Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng khuẩn của các hợp chất thứ cấp từ chủng vi nấm aspergillus niger IMBC NMTP01

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Lê Ngọc Anh NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ VÀ KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC HỢP CHẤT

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Hà Nội - 2021

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Lê Ngọc Anh

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ

VÀ KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ

CHỦNG VI NẤM Aspergillus niger IMBC-NMTP01

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Trần Hồng Quang và TS Trần Thị Hồng Hạnh Các số liệu, kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất Đồng thời, các kết quả này chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Lê Ngọc Anh

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, gia đình và bạn

bè

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến TS Trần Hồng Quang và TS Trần Thị Hồng Hạnh – những người thầy đã tận tâm hướng dẫn, chỉ dạy cho tôi về chuyên môn, đồng thời động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn cũng như quá trình tôi làm việc tại Viện Hóa sinh biển

Tôi xin cảm ơn lãnh đạo và các đồng nghiệp phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ, truyền kinh nghiệm, đưa ra những lời khuyên bổ ích và góp ý quý báu trong suốt thời gian tôi làm việc tại phòng

Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả các thầy cô, cán bộ của Học viện Khoa học và Công nghệ đã giảng dạy, cung cấp cho tôi các kiến thức mới và giúp tôi hoàn thành chương trình đào tạo

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, người thân và bạn

bè đã quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Luận văn được giúp đỡ về mặt kinh phí và thực hiện trong khuôn khổ Đề tài

trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN: ―Nghiên cứu nhận dạng các chất độc và độc tố có trong nấm mốc ở các thực phẩm có thành phần (đậu tương, lạc, ngô, vừng) bảo quản không đúng quy định, kém chất lượng‖ Mã số: TĐNDTP.06/19-21

Học viên

Lê Ngọc Anh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Vi nấm và tầm quan trọng của nghiên cứu các hợp chất tự nhiên từ vi nấm 4

1.1.1 Giới thiệu chung về vi nấm 4

1.1.2 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu các hợp chất từ vi nấm 5

1.2 Giới thiệu chung về Aspergillus niger 8

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về Aspergillus niger 11

1.3.1 Một số ứng dụng của Aspergillus niger 11

1.3.2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Aspergillus niger 12

1.3.2.1 Pyranones 13

1.3.2.2 Alkaloid 14

1.3.2.3 Cyclopeptide 16

1.3.2.4 Polyketide 17

1.3.2.5 Sterol 18

1.4 Tình hình nghiên cứu Aspergillus niger tại Việt Nam 18

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 20

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất 20

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp tạo dịch chiết nấm mốc 21

2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 21

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 22

2.2.4 Phương pháp tính toán phổ ECD 22

2.2.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 22

2.2.6 Phương pháp đánh giá ức chế sự sản sinh nitric oxide (NO) 23

2.2.6.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro 23

2.2.6.2 Phương pháp MTT 24

2.2.6.3 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO 24

2.2.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng sinh 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả nhân sinh khối lượng lớn và tạo cao chiết tổng chủng Aspergillus niger IMBC-NMTP01 26

3.2 Kết quả phân lập, làm sạch, tinh chế các hợp chất từ các chủng nấm mốc A niger IMBC-NMTP01 27

3.3 Kết quả xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 28

3.3.1 Hợp chất A1: epi-Aspergillusol (chất mới) 28

3.3.2 Hợp chất A3: Aspernigin (chất mới) 36

3.3.3 Hợp chất A2: Pyrophen 45

3.3.4 Hợp chất A4: 2-(Hydroxyimino)-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid 46

3.3.5 Hợp chất A5: Aspergillusol A 47

3.3.6 Hợp chất A6: Rubrofusarin B 48

3.3.7 Hợp chất A7: Nigerasperone A 50

3.3.8 Hợp chất A8: Fonsecin 51

3.3.9 Hợp chất A9: TMC-256C1 52

3.3.10 Hợp chất A10: Pyranonigrin A 53

3.3.11 Hợp chất A11: Orlandin 54

3.3.12 Hợp chất A12: Nigerasperone C 55

3.3.13 Hợp chất A13: Asperpyrone A 57

3.3.14 Hợp chất A14: 5-(Hydroxymethyl)-2-furancarboxylic acid 59

3.3.15 Tổng hợp các hợp chất đã đƣợc phân lập 60

3.4 Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất 61

3.5 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế NO của các hợp chất 62

3.6 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các hợp chất 64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

Kết luận 66

Kiến nghị 66

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

A niger Aspergillus niger

CD Circular dichroism Spectroscopy – Phổ lưỡng sắc tròn

CYA Czapek Yeast Agar

DMSO Dimethylsulfoside

GC-MS Gas chromatography – mass spectrometry – Sắc ký khí – khối

phổ Hep-G2 Tế bào ung thư biểu mô gan

HL-60 Tế bào ung thư máu ở người

HMBC Phổ tương tác di hạt nhân qua nhiều liên kết

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSQC Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

IC50 Nồng độ ức chế 50%

KB Tế bào ung thư biểu mô ở người

MCF-7 Tế bào ung thư vú ở người

MIC50 Nồng độ ức chế tối thiểu 50%

MS Phổ khối lượng

NOESY Phổ NOESY

PDA Potato Dextrose Agar

TCA Trichloro acetic acid

PDB Potato Dextrose Broth

SK-Mel-2 Tế bào ung thư da ở người

TLC Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng

SRB Sulforhodamine B

LNCaP Tế bào ung thư tiền liệt tuyến

tR Thời gian lưu

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số hợp chất dùng trong dƣợc phẩm có nguồn gốc từ vi nấm 7

Bảng 3.1 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A1 ………31

Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A3 38

Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A2 45

Bảng 3.4 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A4 46

Bảng 3.5 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A5 48

Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A6 49

Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A7 50

Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A8 51

Bảng 3.9 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A9 52

Bảng 3.10 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A10 53

Bảng 3.11 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A11 54

Bảng 3.12 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A12 56

Bảng 3.13 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A13 58

Bảng 3.14 Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất A14 59

Bảng 3.15 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các hợp chất A1-A14 61

Bảng 3.16 Hoạt tính ức chế NO của các hợp chất A1-A14 63

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Một số loài vi nấm phổ biến 5

Hình 1.2 Một số loại kháng sinh được sản xuất bởi vi nấm 7

Hình 1.3 Một số loài nấm thuộc chi Aspergillus 9

Hình 1.4 Sinh sản vô tính của A niger 10

Hình 1.5 A niger trong môi trường Czapek và PDA 10

Hình 1.6 Bào tử A niger chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope – SEM) 10

Hình 1.7 Các cụm gen sinh tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp của 12 chủng A niger 13

Hình 1.8 Một số hợp chất pyranones từ A niger 14

Hình 1.9 Một số hợp chất alkaloids từ A niger 16

Hình 1.10 Một số hợp chất cyclopeptides từ A niger 17

Hình 1.11 Một số hợp chất polyketide từ A niger 17

Hình 1.12 Một số hợp chất sterol từ A niger 18

Hình 3.1 Lên men nhân sinh khối lượng lớn mẫu IMBC-NMTP01……… 26

Hình 3.2 Ngâm chiết, siêu âm và thu dịch chiết mẫu A niger IMBC-NMTP01 26

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ chủng nấm mốc A niger IMBC-NMTP01 28 Hình 3.4 Cấu trúc và tương tác HMBC ( và COSY (—) của hợp chất A1 29

Hình 3.5 Phổ ECD tính toán lý thuyết và thực nghiệm của hợp chất A1 30

Hình 3.6 Phổ HRESIMS của A1 31

Hình 3.7 Phổ 1H NMR (CDCl3, 500 MHz) của A1 32

Hình 3.8 Phổ 13C NMR (CDCl3, 125 MHz) của A1 32

Hình 3.9 Phổ HSQC (CDCl3, 500 MHz) của A1 33

Hình 3.10 Phổ HMBC (CDCl3, 500 MHz) của A1 33

Hình 3.11 Phổ 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) của A1 34

Hình 3.12 Phổ 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) của A1 34

Hình 3.13 Phổ HSQC (CD3OD, 500 MHz) của A1 35

Hình 3.14 Phổ HMBC (CD3OD, 500 MHz) của A1 35

Hình 3.15 Phổ COSY (CD3OD, 500 MHz) của A1 36

Hình 3.16 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC (), COSY (—) của hợp chất A3 36 Hình 3.17 Phổ HRESIMS của A3 38

