Nghiên cứu định danh và đánh giá đa dạng di truyền của loài tế tân thanh thành (asarum splenders) thu thập tại việt nam

Trong các phương pháp phân loại b ng phân tử chỉ thị DNA barcoding là kỹ thuật định danh loài b ng cách sử dụng các vùng DNA chuẩn trên hệ gen sinh vật chỉ với một mẫu vật rất nhỏ, dùng

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Lê Đình Kỳ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG

DI TRUYỀN CỦA LOÀI TẾ TÂN THANH THÀNH

(ASARUM SPLENDERS) THU THẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội - 2022

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Lê Đình Kỳ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG

DI TRUYỀN CỦA LOÀI TẾ TÂN THANH THÀNH

(ASARUM SPLENDERS) THU THẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

Hướng dẫn 1: TS HUỲNH THỊ THU HUỆ

Hướng dẫn 2: PGS.TS NGUYỄN HUY HOÀNG

Hà Nội - Năm 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình

nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và

nghiên cứu Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và

khách quan nhất Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ

một nghiên cứu nào Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu

sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm

Tác giả luận văn

Lê Đình Kỳ

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự trân trọng và quý mến, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn bộ quý Thầy Cô của Học viện Khoa học và Công nghệ, quý Thầy Cô và các bạn trong Viện Nghiên cứu Hệ gen đã truyền đạt những kiến thức quý báu, những kinh nghiệm trong nghiên cứu cho em trong suốt thời gian học tập và thực hành nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô TS Huỳnh Thị Thu Huệ, người đã tận tâm giúp cho em trong từng việc làm, chỉ dạy từ cách thu thập mẫu, bảo quản và thực hành nghiên cứu đến chỉnh sửa những sai sót khi hoàn thành luận văn này

Em rất biết ơn định hướng của Thầy PGS TS Nguyễn Huy Hoàng đã cho

em có cơ hội tiếp xúc với nghiên cứu khoa học, cách làm khoa học cũng như cách thức để vận dụng những nghiên cứu khoa học vào thực tiển

Mặc dù thời gian đi thực tế thu thập mẫu nghiên cứu bị tác động bởi dịch bệnh Covid-19, do mỗi địa phương đều cố gắng chống dịch triệt để nên có nhiều tác động đến việc đi lại thu thập mẫu Trên tinh thần quyết tâm hết sức vượt qua trở ngại và được sự giúp đỡ hết lòng của các đơn vị để có được mẫu, em thấy thật là may mắn và biết ơn nhiều đến Đại tá Nguyễn Xuân Thủy - Phó chỉ huy trưởng Bộ chỉ huy bộ đội Biên Phòng tỉnh Lai Châu; Thiếu tá Vũ Văn Dũng đoàn kinh tế Quốc phòng 327, quân khu 3, Bắc Phong Sinh, tỉnh Quảng Ninh; các anh chị, đồng bào tại các khu Bảo tồn thiên nhiên Yên Tử, Quảng Ninh, khu Bảo tồn thiên nhiên Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc

Nghiên cứu này cũng được hỗ trợ nghiên cứu phân loại từ đề tài: "Nghiên cứu cơ sở khoa học cho việc sử dụng và bảo tồn một số loài mộc hương (Aristolochia L.) ở Việt Nam", mã số: ĐLTE 00.09/21-22

Bước đầu tiếp xúc nghiên cứu khoa học, do kiến thức và khả năng lý luận của bản thân còn hạn chế dù đã cố gắng hết khả năng nhưng luận văn không tránh khỏi sai sót, em rất mong sự cảm thông và chỉ dạy của Thầy Cô để em có cơ hội được tiếp thu học tập nhiều hơn nữa

Sự quan tâm, động viên và chia sẻ của gia đình và bạn bè đã tạo sự thuận lợi rất lớn cho em hoàn thành luận văn này

Em trân trọng và biết ơn tất cả!

Hà Nội, ngày 20 tháng 2 năm 2022

Tác giả luận văn

Lê Đình Kỳ

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

bp Cặp bazơ nitơ (base pair)

BPS Bắc Phong Sinh

CBOL Hiệp hội mã vạch sự sống (Consortium for the Barcode of Life)

CR Rất nguy cấp (Critically Endangered)

CTAB Cetyl trimethylammonium bromide

DD Thiếu dẫn liệu (Data Deficient)

DNA Axit deoxyribonucleic (Deoxyribonucleic acid)

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EN Nguy cấp (Endangered)

EW Tuyệt chủng ngoài tự nhiên (Extinct in the wild)

EX Tuyệt chủng (Extinct)

GenBank Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế

HK-2 Enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa glucose

(Hexokinase-2)

HPLC Phương pháp cắc ký lỏng (High Performance Liquid

Chromatography)

ITS Vùng đệm trong được sao mã (Internal transcribed spacer)

IUCN Liên minh Quốc tế bảo tồn thiên nhiên và tài nguyên thiên nhiên

(International Union for Conservation of Nature and Natural Resource)

Locus Vị trí mang gen trên NST

LR Ít nguy cấp (Lower risk)

matK Enzyme maturase K

NE Không đánh giá (Not Evaluated)

OD Phép đo mật độ quang (Optical Density)

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction)

PVP Polyvinylpyrrolidone

RNA Axit ribonucleic (Ribonucleic acid)

rpoC RNA polymerase C

VU Sẽ nguy cấp (Vulnerable)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Danh mục xếp hạng các loài Tế tân (Asarum L.) ở

Bảng 2.1 Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu các loài

Bảng 2.2 Danh sách trình tự và tên các đoạn mồi 20

Hình 3.1 Vị trí và hình dạng lá, thân, rễ Tế tân Yên Tử (A

Hình 3.2 Vị trí và hình dạng lá, thân, rễ Tế tân Yên Tử (A

Hình 3.3 Vị trí và hình dạng lá, thân, rễ Tế tân pételot (A

Hình 3.4 Vị trí và hình dạng lá, thân, rễ Tế tân Thanh Thành (A

Hình 3.5 Kết quả điện di DNA tổng số của bốn mẫu Tế tân 31 Hình 3.6 Kết quả điện di các sản phẩm PCR 32 Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch các mẫu Tế tân 33

Hình 3.8 Kết quả giải trình tự và một số vị trí đa hình của các

Hình 3.9 So sánh một số trình tự chỉ thị ITS1 của chi Asarum L 39

Hình 3.10 So sánh một số trình tự chỉ thị ITS2 của chi Asarum L 42

Hình 3.11 So sánh một số trình tự chỉ thị matK của chi Asarum L 50

Hình 3.12 So sánh một số trình tự chỉ thị rpoC của chi Asarum L 55

Hình 3.13 Cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS1 56

Hình 3.14 Cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS2 56

Hình 3.15 Cây phân loại dựa trên chỉ thị matK 57

Hình 3.16 Cây phân loại dựa trên chỉ thị rpoC 58

Contents

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1Đ C ĐIỂM CHUNG VỀ CHI TẾ TÂN (ASARUM L.) 4

1.1.1Đặc điểm phân bố, sinh thái và hình thái chung của chi Tế tân 4

1.1.2Những nghiên cứu về hoạt chất sinh học trong chi Tế tân 8

1.1.3Công dụng theo y học cổ truyền của các loài Tế tân 10

1.1.4Những nghiên cứu các loài Tế tân ở Việt Nam 13

1.2CHỈ THỊ PHÂN TỬ DN B RCODING TR N THỰC VẬT 14

1.2.1Khái niệm về DN barcoding 155

1.2.2Một số chỉ thị DN barcoding thường sử dụng trong phân loại 16

1.2.3Những nghiên cứu DN barcoding trong chi Tế tân nói chung 17

CHƯƠNG 2 NGUY N VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU 19

2.1NGUY N VẬT LIỆU, Đ I TƯ NG NGHI N CỨU 19

2.1.1Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

2.1.2Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 20

2.2PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU 21

2.2.1Mô tả đặc điểm hình thái 21

2.2.2Tách chiết DN tổng số từ lá 21

2.2.3PCR khuếch đại các chỉ thị DN barcoding 22

2.2.4Tinh sạch các đoạn DN 22

2.2.5Xác định trình tự nucleotide các chỉ thị DN 23

2.2.6Phân tích đánh giá sự đa dạng của mẫu nghiên cứu dựa trên chỉ thị DN

b ng công cụ tin sinh 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Đ C ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CÁC MẪU NGHIÊN CỨU 25

