2O được ổn định

bởi alginate có diện tích và năng lượng bề mặt lớn nên thể hiện khả năng kháng

vi sinh vật vượt trội, chứa dinh dưỡng vi lượng và chất điều hòa sinh trưởng

sinh học cần thiết cho sự phát triển của thực vật nên là loại vật liệu tiềm năng

để ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Vì lý do trên, luận văn thạc sĩ chọn

và thực hiện đề tài “Nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn Xanthomonas sp

gây bệnh bạc lá trên lúa của vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate”

Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh bạc lá trên cây lúa của vật liệu nano

Cu2O-Cu/alginate và so sánh với thuốc bảo vệ thực vật thương mại Xantocin 40WP với mục tiêu định hướng sử dụng vật liệu như một chất kiểm soát bệnh bạc lá trên cây lúa, thay thế các loại thuốc bảo vệ thực vật truyền thống giúp phát triển nền nông nghiệp theo hướng an toàn, bền vững

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Tổng hợp và xác định các tính chất hóa lý đặc trưng của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate

Nội dung 2: Thử nghiệm độc tính của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate trên chuột

Nội dung 3: Xác định nồng độ Cu của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate

đạt 100% hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp trong thí nghiệm in vitro

Nội dung 4: Xác định nồng độ Cu của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate đạt > 90% hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá trên cây lúa trong thí nghiệm nhà

lưới

Nội dung 5: Đánh giá ảnh hưởng của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate đối với cây lúa

Ý nghĩa của đề tài

Ý nghĩa khoa học: Xây dựng được quy trình công nghệ và xác định các

tính chất hóa lý đặc trưng của loại vật liệu mới nano Cu2O-Cu/alginate và

nghiên cứu hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh bạc lá trên lúa trong nghiên cứu in vitro và nhà lưới.

Ý nghĩa thực tiễn: Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate là một loại vật liệu

mới có độc tính thấp và có hiệu lực cao kháng vi khuẩn Xanthomonas sp gây

bệnh bạc lá trên lúa, vì vậy nó phù hợp cho việc định hướng sử dụng chúng làm chất kiểm soát bệnh cây trồng nhằm thay thế các thuốc BVTV độc hại đáp ứng nhu cầu phát triển nền nông nghiệp xanh, bền vững Góp phần sản xuất ra các loại nông sản, đặc biệt là lúa đạt chất lượng, an toàn thực phẩm, đảm bảo tiêu

chuẩn xuất khẩu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 BỆNH BẠC LÁ LÚA

Các dịch bệnh phổ biến trên cây lúa do vi khuẩn và vi nấm gây ra bao

gồm bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae, bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas sp., bệnh thối bẹ lá do nấm Sarocladium oryzae và bệnh khô vằn

do nấm Rhizoctonia solani gây ra Trong đó, bệnh bạc lá lúa là một trong những

bệnh có khả năng lây lan trên diện rộng, làm giảm năng suất lúa từ 20 – 50%

và thậm chí là 100% nếu như không xử lý bằng thuốc BVTV kịp thời [2] Bệnh bạc lá lúa hay còn gọi là bệnh cháy bìa lá được phát hiện đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1884 Sau đó, sự xuất hiện của nó đã được ghi nhận ở một số quốc gia khác như Úc, Bangladesh, Campuchia, Indonesia, Ấn Độ và Việt Nam,… [1]

Ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa có khả năng lây lan thành dịch không cao như các bệnh dịch hại khác như rầy nâu, đạo ôn nhưng hậu quả do bệnh bạc lá lúa cũng gây ra thiệt hại đáng kể, đặc biệt là vào những mùa vụ có độ ẩm không khí cao Theo số liệu thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, tính từ đầu năm đến tháng 2 năm 2021, diện tích lúa bị thiệt hại do bệnh bạc lá gây ra là 7.197 ha, trong đó diện tích bị nhiễm nặng là 187 ha và tập trung ở các tỉnh phía Nam [10]

1.1.1 Triệu chứng bệnh bạc lá lúa

Triệu chứng đầu tiên của bệnh bạc lá là những vệt dài khoảng 2 – 3 cm xuất hiện ở mặt trên phiến lá Những vệt này lớn dần và chuyển sang màu vàng trong vài ngày Triệu chứng bệnh có thể xuất hiện một bên hay cả hai bên bìa lá Bệnh nặng có thể làm toàn bộ lá lúa bị khô bạc trước khi lúa trổ và hạt lúa

bị lép dẫn đến giảm năng suất đáng kể [11]

Vết bệnh bạc lá lúa xuất hiện từ mép lá, thường từ chóp lá, mút lá, sau

đó lan dần vào trong phiến lá hoặc kéo dài theo gân chính, hoặc vết bệnh xuất hiện ngay giữa phiến lá và lan rộng ra mép lá Thông thường ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ được phân biệt rõ ràng theo đường gợn sóng màu vàng hoặc viền nâu (hình 1.1) Trong điều kiện ẩm độ cao, trên bề mặt vết bệnh bạc lá xuất hiện những giọt dịch vi khuẩn có màu vàng đục, khi giọt dịch này keo đặc lại rất cứng và có màu nâu hổ phách [11]

Hình 1.1 Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá [12]

1.1.2 Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá gây hại trên cây lúa là do vi khuẩn Xanthomonas sp gây ra,

đây là một trong những bệnh hại nguy hiểm đối với cây lúa trong cả hai vụ (vụ đông xuân và vụ hè thu) ở Việt Nam Những năm gần đây bệnh gây thiệt hại rất nặng, đặc biệt là trên các giống lúa lai và lúa nếp [11]

Vi khuẩn Xanthomonas sp có hình que, đầu tròn, kích thước nhỏ (0,4 –

0,7×0,7 – 2,0 µm), có khả năng di động với một trùng roi đơn cực, bao quanh tế bào là một màng nhầy [1] Đây là loại vi khuẩn Gram âm và không sinh bào

tử, khuẩn lạc hình tròn, lồi, bề mặt nhẵn, màu vàng Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 26 – 30°C, pH thích hợp là 6,8 – 7,0 và ẩm độ không khí trên 90% [13]

Vi khuẩn Xanthomonas sp có thể tồn tại từ mùa vụ này sang mùa vụ

khác trên các lá bị nhiễm bệnh và các mảnh vụn của lá, nhưng không tồn tại trong đất [14] Rao (1987) cho rằng sự lây nhiễm bệnh bạc lá qua hạt giống có thể xảy ra vào mùa vụ hè, nhưng không thể xảy ra vào mùa vụ đông, vì vi khuẩn

Xanthomonas sp không thể phát triển trong thời tiết lạnh và khô [15] Singh (1971) nhận thấy rằng vi khuẩn Xanthomonas sp có thể tồn tại từ 15 – 38 ngày trong nước ruộng [16] Trong tự nhiên, vi khuẩn Xanthomonas tồn tại rất nhiều

chủng loại khác nhau, chúng rất khác nhau về độc lực và được phân biệt bởi các tác động của chúng trên các loại cây trồng khác nhau [17]

1.1.3 Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá có thể phát sinh trong suốt thời kỳ sinh trưởng của cây lúa, các triệu chứng bệnh điển hình thường xuất hiện từ thời kỳ đẻ nhánh đến thời

kỳ trổ bông và chín, đạt đỉnh ở giai đoạn trổ bông [18]

Bệnh bạc lá lúa được chia làm hai giai đoạn: Giai đoạn “Kresek” và giai đoạn cháy lá Kresek là giai đoạn phá hoại nghiêm trọng nhất, toàn bộ lá của cây lúa chuyển sang màu vàng nhạt và héo Nếu giai đoạn Kresek xảy ra trong thời kỳ đẻ nhánh sớm sẽ dẫn đến năng suất lúa bị giảm một phần hoặc mất toàn

bộ Cây lúa dưới 21 ngày tuổi dễ bị nhiễm giai đoạn Kresek khi nhiệt độ môi trường từ 28°C đến 34°C Chính vì vậy, bệnh bạc lá lây lan dễ dàng hơn ở vùng

có khí hậu ấm và ẩm [19,20]