Hình 3.18 Phổ 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của A3 39

Hình 3.19 Phổ 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của A3 39

Hình 3.20 Phổ HSQC (DMSO-d6, 500 MHz) của A3 40

Hình 3.21 Phổ HMBC (DMSO-d6, 500 MHz) của A3 40

Hình 3.22 Phổ COSY (DMSO-d6, 500 MHz) của A3 41

Hình 3.23 Phổ NOESY (DMSO-d6, 500 MHz) của A3 41

Hình 3.24 Phổ 1H NMR (CD3OD, 500 MHz) của A3 42

Hình 3.25 Phổ 13C NMR (CD3OD, 125 MHz) của A3 42

Hình 3.26 Phổ HSQC (CD3OD, 500 MHz) của A3 43

Hình 3.27 Phổ HMBC (CD3OD, 500 MHz) của A3 43

Hình 3.28 Phổ COSY (CD3OD, 500 MHz) của A3 44

Hình 3.29 Phổ NOESY (CD3OD, 500 MHz) của A3 44

Hình 3.30 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC (), COSY (—) của hợp chất A2 45 Hình 3.31 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC () của hợp chất A4 46

Hình 3.32 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC () của hợp chất A5 47

Hình 3.33 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC () của hợp chất A6 48

Hình 3.34 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC () của hợp chất A7 50

Hình 3.35 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC () của hợp chất A8 51

Hình 3.36 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC () của hợp chất A9 52

Hình 3.37 Cấu trúc hóa học của hợp chất A10 53

Hình 3.38 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC () của hợp chất A11 54

Hình 3.39 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC () của hợp chất A12 55

Hình 3.40 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC () của hợp chất A13 57

Hình 3.41 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC () của hợp chất A14 59

Hình 3.42 Cấu trúc hóa học của các hợp chất A1-A14 61

MỞ ĐẦU

Vi nấm là những sinh vật sinh bào tử nhân chuẩn được tìm thấy ở hầu hết mọi môi trường sống Để tồn tại và sinh sản, chúng cạnh tranh với các sinh vật khác Vi nấm tạo ra rất nhiều chất chuyển hóa thứ cấp Các chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau

có tác dụng gây hại như độc tố nấm mốc, tuy nhiên, một số trong số chúng có thể tăng cường sức khỏe và tuổi thọ Các đặc tính y học của nấm đã được khám phá và sử dụng trong điều trị bệnh, tăng cường sức khỏe của con người Một số chất chuyển hóa thứ cấp của nấm như penicillin, cyclosporin, statin và acid mycophenolic được biết đến với ứng dụng trong việc kéo dài tuổi thọ của con người Hiện nay, ngày càng có nhiều nghiên cứu về các chất chuyển hóa thứ cấp của nấm để tìm ra các loại thuốc mới Một

số vai trò có lợi của nấm đối với loài người bao gồm kháng sinh, enzyme, chất tạo màu thực phẩm và thực phẩm bổ dưỡng Nhiều ngành công nghiệp khác nhau sử dụng các sản phẩm từ nấm như enzyme, chất màu thực phẩm và dược phẩm Hoạt tính sinh học của các chất chuyển hóa thứ cấp của nấm bao gồm : chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, kháng virus và chống ung thư Các loài nấm khác nhau tạo ra các chất chuyển

hóa thứ cấp quan trọng về mặt dược lý như Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Beauveria bassiana, Cephalosporium acremonium, Micromonospora purpurea, Monascus purpureus, Penicillium griseofulvum, Penicillium notatum, Streptomyces griseusadium và Tolya

Trong những thập kỷ gần đây, các hợp chất thứ cấp từ vi nấm đã tạo ra một cuộc cách mạng trong nhiều lĩnh vực Kể từ khi phát hiện ra penicillin, kháng sinh nhóm β-lactam đầu tiên, vi nấm đã cung cấp cho y học hiện đại những loại kháng sinh và dược liệu quan trọng Các loại thuốc hoặc sản phẩm dùng trong nông nghiệp có nguồn gốc từ

vi nấm bao gồm statin, echinocandin và strobilurins Sử dụng vi nấm để sản xuất công nghiệp các hormone steroid là một trong những thành công quan trọng của công nghệ sinh học Do tính đa dạng sinh học của nấm cũng như các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, vi nấm hứa hẹn nhiều tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp và nhiều lĩnh vực khác [1]

Aspergillus niger là một loại nấm phổ biến có mặt ở hầu hết mọi nơi Do đặc

tính phát triển nhanh, phân bố trên nhiều loại cơ chất tự nhiên, ít gây bệnh cho con người, có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme, chủng nấm này được sử dụng rộng rãi để sản xuất các enzyme công nghiệp như glucoamylase, pectinase, alpha-galactosidase, glucose oxidase và nhiều hợp chất khác, ứng dụng trong công nghiệp

chế biến thực phẩm và dược phẩm A niger cũng đã được chứng minh là một nguồn

giàu các chất chuyển hóa thứ cấp, bao gồm diketopiperazine, alkaloid, pyrones, bicoumarins, malformins, trong đó một số hợp chất được chứng minh là có tác dụng điều hòa miễn dịch và có các phản ứng gây độc tế bào

Việt Nam là một đất nước có khí hậu nóng ẩm, với đa dạng các loại lương thực

và nông sản có giá thành rẻ, là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển Aspergillus niger xuất hiện ở rất nhiều nơi như trên đất, trên bề mặt hầu hết các loại nông sản nếu

không được xử lý đúng cách Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa

học của các chủng nấm mốc, trong đó có A niger trên bề mặt hạt lạc Do đó, xác định

được các thành phần hóa học cũng như hoạt tính của các hợp chất thứ cấp sản sinh bởi

chủng A niger từ hạt lạc đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện các hợp chất

mới, các độc tố cũng như các hoạt chất tốt, góp phần trong nghiên cứu các dược phẩm điều trị bệnh, đảm bảo an toàn thực phẩm, nâng cao sức khỏe và tuổi thọ của con

người Hiện nay ở Việt Nam có một số nghiên cứu sử dụng A niger trong sinh tổng

hợp pectinase, cellulase để sản xuất công nghiệp Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu hóa học về chủng nấm này trên hạt lạc Việc xác định thành phần hóa học của chủng

nấm A niger từ hạt lạc, qua đó phát hiện các hợp chất có hoạt tính tốt, cũng như phát

hiện các hợp chất mới, chưa được biết đến đóng vai trò rất quan trọng trong kiểm soát

an toàn thực phẩm, đặc biệt là sản xuất dược phẩm, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và ung thư Trên cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn đề

tài : « Nghiên cứu phân lập một số hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thư và

kháng khuẩn từ chủng vi nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01»

Mục tiêu của luận văn :

Xác định được thành phần và cấu trúc của một số hợp chất có mặt trong chủng

nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01 có nguồn gốc từ hạt lạc, đánh giá hoạt tính gây

độc tế bào ung thư và kháng khuẩn của các hợp chất đó, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu y sinh, dược lý sau này

Nội dung luận văn bao gồm :

1 Phân lập, lên men sinh khối lượng lớn, tạo cao chiết tổng của chủng nấm A niger IMBC-NMTP01

2 Phân lập các hợp chất từ cao chiết tổng của chủng A niger IMBC-NMTP01

bằng các phương pháp sắc ký kết hợp

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học

4 Phân tích hoạt tính gây độc tế bào ung thư và hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất phân lập được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Vi nấm và tầm quan trọng của nghiên cứu các hợp chất tự nhiên từ vi nấm 1.1.1 Giới thiệu chung về vi nấm