3.2 NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ DN B RCODING CỦ CÁC MẪU NGHI N CỨU 30

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ các mẫu Tế tân 30

3.2.2 Kết quả khuếch đại các đoạn chỉ thị DN b ng PCR 31

3.2.3 Kết quả tinh sạch các sản phẩm PCR khuếch đại các đoạn chỉ thị DNA

32

3.2.4 Kết quả xác định trình tự các đoạn DN barcoding 34

3.2.5 Kết quả phân tích đánh giá đa dạng di truyền các mẫu nghiên cứu dựa trên DNA barcoding 36

3.2.5.1 So sánh và phân tích trình tự các chỉ thị DNA 36

3.2.5.2 Xây dựng cây phân loại dựa trên các chỉ thị DNA 55

TÀI LIỆU TH M KHẢO 62

PHỤ LỤC i

DANH SÁCH TRÌNH TỰ THAM CHIẾU TỪ CƠ SỞ DỮ LIỆU GENBANK i

TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦ CÁC ĐOẠN CHỈ THỊ ĐÃ GIẢI MÃ ii

HÌNH ẢNH KHẢO SÁT TẾ TÂN TẠI CÁC ĐỊ PHƯƠNG vii

MỞ ĐẦU

Chi Tế tân (hay Hoa tiên, gừng dại – Asarum L.) thuộc họ Nam mộc

hương ( ristolochiaceae), bao gồm khoảng 128 loài, phát triển đa dạng ở các vùng ôn đới Bắc bán cầu Chi này có nhiều loài bản địa ở khu vực Đông Nam

Á, Trung Quốc, Đài Loan và duy nhất một loài ở châu Âu Theo các nghiên cứu trong nước, ở Việt Nam ghi nhận 10 loài theo các tài liệu phân loại thực

vật trong đó các loài A balansae Franch: Biến hóa núi cao; A blumei Duch

Tế hoa blume; A caudigerum Hance Thổ Tế tân; A glabrum Merr Hoa tiên;

A petelotii O C Schmidt Tế hoa pételot và A reticulatum Merr Tế hoa mạng phân bố chủ yếu ở khu vực phía Bắc nước ta; riêng A wulingense Liang (Tế

tân Vũ Linh) được phát hiện ở Hương Sơn, Hà Tĩnh; trong đó 3 loài n m trong sách đỏ nước ta

Ở một số khu vực vùng cao, các bộ phận như rễ, thân của các loài trong chi Tế tân được đồng bào các dân tộc sử dụng làm thuốc chữa các bệnh như viêm phế quản, hen suyễn hay phong hàn, tê thấp hay dùng thay thế mật gấu chữa bệnh Trong các bài thuốc dân gian, các sản phẩm từ chi này còn được

sử dụng kết hợp với các dược liệu khác ngâm làm rượu thuốc, thuốc bổ Các nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy, các loài Tế tân hầu hết có tinh dầu với một số thành phần chính như myristicin, metyl eugenol, myrcen, asafrol, borneol, safrol hay α-pinen bên cạnh đó còn có các chất khác secquiterpen, sterol, naringenin hay các glycosyl flavonoid

Ở Việt Nam, đã có một số nhóm nghiên cứu khoa học về thành phần hóa học của một số loài trong chi này, tuy nhiên còn khá hạn chế về phương pháp cũng như quy mô nghiên cứu Bên cạnh đó, chưa có nghiên cứu nào được ghi nhận về việc phân loại các loài này thông qua các chỉ thị phân tử ở nước ta Trong khi đó, nghiên cứu và ứng dụng nguồn tài nguyên cây cỏ vào y học cổ truyền rất có giá trị cho đời sống và y học Việc có thêm những thông tin quan tâm vào hệ thống dữ liệu phát sinh gen sẽ giúp khắc phục các khó khăn trong việc nhận diện mẫu, điều gây trở ngại cho các nhà nghiên cứu phân loại, tiến hóa, đặc biệt là khi nghiên cứu nhóm phân bố rộng và các loài có nguy cơ tuyệt chủng với nguyên liệu quý hiếm, các loài cây thuốc có giá trị cao Với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử hiện nay, việc khai thác thông tin loài thông qua chỉ thị phân tử là

rất cần thiết phục vụ trong nghiên cứu cơ bản cũng như các ứng dụng trong đời sống Thông thường, việc phân loại sẽ dựa trên các đặc điểm về hình thái bên ngoài, giải phẫu hoặc các đặc tính về sinh hóa, sinh lý bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn nhưng vẫn có sự sai sót nhất định trong phân loại khi những quan sát hình thái ở các giai đoạn sinh trưởng, phát triển chưa đầy đủ để định danh hoặc nhóm loài có quan hệ gần gũi mang những đặc điểm hình thái có độ tương đồng cao, những mẫu vật

bị khô héo, hư hỏng hay không còn nguyên dạng dẫn tới những khó khăn trong việc nhận diện và không thể nhận diện được Trong các phương pháp phân loại b ng phân tử chỉ thị DNA barcoding là kỹ thuật định danh loài

b ng cách sử dụng các vùng DNA chuẩn trên hệ gen sinh vật chỉ với một mẫu vật rất nhỏ, dùng một trình tự nucleotide của một chuỗi DNA ngắn ở vùng có tính bảo thủ cao (vùng ít bị thay đổi) nhưng có thể thay đổi trong quá trình tiến hóa để đánh giá sự sai khác di truyền giữa các sinh vật; phương pháp này sẽ khắc phục các nhược điểm phân loại b ng hình thái nhờ tính chính xác cao và nhanh chóng của nó Chỉ thị DN sử dụng vùng gen của ty thể đã được thiết lập tốt ở động vật, việc lựa chọn các mã vạch cho thực vật thường sử dụng các vùng gen ở lục lạp, cùng với sự kết hợp với một vài vùng trên hệ gen nhân như các đoạn ITS

Nghiên cứu về chỉ thị DNA của loài cây A splendens ở nước ta hầu

như chưa có cũng như các nghiên cứu quốc tế còn rất hạn chế Là một trong những cây thuốc được ứng dụng thay thế mật gấu để chữa bệnh, đặc biệt là tiềm năng ứng dụng trong chữa bệnh gan và thực tế nghiên cứu về loài này

còn ít nên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu định danh và đánh giá đa

dạng di truyền của loài tế tân Thanh Thành (Asarum splenders) thu thập

tại Việt Nam”, thông qua đó góp phần vào hiểu biết chung về các đặc tính

sinh học và về tính đa dạng trong di truyền DN phục vụ phân loại, giám định cho loài cây này

Đề tài thực hiện mục tiêu thu thập một số mẫu lá, thân của cây từ các vùng núi phía Bắc của Việt Nam Đánh giá được tính đa dạng di truyền dựa

trên các chỉ thị DN barcode ITS1, ITS2, matK và rpoC của cây Asarum splendens so với các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về loài Asarum splendens và với loài khác trong chi Tế tân Từ đó, có cái nhìn khái quát

chung về đa dạng di truyền loài Tế tân nói chung và Tế tân A splendens ở

Việt Nam nói riêng

Với những nội dung thực hiện trong nghiên cứu nhƣ sau:

- Thu thập mẫu tại các vùng núi khác nhau của miền núi phía Bắc

- Tách chiết DNA và PCR khuếch đại 4 đoạn chỉ thị DNA barcode ở thực vật

- Giải mã và phân tích trình tự nucleotide các đoạn chỉ thị DNA barcode

- Phân tích đánh giá sự đa dạng của mẫu nghiên cứu dựa trên chỉ thị

DN b ng công cụ tin sinh

Ý nghĩa và điểm mới của luận văn:

Cung cấp thêm dữ liệu DN đặc trƣng của loài Tế tân Thanh Thành

(A splender) cũng nhƣ ở một vài loài Tế tân khác ở Việt Nam, đóng góp

rất có ý nghĩa trong nghiên cứu nh m tìm ra những chỉ thị hữu ích cho việc phân loại và nhận dạng loài Tế tân Thanh Thành cũng nhƣ các loài Tế tân

khác của Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đ C ĐIỂM CHUNG VỀ CHI TẾ TÂN (ASARUM L.)