Thời tiết ẩm ướt, mưa nhiều là điều kiện thuận lợi cho bệnh bạc lá phát sinh và lây lan, đặc biệt là trong mùa vụ hè thu Bên cạnh đó, những ruộng lúa bón thừa đạm hoặc bón phân không cân đối làm cho cây lúa sinh trưởng xanh tốt, nhưng thân, lá mềm yếu do hàm lượng đạm tự do trong cây tích luỹ cao hoặc những ruộng trũng hoặc vùng lúa bị bóng cây che phủ thì cây dễ nhiễm bệnh hơn Các giống lúa khác nhau thì mức độ mẫn cảm với bệnh bạc lá cũng khác nhau Giai đoạn lúa làm đòng, trổ bông và chín sữa là giai đoạn lúa dễ nhiễm bệnh nhất và cũng gây thiệt hại năng suất cao nhất [11]

Vi khuẩn Xanthomonas sp tồn tại chủ yếu trong hạt giống hoặc tàn dư

cây bệnh, ngoài ra vi khuẩn còn tồn tại ở dạng giọt keo trên cỏ dại [21] Vi khuẩn chủ yếu xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn thực vật làm nhiễm trùng toàn thân cây lúa Sau một vài ngày, các tế bào vi khuẩn có thể lấp đầy các mạch xylem sau đó rỉ ra khỏi các lổ khí khổng của lá tạo thành các giọt dịch vi khuẩn trên bề mặt lá [22] Khi gặp điều kiện thời tiết thuận lợi vi khuẩn lại tiếp tục phát sinh và gây hại

Vi khuẩn Xanthomonas sp xâm nhập vào thực vật bằng cách chủ động

là bơi, hoặc thụ động theo nước khi được rút vào lá Sau khi xâm nhập vào tế

bào biểu mô mặt dưới của lá, vi khuẩn Xanthomonas sp phát triển trong khoảng

gian bào và lây lan thông qua lỗ khí khổng ở đầu mút gây tổn thương dọc theo gân lá Ngoài ra, vi khuẩn này còn có thể xâm nhập qua các vết thương cơ học trên lá, có thể gây ra bởi gió thổi mạnh làm lá lúa xây xát và lây lan từ lá này

sang các lá khác Tùy vào mức độ bị tổn thương trên lá lúa mà bệnh phát sinh rộng hay hẹp [23]

1.1.4 Cách phòng trừ bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá lúa gây tổn thất nặng nề và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất lúa gạo trên toàn thế giới Do vậy đòi hỏi phải có biện pháp nhằm chống lại sự bùng phát của dịch bệnh Xử lý bệnh bạc lá trên lúa giai đoạn đầu rất quan trọng, bệnh cần được kiểm soát để ngăn chặn sự phát triển và giảm mức

độ lây lan

Có rất nhiều biện pháp để ngăn ngừa và quản lý bệnh bạc lá trên cây lúa, chẳng hạn như xử lý hạt giống hoặc nhúng mạ vào thuốc kháng sinh trước khi gieo cấy để làm giảm mầm bệnh, sử dụng các giống lúa kháng bệnh bạc lá, sử dụng các hoạt chất kháng vi khuẩn sau khi sạ khoảng 20 – 30 ngày [24] Tuy nhiên, sự suy giảm tính kháng bệnh của giống lúa thường xảy ra sau vài năm

do sự thích nghi di truyền của mầm bệnh [25], thói quen sử dụng thuốc không đúng liều lượng của nông dân cũng tạo điều kiện cho mầm bệnh biến đổi và kháng thuốc nên lượng thuốc sử dụng phải tăng dần mới đạt hiệu quả kiểm soát bệnh

Bón phân cân đối ngay từ đầu vụ (không bón thúc đạm quá muộn, không bón dư đạm), tránh làm gãy, dập lá trong mùa mưa bão Khi bệnh xuất hiện, dừng bón phân đạm, không phun các chất kích thích sinh trưởng, phân bón lá

và duy trì mức nước trong ruộng từ 3 – 4 cm Có thể kiểm soát dịch bệnh bằng các phương pháp khác như sử dụng các vi sinh vật đối kháng hoặc các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng được coi là một công nghệ kiểm soát dịch bệnh

an toàn, có tính khả thi và đã được nghiên cứu nhưng phương pháp này có chi phí cao, hiệu quả thấp hơn phương pháp xử lý hóa học [26]

Cho đến nay, các biện pháp sử dụng thuốc BVTV để kiểm soát bệnh bạc

lá lúa vẫn là phương cách hữu hiệu nhất Các loại thuốc BVTV thương mại đặc trị bệnh bạc lá lúa đã được Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn cấp phép lưu hành và thương mại thông dụng như Sasa 25WP, Kaisin 100WP, Xantocin 40WP, Kasumin 4SL và một số loại thuốc kháng sinh như Streptomycin, Streptocycline, Agrimycin, Propenazole Hạn chế của chúng là thường có độ độc cao, nếu sử dụng thường xuyên sẽ gây độc đối với con người, hệ động thực vật trong môi trường và làm phát sinh các chủng vi sinh vật kháng thuốc Khi

bệnh bạc lá phát triển trên đồng ruộng với triệu chứng rõ ràng thì việc xử lý bệnh bằng thuốc BVTV thường mang lại hiệu quả không cao, vì vậy việc thăm ruộng và phát hiện bệnh có vai trò quan trọng trong việc đảm bảo năng suất trong canh tác lúa [27]

Vì các lý do nêu trên, việc nghiên cứu những loại vật liệu mới khắc phụ được những nhược điểm của thuốc BVTV tổng hợp hữu cơ, chất kháng sinh để kiểm soát bệnh bạc lá trên cây lúa là cần thiết Trong một thập kỷ qua, với sự phát triển của công nghệ nano, đã chế tạo được những hạt nano kim loại, oxit kim loại, nano polyme,… mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng chúng vào việc xử lý vi sinh vật gây bệnh thực vật Trong các loại hạt nano thì nano Cu tỏ

ra có hiệu quả hơn trong việc kháng lại vi sinh vật gây hại cây trồng, đồng thời chúng cũng là dinh dưỡng cần thiết cho thực vật trong quá trình quang hợp, tham gia vào quá trình phân mô để tăng trưởng cây trồng, đó là vật liệu tương lai để phát triển nền nông nghiệp an toàn và bền vững

1.2 VẬT LIỆU NANO Cu2O-Cu/ALGINATE

1.2.1 Nano Cu và nano Cu 2 O

Cu là nguyên tố hóa học trong bảng tuần hoàn có số hiệu nguyên tử 29,

là kim loại dẻo, có tính dẫn điện và dẫn nhiệt cao nên được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: Xây dựng, vật liệu dẫn điện, dẫn nhiệt, vật liệu xúc tác quang, phát quang, quang điện tử [28] Cu là nguyên tố vi lượng cần thiết cho các loài động, thực vật bậc cao, nó là thành phần của enzyme vận chuyển oxy trong cơ thể Kim loại Cu và các hợp chất của Cu từ lâu đã được ứng dụng làm chất diệt khuẩn, diệt nấm và chất bảo quản gỗ [3,4]

Cu2O là một trong hai dạng oxit của Cu, có màu đỏ, rất bền với nhiệt (nóng chảy ở 1.240°C), không tan trong nước nhưng tan chậm trong môi trường kiềm đặc hoặc dung dịch NH3 đặc và tan tốt trong dung dịch axit Cu2O có cấu trúc tinh thể lập phương tâm mặt (fcc), là kim loại bán dẫn không độc hại, giá thành rẻ và có nguồn nguyên liệu dồi dào [29]

Vật liệu Cu và Cu2O ở kích thước nanomet có diện tích bề mặt lớn nên thể hiện các tính chất dẫn điện, dẫn nhiệt, kháng khuẩn cao vượt trội so với trạng thái vật liệu khối [30] Vì vậy, gần đây vật liệu nano Cu và nano Cu2O được quan tâm nghiên cứu sử dụng trong lĩnh vực công nghiệp điện tử, môi

trường và vật liệu kháng vi sinh vật phổ rộng đặc biệt là vi sinh vật gây hại cho thực vật Tuy nhiên các hạt nano Cu và nano Cu2O luôn có xu hướng kết tụ, tiến lại gần nhau làm tăng kích thước hạt dẫn đến làm giảm hoạt tính sinh học [31], vì vậy trong quy trình chế tạo vật liệu nano cần phải sử dụng các chất ổn định là chất hoạt động bề mặt hoặc các polyme tự nhiên Ưu điểm của vật liệu nano kim loại Cu và nano oxit Cu là được tổng hợp từ nguyên liệu thông dụng,

có chi phí thấp hơn nano Ag [32]