Giới Nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn dị dưỡng

có thành tế bào bằng kitin (chitin) Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên thể sợi (mycelium), một số nấm khác lại phát triển dưới dạng đơn bào Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) của nấm thường là qua bào tử, được tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt hay thể quả Một số loài mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc biệt và nhân lên qua hình thức sinh sản sinh dưỡng

Vi nấm là các sinh vật nhân chuẩn thuộc giới Nấm, có cấu tạo đa bào, tế bào không có diệp lục, sống dị dưỡng, vách tế bào cấu tạo chủ yếu bởi chitin, có hoặc không có cellulose, sinh trưởng bằng cách kéo dài sợi Cấu tạo của vi nấm thường gồm những sợi kéo dài, gọi là sợi nấm (hyphae), lan ra trên bề mặt mà chúng bám vào Thể sợi tạo ra các bào tử, được phát tán và lây lan nấm ra các bề mặt, sinh vật khác Vi nấm phân bố ở hầu khắp các vùng khí hậu, từ nóng đến lạnh, nhiệt đới hay ôn đới, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc ký sinh trên cơ thể động, thực vật và nấm khác

Vi nấm đóng một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các vật chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất Nhiều loại vi nấm là có lợi, chẳng hạn như làm sinh vật phân giải trong đất, phần lớn không thể nhìn thấy bằng mắt thường Hàng ngàn loài vi nấm được tìm thấy trong địa

y, một dạng cộng sinh giữa nấm và tảo Tuy nhiên cũng có một số loài nấm có chứa

các độc tố, chẳng hạn như Penicillium, Aspergillus và Neurospora được phát hiện là

những loại nấm mốc làm hỏng trái cây và bánh mì, gây ảnh hưởng đến quá trình bảo quản thực phẩm Một số loài vi nấm còn có giá trị thương mại Vi nấm còn được dùng

để sản xuất chất kháng sinh, dược phẩm trong y học và nhiều loại enzyme, ngày nay nhiều loại nấm được biết đến và sử dụng trong phòng chống nhiều loại bệnh hiểm nghèo như viêm gan, mỡ máu, đột quỵ, ung thư Tuy vậy, nhiều loại nấm lại có chứa các chất hoạt động sinh học được gọi là mycotoxin, như ankaloid và polyketide - là những chất độc đối với động vật lẫn con người Một số loại nấm có thể gây ra các chứng bệnh cho con người và động vật, cũng như bệnh dịch cho cây trồng, mùa màng

và có thể gây tác động lớn lên an ninh lương thực và kinh tế

Hình 1.1 Một số loài vi nấm phổ biến [1]

1.1.2 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu các hợp chất từ vi nấm

Vi nấm được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp chế biến thực phẩm dùng để sản xuất tương, chao, xì dầu…, các loại axit hữu cơ như citric acid, oxalic acid, các enzyme thực phẩm như protease, pectinase, amylase Trong y học, nấm mốc được dùng để sản xuất các loại kháng sinh như penicillin, cephalosporin, griseofulvin, các vitamin nhóm B và các dược phẩm khác Trong nông nghiệp, vi nấm được ứng dụng trong sản xuất các chất kích thích tăng trưởng kéo dài ngọn, lá, rễ cho cây trồng như gibberellin, auxin, các chế phẩm phân bón hữu cơ, phân vi sinh giúp tăng độ màu mỡ, cải tạo đất hoặc là thiên địch chống lại côn trùng

Tầm quan trọng của việc khai thác các hợp chất tự nhiên từ vi nấm lần đầu tiên được ghi nhận vào năm 1928, khi kháng sinh penicillin được tìm ra bởi Alexander

Fleming từ chủng nấm Penicillium notatum Kể từ đó, việc phát hiện ra các sản phẩm

tự nhiên từ vi nấm đã thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học trong sản xuất và phát triển thuốc Trong những thập kỷ gần đây, các hợp chất trao đổi thứ cấp từ vi nấm đang ngày càng được quan tâm nghiên cứu, nhiều hợp chất có cấu trúc độc đáo, thể hiện nhiều hoạt tính sinh học và tác dụng dược học như ức chế khối u, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng enzyme và ức chế ung thư [2, 3] Các lớp chất chủ yếu sản sinh bởi vi nấm là các polyketide, alkaloid, terpene, peptide, lipid, các hợp chất chứa nitro và các chất sinh tổng hợp hỗn hợp khác [4]

Nhiều công bố đã cho thấy tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của nguồn

vi nấm và khả năng phát triển các hợp chất tự nhiên thành các thuốc kháng sinh mới ứng dụng trong điều trị [5] Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hầu hết các hợp chất

kháng sinh mới được phát hiện chủ yếu từ các loài vi nấm thuộc chi Aspergillus và Penicillium

Một trong các kháng sinh phổ biến nhất này là các hợp chất có chứa nhân lactam trong cấu trúc hóa học của chúng, bao gồm penicillin (penam), cephalosporin (cephems), monobactams và carbapenems [6] Các hợp chất này hoạt động bằng cách

β-ức chế sự tổng hợp lớp peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn, từ đó gây chết tế bào

vi khuẩn Thuốc kháng sinh β-Lactam, chủ yếu là penicillin và cephalosporin, là một trong những loại thuốc phổ biến nhất trên thế giới, chiếm khoảng 65% thị trường thuốc kháng sinh [1]

Griseofulvin là một trong những sản phẩm tự nhiên chống nấm đầu tiên được

phát hiện ở nấm sợi [7] Hợp chất này có nguồn gốc từ nấm mốc Penicillium griseofulvum và thường được sử dụng để điều trị nhiễm nấm do có khả năng ức chế

mạnh quá trình nguyên phân ở tế bào nấm [1]

Fusidic acid, một loại kháng sinh nhóm steroid, được phân lập lần đầu tiên vào

năm 1962, từ môi trường lên men của nấm Fusidium coccineum, có khả năng ức chế sự

tổng hợp protein của vi khuẩn [8], do đó, hợp chất này được đưa vào sử dụng như một loại kháng sinh phổ biến và hiệu quả

Bên cạnh các hoạt chất phổ biến có nguồn gốc từ vi nấm như fusidic acid, griseofulvin, một số loại thuốc kháng nấm mới như anidulafungin (eraxis), caspofungin (cancidas), reptapamulin được bán tổng hợp từ các hợp chất được phân lập từ vi nấm [9, 10] Các hoạt chất statin sử dụng trong điều trị bệnh mạch vành, được bán tổng hợp

từ các hợp chất mevastitin và lovastatin phân lập từ các loài nấm Penicillium citrinum

và Aspergillus terreus [9, 11]

Hình 1.2 Một số loại kháng sinh được sản xuất bởi vi nấm

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng một số nhóm thuốc kháng sinh có nguồn gốc từ vi nấm đã được sử dụng thành công trong điều trị các bệnh ung thư bao gồm anthracycline, actinomycin và bleomycin Trong đó, nhiều hợp chất thuộc nhóm anthracycline đóng vai trò quan trọng trong điều trị lâm sàng các bệnh ung thư máu, ung thư bạch cầu, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú và ung thư bàng quang [12] Theo nghiên cứu của Wang và cộng sự (2013), hợp chất kháng sinh anthraquinone SZ-685C

thuộc nhóm anthracycline được phân lập từ chủng vi nấm Halorosellinia sp No 1403

thể hiện hoạt tính kháng đặc hiệu đối với cả hai dòng tế bào ung thư vòm họng ở người gồm CNE2 và CNE2R [13] Hợp chất này còn có khả năng ức chế hiệu quả sự gia tăng của sáu dòng tế bào ung thư ở người gồm ung thư vú kháng adriamycin, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thần kinh đệm và ung thư gan [14] Vì vậy, việc đánh giá khả năng kháng ung thư của các chủng vi nấm và đặc biệt là các hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng sinh đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