1.1.1 Đặc điểm phân bố inh hái và hình hái chung của chi Tế tân

Chi Tế tân (hay Hoa tiên, gừng dại – Asarum L.) thuộc họ Nam mộc

hương ( ristolochiaceae), bao gồm khoảng 128 loài [1] phát triển đa dạng ở các vùng ôn đới Bắc bán cầu Chi này có nhiều loài bản địa ở khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc, Đài Loan và duy nhất một loài ở châu Âu Theo một số nghiên cứu chi Tế tân được tìm thấy chủ yếu ở vùng núi có độ cao từ 700 m trở lên so với mặt nước biển Các loài cây Tế tân ưa thích các khu vực ẩm ướt,

có nhiều bóng râm và đất giàu mùn, lá có hình tim, mỗi năm lá mọc ra từ các đầu chồi tăng trưởng trên thân rễ

Các nghiên cứu trong nước cho thấy tuy cây Tế tân phát triển khá tốt trong các khu rừng đặc dụng, nhờ cách thức sinh trưởng nhưng cũng bị đe dọa

do các hoạt động khai thác quá mức để làm thuốc dẫn đến suy giảm nghiêm trọng trong tự nhiên Theo các công trình nghiên cứu của GS Phạm Hoàng Hộ trong cuốn “Cây cỏ Việt Nam, 1999” [2]; công trình nghiên cứu của GS Đỗ Tất Lợi trong cuốn “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 2004” [3]; Sách

đỏ Việt Nam, 2007 [4]; cuối năm 2007 ghi nhận được 7 loài Tế tân; năm 2012 Nguyễn Anh Tuấn và cộng sự bổ sung thêm 2 loài mới, đến năm 2017 Nguyễn Anh Tuấn và cộng sự tiếp tục bổ sung thêm loài mới là Tế tân Yên

Tử, như vậy đến năm 2017 Việt Nam ghi nhận 10 loài Tế tân, phân bố ở các tỉnh như Lai châu, Cao B ng, Ba Vì - Hà Nội, Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Sapa - Lào Cai, Hà Giang, Đảo Cát Bà - Hải Phòng, Hà Tĩnh, Yên Tử - Quảng Ninh

Các loài Tế tân ở nước ta gồm có Tế hoa blume – A blumei Duch, được Duch

mô tả khoa học lần đầu tiên năm 1864: tên gọi khác là Biến hóa Blume [5 ;

Thổ tế tân – A caudigerum Hance, được Hance mô tả khoa học lần đầu tiên năm 1881: tên gọi khác là Tế tân, Biến hóa, Quán chì; Biến hóa núi cao – A balansae Franch, được Franch mô tả khoa học lần đầu tiên năm 1898: tên gọi khác là Tế tân nam, hoa tiên [5]; Tế tân Pételot – A petelotii O C Schmidt,

được O.C.Schmidt mô tả khoa học đầu tiên năm 1931: tên gọi khác là Tế tân

Pételot [5]; Hoa tiên – A glabrum Merr, tên đồng nghĩa A maximum Auct

được Merr mô tả khoa học lần đầu tiên năm 1942: tên gọi khác là Trầu tiên,

Dầu tiên, Đại hoa tế tân [2]; Tế hoa mạng – A reticulatum Merr, được Merr

mô tả khoa học đầu tiên năm 1942; Vũ Linh Tế tân – A wulingense Liang được C.F.Liang mô tả khoa học đầu tiên năm 1975; A cordifolium C E C Fischer và Tế tân Vân Nam – A yunnanense T Sugaw., Ogisu & C.Y Cheng

bổ sung năm 2012 [6], [7] và Tế tân Yên Tử - A yentuense N Tuan và cộng

sự mô tả khoa học năm 2018 [8] Trong đó có 3 loài n m trong sách đỏ, đó là

A balansae Franch là cây thuốc dạng quý hiếm, thuộc phân hạng nguy cấp

EN 1c,d, B1+2b,c đang đứng trước một nguy cơ rất lớn sẽ bị tuyệt chủng ngoài thiên nhiên trong một tương lai gần, theo quan sát đã suy giảm ít nhất

50 %; A caudigerum Hance và A glabrum Merr cũng là cây thuốc dạng quý

hiếm, thuộc phân hạng nguy cấp VU 1a,c,d, và VU 1c,d tuy chưa phải là rất nguy cấp nhưng trong một tương lai gần sẽ đứng trước nguy cơ lớn tuyệt chủng ngoài thiên nhiên và đã suy giảm ít nhất 20 % [4]

Hình 1.1: Thứ hạng loài Asarum L theo tiêu chuẩn IUCN trong “Sách đỏ

Việt Nam”, 2007

Theo báo cáo “Điều tra đánh giá tình trạng bảo tồn các loài thực vật rừng nguy cấp, quý hiếm thuộc danh mục Nghị định 32/2006/NĐ-CP theo

vùng sinh thái” của Tổng cục Lâm nghiệp cuối năm 2010 thêm 2 loài Tế tân

n m trong nhóm IIA: nhóm các loài thực vật nguy cấp, quý hiếm đó là A petelotii O C Schmidt và A reticulatum Merr [9]

Bảng 1: Danh mục xếp hạng các loài Tế tân (Asarum L.) ở Việt Nam

Số

thứ tự Tên chi Tế tân Tên khoa học

Nghị định 32/2006 ND-CP

1 Biến hóa núi cao A balansae Franch IIA

5 Tế tân Pételot A petelotii O C Schmidt IIA

7 Tế tân Vũ Linh A wulingense C.F.Liang -

Nguồn: Trung tâm Tài nguyên và Môi trường Lâm nghiệp Viện Điều tra Quy hoạch Rừng

Về đặc điểm hình thái Tế tân là cây lá nhỏ có vị cay, các loài thuộc chi

Tế tân đều thân cỏ cao 10 cm - 30 cm tùy loài, mọc thấp thành đám nhỏ ở những nơi đất mùn, thường mọc thành từng đám theo bờ khe suối, không tìm thấy dưới tán cây lớn, chưa thấy mọc trên đỉnh núi, thường sống ở nơi có khí hậu mát mẻ, ẩm ướt quanh năm, nơi thường xuyên có mây mù bao phủ và độ cao trên dưới 1000 m, nơi có độ ẩm không khí trung bình năm trên 80 % và nhiệt độ trung bình năm từ 15 °C – 18 °C Mỗi năm cây phát triển thêm 1 – 4

lá tùy loài, phiến lá dài 10 cm – 18 cm, rộng 8 cm – 12 cm, lá mềm mỏng màu xanh lục, mặt trên nhẵn, mặt dưới hơi có lông, hình tim hoặc hình quả thận, mép nguyên, chóp lá nhọn, cuống lá dài, có lông tơ nhẵn mịn thường có màu tím nhạt Thân rễ dưới đất, bò ngang, đầu thân rễ có phân nhánh, đường kính thân rễ 4 – 5 mm, thân rễ n m rồi đứng, có rế sái vị, rễ nhỏ và dài, vê ở tay có mùi thơm [3]

Loài Tế tân Thanh Thành (A splendens) còn gọi là gừng dại Trung Quốc (Chinese wild ginger) trước đây còn gọi là A chingchengense Cây có

tốc độ phát triển chậm, mỗi năm chỉ ra 1 lá, cuống lá dài 15 cm - 18 cm có

màu tím đậm hơn so với loài khác trong chi Asarum L., lá sớm rụng vào mùa

đông và đến mùa xuân lá mới lại mọc ra từ các đầu chồi rễ n m dưới đất, nên người địa phương còn gọi là cây1 lá Lá mỏng cỡ 13 cm x 18 cm có màu xanh đậm lốm đốm bạc ở mặt trên hai bên phiến lá khác biệt so với các loài trong

chi Asarum L., lá hình tim nhọn ở chóp lá, 2 thùy gốc lá rộng (Xem hình 1.2)

Hình 1.2: Tế tân Thanh Thành (Asarum splendens F Maek.)