Trong canh tác nông nghiệp, ngoài khả năng kháng vi sinh vật gây hại, các nano hợp chất của kim loại Cu còn cung cấp nguyên tố dinh dưỡng vi lượng rất cần thiết giúp điều hòa sinh trưởng và phát triển thực vật Cụ thể Cu tham gia vào quá trình hình thành diệp lục và liên quan đến một số enzyme điều hòa các phản ứng sinh hóa của thực vật [9] Đối với cơ thể con người, Cu cũng là dinh dưỡng thiết yếu, nó là thành phần trong một số enzyme hình thành hemoglobin, trao đổi carbohydrate, collagen, elastin, keratin có tác dụng chống oxy hóa [5]

1.2.2 Các phương pháp tổng hợp nano Cu và nano Cu 2 O

Các nghiên cứu về tổng hợp nano Cu và nano Cu2O trên thế giới hiện nay chủ yếu tập trung vào việc nghiên cứu thay đổi các yếu tố để tạo ra các hạt nano kim loại Cu và oxit Cu có kích thước nhỏ và nồng độ Cu cao hơn Có thể tổng hợp các hạt Cu2O-Cu có kích thước nanomet bằng phương pháp hóa học hoặc phương pháp kết hợp hóa học và vật lý Zhu và cộng sự (2004) đã tổng hợp các hạt nano Cu có kích thước khoảng 10 nm bằng cách khử CuSO4.5H2O với tác nhân khử là NaH2PO2 kết hợp chiếu xạ vi sóng [33] Blosi và cộng sự (2011) tổng hợp nano Cu có kích thước hạt trung bình là 46 ± 9 nm bằng phương pháp polyol, sử dụng axit ascorbic làm chất khử và ổn định trong PVP [34] Khan và cộng sự (2016) tổng hợp thành công các hạt nano Cu và Cu2O có kích thước hạt trung bình lần lượt là 28,73 nm và 25,19 nm bằng quá trình khử hóa học muối CuSO4.5H2O sử dụng tác nhận khử là axit ascorbic và được ổn định trong tinh bột [35]

Tổng hợp một số công nghệ điều chế các hạt nano Cu2O bằng các kỹ thuật khác nhau được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Các phương pháp tổng hợp nano Cu2O

nano

Hình thái, Kích thước

Hạt

Đa tinh thể, kích thước ~

Màng mỏng

Hình cầu, kích thước nanomet

Nhiệt độ và thế cao, giá thành cao, cần kiểm soát

Đòi hỏi nhiệt độ, năng lượng cao và kiểm soát

áp suất, giá thành cao

[38]

4 Phun nhiệt phân Đồng nitrate trong dung

Hình cầu, kích thước 50 – 80

nm

Nhiệt độ cao, giá thành cao, bắt buộc kiểm soát chính xác nhiệt độ

[39]

5 Siêu âm hóa học Đồng II acetate với 1%

dung môi aniline-nước

Nhiệt độ và

áp suất cục

bộ cao

Hạt Tinh thể, kích thước nano

Yêu cầu về thiết bị đặc trưng, cần có nguồn năng lượng bên ngoài

[40]

6 Bức xạ vi sóng

Đồng acetate và dung dịch rượu benzyl, tổng hợp

nhanh

Nhiệt độ cao Hạt

Đa tinh thể, kích thước ~

38 nm

Rượu benzyl độc, các vấn đề an toàn, khó mở

rộng quy mô, giá thành

cao

[41]

7 Khử catốt

Khử dung dịch Cu2+ trong dung dịch polyme hoặc chất hoạt động bề mặt

Nhiệt độ

Đường kính ~

100 nm, chiều dài ⁓ 16 µm

Đòi hỏi kiểm soát pH (7 – 10) và nhiệt độ [42]

1.2.3 Alginate chiết xuất từ rong nâu Khánh Hòa

Alginate là muối của axit alginic, nó là loại polyme sinh học có trong rong biển Rong biển Việt Nam rất đa dạng và phong phú, đã phát hiện gần 700

loại, trong đó họ rong biển Mơ (Sargassaceae) là phổ biến nhất, có sản lượng cao nhất Họ rong biển Mơ thuộc bộ rong biển đuôi ngựa (Fucales), ngành rong nâu (Phaeophyceae) tập trung tại khu vực biển miền Trung Nam Bộ từ Bình

Định vào đến Bình Thuận, sản lượng rong biển ước tính khoảng 30.000 – 40.000 tấn, trong đó vùng biển Khánh Hòa chiếm sản lượng trên 11.000 tấn

[43]

Rong nâu là loài thực vật có giá trị cao về mặt dinh dưỡng, dược liệu bao gồm các axit amin, protein, axit béo không bão hòa, các vitamin, khoáng chất, polyphenol, các hợp chất chứa iốt, laminarin, axit alginic và fucoidan Trong

đó, hàm lượng axit alginic trong rong biển dao động từ 29,1 – 40,6% trên trọng lượng chất khô Ngoài ra rong biển còn chứa các hoạt chất khác như auxin, axit gibberellic, cytokinin nên còn được dùng làm chất kích thích tăng trưởng thực vật an toàn, hiệu quả [44]

Axit alginic là một copolyme được cấu tạo từ các gốc β-D-mannuronate và α-L-Guluronate bằng liên kết 1,4 glucoside (hình 1.2)

Hình 1.2 Đặc trưng cấu trúc của alginate: a) Các monome của axit alginic, b)

Cấu trúc chuỗi, cấu trúc dạng ghế, c) Các kiểu phân bố các khối trong mạch

alginate [45]

Các alginate có cấu trúc khác nhau phụ thuộc vào sự sắp xếp của các monome Alginate có khả năng phân hủy sinh học, hoàn toàn an toàn trong các thử nghiệm trên người và động vật Mặt khác, alginate là polyme tan trong nước tạo dung dịch có độ nhớt cao và có khả năng tạo gel với các cation của kim loại hóa trị 2

Alginate còn có khả năng tạo gel với những ion kim loại hóa trị 2, 3 Gel được tạo ra do tương tác tĩnh điện với ion kim loại, tạo ra gel không thuận nghịch với nhiệt và ít đàn hồi Khả năng tạo gel và độ bền của alginate phụ thuộc vào số lượng các đoạn guluronic (G), được giải thích bằng mô hình cấu trúc “hộp trứng” Khả năng tạo gel của các muối alginate còn phụ thuộc vào kích thước của ion kim loại liên kết Ái lực của alginate đối với các ion kim loại hóa trị 2 khác nhau giảm theo trình tự sau: Pb2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ba2+ >

Sr2+ > Ca2+ > Co2+

Trong điều chế các dung dịch keo nano kim loại và các vật liệu nano khác, alginate được sử dụng làm chất ổn định, ngăn chặn sự kết tụ của các hạt thành các hạt lớn hơn Với tính chất tạo gel của alginate đối với các ion kim loại hóa trị 2 như Cu2+ nêu trên, khi hòa tan dung dịch muối Cu2+ vào dung dịch alginate sẽ tạo gel kết tủa Chính vì vậy, dung dịch muối Cu2+ phải được tạo phức trước khi đưa vào dung dịch alginate

Các tác nhân tạo phức với muối Cu2+ có thể sử dụng là EDTA-Na, EDTA, NH3,… trong đó NH3 là tác nhân tạo phức với Cu2+ có chi phí thấp, tạo môi trường kiềm nên thuận lợi cho quá trình khử Cu2+ thành Cu2O vì quá trình khử Cu2+ thành Cu2O xảy ra trong môi trường kiềm (pH > 10) [46]

Ở Việt Nam, chất điều hòa sinh trưởng thực vật chứa hoạt chất alginate

đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cấp phép cho các sản phẩm như: T&D 4DD (Viện Nghiên cứu Hạt nhân – Đà Lạt), 2S Sea & See 12DD (Doanh nghiệp Tư nhân Thương mại Tân Quy) và rất nhiều các sản phẩm nhập khẩu khác

1.2.4 Cơ chế kháng vi sinh vật của vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate

Theo thống kê, nano Cu có hoạt lực cao trong phòng trừ trên 20 loại vi khuẩn, virus, vi nấm gây bệnh trên thực vật, động vật và con người [47] Cơ chế phòng trừ vi khuẩn, vi nấm gây bệnh trên thực vật của nano Cu, nano CuO

và nano Cu2O đã được một số một số tác giả nghiên cứu như sau: Cu làm thay

đổi cấu trúc 3 chiều của protein, do đó protein không thể thực hiện các chức năng bình thường, kết quả là bất hoạt vi sinh vật [48]; hợp chất của Cu tạo thành các gốc tự do vô hiệu hóa các virus [49]; Cu có thể phá vỡ cấu trúc enzyme chức năng bằng cách liên kết các nhóm có chứa lưu huỳnh hoặc carboxylat và các nhóm amino, tạo điều kiện cho hoạt động của các gốc tự do có hại trong vi sinh vật Các phản ứng redox lặp đi lặp lại ở các đại phân tử tạo ra các gốc tự

do OH–, do đó gây ra chết tế bào vi khuẩn, vi nấm [50]