Bảng 1.1 Một số hợp chất dùng trong dược phẩm có nguồn gốc từ vi nấm

tham khảo

Penicillins Kháng sinh Penicillium notatum [15]

Cephalosporins Kháng sinh Cephalosporium

acremonium

[16, 17]

Griseofulvin Kháng nấm Penicillium Griseofulvin [7]

Fusidic acid Kháng sinh Fusidium

Nodulisporic acid

A

Diệt côn trùng Nodulisporium sp [25]

Không chỉ sinh tổng hợp các hợp chất kháng sinh, kháng ung thư, vi nấm còn là một nguồn tiềm năng các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ tế bào thần kinh, kháng viêm, kháng lao, và nhiều hoạt tính có giá trị khác Với các hoạt tính sinh học có giá trị đã thể hiện, các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ vi nấm được xem là nguồn đầy hứa hẹn cho các sản phẩm y dược mới Do đó, cần có những nghiên cứu chi tiết hơn về điều tra và thu nhận các hợp chất tự nhiên mới từ vi nấm nhằm đáp ứng được nhu cầu phát triển của các hoạt chất sinh học

1.2 Giới thiệu chung về Aspergillus niger

Aspergillus niger là một trong những loài phổ biến nhất của chi Aspergillus [26] A niger thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota, lớp Eurotiomycetes, bộ Eurotiales,

họ Aspergillaceae, chi Aspergillus, phân chi Nigri, hoặc có thể được gọi là phân nhóm Aspergillus đen Trong phân nhóm này có 14 loài có bào tử màu đen, dễ nhầm với A niger [27]

Mô tả đầu tiên về Aspergillus xuất hiện vào năm 1729 Pier Antonio Micheli (1679-1737) đã mô tả Aspergillus là một trong 1400 chi mới của thực vật trong chi Nova plantarum Micheli đã nhận ra sự giống nhau giữa cấu trúc hình thành của nấm

và Aspergillum [28] Aspergillus niger được mô tả vào năm 1867 trong một bản thảo

có tựa đề ―Physiologie des mucédinées‖ của nhà thực vật học người Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem Ông đã phân lập loại nấm này từ những túi mật bị mốc để nghiên cứu sản xuất acid gallic bằng quá trình lên men Ông đã phân lập được hai loại

nấm là Penicillium glaucum và một loài Aspergillus, tương tự như Aspergillus glaucus,

nhưng màu đen của nó được duy trì trên các môi trường khác nhau và có một số đặc

điểm khác, ông đặt tên là Aspergillus niger [29]

Hình 1.3 Một số loài nấm thuộc chi Aspergillus [30]

Khuẩn lạc A niger phát triển nhanh và có thể dễ dàng nhận biết thông qua hình

thái của chúng Ban đầu sợi nấm có màu trắng, sau đó dần dần trở nên sẫm màu hơn thành màu đen tuyền hoặc nâu sẫm Từ sợi đầu tiên, chúng phân nhánh tạo thành từ 2

đến 4 sợi, các sợi này tiếp tục phân nhánh tạo thành khuẩn lạc Khuẩn lạc của A niger

có hình dạng tròn, lồi, xốp và đều

Trong môi trường CYA (Czapek Yeast Extract Agar), Czapek và PDA (Potato

Dextrose Agar), A niger có dạng sợi, bào tử ở đầu sợi có màu đen Hình ảnh chụp

bằng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope - SEM) cho thấy bào tử

A niger có dạng hình cầu lõm 2 mặt, đường kính trung bình khoảng 2.5 – 3 µm (Hình

1.6) Khi nhìn ngược lại đĩa thạch, có thể quan sát sự phát triển của sợi nấm, sợi nấm màu trắng đến vàng, nhăn nheo Sau 7 ngày nuôi cấy ở 25°C, khuẩn lạc trên môi trường CYA có đường kính 90 mm, trong khi khuẩn lạc trên môi trường Czapek có đường kính 70 ± 2,5mm [26]

Hình 1.4 Sinh sản vô tính của A niger [31]

Hình 1.5 A niger trong môi trường Czapek và PDA

Hình 1.6 Bào tử A niger chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron

Microscope – SEM) [26]

Nhiều loài Aspergilli đen đã được phân lập từ khắp nơi trên thế giới A niger là

một loại nấm sợi sinh trưởng hiếu khí trên các cơ chất hữu cơ Trong tự nhiên, nó được tìm thấy trong đất, phân hữu cơ, thực vật đang phân hủy

Reiss (1986) đã khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ, hoạt động của nước và độ

pH đến sự phát triển của các loại Aspergilli khác nhau A niger có thể phát triển trong

phạm vi nhiệt độ từ 6 – 47 ° C, phạm vi pH 1,4 – 9,8 Những khả năng này cùng với sự tăng sinh và phát tán nhanh của bào tử, là nguyên do cho sự xuất hiện phổ biến của loài, với tần suất cao hơn ở những nơi có nhiệt độ và độ ẩm cao [32]

A niger phát triển tốt trong nhiều môi trường khác nhau với các nguồn carbon

khác nhau, bao gồm glucose, cám, maltose, xylan, xylose, sorbitol và lactose [33] Tuy nhiên, sự trao đổi chất của nó bị ảnh hưởng đáng kể bởi các điều kiện nuôi cấy, chẳng hạn như thành phần môi trường và chế độ lên men

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về Aspergillus niger

1.3.1 Một số ứng dụng của Aspergillus niger

Aspergillus niger là đối tượng nghiên cứu và sử dụng phổ biến trong công nghiệp trong vài thập kỷ gần đây A niger thể hiện sự trao đổi chất linh hoạt, điều này

đã làm cho nó trở thành một trong những sinh vật sản xuất quan trọng nhất được sử

dụng để lên men công nghiệp [34, 35] Tầm quan trọng thực tế của A niger lần đầu

tiên được ghi nhận vào năm 1919, khi khả năng sản xuất acid citric của chúng được

khai thác công nghiệp A niger là một nguồn giàu các enzyme như α-amylase, cellulase và pectinase, do đó, kể từ những năm 1960, A niger đã trở thành một nguồn

cung cấp nhiều loại enzyme sử dụng trong chế biến trái cây, làm bánh và trong công nghiệp tinh bột và thực phẩm [34]

Pectinase, protease và amyloglucosidase là những chất đầu tiên được khai thác

và ban đầu được sản xuất trong nuôi cấy A niger bề mặt [36] Một số enzyme như cellulase và hemicellulase đã được sản xuất bằng cách nuôi cấy các chủng Aspergillus

đen

Để sản xuất ra các sản phẩm, tinh bột phải được thủy phân thành siro, chứa glucose, maltose và dextrin có khối lượng phân tử thấp Amyloglucosidase, còn được gọi là glucoamylase, là một exo-amylase xúc tác quá trình giải phóng các đơn vị glucose của tinh bột bằng cách thủy phân các liên kết α-1,4-D-glucosidic Siro glucose

và các ngành công nghiệp rượu sử dụng amyloglucosidase được tổng hợp từ A niger

Pectin, một heteropolysaccharide, là một thành phần chính trong trái cây và rau quả Một số enzyme, bao gồm pectin esterase, endopolygalacturonidases,

exopolygalacturonidases và pectin lyases, được sản xuất từ A niger để phân giải

pectin Các enzymes này được sử dụng trong sản xuất rượu vang và nước trái cây nhằm giảm độ nhớt trước khi ép và cải thiện độ trong [37]

Các isozyme endoxylanase của A niger có khả năng chuyển hóa lignocellulose,

ứng dụng trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy như chất hỗ trợ tẩy trắng Thêm

vào đó, A niger cũng có thể giải quyết được vấn đề nhiễm phenolic - chất gây ô nhiễm

trong nước thải của quá trình lên men trong công nghiệp [38]

A niger còn được ứng dụng để sản xuất glucose oxidase và catalase, nhằm loại

bỏ glucose hoặc oxy từ thực phẩm, đồ uống, tạo thành gluconic acid từ glucose [39]