(Hình vẽ theo Legacy.tropicos.org) [10]

Hoa xuất hiện vào mùa xuân, mọc đơn giữa các gốc lá, ở mặt đất, hoa

có màu nâu tía hình cái bát, kì dị như cái ấm nhỏ, nên có biệt danh là “Little Brown Jug” (cái ấm nâu nhỏ) (Xem hình 1.3) [11]

Hình 1.3: Tế tân Thanh Thành (Asarum splendens F Maek.)

(Hình ảnh theo Alamy.com) [11]

1.1.2 Những nghiên cứu về h ạ ch inh học ng chi Tế n

Dựa trên các thành phần hợp chất phong phú, các loài trong chi Asarum

L cũng được các nhà khoa học quan tâm tới các hoạt tính sinh học của chúng trong những năm gần đây, mặc dù các loài này đã được ghi nhận trong các bài thuốc dân gian từ lâu Nhìn chung, các nghiên cứu ở chi này thường chỉ tập

trung ở một số loài phổ biến như A sieboldii (Hán thành tế tân) hay A heterotropoides (Bắc tế tân) Chi Tế tân n m trong nhóm 10 chi giàu loài cây

thuốc có chứa tinh dầu nhất [12], lượng tinh dầu thường ở khoảng 2 % - 3 % tùy thuộc vào loài Nghiên cứu trước đây của Yu Jing và cộng sự 2017 đã

đánh giá hoạt tính kháng viêm của 37 hợp chất trên loài A heterotropoides

var mandshuricum gồm các loại như lignans, neoasarinin, monoterpene, asarincin (Jing Y và cộng sự., 2017) [13] Trong năm 2001, Zhang và cộng

sự đã sử dụng phương pháp sắc ký để phân lập và phát hiện nhiều hợp chất

mới từ rễ và thân rễ của loài A longerhizomatosum C F Liang et C S Yang

(Zhang và cộng sự, 2001) [14] Ngoài ra, còn một số nghiên cứu đơn lẻ của các nhà khoa học Trung Quốc và Nhật Bản về thành phần hóa học của các

loài Asarum L., chủ yếu phân lập và chiết xuất các dẫn chất flavonoid glycosid Theo Feng Zhang 2005, tinh dầu lá ở mô lá của cây A forbesii chứa

hai thành phần chính là methylisoeugenol (33.3 %) và alpha-asaron (19.2 %); còn ở rễ tỉ lệ lần lượt là 58.8 % và 10.3 % [15]

Vào năm 2008, Shao-Qing Cai và cộng sự đánh giá hoạt tính gây độc của các cây trong chi Tế tân, ghi nhận một số chiết xuất có chống lại một số dòng tế bào ung thư nhất định; đáng chú ý trong đó có chiết xuất 95 % với

ethanol hoặc nước của A splendens cũng thể hiện khả năng gây độc tế bào

một cách có chọn lọc [16] Năm 2017, Wenting Ji và cộng sự đã đánh giá khả năng điều tiết quá trình viêm của một loại thuốc có nguồn gốc Tế tân lên tế bào tua [17] Một nhóm nghiên cứu khác sử dụng kỹ thuật sắc ký khối phổ để

tìm hiểu về độc tính in vitro của các loài Tế tân lên tế bào thận người (HK-2)

[18] Kết quả cho thấy không có độc tính lên tế bào ở nồng độ trong nghiên cứu, tuy nhiên các cơ chế khác liên quan tới gây độc ở thận và hình thành ung thư do aristolochic acid có thể xảy ra Công bố năm 2018 của nhóm khoa học Trung Quốc cho thấy các yếu tố viêm có liên quan tới độc tính trên phổi của

Asarum, mở ra những hướng nghiên cứu tiếp theo về cơ chế phân tử của độc

tính ở chi này [19] Gần đây nhất, trong năm 2021, có hai nghiên cứu mới của các nhóm nhà khoa học Trung Quốc về đánh giá về hoạt tính và mức độ gây độc của thuốc có nguồn gốc Tế tân và khả năng bảo vệ tế bào khỏi virus cúm H1N1, giảm các tác động của quá trình viêm [20] Các nhà khoa học Nga

trong năm 2020 về hóa thực vật và dược dân tộc học của chi Asarum L lần

nữa khẳng định sự có mặt của tinh dầu cùng các hợp chất thứ cấp cũng như hoạt tính sinh học rất phong phú [21] Cũng trong năm này, tìm hiểu của Seol

Jang và cộng sự ghi nhận 6 thành phần gây dị ứng của loài A sieboldii b ng

phương pháp HPLC [22]

1.1.3 Công dụng theo y học cổ truyền của các loài Tế tân

Tế tân đã được khai thác và sử dụng từ lâu trong nền Y học cổ truyền

để chữa bệnh, là loại thuốc có vị cay, tính ôn, quy vào kinh tâm, kinh can, kinh phế và kinh thận Có tác dụng khu phong tán hàn giải biểu, ôn ấm phế hóa đàm, thông khiếu, dùng trị phong hàn biểu chứng như đầu thống, tý thống, phúc thống, nha thống, đàm ẩm khái suyễn, và cũng được dùng làm thuốc bồi bổ cơ thể

Qua thực tế và tìm hiểu cây thuốc Tế tân có thể được sử dụng cả lá, thân

và rễ để làm thuốc, ở Việt Nam có nhiều nơi thu hoạch bán sang Trung Quốc, đồng thời các đại lý đông y cũng nhập Tế tân về từ Trung Quốc, khi sử dụng thường kết hợp với một số vị thuốc khác để chữa bệnh, liều lượng thường sử dụng 4 gram - 12 gram, lá Tế tân (Trầu tiên 1 lá) cùng với gừng gió, địa liền,

vỏ quế, hoa hồi ngâm với rượu dùng để xoa bóp trị bong gân, thần kinh tọa, phong thấp, cảm lạnh hoặc hòa nước tắm, ngâm chân tay khi đau nhức Ở vùng cao, đồng bào các dân tộc sử dụng làm thuốc giải độc rượu, nấu lá nước tắm chữa cảm phong hàn hay chữa các bệnh như viêm phế quản, hen suyễn, tê thấp Ngoài ra các sản phẩm từ chi này còn được kết hợp với các vị thuốc khác thay thế mật gấu để chữa bệnh hay ngâm làm rượu thuốc bổ

Một số bài thuốc cổ phương đến nay vẫn được sử dụng với vị thuốc Tế tân rất có hiệu quả như:

1 Bài thuốc Ma hoàng Phụ tử Tế tân thang gồm: Ma hoàng 4 g - 6 g, Phụ tử 4 g - 8 g, Tế tân 4 g – 8 g, sắc uống làm tráng dương, giải biểu, trị dương hư gầy yếu, cảm phong hàn, ớn rét, phế quản viêm mạn, hen phế quản

Tế tân vừa giúp Ma hoàng giải biểu, vừa giúp Phụ tử ôn kinh, tán hàn [23]

2 Bài thuốc Độc hoạt ký sinh thang là phương thuốc cổ truyền nổi tiếng được giới y học phương Đông đánh giá cao về hiệu quả điều trị hội chứng đau thần kinh tọa, trừ phong thấp, giảm đau, dưỡng can thận, bổ khí huyết gồm các vị như: Độc hoạt 8 g – 12 g, Phòng phong 8 g – 12 g, Bạch thược 12 g– 16 g, Đỗ trọng 12 g – 16 g, Phục linh 12 g– 16 g, Tang ký sinh

12 g – 24 g, Tế tân 4 g– 8 g, Xuyên khung 6 g– 12 g, Ngưu tất 12 g – 16 g,

Chích thảo 4 g, Tần giao 8 g – 12 g, Đương qui 12 g – 16 g, Địa hoàng 16 g–

24 g, Đảng sâm 12 g– 16 g Tùy từng trường hợp mà có thể điều chỉnh gia giảm liều lượng từng vị cho phù hợp Trong bài này độc hoạt và Tế tân là 2 vị chủ quy vào kinh thận loại bỏ các chứng tý khiến cho tà khí xuất ra ngoài [23]

3 Bài thuốc Linh cam ngũ vị khương tân thang gồm: Tế tân 4 g– 8 g, Can khương 8 g- 12 g, Phục linh 12 g– 16 g, Cam thảo 4 g- 8 g, Ngũ vị tử 4 g– 8 g sắc uống chữa trị ho nhiều đờm loãng như bệnh hen phế quản, giãn phế quản Trong bài này Tế tân là vị chủ dược ôn phế tán hàn [23]