Cho đến nay, các hợp chất của Cu vẫn thể hiện hiệu quả cao trong công tác phòng trừ nấm bệnh với hoạt tính xúc tác mạnh, chi phí thấp, ít độc, mặt khác, sau khi thực hiện nhiệm vụ kháng vi sinh vật, nano Cu sẽ chuyển thành

Cu2+ được cây trồng hấp thụ theo cơ chế hấp thụ dinh dưỡng không để lại tồn

dư Vì vậy, dung dịch keo nano Cu2O-Cu là một hoạt chất trừ vi nấm, vi khuẩn tiềm năng có hoạt tính sinh học cao Về cơ chế kháng khuẩn, tác giả Meghana

và cộng sự (2015) đã đưa ra mô tả cơ chế phòng trừ vi khuẩn sau khi nghiên

cứu sự kháng khuẩn trên E Coli của nano Cu như sau [6]: Các hạt nano Cu liên

tục giải phóng các ion Cu, các ion này mang điện tích dương sẽ hút tế bào vi khuẩn mang điện tích âm bằng lực hút tĩnh điện do đó các hạt nano Cu có khả năng bám dính tốt lên bề mặt tế bào vi khuẩn làm sản sinh các gốc tự do có tính oxy hóa mạnh (ROS) theo phản ứng Fenton:

Hình 1.3 Cơ chế phòng trừ vi khuẩn E coli của CuO và Cu2O [6]

Các hạt nano CuO và nano Cu2O có cơ chế kháng vi sinh vật được mô tả trong hình 1.3 Các hạt nano này xâm nhập qua thành tế bào của vi sinh vật và tương tác với các cấu trúc nội bào nhờ kích thước hạt nhỏ với năng lượng và diện tích bề mặt lớn Hoạt tính kháng khuẩn của nano Cu phụ thuộc vào kích thước hạt, ngoài ra nó còn phụ thuộc vào nồng độ hạt và nhiệt độ Khi kích thước hạt nhỏ, nồng độ hạt và nhiệt độ cao sẽ hạn chế sự kết tụ của các hạt nano làm tăng diện tích bề mặt giúp tương tác tốt với màng tế bào từ đó làm tăng độc tính đối với vi khuẩn [7]

1.2.5 Độc tính của nano Cu và nano Cu 2 O

Các muối Cu từ thời cổ đại đã được sử dụng làm thuốc trị nấm cho cây trồng Cho đến nay, các muối và hợp chất của Cu vẫn tỏ ra có hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh thực vật Tại Việt Nam, các sản phẩm thuốc BVTV gốc

Cu thường ở dạng hỗn hợp các muối vô cơ như CuSO4 và vôi Ca(OH)2 (hỗn hợp Bordeaux), CuOCl, CuCl, Cu(CH3COO)2 và CuCl2Cu(OH)3 Cho đến nay, các nghiên cứu đều xác nhận muối Cu ít độc với động vật máu nóng, không ảnh hưởng xấu đến cây trồng, ít tích lũy trong đất và nông sản Sản phẩm thuốc BVTV sử dụng hợp chất của Cu có phổ phòng trừ nấm bệnh rộng, phòng trừ được nhiều loại bệnh trên cây trồng do vi khuẩn và vi nấm gây ra Tuy nhiên

Gây chết tế bào

một số sản phẩm thuốc BVTV chứa Cu có những hạn chế nhất định như thuốc khi hoà tan trong môi trường kiềm hoặc các thuốc khác có tính kiềm, phân bón chứa anion PO43-, thì chúng bị giảm hoạt tính Nồng độ sử dụng của các muối

Cu trong phòng trừ bệnh thực vật tương đối cao từ 0,1 – 0,2% nên có thể để lại

dư lượng trên nông sản

Độ độc của nano Cu và các hợp chất nano Cu trên động vật máu nóng nhỏ hơn của các muối Cu2+ Các kết quả nghiên cứu về độc tính của các hợp chất nano Cu trên cơ thể động vật hiện nay được công bố còn tương đối ít vì chúng là loại vật liệu mới [51] Chen và cộng sự (2006) đã xác định được liều lượng gây chết 50% (LD50) của ion Cu, nano Cu qua đường miệng trên chuột tương ứng là 119 mg/kg và 413 mg/kg, kết quả cho thấy nano Cu ít độc hơn ion

Cu2+ (CuCl2) [8] Lee và cộng sự (2016) đã xác định độc tính cấp LD50 của nano Cu và ion Cu (CuCl2) qua đường miệng trên thỏ, kết quả nghiên cứu cho thấy thử nghiệm trên thỏ đực thì giá trị LD50 của nano Cu là 1.344 mg/kg cao hơn 2,1 lần so với ion Cu là 640 mg/kg Thử nghiệm trên thỏ cái cho thấy giá trị LD50 của nano Cu là 2.411 mg/kg cao hơn 4,2 lần so với ion Cu là 571 mg/kg [7] Nano Cu2O, Cu2O/zeolite có độc tính cấp thấp hơn ion Cu [52] Như vậy, các hạt nano Cu, nano Cu2O cũng giống như nano Ag, nano CuO và nano ZnO

có độc tính thấp hơn so với các muối kim loại của chúng, đặc biệt đối với động vật giáp xác, cá trong nghiên cứu của Bondarenko và cộng sự (2013) [5] Như vậy, sử dụng vật liệu nano trong nông nghiệp an toàn hơn so với sử dụng muối kim loại kể cả trong môi trường nước, thủy sản

Khi ở ngoài môi trường, dưới tác động của oxy và nước, các hạt nano

Cu, CuO, Cu2O dễ dàng chuyển thành Cu2+ làm dinh dưỡng vi lượng cho cây trồng Vì vậy, vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate có độ an toàn cao khi sử dụng trong nông nghiệp

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm vừa qua, ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu tổng hợp và định hướng sử dụng các hợp chất của nano kim loại Cu làm thuốc BVTV

vì chúng có hiệu quả ức chế vi sinh vật gây bệnh thực vật cao trên một số loại cây trồng và tương đối an toàn Đến nay, việc sử dụng các hợp chất nano kim

loại Cu trong phòng trừ bệnh cho cây trồng chưa được thương mại hóa vì các công bố mới ở trong giai đoạn thử nghiệm

Một số nghiên cứu về tổng hợp nano Cu định hướng ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp đã được công bố bao gồm: Nguyễn Hoài Châu và cộng sự (2014) đã thử nghiệm sử dụng nano Cu để xử lý hạt giống ngô nhằm kích thích sinh trưởng, tăng năng suất và tăng khả năng chống chịu cho cây ngô, đã làm tăng trưởng chiều cao cây ngô vượt trội hơn đối chứng 10 cm và tăng năng suất hơn 33% so với hạt ngô không qua xử lý nano Cu [53] Năm 2014, Cao Văn

Dư và cộng sự cũng đã nghiên cứu chế tạo nano Cu bằng phương pháp sử dụng chất khử hydrazin để khử Cu2+ trong chất ổn định glycerin/ Polyvinylpyrrolidone (PVP) và thử nghiệm hiệu ứng kháng bệnh nấm hồng trên

cây cao su, xác nhận vật liệu có hiệu quả trong việc kháng nấm Corticium salmonicolor [54]

Sử dụng hạt nano kim loại để kháng vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng đã được nghiên cứu bởi tác giả Nguyễn Thị Thu Thủy (2018) khi nghiên cứu sử

dụng nano đồng-bạc/silica để ức chế vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa Trong thí nghiệm in vitro, vật liệu nano đồng-bạc/silica ở nồng độ

70 ppm và 100 ppm đạt 100% hiệu lực ức chế vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy Trong thí nghiệm nhà lưới, nano đồng-bạc/silica với nồng độ 100 ppm đã làm giảm tỷ lệ bệnh bạc lá lúa từ 87,22% xuống còn 5,56%, giảm chỉ số bệnh bạc

lá lúa từ 56,35% xuống còn 0,58%, hiệu quả tương đương với thuốc thương mại Kasumin 2L [55] Bùi Duy Du và cộng sự (2017) đã nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano Cu2O/zeolite A dạng bột, vật liệu này có hiệu lực phòng trừ