Các chuyên gia của FAO/WHO đã xem xét và chấp nhận các chế phẩm enzyme

từ A niger bao gồm cả bản thân sinh vật (FAO / WHO 1972, 1978, 1981, 1987, 1990)

FDA ở Hoa Kỳ đã chấp nhận nhiều loại enzym để sử dụng trong thực phẩm: vào đầu những năm 1960, FDA đã ban hành thư lấy ý kiến công nhận rằng α-amylase,

cellulase, myloglucosidase, catalase, glucose oxidase, lipase và pectinase từ A niger có

thể được coi là an toàn với điều kiện là các chủng không gây bệnh và không gây độc hại và có quy trình sản xuất tiêu chuẩn Ngoài các enzyme này, carbohydrase và

cellulase từ A niger cũng được FDA chấp thuận dùng làm phụ gia trong chế biến ngao

và tôm

Các cơ chế sau dịch mã của A niger có khả năng tạo ra các protein khó biểu

hiện ở các sinh vật chủ truyền thống Do đó, nó được sử dụng rộng rãi để biểu hiện các protein khác nhau [40] Ví dụ, bằng cách sử dụng công nghệ tái tổ hợp, hàm lượng

catalase tự nhiên từ A niger tăng lên đáng kể [41, 42], trong khi mức độ biểu hiện của

A niger phytase được cải thiện gấp 1.000 lần so với sản xuất thông thường [43, 44, 45] Cho đến nay, trên thị trường có nhiều sản phẩm enzyme từ các chủng A niger tái

tổ hợp Hiệp hội Kỹ thuật Enzyme đã công nhận các enzyme như α-amylase, arabinofuranosidase, catalase, chymosin, glucoamylase, glucose oxidase, pectin

esterase, phospholipase A2, phytase và xylanase có thể được tạo ra bởi các chủng A niger tái tổ hợp với hiệu suất cao [46]

1.3.2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Aspergillus niger

Kích thước bộ gen của các chủng wild-type A niger (WT A niger) nằm trong

khoảng từ 33,8 đến 36,1 Mb (G + C)% và số lượng gen của chúng gần giống nhau, nhưng cách sắp xếp trình tự và cách lắp ráp khác nhau Kết quả phân tích kháng sinh

các chất chuyển hóa thứ cấp (antiSMASH) chỉ ra rằng mỗi chủng WT A niger chứa ít

nhất 20 cụm gen sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp (Biosynthetic gene cluster – BGC), bao gồm PKS, NRPS và các đoạn lai của chúng [47] Các BGC này liên quan đến sinh tổng hợp indole và terpene có mặt ở khắp nơi và có tiềm năng lớn để tổng hợp

các tác nhân điều trị và thuốc trừ sâu, chẳng hạn như AbT1, azanigerone A, fusarin, ferrichrome, nidulanin A, melanin, TAN-1612, yanuthone D và aflavarin (Hình 1.7)

Hình 1.7 Các cụm gen sinh tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp của 12 chủng A niger

Các dẫn xuất pyranone là những hợp chất thứ cấp được phân lập nhiều nhất từ

A niger, bao gồm γ-naphthylpyradones, α-pyranones và γ-pyranones Các naphthylpyradon có nguồn gốc từ A niger được sắp xếp thành hai loại: monomer và

dimer Fonsecin (1) là một trong những γ-naphthylpyradone được phân lập thường

xuyên nhất được tạo ra bởi một số chủng A niger từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm

đất trên cạn, biển, thực vật [48] Các thử nghiệm sinh học cho thấy hợp chất 1 có tác

dụng ức chế truyền tín hiệu interleukin-4 (IL-4) và kháng

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) mạnh hơn so với acid ascorbic [49, 50] Một rubrofusarin B (2)

mới có hoạt tính gây độc tế bào và kháng khuẩn cũng đã được tinh sạch từ chủng A niger IFB-E003 [51]

A niger naphthylpyradon dạng dimer bao gồm hai monomer có (các) cấu trúc

dạng thẳng và/hoặc dạng góc, hầu hết các bis-naphtho-γ-pyrones được tạo ra bởi các

chủng A niger cộng sinh Các nghiên cứu trên tám chủng A niger khác nhau đều cho

thấy sự có mặt của hợp chất aurasperone A (3), có phổ hoạt tính sinh học rộng bao gồm

hoạt tính tế bào, tác dụng kháng khuẩn mạnh và hoạt tính chống oxy hóa [48]

Các α-pyranones có nguồn gốc từ A niger bao gồm các campyrones,

asnipyrones và nigerapyrones, lần đầu tiên đƣợc phát hiện từ chủng MA-132 có nguồn

gốc từ thực vật rừng ngập mặn [52] Nafuredin (4) và bicoumanigrin (5) là các

α-pyranone mới đƣợc tạo ra bởi các chủng A niger có nguồn gốc từ bọt biển, thể hiện tác

dụng ức chế mạnh đối với NFRD (NADH-fumarate reductase) [53, 54]

Có bốn dẫn xuất γ-pyranone đã đƣợc phát hiện trong dịch chiết của A niger

Trong số các chất này, phổ biến nhất là axit kojic (6) có đặc tính kháng khuẩn Ngoài carbonarone A (8) và tensidol B (9), một benzyl γ-pyranone nigerpyrone mới (10) đã

đƣợc phát hiện từ chủng FGSC A1279 ΔgcnE với hoạt tính mạnh kháng nấm Candida parapsilosis [55]

Hình 1.8 Một số hợp chất pyranone từ A niger

1.3.2.2 Alkaloid

 Pyrroles

Các dẫn xuất pyranonigrin là một họ đặc trƣng bởi khung pyrrole pyrano, và quá

trình sinh tổng hợp của chúng đƣợc điều khiển bởi cụm gen pyn ở A niger [56, 57] Phân tích một dòng A niger có nguồn gốc từ bọt biển thu đƣợc bốn pyranonigrins B-D

(11-13), Ab (14) trong đó chất 14 ức chế mạnh đối với sự phát triển của ấu trùng gây

hại thực vật Spodoptera littoralis [58]

 Pyridones

Các dẫn xuất pyridone có từ A niger có một nhóm benzyl và có đặc tính kháng

khuẩn và gây độc tế bào Hai α-pyridones mới là aspernigrins A (15) và Bb (16) được

phân lập từ một chủng A niger từ bọt biển có khả năng gây độc tế bào ở mức trung

bình nhưng có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh mạnh mẽ [58] Khi được nuôi cấy trong môi trường lên men có chứa axit suberoylanilide hydroxamic (SAHA) và p-fluoro SAHA, chủng ATCC 1015 tạo ra ba chất kháng nấm là γ-pyridones, nygerones

A (17), B (18) và p-fluoro nygerone B (19) [59] Ngoài ba γ-naphthylpyradones và một

peptit mạch vòng, ba aspernigrins 2-benzyl-γ-pyridones B-D đã được thu được từ

chủng biển SCSIO Jcsw6F30, trong đó 2-benzyl-γ-pyridones C (20) được phát hiện có

hoạt tính ức chế mạnh đối với các tế bào TZM-bl nhiễm HIV-1 SF162 [60]

 Các alkaloid khác

Ba fumonisin B2, B1 và B4 (21-23) được tìm thấy ở chủng FGSC A1279 và IBT

28144 là chất gây ung thư [61, 62, 63] Cụm gen aza trong chủng ATC C1015 chịu

trách nhiệm sinh tổng hợp azanigerone D (24) [64] Hai piperazine mới là nigragillin

(25) và nigerazine B (26) đã được tinh sạch từ chủng ATCC 11414, và quá trình sinh

tổng hợp của chúng được điều chỉnh bởi cụm gen BGC alb [65] Chủng A niger

IFB-E003 tạo ra aspernigerin (27) thể hiện tác dụng mạnh trên các dòng tế bào ung thư biểu

mô vòm họng KB, ung thư biểu mô cổ tử cung Hela và ung thư biểu mô đại trực tràng SW1116 [66]