4 Bài thuốc Tái tạo tán gồm: Hoàng kỳ 8 g, Nhân sâm 4 g, Quế chi 4 g, Thược dược 4 g, Cam thảo 2 g, Thục Phụ tử 4 g, Tế tân 4 g, Khương hoạt 4 g, Phòng phong 4 g, Xuyên khung 4 g, Gừng nướng 4 g, Đại táo 2 g Bài thuốc

có tác dụng trợ dương, ích khí, giải biểu, trị chứng dương hư, khí kém, mắc bệnh ngoại cảm phong hàn, thường có các triệu chứng đau đầu, sốt, sợ lạnh, chân tay mát, không có mồ hôi, mệt mỏi, buồn ngủ, sắc mặt tái nhợt, tiếng nói nhỏ, lưỡi nhợt, rêu lưỡi trắng, mạch trầm, vô lực hoặc phù, đại vô lực [23]

5 Đại hoàng Phụ tử thang chủ trị chứng thực hàn tích tụ, táo bón bụng đau, chân tay mát sợ lạnh, rêu lưỡi nhớt trắng, mạch trầm, huyền khẩn gồm 3 vị: Đại hoàng 8 g– 12 g, Thục phụ tử 8 g– 12 g, Tế tân 4 g– 8 g [23]

6 Thông quan tán gồm có 2 vị, lượng b ng nhau gồm Tạo giác, Tế tân tất cả thuốc tán thật mịn hòa đều, lúc dùng thổi vào mũi gây nên hắt hơi (nhảy mũi) Tác dụng làm thông quan, khai khiếu Tế tân thổi vào mũi có tác dụng khai thông khiếu vì phế chủ khí toàn thân, gây hắt hơi làm cho phế khí được tuyên thông thì chứng bế được cứu [23]

7 Bài thuốc chữa đau răng: Tế tân 10 g, thạch cao 10 g ngâm với 100

ml rượu trong nữa ngày Dùng rượu này để ngậm trong miệng cho đến khi mỏi thì nhổ đi [3], nên súc lại miệng b ng nước sạch

8 Bài thuốc chữa lở mồm, lở lưỡi: Tế tân và Hoàng liên lấy 2 vị lượng

b ng nhau tán nhỏ bôi vào miệng, lưỡi, ngậm cho đến khi chảy dãi ra là khỏi [3], nên súc lại miệng b ng nước sạch

9 Bài thuốc chữa cảm lạnh: Tế tân, bán hạ, phục linh, cát cánh, quế chi mỗi vị 2g và cam thảo 1g, sắc với 200 ml nước còn 100 ml chia 3 lần uống trong ngày [3]

10 Bài thuốc xoa bóp gồm có các vị lá trầu tiên, gừng gió, địa liền, quế chi, hoa hồi, tất cả thái nhỏ ngâm cùng với rượu sau 15 ngày dùng được; chủ trị các bệnh bong gân, trật khớp, vết thương bầm tím, gai đôi thoái hóa cột sống, thần kinh tọa, cảm gió, cảm lạnh, đau bụng đi ngoài, hoặc hòa vào nước ấm ngâm chân (Theo Nhà thuốc đông y Trường Sinh - Chùa Yên Tử - Uống Bí - Quảng Ninh)

11 Bài thuốc dùng thay thế thế mật gấu của người dân tộc Dao ở Đồng

Hỷ, Thái Nguyên: Hoa Tiên (A Glablum Merr.), Tế hoa pételot (A Petelotii O.C Schmidt), Răm rừng, Mận rừng, Địa liền, Hoàng đ ng, Nam hoàng, Rễ

gió, Củ gió, Tiêu lá gai, tất cả lượng b ng nhau (rau răm cho ít hơn), băm nhỏ, phơi khô, kết hợp ngâm rượu xoa bóp hay sắc uống [24]

Một điều rất đặt biệt trong thời gian gần đây, một người bị bệnh xơ gạn mạn do virus viêm gan C gây nên, giai đoạn bệnh nặng đã trở về từ bệnh viện

và may mắn sử dụng rượu một loại Tế tân, sau hơn 2 tháng dùng rượu thuốc bệnh đã thuyên chuyển theo chiều hướng tốt, nay người bệnh ổn định tuy không làm được việc nặng nhưng sinh hoạt đi lại được bình thường

sari Radix et Rhizoma ( RR) là một loại thuốc truyền thống quan trọng của Trung Quốc được bào chế từ một số cây thuốc thuộc chi Tế tân, đã được chứng minh là có các chức năng xua tan cảm lạnh, giảm đau và giảm đờm theo lý thuyết của y học cổ truyền Trung Quốc dùng hàng ngàn năm nay Trong số đó, thành phần tinh dầu và lignans là các thành phần chính quan trọng liên quan hoạt tính dược học đó Ngoài ra, các nghiên cứu hiện đại cũng chỉ ra r ng chi Tế tân và các hợp chất hoạt tính của nó có nhiều tác dụng dược

lý, đặc biệt là giảm đau, chống viêm, bảo vệ thần kinh, bảo vệ tim mạch, chống ho, ức chế miễn dịch, chống khối u và các kháng vi khuẩn [25]

Dịch chiết từ thuốc RR (thuốc đông y gồm các loài tế tân) có thể ức chế đáng kể sự chết của tế bào thần kinh PC12 và tế bào thần kinh đệm do axit α-amino-3-hydroxy-5methyl-4- soxazole propionic (AMPA) gây ra Kết quả cho thấy tác dụng bảo vệ não được suy đoán là chứa một số alcaloid bậc bốn và N-oxit, không có tác dụng gây độc tế bào trên tế bào PC12, như vậy dịch chiết xuất từ thuốc RR có khả năng bảo vệ tế bào thần kinh và tế bào thần kinh đệm [26] Những phát hiện này cho thấy dịch chiết từ thuốc RR

có thể là một công cụ dược lý mới được sử dụng để điều trị các bệnh thoái

hóa thần kinh như bệnh lzheimer, đột quỵ và bệnh Parkinson Thành phần asarinin và sesamin có trong thành phần các loài thuộc chi Tế tân có tác dụng dược lý trên hệ thống dopamine - là chất dẫn truyền thần kinh catecholamine phong phú nhất trong não sarinin và sesamin có thể kích thích sinh tổng hợp dopamine và bảo vệ tế bào PC12 khỏi L-DOPA gây ra độc tính thần kinh và sự ức chế gây độc tế bào gây ra 6-hydroxydopamine

b ng cách điều chỉnh hệ thống tín hiệu kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào (ERK1/2) trong tế bào PC12 [27]

Tế tân còn được ứng dụng trong nhiều bài thuốc khác chữa được nhiều bệnh trong các bài thuốc cổ phương hiệu nghiệm chưa thể đề cập hết ra đây, việc sử dụng cây Tế tân cũng nên cẩn trọng về liều lượng, bản thân Tế tân có chất độc acid aristolochic có thể được thận hóa giải với liệu lượng thấp nhưng nếu sử dụng ở liều cao thì sẽ gây ngộ độc

1.1.4 Những nghiên cứu các ài Tế tân ở Việt Nam

Theo các nghiên cứu trong nước, ở Việt Nam ghi nhận 10 loài trong

các tài liệu phân loại thực vật trong đó các loài Asarum balansae Franch: Biến hóa núi cao; Asarum blumei Duch Tế hoa blume; Asarum caudigerum Hance Thổ tế tân; Asarum glabrum Merr Hoa tiên; Asarum petelotii O C Schmidt

Tế hoa pételot và Asarum reticulatum Merr Tế hoa mạng phân bố chủ yếu ở khu vực phía Bắc nước ta; riêng Asarum wulingense Liang Vũ Linh tế tân

được phát hiện ở Hương Sơn, Hà Tĩnh; Các loài thuộc chi Tế tân đều thân cỏ, mọc thấp thành đám nhỏ ở những nơi có khi hậu ẩm; phân bố hạn chế ở những vùng núi cao, chỉ sống ở nơi có khí hậu mát mẻ quanh năm và độ cao trên dưới 1000 m Bên cạnh đó, một số loài được mô tả trong các tài liệu cây

thuốc nam hoặc du nhập vào nước ta, chẳng hạn như loài Asarum splendens

(Tế tân Thanh Thành hay còn gọi là gừng dại Trung Quốc), được (F.Maek.) C.Y.Chen & C.S.Yang mô tả khoa học lần đầu vào năm 1988