99,99% vi khuẩn E coli tại nồng độ Cu là 15 ppm [52] Vật liệu dạng dung

dịch keo nano CuCl ổn định trong chitosan có hiệu lực phòng trừ các bệnh trên cây trồng ở mức độ cao như bệnh đạo ôn lúa (91%), đốm nâu thanh long (78%), bệnh chết chậm trên hồ tiêu (68%) trong thí nghiệm ngoài đồng ruộng đã được công bố bởi nhóm tác giả Bùi Duy Du (2017) [56] Ngoài khả năng kháng lại

vi sinh vật, một số loại nano Cu còn có khả năng kháng tuyến trùng rễ, ví dụ vật liệu nano CuCl/zeolite 4A dạng bột có hiệu lực phòng trừ tuyến trùng rễ gây bệnh trên cây cà phê ở nồng độ Cu 20 ppm đạt gần 100% [57] Trong số các vật liệu nêu trên, nano CuCl có hiệu quả phòng trừ nấm bệnh cao nhưng chúng chứa ion Cl- trong dung dịch là một yếu tố gây nên tình trạng cháy lá khi

thời tiết nắng nóng, làm sượng trái trên cây có múi như cam, bưởi, quýt, sầu riêng, mít, Để khắc nhược điểm này, thay vì sử dụng tiền chất CuCl phản ứng với chất khử hydrazin để tạo ra nano CuCl, trong nghiên cứu của luận văn này

sẽ sử dụng CuSO4 tác dụng với chất khử trong môi trường kiềm để tạo ra vật liệu nano Cu2O-Cu ổn định trong alginate, vật liệu không chứa Cl- là giải pháp khắc phục được tác hại của Cl- nêu trên Việc tạo ra nano Cu2O-Cu xảy ra ở môi trường kiềm, vì vậy sử dụng polyme alginate làm chất ổn định là phù hợp

vì chúng là chất điều hòa sinh trưởng thực vật, tương hợp sinh học, tan và bền trong môi trường kiềm Trong nghiên cứu của Bùi Duy Du và cộng sự (2019)

và Đoàn Thị Bích Ngọc và cộng sự (2020) đã báo cáo rằng vật liệu nano Cu2

O-Cu/alginate với hàm lượng Cu 30 ppm đã ức chế hoàn toàn nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu thanh long và vi khuẩn Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn lúa trong thí nghiệm in vitro [58,59]

Mặc dù vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate đã được công bố có hiệu quả

trong việc ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long và nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên cây lúa nhưng chưa

có các nghiên cứu hiệu lực kháng trên đối tượng vi khuẩn gây hại thực vật, cụ

thể là vi khuẩn Xanthomanas sp gây bệnh bạc lá trên cây lúa Vì vậy, kết quả

nghiên cứu hiệu ứng kháng của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate đối với vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa trong luận văn này là những nghiên cứu mới chưa từng được công bố

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Để kiểm soát vi khuẩn Xanthomonas sp gây bệnh bạc lá trên lúa đã có

nhiều nghiên cứu và biện pháp được áp dụng

Phương pháp sử dụng biện pháp sinh học được nghiên cứu bởi Pustika

(2020), tác giả sử dụng chế phẩm vi sinh vật đối kháng gồm Azotobacter chroococum, Azotobacter vinelandii, Azospirillum sp., Pseudomonas cepacia, Penicillium sp và Acinetobacter với mật độ trên 107 Cfu/g phun lên lúa đã làm giảm chỉ số bệnh bạc lá xuống mức thấp 14,44% so với nghiệm thức không xử

lý 17,5% sau 10 tuần gieo cấy [60] Phương pháp xử lý hạt giống được

Nagendran và cộng sự (2013) báo cáo các lô lúa thí nghiệm xử lý ngâm hạt giống lúa với Endophytes có chỉ số bệnh bạc lá lúa thấp hơn đáng kể (2,8%) so

với lô lúa đối chứng không xử lý (19,82%) khi gieo trồng trong điều kiện nhà

lưới [61]

Đối với biện pháp sử dụng hóa chất tổng hợp, Ibrahim và cộng sự (2019)

đã sử dụng vi khuẩn Endophytes (các chủng vi sinh vật nội sinh thực vật) để tổng hợp các hạt nano Ag có kích thước 25 – 50 nm, kết quả thử nghiệm hoạt

tính kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae khi sử dụng vật liệu ở

nồng độ 20 µg/mL cho thấy đường kính vòng vô khuẩn là 17,3 mm trong thí

nghiệm đục lỗ thạch [62] Li và cộng sự (2014) đã nghiên cứu in vitro sử dụng

các dẫn xuất 2,5-substituted-1,3,4-oxadiazole/thiadiazole sulfone có tác dụng

ức chế vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae và Xanthomonas oryzae pv oryzicolaby via gây bệnh bạc lá lúa hiệu quả với EC50 là 1,07 µg/mL Hoạt chất này thể hiện khả năng khoáng khuẩn trong điều kiện nhà lưới đạt hiệu quả phòng trừ bệnh bạc lá lúa khoảng 63% với nồng độ sử dụng là 200 µg/mL tại

thời điểm 15 ngày sau xử lý [63]

Gần đây, các loại vật liệu nano đã được nghiên cứu để kiểm soát bệnh bạc lá lúa Sherkhane và cộng sự (2018) đã tổng nano Ag bằng dịch chiết lá cây

Tulsi, khi sử dụng vật liệu ở nồng độ 15 mM để kháng vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv punicae theo phương pháp đục lỗ thạch cho thấy đường kính

vòng vô khuẩn là 22 mm lớn hơn so với đối chứng sử dụng AgNO3 là 12 mm [64]

Nano Cu2O có hiệu lực kháng khuẩn cao, tương đương với nano CuO và nano Cu [30,51] Trong thời gian vừa qua, nhiều nghiên cứu sử dụng các hợp chất nano Cu nhằm quản lý các loài vi sinh vật gây hại trên một số cây trồng

đã được công bố bao gồm: Huang và cộng sự (2015) đã báo cáo rằng nồng độ

nano CuO trong khoảng 500 – 750 mg/kg có khả năng ức chế nấm A solani

gây bệnh đốm vòng trên cây cà chua, đạt hiệu lực ức chế từ 70,7 – 81,7% Kết quả này cho thấy CuO có hiệu lực cao hơn so với đối chứng sử dụng carbendazim 50% [65] Liao và cộng sự (2019) công bố nano Cu ở nồng độ

100 µg/mL có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Xanthomonas perforans gây bệnh đốm vi khuẩn trên cây cà chua trong thí nghiệm in vitro

[66]

Nhận xét:

Qua nghiên cứu tổng quan tài liệu, có thể thấy rằng bệnh bạc lá trên lúa

do vi khuẩn Xanthomonas sp là bệnh xuất hiện thường xuyên, gây ảnh hưởng

lớn đến năng suất trong canh tác lúa ở Việt Nam Có nhiều biện pháp để quản

lý bệnh bạc lá lúa, trong đó việc sử dụng thuốc BVTV được xem là biện pháp phòng trừ phổ biến được nông dân lựa chọn để giảm thiểu thiệt hại do loại bệnh này gây ra Hiện nay, tình trạng lạm dụng thuốc BVTV tổng hợp hữu cơ có thể phát sinh vi sinh vật kháng thuốc và ảnh hưởng đến sức khỏe của người sản xuất, đồng thời để lại dư lượng trên nông sản gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng

Ngày nay, công nghệ nano được biết đến là một trong những phương pháp tạo ra vật liệu mới có thể kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh thực vật Phương pháp tổng hợp các hạt nano Cu2O-Cu từ muối Cu2+ trong polyme bảo

vệ, sử dụng chất khử để tạo ra dung dịch keo nano là một công nghệ đơn giản, chi phí thấp và có thể phát triển với quy mô lớn Cho đến nay, các tác giả mới chỉ nghiên cứu điều chế các dung dịch keo nano Cu với nồng độ Cu thấp từ 0,01-10 mM nên ít có giá trị thực tiễn [30] Trong các chất khử hóa học để khử