Hình 1.9 Một số hợp chất alkaloid từ A niger

1.3.2.3 Cyclopeptide

Các peptide dạng vòng từ A niger bao gồm mười dipeptide, tám pentapeptide

và ba bis (dipeptide) Phân lập các hợp chất từ một chủng A niger nội sinh Heteroscyphus tener (Steph.) Schiffn thu được các α-pyranones và bốn

diketopiperazine (28-31) trong đó các hợp chất 30 và 31 có hoạt tính yếu đối với dòng

tế bào ung thư biểu mô buồng trứng ở người A2780 [67].Tuy nhiên, 30 có khả năng

gây độc tế bào đáng kể đối với các dòng tế bào ung thư đại tràng H116 và CX1 ở người

[68, 69] A niger cũng là nguồn sản xuất các malformin trong đó malformin A có khả

năng kháng khuẩn và chống ung thư, trong khi malformin C có các đặc tính sinh học như chống HIV -1, gây độc tế bào, chống ung thư và kháng khuẩn [70, 71, 72, 60]

Hình 1.10 Một số hợp chất cyclopeptide từ A niger

1.3.2.4 Polyketide

Polyketide là nhóm hợp chất thứ cấp lớn nhất do A niger tạo ra, điển hình là

acid citric (32) và acid itaconic (33) là những sản phẩm được sản xuất quy mô lớn

trong ngành thực phẩm và dược phẩm trong nhiều thập kỷ Một số hợp chất polyketide

có giá trị khác cũng được sản xuất bởi A niger như 2-phenylethanol acid

p-hydroxyphenylacetic, gallic acid, dẫn xuất acid benzoic và asperyellone [48]

Asperyellone (34) thể hiện tác dụng ức chế lipoxygenase và ngưng kết tiểu cầu ở

người, chống lại tia UVB và kháng nấm [73, 74, 75] Hai hợp chất tetracycline là

BMS-192548 (35) và TAN-1612 (36) lần lượt thu được từ các chủng WB2346 và ATC

C1015 được chứng minh có khả năng liên kết với chất ức chế của thụ thể neuropeptide

Y [76, 77, 78]

Hình 1.11 Một số hợp chất polyketide từ A niger

1.3.2.5 Sterol

Các sterol là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất acid citric,

14-dehydroergosterol (37) và benzoat của nó (38) là những steroid đầu tiên được phân lập

từ A niger, có hoạt tính chống viêm và gây độc tế bào [79, 80] Năm 2007, bốn dẫn xuất steroid được phân lập từ chủng A niger EN-13 nội sinh trong tảo biển [81] Các

nigerasterol A, B (39, 40) có nguồn gốc từ chủng MA-132 có hoạt tính mạnh chống lại

sự tăng sinh tế bào bạch cầu nguyên bào nuôi (HL60) và ung thư phổi ở người (A549), với giá trị IC50 tương ứng là 0,11 và 0,43 μM [71]

Hình 1.12 Một số hợp chất sterol từ A niger 1.4 Tình hình nghiên cứu Aspergillus niger tại Việt Nam

Tại Việt Nam, một số nhóm nghiên cứu sử dụng A niger để biểu hiện, thu nhận

và đánh giá hoạt tính enzyme như : năm 2008, Huỳnh Ngọc Oanh nghiên cứu tinh sạch enzyme pectinase bằng phương pháp lọc gel và lọc màng [82] Một số nhóm khác cũng

nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng A niger từ nhiều nguồn khác nhau để chọn

ra chủng có khả năng tạo pectinase với hiệu suất cao Năm 2011, nhóm Lê Thị Thu

Trang nghiên cứu khả năng tổng hợp pectinesterase và polygalaturonic của A niger [83], Trần Thanh Trúc đã phân lập và tuyển chọn dòng A niger sinh pectin

methylesterase cao [84] Các nghiên cứu đã công bố chủ yếu tập trung vào một số ít loại enzyme có hoạt tính tốt, chưa có nhiều nghiên cứu về tách chiết và xác định các

nhiều hơn nữa để khám phá thêm nguồn phân lập các chủng A niger mới, kích thích

hoạt động của các vùng gen sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp để tăng cường sản xuất

các phân tử sinh học Để đẩy nhanh sự phát triển của các sản phẩm có giá trị từ A niger, cần tìm kiếm và nhân giống các chủng cũng như tối ưu hóa quá trình nuôi cấy và

lên men ở nhiều cấp độ khác nhau

Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về phân tích cấu trúc hóa học

cũng như hoạt tính sinh học của các hợp chất thứ cấp từ A niger Trong khi đó, nước ta

có tiềm lực to lớn về nông sản, là nguồn dinh dưỡng phổ biến cho sự phát triển của các

vi sinh vật Chính vì thế, việc khai thác, khám phá và nghiên cứu A niger từ nông sản,

đặc biệt là từ hạt lạc, là một hướng đi mới, hứa hẹn cho nhiều kết quả có giá trị

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất

Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi nấm Aspergillus niger IMBC-NMTP01 được

lưu tại Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Bột silica gel (Kieselgel 60, 230–400 mesh, Merck), Bột pha đảo C18 (ODS-A,

12 nm, S-150 m, YMC Co.,), bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck) và RP-18 F254Splates (Merck), các dung môi CH2Cl2, MeOH, EtOAc, n-hexane, acetone, acetonitrile, môi trường PDB, thạch agar-agar, và các loại hóa chất, vật tư khác dùng để tinh sạch

và xác định cấu trúc các hợp chất

FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma) Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad) Chất tham khảo: Ellipticine (Sigma, USA) Các dòng tế bào ung thư do GS.TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp

Các dòng tế bào ung thư bao gồm:

- HepG2: Ung thư gan ở người (human hepatocellular carcinoma)

- KB: Ung thư biểu mô miệng (human carcinoma in the mouth)

- HL-60: Ung thư bạch cầu cấp ở người (human leukemia)

- MCF7: Ung thư vú ở người (human breast carcinoma)

- SK-Mel-2: Ung thư da ở người (human melanoma)

- LNCaP: Ung thư tiền liệt ở người (human prostate carcinoma)

Lipopolysaccharides (LPS) từ Escherichia- coli của Sigma Chemical Co (St

Louis, MO, USA) Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) Life Technologies, Inc., (Gaithersburg, MD, USA) Sodium nitrite, sulfanilamide, N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride và dimethyl sulphoxide (DMSO) của Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA), các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega v.v

Dòng tế bào RAW 264.7 do GS TS Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia cung cấp

Các chủng vi khuẩn và nấm dùng để thử hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất

bao gồm: 3 chủng vi khuẩn gram dương (Enterococcus faecalis ATCC299212, Staphylococcus aureus ATCC25923 và Bacillus cereus ATCC13245), 3 chủng vi

khuẩn gram âm (Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC

9027, và Salmonella enterica ATCC13076), và một chủng nấm men Candida albicans

ATCC 24433 Ngoài ra còn có các nguyên liệu, hóa chất khác dùng để thử hoạt tính kháng khuẩn

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

Góc quay cực quang học được đo trên máy JASCO P-2000 polarimeter (Tokyo, Japan) Phổ khố lượng phân giải cao HRESITOFMS được đo trên máy X500 QTOF mass spectrometer (Sciex, USA) Phổ lưỡng sắc tròn điện tử (ECD) được đo trên máy Chirascan spectrometer (Applied Photophysics, UK) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy AVANCE III HD 500 FT-NMR spectrometer (Bruker, Germany) sử dụng tetramethylsilane (TMS) là chất chất nội chuẩn Sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (prep HPLC) được thực hiện trên hệ thống Agilent 1200 (Agilent Technologies, USA), với bơm điều chế G1361A, bộ ghi tín hiệu DAD G1315D, bộ lấy mẫu tự động G2260A, cột điều chế COSMOSIL 5C18-MS-II (250 × 10 mm, 5 m) Các thiết bị nuôi cấy vi nấm như: tủ cấy an toàn sinh học cấp II (Esco, UK), tủ nuôi cấy (Sanyo, Nhật Bản), nồi khử trùng (Nhật Bản), tủ sấy, và các thiết bị nghiên cứu chuyên dụng khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tạo dịch chiết nấm mốc