Ở một số khu vực vùng cao, các bộ phận như rễ, thân, lá của các loài trong chi Tế tân được đồng bào các dân tộc sử dụng làm thuốc chữa các bệnh như viêm phế quản, hen xuyễn hay phong hàn, tê thấp, viêm gan Ngoài các bài thuốc dân gian, các sản phẩm từ chi này còn được sử dụng ngâm làm rượu thuốc xoa bóp, thuốc bổ

Theo một số tài liệu trong tinh dầu Tế tân chứa các chất như metyl eugenol, myrcen, asafrol, borneol, hay α-pinen bên cạnh đó còn có các chất khác secquiterpen, sterol, naringenin hay các glycosyl flavonoid Các nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy, các loài Tế tân hầu hết có tinh dầu Với Tế tân pételot toàn bộ thân lá cho thấy có 18 hợp chất điển hình như myristicin (40,15%), dimethyl bicyclo (2-2-l)-2,5-heptadien (17,36 %), bissabolen (10,37 %), camphen (6,32 %), P-pinen (3,07 %) Kết quả cho thấy trong tinh dầu của thân và lá cây Tế tân Pételot đều có myristicin là thành phần có hàm lượng cao nhất trong tinh dầu Như vậy, trong tinh dầu Tế tân pételot thành phần myristicin chiếm 40,15 % toàn cây, thân cây chứa 33,11 %, trong rễ cây chứa 84,60 %, còn hàm lượng safrol trong tinh dầu toàn cây rất thấp chỉ

chiếm 0,79 % [28] Hàm lượng tinh dầu từ tế tân A balancae gồm 18 hợp

chất, trong đó elemicin (71,53 %), trans isoelemicin (19,85 %) Với loài tế tân

A yunnanense hàm lượng tinh dầu đạt 0,16% Thành phần hóa học chính là

E-methyl isoeugenol (47,39 %); Cis-β-elemene (5,94 %), bicyclogermacren

(4,58 %) Myristicine (4,26 %); δ-elemene (4,90 %) Còn loài tế tân A reticulatum có hàm lượng tinh dầu đạt 0,002 % với chất chính myristicine

(59,06 %); dilapiole (17,67 %) Các hợp chất khác có tỷ lệ nhỏ là elemicine (2,29 %) và 2-caren (2,1 %) Thành phần các hợp chất thứ cấp của Tế tân tương đối đa dạng, trong đó có các chất có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng histamin hay có tiềm năng gây độc cho tế bào ung thư (Trần Minh Hợi, 2004; Trần Huy Thái, 2010) [29], [30 Như vậy, đã có các nghiên cứu khoa học ở Việt Nam khảo sát về thành phần hóa học của một số loài trong chi này, mặc dù còn khá hạn chế về quy mô nghiên cứu Bên cạnh đó, chưa có nghiên cứu được ghi nhận về việc phân loại hay hệ thống học tiến hóa các loài này thông qua các chỉ thị phân tử DN cũng như nghiên cứu về gen/ hệ gen các loài này ở nước ta

1.2 CHỈ THỊ PHÂN TỬ NA A CO ING T N THỰC VẬT

Việc phân loại và định danh tên các loài chủ yếu dựa trên các đặc điểm hình thái đã có từ lâu, nhưng nếu chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái để phân biệt loài thì đôi khi khó khăn Phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái có nguyên tắc cơ bản là hai đơn vị phân loại có nhiều đặc điểm chung, càng giống chúng càng có quan hệ gần gũi với nhau Nhưng không phải đặc

điểm nào cũng có thể là đặc điểm để phân loại Các taxon bậc cao thường có đặc điểm phân loại ổn định, biến đổi chậm, còn taxon bậc thấp thì biến đổi nhanh hoặc liên quan đến cơ chế cách ly sinh sản Do vậy, để tăng độ tin cậy cho phân loại hình thái thì thường kết hợp nhiều đặc điểm lại với nhau

Ưu điểm của phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái là rất kinh tế, nhanh chóng và tiện lợi nhưng lại đòi hỏi các nhà phân loại học phải

có kiến thức chuyên sâu, có kinh nghiệm và sự khéo léo Đôi khi phương pháp này sẽ thiếu độ chính xác vì có hiện tượng đồng quy tính trạng và không phân biệt được các loại đồng hình, mặt khác bởi hình thái chính là kết quả của biểu hiện gen trong một điều kiện môi trường nhất định nên việc hoàn toàn dựa vào hình thái đôi khi dẫn đến các kết quả không xác thực, nhất là đối với các taxon thực vật có mức độ thường biến cao Các marker hình thái có nhiều điểm hạn chế như: các biến đổi hình thái không phát hiện được ở một số loài Các nghiên cứu sử dụng đặc điểm hình thái nói chung thường giới hạn trong một hay một vài locus; nhiều đặc điểm hình thái chỉ có thể quan sát được vào cuối chu kỳ sống; nhiều đặc tính hình thái không riêng biệt mà mang tính liên tục và chồng lấp giữa các loài gây trở ngại cho việc phân tích chính xác sự đa dạng di truyền của quần thể

1.2.1 Khái niệ về NA a c ding

Hiện nay, phương pháp hiện đại để giải quyết khó khăn trong phân loại

là ứng dụng sinh học phân tử để so sánh sự tiến hóa hay khác biệt giữa các loài bởi các đoạn DN đặc trưng, phương pháp này được gọi là DNA barcoding Đây là phương pháp đã và đang được sử dụng phổ biến trên thế giới để định danh hay nghiên cứu di truyền với ưu điểm nhanh chóng và có độ chính xác rất cao, có ứng dụng lớn trong công tác đánh giá, phân loại mức độ

đa dạng sinh học và bảo tồn nguồn gen của nhiều loài thực vật [31] Phương pháp này được áp dụng cho nhiều đối tượng, từ động, thực vật cho tới các loài

vi sinh vật khác nhau, dựa trên nguyên tắc so sánh một số trình tự DNA ở trong nhân, ty thể hay lục lạp, có tốc độ tiến hóa đủ lớn, để phân loại ở quy

mô các loài trong một chi hoặc giữa các chi Một số mã vạch thường được sử

dụng ở thực vật được biết đến là matK, rbcL [32], rpoC1, rpoB [33], thuộc vùng gen lục lạp, hay trình tự ITS (internal transcribed spacer) ở vùng gen

nhân, vùng này có tốc độ tiến hóa nhanh, mức độ đa dạng loài cao hơn nhiều

lần các vùng DNA lục lạp nên đang được đề xuất như là vùng DN chuẩn cho giám định thực vật

1.2.2 Một số chỉ thị NA a c ding hường sử dụng trong phân loại

Hệ gen lục lạp là phân tử DNA dạng vòng, kích thước, cấu trúc và trình

tự của hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao Những vùng không mã hóa của hệ gen lục lạp biến đổi nhanh hơn những vùng mã hóa Các đột biến ở DNA lục lạp thường là các thay thế nucleotide hay sự sắp xếp lại Phần lớn các gen lục lạp là loại gen đơn, trong khi các gen trong nhân là thường là họ đa gen Tính bảo thủ cao trong trình tự của DNA lục lạp là ưu thế để xây dựng lại mối quan

hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở các mức độ từ loài đến chi và đến họ thực

vật Một số mã vạch thường được sử dụng ở thực vật được biết đến là matK, rbcL, rpoC1, rpoB, trnH-psbA [32], [33], [34] thuộc vùng gen lục lạp, hay ITS