Cu2+, hydrazin được báo cáo là một tác nhân khử hiệu quả so với axit ascorbic

và glucose do phản ứng xảy ra ở nhiệt độ thường không phải gia nhiệt và tạo ra các hạt có kích thước nhỏ và đồng đều hơn [67] Các hạt nano có diện tích bề mặt lớn và năng lượng bề mặt cao nên lực hấp dẫn giữa chúng rất lớn, nhanh chóng va chạm xảy ra kết tụ và phá hủy hệ keo nano Vì lý do đó, cần thiết phải tạo ra lớp bảo vệ giữa các hạt nano bằng cách sử dụng chất hoạt động bề mặt, các chất đóng nắp có cấu trúc mao quản hoặc các polyme như alginate Alginate phù hợp với quy trình điều chế nano Cu2O-Cu vì chúng tương hợp sinh học với

Cu, tan và bền trong môi trường kiềm, ngoài ra chúng còn có khả năng chống oxy hóa và ngăn cản oxy xâm nhập vào dung dịch, giúp tạo ra các hạt nano Cu bền không bị oxy hóa Tổng hợp các kiến thức trên, trong nghiên cứu của luận văn này chúng tôi sử dụng tiền chất là CuSO4 tạo phức với dung dịch NH3 và phân tán trong dung dịch alginate Khánh Hòa, sử dụng chất khử hydrazin để phản ứng với dung dịch trên tạo thành vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate có độ

bền cao, định hướng ứng dụng làm chất kiểm soát vi khuẩn Xanthomonas sp

gây bệnh bạc lá trên lúa Ngoài khả năng kháng vi khuẩn, vi nấm do có kích

thước nhỏ, năng lượng bề mặt lớn, vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate còn là dinh dưỡng giúp tăng trưởng cây trồng nên chúng không để lại dư lượng trên nông sản Như vây, vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate là chất kiểm soát bệnh thực vật

an toàn, đồng thời là loại phân bón vi lượng hiệu quả cao Công nghệ tổng hợp vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate sử dụng hóa chất thông dụng có giá thấp, thiết

bị đơn giản nên tạo ra sản phẩm có giá thành hợp lý rất có tiềm năng thay thế các loại thuốc BVTV hữu cơ độc hại

Gần đây, đã có một vài công trình nghiên cứu sử dụng các hạt nano Cu

và Cu2O làm chất kiểm soát vi sinh vật gây hại cây trồng [34,34] Tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của các hạt nano

này trong thí nghiệm in vitro thực hiện trên đĩa thạch nên tác động của chúng

với vi sinh vật ngoài môi trường chưa được đánh giá

Các nghiên cứu trong luận văn này thực hiện một cách hệ thống nghiên

cứu hoạt tính kháng vi khuẩn Xanthomonas sp ở điều kiện in vitro trong thí

nghiệm đĩa thạch, dựa vào kết quả này, thực hiện xác định hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa trong điều kiện nhà lưới nhằm có các kết quả khoa học tương đối chính xác về khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa trong điều kiện gần với điều kiện xử lý vật liệu ngoài đồng ruộng

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Vi khuẩn Xanthomonas sp được cung cấp bởi Bộ môn Bảo vệ thực vật

– Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam

Alginate chiết xuất từ rong nâu Khánh Hòa (có khối lượng phân tử ~ 51.200 g/mol) được cung cấp bởi Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng

Hóa chất tinh khiết CuSO4.5H2O (99,99%), N2H4.H2O (80%), NH3

(30%) và poly ethylen glycol (PEG) 600 của Merck – Đức Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Luria Bertani (LB) của Himedia – Ấn Độ

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp tổng hợp vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate

Trong luận văn, vật liệu nano Cu2O-Cu được tổng hợp bằng cách sử dụng tiền chất là CuSO4.5H2O, chất khử là hydrazin hydrate và chất ổn định là alginate tham khảo theo quy trình tổng hợp nghiên cứu trước đây của nhóm tác giả Bùi Duy Du và cộng sự (2019) [58] Quy trình tổng hợp 250 mL vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được trình bày trong hình 2.1, gồm các công đoạn sau:

Công đoạn 1: Tạo phức Cu2+với dung dịch NH3

Cân 5 g CuSO4.5H2O hòa tan hoàn toàn trong 5 mL nước thu được dung dịch CuSO4 Sau đó thêm 5,5 mL dung dịch NH3 25% vào dung dịch CuSO4

để tạo phức [Cu(NH3)4]2+ nhằm tránh việc tạo gel giữa Cu2+ và alginate

Công đoạn 2: Chuẩn bị dung dịch alginate/phức [Cu(NH3)4]2+

Cân 12,5 g alginate hòa tan trong 225 mL nước, khuấy gia nhiệt ở 60°C trong 2 giờ thu được dung dịch alginate Sau đó cho dung dịch phức [Cu(NH3)4]2+ vào dung dịch alginate, tiếp tục khuấy trong 10 phút để hỗn hợp đồng nhất thu được hỗn hợp dung dịch alginate/phức [Cu(NH3)4]2+

Công đoạn 3: Khử Cu2+ thành Cu+ và Cu°

Thêm từng giọt 9 mL dung dịch chất khử hydrazin (N2H4 8%) vào cốc đựng hỗn hợp dung dịch alginate/phức [Cu(NH3)4]2+, khuấy trên máy khuấy từ Trong quá trình này sẽ xảy ra phản ứng khử Cu2+ thành Cu+ và Cu° có kích

thước nano ổn định trong alginate Sau khi cho hết dung dịch chất khử hydrazin 8%, tiếp tục khuấy trong khoảng 1 giờ để phản ứng khử xảy ra hoàn toàn

Công đoạn 4: Thêm 2,5 g PEG vào dung dịch keo nano Cu2Cu/alginate, khuấy trong 1 giờ thu được vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate Tổng thể tích của hỗn hợp phản ứng được điều chỉnh thành 250 mL bằng cách thêm nước khử ion

O-Hình 2.1 Quy trình tổng hợp vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate

2.2.2 Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

TEM là một kỹ thuật hiển vi trong đó dòng điện tử đi xuyên qua một màng mỏng của mẫu đo và tương tác với nó Một hình ảnh được tạo thành từ

sự tương tác của điện tử đi xuyên qua mẫu đo, hình ảnh này được phóng đại và tập trung lên một thiết bị nhận ảnh như là màn hình huỳnh quang (fluorescent screen) hay lớp phim nhằm xác định kích thước hạt nano Cu2O-Cu/alginate

Về mặt lý thuyết, độ phân giải cực đại d nhận được từ ánh sáng bị giới hạn bởi bước sóng của các photon được dùng để quan sát mẫu

DD keo nano Cu2O-Cu/alginate

Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate PEG

d = λ2nsinαHiện nay, độ phân giải của kính hiển vi sử dụng ánh sáng khả kiến với bước sóng tương đối lớn từ 400 – 700 nm bằng cách dùng chùm điện tử (electron bean) Theo lý thuyết Broglie, các điện tử vừa có tính chất sóng vừa

có tính chất hạt Điều này có nghĩa là chùm điện tử có thể đóng vai trò như là chùm bức xạ điện từ Bước sóng của điện tử liên hệ với động năng thông qua phương trình Broglie

mo: Khối lượng tịnh của điện tử

E: Năng lượng của electron được tăng tốc

Các điện tử được tạo ra thông qua sự phát xạ ion nhiệt từ một dây tóc làm bằng tungsten Các điện tử này được tăng tốc bằng một điện trường (được tính bằng volt) Các điện tử khi đi qua mẫu chứa đựng những thông tin về mật

độ điện tử, pha cấu trúc tinh thể, dòng điện tử này dùng để tạo hình ảnh

Tiến hành: Pha loãng dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate đến nồng độ thích hợp và đánh tan bằng máy siêu âm trong 10 phút Sử dụng pipet nhỏ 1 –

2 giọt dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate đã pha loãng lên bề mặt đế mẫu Sấy khô và tiến hành chụp ảnh TEM trên thiết bị đo TEM – JEM 1400 tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương có các thông số M = x50 – x600.000, d=3A0, U= 40 –

100 kV

2.2.3 Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD)