Mỗi chủng nấm mốc được nuôi cấy nhân sinh khối lượng lớn trên môi trường PDA trong bình tam giác 2L nhằm sản sinh ra lượng đủ lớn các hợp chất thứ cấp phục

vụ cho nghiên cứu thành phần hóa học Sinh khối nấm mốc được ngâm chiết trong dung môi EtOAc trong điều kiện siêu âm (30 phút x 3 lần) và nhiệt độ phòng Dịch chiết được lọc qua giấy lọc và được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tổng

2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất

- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254

(Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck); phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu

- Sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC): thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G

F254 (Merck, 105875)

- Sắc ký cột (CC): được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường, silica gel

pha đảo ODS (30 - 50 m, Fujisilisa Chemical Ltd.), Diaion HP-20, và Sephadex LH-20

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): thực hiện trên hệ thống máy HPLC Agilent 1200

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

- Phổ hồng ngoại (IR): được đo trên máy Nicolet 380 FT-IR spectrometer

- Phổ tử ngoại (UV): được đo trên máy JASCO V-630 UV-VIS spectrophotometer

- Phổ khối lượng (MS): Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization mass spectra) được đo trên máy AGILENT 1200 LC-MSD Trap

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer

- Phổ lưỡng sắc tròn (CD): được đo trên máy Chirascan CD spectrometer

- Độ quay cực []D: đo trên máy Jasco P-2000 digital polarimeter

2.2.4 Phương pháp tính toán phổ ECD

Tính toán phổ lưỡng sắc hình tròn điện tử (ECD) lý thuyết với hàm mật độ phụ thuộc thời gian (TDDFT) được thực hiện bằng chương trình Gaussian 16W [85] Đầu tiên, các cấu dạng của hợp chất được phân tích bằng chương trình Spartan'18 với trường lực MMFF Những cấu dạng có thông số Boltzmann trên 1% đã được lựa chọn

để tính toán phổ ECD và được tối ưu hóa với hàm chức năng B3LYP/6-311G(d,p) trong methanol bằng mô hình CPCM [86] Phổ ECD lý thuyết được tính toán trong methanol bằng phương pháp TDDFT ở cùng hàm chức năng bằng chương trình Gaussian 16W Cuối cùng, phổ ECD tính toán lý thuyết được mô hình hóa bằng chương trình SpecDis 1.71 [87] Phổ ECD tính toán cho mỗi cấu dạng được tuân theo trọng số và tính tổng theo phân bố Boltzmann và so sánh với dữ liệu thực nghiệm

2.2.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa

Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư

(TBUT) ở điều kiện in vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của

Monks (1991) [88] Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận

với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn

Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

Pha các mẫu dịch chiết thử thành các dải nồng độ thích hợp Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm Chất thử (10 L) đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm 190 l tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ mẫu thử trong giếng là 100, 20, 4, và 0.8 g/mL đối với cặn chiết và nồng

độ 100, 20, 4, và 0.8 M đối với chất sạch Ủ trong tủ ấm 48 giờ Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (190l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad)

Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100

% Ức chế = 100% -

OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)

Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác Ellipticine ở các nồng độ 10

g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml được sử dụng như là chất đối chứng dương;

DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4

2.2.6 Phương pháp đánh giá ức chế sự sản sinh nitric oxide (NO)

2.2.6.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

Dòng tế bào RAW264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài

ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO)

Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37o

C, 5% CO2

2.2.6.2 Phương pháp MTT

Phương pháp MTT được sử dụng để đánh giá độc tính của các hợp chất thử

nghiệm đối với sự sống sót của tế bào RAW264.7 [89]

Chất thử (20 l) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ tương

tự nồng độ của thí nghiệm NO Sau khi điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút

180 l tế bào vào các giếng của khay 96 giếng đã có chất thử Trên cùng một đĩa thử,

bố trí một số giếng để làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu là DMSO 10%

Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2, nuôi trong thời gian 72 giờ Sau 72 giờ, 10 l MTT (nồng độ cuối cùng là 5 mg/ml) được cho vào mỗi giếng Sau 4h, loại bỏ môi trường, tinh thể formazan được hòa tan bằng 50 L (DMSO) 100% Giá trị OD đo ở bước sóng 540 nm bằng máy quang phổ

Lượng tế bào sống sót sẽ được tính theo công thức:

OD (chất thử) - OD (đối chứng trắng) % tế bào sống sót = x 100%

OD (DMSO) - OD (đối chứng trắng)

2.2.6.3 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO

Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO bằng phương pháp Griess [90]

Tế bào RAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 105 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 37oC và 5% CO2 trong 24h Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3h Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1μg/mL) trong 24h Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm Trong khi đối chứng dương được

sử dụng là NG-Methyl-L-arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) ở các nồng độ 100; 20;

4 và 0.8 μg/ml

Nitrite (NO2-), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA) Cụ thể là, 100 μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100 μL Griess reagent: 50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) phosphoric acid và 50

μL 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước Hỗn

hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo

bằng máy microplate reader ở bước sóng 540 nm Môi trường DMEM không FBS

được sử dụng như giếng trắng (blank)

Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm

lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS)

Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức :

% ức chế =100%- [hàm lượng NO sample /hàm lượng NO LPS ] x 100

Phép thử được lặp lại 3 lần Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO)

được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4

2.2.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng sinh

Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các dịch chiết và các hợp chất phân lập

được đánh giá đối với các vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ), bao gồm ba chủng vi khuẩn

Gram dương (Enterococcus faecalis ATCC299212, Staphylococcus aureus

ATCC25923 và Bacillus cereus ATCC13245), ba chủng vi khuẩn Gram âm

(Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, và Salmonella

enterica ATCC13076), và một chủng nấm men Candida albicans ATCC 24433

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha

loãng đa nồng độ Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng VSVKĐ và nấm nhằm

đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện

hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO

ở dải nồng độ giảm dần từ 3002.34 µM với số thí nghiệm lặp lại N=3

Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 2×105CFU/ml

Tiến hành thử: lấy 6 l dung dịch mẫu thử có nồng độ 10mM vào hàng đầu tiên có

chứa 100l môi trường LB rồi pha loãng nối tiếp giảm ½ nồng độ vào các hàng có

chứa 50l cho đến khi đạt được nồng độ là 2.34 M, thêm 50 l dung dịch vi khuẩn và

nấm ở nồng độ 2×105 CFU/ml, ủ ở 37oC Sau 24h, xác định sơ bộ giá trị MIC bằng

quan sát Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế

hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật sau 24 giờ nuôi cấy và được xác định chính xác

dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ Bioteck và phần mềm Raw data

Streptomycin và nystatin được sử dụng làm đối chứng dương [91, 92]

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả nhân sinh khối lượng lớn và tạo cao chiết tổng chủng Aspergillus

niger IMBC-NMTP01

Chủng A niger IMBC-NMTP01 được lên men nhân sinh khối trong 50 bình tam

giác 2 L, mỗi bình chứa 150 mL môi trường PDA trong 25 ngày ở nhiệt độ phòng (Hình 3.1)

Hình 3.1 Lên men nhân sinh khối lượng lớn mẫu IMBC-NMTP01

Sinh khối và sợi nấm được được ngâm chiết với EtOAc (1L x 3 lần) trong điều kiện siêu âm (30 phút/ lần) ở nhiệt độ phòng (Hình 3.2) Dịch chiết được gộp lại, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 5.2 g cao chiết