ở vùng gen nhân Các gen rpoC trong hệ gen lục lạp bao gồm các gen rpoA, rpoB và rpoC, mã hóa các protein tương đồng với các tiểu đơn vị α, β và β' của RNA polymerase của vi khuẩn (rpoC thường được chia thành rpoC1 và rpoC2, mã hóa β' và tiểu đơn vị β") RN polymerase có đa tiểu đơn vị từ lục

lạp của một số loài thực vật và thường bao gồm 7 - 13 tiểu đơn vị, một số

trong số đó có thể được xác định là sản phẩm của gen rpoA - rpoC [35] Hệ

gen trong nhân có kích thước lớn nhất trong số ba hệ gen ở thực vật (1.1×

bp đến 110× bp) và bao gồm rất nhiều gen Phần lớn các nỗ lực nghiên cứu về quan hệ phát sinh b ng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự DNA

ribosome trong nhân Vùng gen ITS trong nhân có cấu trúc bao gồm vùng bên ngoài vùng sao mã, tiếp đến là vùng gen 18S mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ và gen 26S mã hóa cho tiểu đơn vị lớn vốn phân cách nhau bởi một gen nhỏ hơn

là 5,8S Các vùng không mã hóa giao nhau giữu các gen trên là ITS1 và ITS2 Kích thước ba vùng mã hóa ở thực vật là khoảng 1800 bp với gen 18S, với gen 26S là khoảng 3300 bp và với gen 5,8S là khoảng 160 bp Tuy nhiên, chiều dài vùng ITS khá dao động Các trình tự 18S rDNA thường được sử dụng rộng hơn các trình tự 26S, do kích thước của 18S rDNA khoảng 1800 bp

giúp thuận lợi hơn để khuếch đại b ng PCR và giải trình tự Thực tế cho thấy

hình thể cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự 18S rDNA khá đồng dạng với cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự rbcL ở nhiều mức độ phân loại ở thực vật hạt kín Vùng gene 5,8S rDNA dễ dàng được khuếch đại và giải trình tự

khi sử dụng các mồi định vị trên các gen 18S và 26S rDNA Vùng ITS1 phân cách gen 18S rDNA với gen 5,8S rDNA còn ITS2 phân cách gen 5,8S rDNA với gen 26S rDNA Ở các thực vật có hoa vùng ITS có kích thước dưới 700 bp [34] Các trình tự ITS1 và ITS2 vốn giàu GC làm cho việc giải trình tự trở nên khó khăn Việc so sánh trình tự ITS từ nhiều họ thực vật hạt kín chỉ ra r ng các trình tự ITS1 và ITS2 đa dạng hơn trình tự của các gen rDNA Đã có nhiều bài báo chỉ ra sự thành công khi stuy nhiên quan hệ cử dụng các trình tự ITS

trong việc xây dựng lại lịch sử tiến hóa [36]

1.2.3 Những nghiên cứu NA a c ding ng chi Tế n n i chung

Trong năm 2015, Wu và cộng sự đã dựa trên một số chỉ thị DNA ITS

và psbA-trnH cùng kết hợp với kỹ thuật realtime PCR nhận diện các loài thực

vật thuộc họ Aristolochiaceae có chứa axít aristolochic, trong đó có 19 loài

thuộc chi Asarum L Nghiên cứu này là sự kết hợp một số chỉ thị DNA với

hóa phân tích để phát hiện những loài có chứa thành phần axít aristolochic

nh m bảo vệ người tiêu dùng khi sử dụng các thảo dược thuộc họ Aristolochiaceae [37] Một công bố khác của Sinn và cộng sự đã xây dựng và

bổ sung cho hiểu biết về mối quan hệ phát sinh các loài trong chi Asarum L dựa trên hai chỉ thị nhân (ITS1 - ITS2) và một số chỉ thị ở lục lạp khác; trong

đó phân tích 8 chỉ thị DNA của nhiều loài trong chi nên đã tiến hành trên

Asarum splendens, chỉ ra cây phân loại của chi này, tuy nhiên trong nghiên cứu này vẫn chưa có số liệu của các loài Asarum petelotii O C Schmidt và

Tế tân Yên Tử [38] Một nghiên cứu rất thú vị của nhóm này về vùng đơn

copy nhỏ trong cấu trúc của các đoạn DNA chỉ thị ở lục lạp như trnH, trnT, rps của rất nhiều loài trong chi Asarum L cho thấy chức năng của các vùng

này trên các chỉ thị lục lạp đó [39] Năm 2017, nghiên cứu về phân loại học

và tiến hóa phân tử trong chi Asarum L của Takahachi D và Setoguchi H dựa trên chỉ thị ITS và matK, đã tiến hành trên 120 mẫu được thu thập từ các vùng

khác nhau của Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan và Bắc Mỹ, trong đó có

Asarum splendens, có mẫu tại Việt Nam (A.sp DT2604§), còn một số loài như Asarum petelotii O C Schmidt và Tế tân Yên Tử cũng chưa được nghiên cứu Nghiên cứu này đã xây dựng cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS và matK cho chi Asarum L phân bố từ Trung Quốc đại lục và vòng cung đảo từ Đài

Loan đến vùng lục địa Nhật Bản [40] Trong nghiên cứu của Yao G và cộng

sự đánh giá chất lƣợng dựa vào phân tích GC-MS và định danh những mẫu

Asarum L thô và đã qua xử lý sử dụng mã vạch ITS2 cho thấy rất hiệu quả để đánh giá và nhận dạng các mẫu Asarum L thuộc các loài A heterotropoides

Fr Schmidt var mandshuricum, Asarum maximum Hemsl, Asarum sieboldii Miq, Asarum sieboldii Miq Var seoulense Nakai (Yao và cộng sự, 2020)

[41] Nhƣ vậy, qua tham khảo cho thấy nhiều nghiên cứu đã có trên các loài

khác nhƣng với A splendens và đặc biệt các loài A petelotii O C Schmidt

và A yentuense thì gần nhƣ chƣa có

CHƯƠNG 2 NGUY N VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU 2.1 NGUY N VẬT LIỆU Đ I TƯ NG NGHI N CỨU

2.1.1 Đối ư ng địa điểm và thời gian nghiên cứu

Tìm hiểu, khảo sát thực tế tại một số vùng núi phía Bắc Việt Nam như vùng núi Tân Phong, tỉnh Lai Châu; vùng núi biên giới Việt Trung (đối diện cột mốc 1337) thuộc xã Quảng Sơn, huyện Hải Hà, tỉnh Quảng Ninh; vườn quốc gia Tam Đảo thuộc tỉnh Vĩnh Phúc; rừng quốc gia Yên Tử thuộc tỉnh Quảng Ninh Việc thu thập mẫu được trình bày ở bảng sau:

Bảng 2.1: Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu các loài Tế tân tại Việt

Độ cao khoảng 800 m so với mặt nước biển

16/7/2021

Các mẫu cây Tế tân thu thập được bảo quản tươi ở khoảng 4 oC trong

tủ lạnh trước khi chuyển về Phòng Đa dạng sinh học Hệ gen, Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Tại đây, các mẫu lá được rửa sạch và bảo quản ở -20 oC để đảm bảo chất lượng cho các bước thí nghiệm tiếp theo

2.1.2 Hóa ch hiế ị nghiên cứu

Các hóa chất, thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu:

- Tách chiết DNA tổng số: đệm (100 mM Tris pH 8.0, 20 mM EDTA

pH 8.0, 1.4 M NaCl, 1 % PVP, 2% (CTAB), 0,2 % β-mercaptoethanol, phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), sodium acetate 0,3 M, ethanol (100 %), ethanol (70 %), RNase

- Khuếch đại sản phẩm PCR: DreamTaq PCR Master Mix (2X) (Thermo Scientific)

- Tinh sạch sản phẩm PCR: Thermo Scientific GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific), E.Z.N.A®Cycle Pure Kit (Omega Bio-tek)

Các hóa chất, thiết bị và vật tƣ tiêu hao khác phục vụ cho nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi Phòng Đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các đoạn mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR đƣợc thiết kế dựa trên thông tin về trình tự gen từ ngân hàng Gen quốc tế (GenBank) (Xem bảng 2.1):

Bảng 2.2: Danh sách trình tự và tên các đoạn mồi

Các trình tự gen ITS1, ITS2, matK và rpoC trong chi Asarum L tham

khảo và sử dụng để so sánh đối chiếu với trình tự trong nghiên cứu này và trình tự outgroup đã đƣợc công bố trên GenBank đƣợc liệt kê ở phần phụ lục 1: Danh sách trình tự tham chiếu từ cơ sở dữ liệu GenBank