Phương pháp XRD dựa vào hiện tượng nhiễu xạ của chùm tia X trên mạng lưới tinh thể Khi bức xạ tia X tương tác với vật chất sẽ tạo hiệu ứng tán

xạ đàn hồi với các điện tử của các nguyên tử trong vật liệu có cấu trúc tinh thể,

sẽ dẫn đến hiện tượng nhiễu xạ tia X

Theo lý thuyết cấu tạo tinh thể, mạng tinh thể được xây dựng từ các nguyên tử hay ion phân bố đều trong không gian theo một trật tự nhất định Khi

chùm tia X chiếu tới bề mặt tinh thể và đi sâu vào bên trong mạng lưới tinh thể thì mạng lưới này đóng vai trò như một cách tử nhiễu xạ đặc biệt Các nguyên

tử hoặc ion bị kích thích bởi chùm tia X sẽ thành các tâm phát ra các tia phản

xạ Mặt khác, các nguyên tử hoặc ion này được phân bố trên các mặt phẳng song song

Mối liên hệ giữa khoảng cách hai mặt nhiễu xạ song song (dhkl), góc giữa chùm tia X và mặt phẳng phản xạ (θ) với bước sóng (λ) được biểu thị bằng hệ phương trình Vulf – Bragg:

2dhklsin θ = nλ Đây là phương trình cơ bản để nghiên cứu cấu trúc tinh thể Căn cứ vào cực đại nhiễu xạ trên giản đồ (giá trị 2) có thể suy ra d theo công thức trên So sánh giá trị d tìm được với giá trị d chuẩn sẽ xác định được cấu trúc mạng tinh thể chất cần nghiên cứu

Kích thước của hạt được tính theo phương trình Scherrer như sau:

2.2.4 Phương pháp đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR)

Chùm tia hồng ngoại phát ra từ nguồn phát được tách ra thành hai phần, một phần đi qua mẫu và một phần đi qua môi trường đo – tham chiếu (dung môi) rồi được bộ phận tạo đơn sắc tách thành từng bức xạ có tần số khác nhau và chuyển đến detector Detector sẽ so sánh cường độ hai chùm tia và chuyển thành tín hiệu điện có cường độ tỷ lệ với phần bức xạ đã bị hấp thu bởi mẫu Dòng điện này có cường độ rất nhỏ nên phải nhờ bộ khuếch đại tăng lên

nhiều lần trước khi chuyển sang bộ phận tự ghi vẽ lên bản phổ hoặc đưa vào máy tính xử lý số liệu rồi in ra phổ

Phương pháp FT-IR được sử dụng để ghi nhận các dao động đặc trưng của các liên kết hóa học giữa các nguyên tử Phương pháp này cho phép phân tích với hàm lượng chất mẫu rất thấp và có thể phân tích cấu trúc, định tính và

cả định lượng Các đỉnh phổ hồng ngoại đặc trưng cho nhóm chức được gán với các dao động của liên kết có mặt trong phân tử hợp chất hoá học

Tiến hành: Dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate được kết tủa với etanol 90%, tỷ lệ Vetanol/Vdung dịch vật liệu = 2/1, lọc và rửa kết tủa 3 lần bằng etanol 70%, sấy chân không ở nhiệt độ 60°C thu được mẫu vật liệu dạng bột Cân 0,002 g mẫu, trộn chung với 0,2 g KBr rồi ép thành viên có đường kính 13

mm và chiều dày 0,5 mm Các nhóm chức và liên kết hóa học của vật liệu nano

Cu2O-Cu/alginate được xác định bằng phổ hồng ngoại trên máy FT-IR Model 8400S, số sóng từ 7.800 – 350 cm-1 tại Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng

2.2.5 Phương pháp đo phổ tử ngoại – khả kiến (UV-vis)

Khi áp dụng định luật Lambert - Beer cho trường hợp vật chất là dung dịch đựng trong cuvét có độ dày, l chứa chất hấp thụ có nồng độ C Nhà bác học Beer đã đưa ra định luật Lambert – Beer: Với cùng bề dày của lớp dung dịch, hệ số hấp thụ k tỉ lệ với nồng độ của chất hấp thụ của dung dịch

C: Nồng độ dung dịch, đo bằng mol/l

l: Bề dày của cuvét đựng dung dịch, đo bằng cm

ε: Hệ số tắt phân tử hay hệ số hấp thụ phân tử ε là đại lượng xác định, phụ thuộc vào bản chất của chất hấp thụ, bước sóng λ của bức xạ điện từ và nhiệt độ

Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào việc đo cường độ ánh sáng còn lại sau khi đi qua dung dịch bị chất phân tích hấp thụ một phần Nếu dung dịch phân tích trong suốt thì gọi là phương pháp đo màu Phương pháp đo phổ

tử ngoại – khả kiến UV-vis có thể dùng để định tính, định lượng các chất có

màu và dung dịch keo

Tiến hành: Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được để ổn định trong điều kiện bình thường, pha loãng đến 0,1 mM (tính theo nồng độ ban đầu), dung môi là nước, sau cho vào cuvet thạch anh có chiều dài đường truyền quang 1 cm, phổ UV-vis được đo trong dải bước sóng (wavelength) từ 800 – 200 nm, trên máy Jasco-V630 – Nhật Bản

Dựa trên kết quả cường độ hấp thụ (E) và bước sóng hấp thụ UV-vis cực đại (max) của dung dịch keo để suy đoán sự thay đổi tính chất và liên kết của vật liệu

2.2.6 Phương pháp khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS)

Phương pháp ICP-MS là một kỹ thuật phân tích dùng để xác định nồng

độ đa nguyên tố và đồng vị trong các mẫu chất lỏng, rắn hoặc khí Nó kết hợp nguồn plasma argon tạo ion với giới hạn phát hiện nhạy cảm của phát hiện khối phổ

Với kích thước mẫu nhỏ, phải đảm bảo rằng các mẫu được thu thập là đại diện cho vật liệu khối Do ICP-MS có thể phát hiện các yếu tố ở nồng độ dưới dạng vài nanogram mỗi lít (phần nghìn tỷ), cần phải cẩn thận trong việc thu thập và lưu trữ mẫu trước khi đo Nên hạn chế sử dụng các dụng cụ thủy do các tạp chất bị rò rỉ từ thủy tinh hoặc sự hấp thụ chất phân tích bằng thủy tinh Nếu sử dụng thủy tinh, cần được rửa định kỳ bằng chất oxy hóa mạnh như axit cromic (H2Cr2O7) hoặc chất tẩy thủy tinh thương mại Vật chứa mẫu sử dụng nhựa PTFE hoặc Teflon Tất cả các vật chứa, pipet, đầu pipet nên được ngâm trong HNO3 từ 1 – 2%

Mẫu ở dạng rắn phải được nghiền thành bột mịn với cối và chày sứ sau

đó rây qua lưới Mẫu đầu tiên nên được loại bỏ để tránh nhiễm bẩn từ vữa hoặc rây Phá mẫu bột sau rây bằng axit đậm đặc siêu tinh khiết hoặc các tác nhân oxy hóa như axit chloric (HClO3) và pha loãng theo đúng thứ tự cường độ với HNO3 từ 1 – 2%

Mẫu ở dạng khí cũng có thể được phân tích bằng cách tiêm trực tiếp vào dụng cụ Ngoài ra, thiết bị sắc ký khí có thể được ghép nối với máy ICP-MS để tách nhiều khí trước khi đưa vào mẫu

Mẫu ở dạng lỏng hoặc dung dịch, các mẫu phải được pha loãng với HClO3 siêu tinh khiết 1 – 2% đến nồng độ thấp để tạo ra cường độ tín hiệu thấp hơn Sau khi pha loãng, mẫu phải được lọc qua màng 0,25 – 0,45 μm để loại

Tiến hành: Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được đo và phân tích hàm lượng Cu trên máy Perkin Elmer NexION 2000 – Mỹ tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng

2.2.7 Đánh giá độ độc của vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate

Chuột nhắt trắng giống Swiss được cung cấp bởi Viện Pasteur TP.HCM

có trọng lượng từ 18 – 22 g Chuột được nuôi ở điều kiện 25°C, ẩm độ phòng nuôi 65 – 72% với nguồn thức ăn tiêu chuẩn được cung cấp từ Viện Pasteur TP.HCM có bổ sung giá sống Nước uống sạch được cung cấp đầy đủ qua bình nước chuyên dụng cho chuột Thí nghiệm thử nghiệm độc tính cấp trên chuột trắng thực hiện tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường (Đại học Nông Lâm TP.HCM)

2.2.7.1 Xác định độc tính qua đường miệng trên chuột

Độc tính cấp đường miệng được xác định theo phương pháp hướng dẫn

OECD cho các thử nghiệm về Hóa chất 423 – Độc tính cấp đường miệng 17/12/2001 [68]