Hình 3.2 Ngâm chiết, siêu âm và thu dịch chiết mẫu A niger IMBC-NMTP01

3.2 Kết quả phân lập, làm sạch, tinh chế các hợp chất từ các chủng nấm mốc A

niger IMBC-NMTP01

Chủng nấm mốc A niger IMBC-NMTP01 sau khi được lên men sinh khối

lượng lớn và chiết với ethylacetate thu được 5.2 g cao chiết tổng Cao chiết này được cắt phân đoạn qua cột pha đảo (RP) C18, rửa giải gradient lần lượt với các tỷ lệ dung môi tăng dần của methanol (MeOH) trong H2O từ 20:80 đến 100: 0 để thu được sáu phân đoạn F1 - F6 Phân đoạn F1 được tách bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 (CC), sử dụng MeOH-H2O (4: 1, v/v) làm chất rửa giải để thu được hợp chất A14 (18 mg) Phân

đoạn F2 được rửa nhiều lần bằng MeOH và lọc qua giấy lọc, thu được chất bột màu

hợp chất A4 (3 mg) Phân đoạn F3 được đưa lên cột Sephadex LH-20 CC, rửa giải

bằng MeOH-H2O (4: 1, v/v) để tạo ra sáu phần F3.1 – F3.6 F3.1 được sắc ký bằng cột silica gel, với hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (8: 1, v/v) làm pha động để thu được hợp

chất A5 (5 mg) F3.2 được tách bằng cột silica gel CC, sử dụng hệ n-hexan – EtOAc (1: 2,5, v/v) làm pha động để thu được hợp chất A2 (13 mg) F3.3 được sắc ký trên silica gel, rửa giải bằng n-hexan-EtOAc (1: 1, v/v) để thu được hợp chất A1 (2,4 mg)

và một phần nhỏ được tinh chế thêm qua cột RP C18 HPLC, sử dụng dung môi 28%

CH3CN trong nước (chứa 0,1% HCOOH) làm chất rửa giải để giải phóng hợp chất A11

(2 mg, tR = 28,3 phút) Từ phân đoạn F3.5, hợp chất A8 (6 mg) được phân lập bằng cột

silica gel CC, rửa giải bằng CH2Cl2 – EtOAc (4: 1, v/v) Phân đoạn F4 được tách qua cột Sephadex LH-20, sử dụng hệ dung môi MeOH – H2O (4: 1, v/v) làm chất rửa giải

để tách thành 5 phần F4.1 – F4.5 F4.2 được sắc ký qua cột silica gel CC, rửa giải bằng

CH2Cl2 – EtOAc (3,5: 1, v/v) và được tinh chế thêm qua hệ thống RP C18 HPLC, sử dụng hệ rửa giải 36% CH3CN trong H2O (chứa 0,1% HCOOH) thu được hợp chất A12

(4 mg, tR = 17,0 phút) F4.3 được tách bằng silica gel CC, rửa giải với CH2Cl2 –

acetone (8: 1, v/v) để thu được hợp chất A7 (16 mg) và một phân đoạn nhỏ được tinh

chế thêm qua hệ thống RP C18 HPLC, sử dụng 33% CH3CN trong H2O (chứa 0,1%

HCOOH) làm chất rửa giải để thu được hợp chất A9 (2,3 mg, tR = 28,7 phút) F4.4 được đưa qua cột RP C18 CC, rửa giải bằng CH3CN – H2O (1: 1, v/v) để tạo ra các phân đoạn con F4.4.1 – F4.4.4 F4.4.1 được tinh chế qua RP C18 HPLC, sử dụng hệ rửa

giải 47% CH3CN trong H2O (chứa 0,1% HCOOH) thu được hợp chất A6 (6 mg, tR =

31,8 phút) Tương tự, hợp chất A13 (5 mg, tR = 30,6 phút) thu được từ phân đoạn F4.4.4 bằng cách chuẩn bị RP C18 HPLC, sử dụng hệ dung môi 45% CH3CN trong

H2O (chứa 0,1% HCOOH) Như vậy, từ cao chiết tổng của chủng A niger

IMBC-NMTP01, sử dụng các phương pháp sắc ký kết hợp, kết quả thu được 14 hợp chất sạch (Hình 3.3)

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ chủng nấm mốc A niger IMBC-NMTP01

3.3 Kết quả xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

Từ cao chiết tổng của chủng nấm A niger IMBC-NMTP01, 14 hợp chất đã

được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, trong đó có hai hợp chất mới (A1 và A3)

12 hợp chất đã biết (A2, A4–A12) Cấu trúc của các hợp chất được xác định thông qua

phân tích phổ NMR 1 chiều và 2 chiều và phổ MS, kết hợp với so sánh các số liệu của các hợp chất đã công bố

3.3.1 Hợp chất A1: epi-Aspergillusol (chất mới)

Hợp chất A1 phân lập được có dạng chất bột màu trắng Công thức phân tử là

C14H14O4, được xác định dựa trên pic ion phân tử tại m/z 247.0963 [M+H]+

trên phổ HRESITOFMS, tương ứng với 8 độ bất bão hòa

Hình 3.4 Cấu trúc và tương tác HMBC ( và COSY (—) của hợp chất A1

Trên phổ 1H NMR (đo trong CDCl3) của hợp chất A1 xuất hiện các tín hiệu của

5 proton thơm tại H 7.22 (d, J = 8.0 Hz, H-9 and H-13), 7.32 (t, J = 8.0 Hz, H-10 and H-12), và 7.26 (t, J = 8.0 Hz, H-11), đặc trưng cho sự có mặt của một vòng phenyl

Phổ 1H-NMR cũng thể hiện tín hiệu của hai proton olefinic tại H 5.44 (d, J = 2.5 Hz, H-2) và 6.05 (dd, J = 1.0, 2.5 Hz, H-4), một proton oxymethine tại H 4.60 (dd, J = 4.0,

8.0 Hz, H-6), hai proton bắt cặp germinal tại H 3.26 (dd, J = 4.0, 14.0 Hz, Ha-7) và 2.93 (dd, J = 8.0, 14.0 Hz, Hb-7), và một nhóm methoxy tại H 3.84 (s, 3-OCH3) Từ những dữ liệu 1H NMR quan sát được, kết hợp với phân tích phổ 13C-NMR và HSQC (trong CDCl3) gợi ý sự hiện diện của phần cấu trúc 3-methoxy-1-oxo-1H-pyran-5-yl

trong phân tử Điều này được thể hiện thông qua sự xuất hiện của của một carbonyl carbon tại C 164.2 (C-1), bốn sp2 carbons tại C 88.2 (C-2), 171.3 (C-3), 99.0 (C-4), và 165.2 (C-5) Vị trí của nhóm metoxy tại C-3 được xác nhận bởi tương tác HMBC từ proton của nó (H 3.84) với C-3 Ngoài ra, tương tác COSY giữa H-6 và H2-7, cùng với tương tác HMBC từ H2-7 với C-8, C-9 và C-13 cho thấy sự xuất hiện của một đơn

vị 1-hydroxy-2-phenylethyl Cuối cùng, cấu trúc phẳng của hợp chất A1 được xác định

là 5-(6-hydroxy-7-phenylethyl)-3-methoxy-1H-pyran-1-one bởi tương tác HMBC từ

H-6 đến C-4 và C-5 So sánh dữ liệu 1H- và 13C-NMR của hợp chất A1 với hợp chất

aspergillusol đã biết cho thấy 2 hợp chất có cấu trúc phẳng giống nhau [93] Tuy nhiên,

giá trị góc quay cực của hợp chất A1 và aspergillusol lại ngược chiều nhau [hợp chất

A1: = -61.0 (c = 0.5, CHCl3) so với aspergillusol: = +35 (c = 0.4, CHCl3)],

gợi ý rằng hợp chất A1 là đồng phân đối quang của aspergillusol [93] Trên cơ sở đó, cấu hình tuyệt đối của hợp chất A1 được xác định bẳng phương pháp tính toán phổ

lưỡng sắc tròn điện tử (ECD) bằng chương trình Gaussian 16W Đầu tiên, các cấu dạng

của cặp đồng phân 6R và 6S được phân tích bằng chương trình Spartan'18 (MMFF)