Sau khi đưa về phòng thí nghiệm, chuột được nuôi ổn định trong 3 ngày, ngừng cung cấp thức ăn cho chuột một đêm trước khi tiến hành thử nghiệm Cân và ghi nhận trọng lượng từng con, tiến hành ghi số thứ tự trên lưng chuột

và cho vào hộp nuôi lớn (hình 2.2) Chuột được chăm sóc ở điều kiện nhiệt độ

25°C ± 3°C, độ ẩm tương đối 40% – 70% Thử nghiệm được thực hiện trên 2 nhóm chuột gồm:

+ Nhóm chứng âm: 06 con chuột khỏe mạnh (3 con chuột đực và 3 con chuột cái)

+ Nhóm thử nghiệm: 06 con chuột khỏe mạnh (3 con chuột đực và 3 con chuột cái)

Liều thử nghiệm là 300 mg/kg và 3.000 mg/kg khối lượng cơ thể chuột Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate được pha loãng bằng nước cất để đạt nồng độ là 10 mg/mL và 100 mg/mL Thể tích cho uống là 0,3 mL/10 g trọng lượng cơ thể chuột với nồng độ 10 mg/mL ở liều thử nghiệm 300 mg/kg và 0,3 mL/10g trọng lượng cơ thể chuột với nồng độ 100 mg/mL ở liều thử nghiệm 3.000 mg/kg

Cho chuột uống chất thử bằng kim cong chuyên dụng (1 mL), theo dõi

tỷ lệ chết ở chuột trong vòng 15 ngày sau khi uống chất thử Tính liều LD50 theo phương pháp Behrens – Karber [69]

Hình 2.2 Chuột được nuôi trong hộp nhựa có gắn nắp lưới

2.2.7.2 Xác định kích ứng da (nhạy cảm da) trên chuột

Xác định kích ứng da trên chuột theo hướng dẫn OECD cho các thử nghiệm về Hóa chất 406 – Nhạy cảm da 17/7/1992 [70]

Sau khi được đưa về phòng thí nghiệm, chuột được nuôi ổn định trong 3 ngày, khoảng 24 giờ trước khi tiến hành thử nghiệm, cạo sạch lông ở vùng lưng của chuột, diện tích vùng cạo là 1 cm2 (hình 2.3) Chuột được chăm sóc ở điều

kiện nhiệt độ 25°C ± 3°C, độ ẩm tương đối 40% – 70% Thử nghiệm được thực hiện trên 03 nhóm chuột gồm:

+ Nhóm chứng âm: gồm 06 con chuột khỏe mạnh (03 con chuột đực và

03 con chuột cái) Chất tiếp xúc gây nhạy cảm là nước cất, chất thử thách là nước cất

+ Nhóm thử nghiệm: gồm 20 con chuột khỏe mạnh (10 con chuột đực và con chuột 10 cái) Chất tiếp xúc gây nhạy cảm là vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate (dùng nguyên mẫu), chất thử thách là vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate (dùng nguyên mẫu)

+ Nhóm chứng dương: gồm 06 con chuột khỏe mạnh (03 con chuột đực

và 03 con chuột cái) Chất tiếp xúc gây nhạy cảm là 2,4-dinitrochlorobenzene với nồng độ 8 mg/mL, chất thử thách là 2,4-dinitrochlorobenzene với nồng độ

là 4 mg/mL

Bôi 2 g chất thử/kg trọng lượng cơ thể chuột lên vùng da đã cạo lông Các thời điểm tiếp xúc gây nhạy cảm là ngày 0, ngày 7 và ngày 14 Thời điểm thử thách là ngày 28

Theo dõi các biểu hiện phản ứng nhạy cảm da (ban đỏ, phù nền hoặc các thay đổi khác trên da) của chuột trong 24 giờ và 48 giờ sau khi thử thách và đánh giá tỷ lệ nhạy cảm

Hình 2.3 Chuột được đánh số thứ tự và ghi nhận trọng lượng ban đầu

2.2.8 Nghiên cứu hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp của vật

liệu nano Cu 2O-Cu/alginate trong thí nghiệm in vitro

Thí nghiệm nghiên cứu hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp in vitro được tham khảo theo phương pháp của Nguyễn Thị Thu Thủy (2018) [55]

Vi khuẩn Xanthomonas sp sau khi đưa về phòng thí nghiệm được bảo

quản ở 4°C Trước các thí nghiệm, cấy truyền vi khuẩn trên đĩa petri chứa 15 –

20 mL môi trường LB Agar (25 g LB, 16 g agar, 1.000 mL nước, hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút) để tạo khuẩn lạc đơn Bước tiếp theo, cấy tăng sinh

chủng vi khuẩn Xanthomonas sp bằng cách chuyển một phần khuẩn lạc đơn

của vi khuẩn vào bình tam giác 250 mL chứa 200 mL môi trường LB Broth (25

g LB, 1.000 mL nước, hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút) Tiếp tục đưa bình tam giác chứa dịch vi khuẩn đem đi lắc tăng sinh ở 170 vòng/phút trong 24 giờ [71] Dung dịch tăng sinh vi khuẩn được pha loãng đến 10-6 lần, hút 0,1 mL dung dịch vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng nhỏ lên đĩa petri chứa môi trường

LB Agar bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate với các nồng độ Cu là 15 ppm; 22,5 ppm; 30 ppm và thuốc thương mại Xantocin 40WP với nồng độ broponol 250 ppm, sử dụng que cấy thủy tinh trang đều lên bề mặt môi trường rồi tiến hành nuôi cấy ở cùng điều kiện (28°C)

Thí nghiệm gồm 05 nghiệm thức được lặp lại 03 lần, mỗi nghiệm thức lặp lại trên 03 đĩa petri Các nghiệm thức gồm:

NT1: Môi trường LB Agar

NT2: Môi trường LB Agar bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate 15 ppm Cu

NT3: Môi trường LB Agar bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate 22,5 ppm Cu NT4: Môi trường LB Agar bổ sung nano Cu2O-Cu/alginate 30 ppm Cu

NT5: Môi trường LB Agar bổ sung thuốc thương mại Xantocin 40WP 250 ppm broponol

Xác định mật độ vi khuẩn ở các nghiệm thức sau 24 giờ nuôi cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, hiệu lực ức chế (HLUC) vi khuẩn được xác định như sau:

c: Mật độ khuẩn lạc ở nghiệm thức bổ sung chất thử

2.2.9 Nghiên cứu hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá lúa của vật liệu nano Cu 2 O-Cu/alginate trong thí nghiệm nhà lưới

Thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá lúa của vật liệu nano

Cu2O-Cu/alginate trong điều kiện nhà lưới được tham khảo từ nghiên cứu của Đoàn Thị Bích Ngọc và cộng sự (2020) [59]

Thời gian: từ 18/04/2020 đến 25/07/2020

Địa điểm nghiên cứu: Khu nhà lưới Viện Khoa học Kỹ thuật Nông

nghiệp miền Nam – Số 121 Nguyễn Bỉnh Khiêm, quận 1, thành phố Hồ Chí Minh

Giống lúa: Lúa nếp 46 (IR 4625)

Đất thịt được xử lý với vôi, sau đó cho vào các chậu nhựa với lượng đất bằng nhau, mỗi chậu gồm 7 kg đất thịt đã trộn với 4g phân bón NPK 16-16-8 Cấy 6 dảnh mạ giống lúa nếp IR 4625 trong các chậu nhựa có kích thước Ø30×26,8 cm Các chậu được đặt trong nhà lưới

Phương pháp bón phân:

− Bón lần 1: Bón 3 g phân bón NPK 16-16-8 vào ngày thứ 10 sau cấy

− Bón lần 2: Bón 3 g phân bón NPK 16-16-8 vào ngày thứ 20 sau cấy

− Bón lần 3: Bón 3 g phân bón NPK 21-5-21 vào ngày thứ 5 trước khi trổ bông

Cây lúa sau 35 ngày tuổi thì bắt đầu phun 20 mL dung dịch nano Cu2Cu/alginate ở các nồng độ Cu là 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm và thuốc thương mại Xantocin 40WP (250 ppm broponol) theo nồng độ khuyến cáo Nghiệm thức đối chứng âm phun nước lã Sau 24 giờ phun thuốc, tiến hành lây nhiễm nhân tạo bằng cách tạo vết thương trên lá (cắt đầu lá) rồi phun dung dịch vi khuẩn

O-Xanthomonas sp với mật độ 108 Cfu/mL, dung dịch vi khuẩn được phun ướt đều toàn bộ thân và lá cây lúa