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU

2.2.1 Mô tả đặc điểm hình thái

Xác định tên khoa học b ng phương pháp so sánh hình thái, đối chiếu với phương pháp phân loại trong các tài liệu chuyên ngành như sách Cây cỏ Việt Nam [2], Từ điển cây thuốc Việt Nam [5]

2.2.2 Tách chiế NA ổng ố ừ á

Mẫu được chọn để tách chiết là mô lá thân DNA tổng số được tách chiết b ng phương pháp CT B của Doyle và cộng sự với một số cải tiến để phù hợp hơn với các mẫu, cũng như bổ sung thêm phenol và chloroform để loại bỏ các sản phẩm phụ trong dịch chiết

Các mẫu lá được nghiền trong N2 lỏng để thu lấy dịch chiết, mẫu đã chuẩn bị được nghiền bột mịn và chuyển vào ống eppendorf 1,5 ml Dung dịch đệm chiết bao gồm 0,1 M Tris-HCl pH 8, 0,5 M NaCl, 0,05 M EDTA

pH 8; 0,01 % β-mercaptho ethanol và CTAB 10 %) có tác dụng phá vỡ màng tế bào và nhân Dịch chiết được ủ ở 65 °C trong 1 giờ, sau đó ly tâm ở tốc độ 13000 vòng /phút trong 15 phút để loại bỏ cặn Phần dịch trong tiếp tục được bổ sung hỗn hợp phenol: cloroform: isoamylalcohol theo tỉ lệ 25:24:1 (lần 1) hỗn hợp cloroform: isoamylalcohol theo tỉ lệ 24:1 và ly tâm

ở tốc độ 13000 vòng /phút trong 15 phút, nh m loại bỏ các sản phẩm phụ và các hợp chất thứ cấp /protein còn sót lại có thể ảnh hưởng tới chất lượng DNA tổng số Dịch chiết trong suốt được chuyển sang ống eppendorf mới và

bổ sung 50µl nước chứa RNAse (0,01 mg /ml) nh m loại bỏ RNA, ủ 37 °C trong 1 giờ Sau đó kết thúc thời gian ủ, thêm hỗn hợp cloroform:isoamylalcohol (24:1) và ly tâm 12000 vòng /phút trong 15 phút 4

°C, sau đó hút dung dịch pha trên để loại bỏ RNAse DNA trong dịch thu trên được tủa b ng CH3COONa 0,3 % cùng etanol 100 % và ủ ở -80 °C trong 1 giờ; sau đó ly tâm 12000 vòng /phút trong 15 phút ở 4 °C để thu được kết tủa Phần tủa được rửa b ng 300 µl ethanol 70 %, ly tâm làm sạch

và làm bay hơi hết b ng máy SpeedVac Cuối cùng, bổ sung nước đã khử trùng và bảo quản ở -20 °C DNA tổng số cũng được điện di trên gel agarose (0.8 %) để đảm bảo chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.2.3 PCR khuếch đại các chỉ hị NA a c ding

Sau khi có được DNA tổng số với chất lượng cao, phản ứng PCR nh m khuếch đại được thực hiện và tối ưu ở các điều kiện như sau: 25 µL tổng thể tích trên một phản ứng, bao gồm DNA tổng số (50 ng), primer thuận và nghịch (2,5 µM cho mỗi primer), enzyme Taq DNA Polymerase (1 unit), dNTPs (1 mM) và buffer tương ứng Chu trình nhiệt của phản ứng trên được tối ưu nhiệt độ gắn mồi phù hợp với từng cặp mồi, bao gồm ba bước như sau:

a Biến tính

Trong nghiên cứu của chúng tôi, bước biến tính được thực hiện ở điều kiện 95 oC trong 5 phút đầu tiên và 30 giây trong mỗi chu kì, nh m bẻ gãy các liên kết hydro và tách hoàn toàn DNA thành hai mạch đơn

b Gắn mồi

Nhiệt độ gắn mồi để thu được sản phẩm chính xác và duy nhất là rất quan trọng đối với kết quả của phản ứng PCR, do đó chúng tôi đã thực hiện tối ưu cho từng mồi và thu được nhiệt độ gắn mồi phù hợp với các chỉ thị

ITS1, ITS2, matK và rpoC; thực hiện ở 58 oC trong 30 giây

Kết thúc phản ứng PCR, sản phẩm được kiểm tra lại qua điện di gel agarose (0.8 %) và bảo quản ở 4 oC Các trình tự đúng với kích thước gen quan tâm sẽ tiếp tục được tinh sạch và các sản phẩm có nhiều băng không đặc hiệu sẽ được tinh sạch từ gel để thu đoạn trình tự có kích thước phù hợp

2.2.4 Tinh ạch các đ ạn NA

a) Tinh sạch DNA từ gel agarose

Đối với các kết quả có băng đúng kích thước nhưng xuất hiện các băng không đặc hiệu, sản phẩm PCR mong muốn được thu lại b ng phương

pháp gel agarose với bộ kit GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) Sản phẩm PCR được đưa lên gel agarose 0,8 % để điện di số lượng lớn (75 µL – 100 µL tổng thể tích) Vị trí sản phẩm đúng được cắt bỏ khỏi bản gel và cân khối lượng Dung dịch đệm gắn màng được bổ sung với tỉ lệ 1:1 (thể tích đệm : khối lượng gel) và ủ hỗn hợp gel ở 50 °C - 60

°C Sau gel tan hoàn toàn và dung dịch có màu vàng (nếu màu của dung dịch là cam hoặc tím, cần bổ sung 10 µl 3M CH3COONa, pH 5.2), dung dịch chứa gel được chuyển vào cột tinh sạch và ly tâm trong 1 phút Loại

bỏ dòng chảy qua và đặt cột trở lại ống thu nhận như cũ Lặp lại bước ly tâm và loại dịch sau khi bổ sung thêm 100 µl dung dịch đệm gắn màng (để tăng chất lượng sản phẩm giải trình tự) Sau khi loại hết dung dịch đệm gắn màng, 700 µl Wash buffer (đã có etanol) được bổ sung vào cột và ly tâm trong 1 phút để loại bỏ dòng chảy qua Tiếp tục ly tâm cột rỗng trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dung dịch đệm rửa còn sót lại Chuyển cột vào ống Eppendorf 1,5 ml mới, bổ sung 20 µl nước khử trùng vào giữa màng của cột và ly tâm để hòa tan DNA Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra b ng phương pháp điện di và bảo quản ở -20 °C

b) Tinh sạch DNA trực tiếp từ sản phẩm PCR

Các trình tự đúng kích thước được tinh sạch với bộ kit E.Z.N.A®Cycle Pure Kit (Omega Bio-tek) Sau khi bổ sung đệm CP phù hợp với lượng sản phẩm PCR, dung dịch được đưa vào cột và thực hiện các bước tinh sạch theo hướng dẫn của bộ kít Sản phẩm có chất lượng điện di cho băng chính xác và nồng độ phù hợp được bảo quản ở -20 oC

2.2.5 Xác định ình ự nuc e ide các chỉ hị NA

Trình tự các gen quan tâm được xác định bởi hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer dựa trên nguyên lý Sanger, sử dụng bộ kit BigDye®Terminator v 3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Mỹ) Các đoạn mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR đã được trình bày ở bảng 2.1 Sau khi thu được kết quả từ điện di mao quản, trình tự thô được xử lý b ng phần mềm Chromas và BioEdit (bao gồm hiệu chỉnh các peak không chính xác /không

có kết quả rõ ràng và loại bỏ phần rìa có chất lượng giải trình tự thấp) để có

được trình tự của đoạn chỉ thị mong muốn với độ chính xác cao

2.2.6 Ph n ch đánh giá ự đa dạng của ẫu nghiên cứu dựa ên chỉ hị

NA ng c ng cụ in inh

Sau khi có kết quả từ giải trình tự theo nguyên lý Sanger, trình tự thô

được xử lý, hiệu chỉnh và phân tích qua phần mềm Chromas và BioEdit Các

trình tự tương đồng trong chi Asarum L và một trình tự outgroup bổ sung đã

được công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế được tìm kiếm b ng công cụ BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Các trình tự được sắp xếp thẳng hàng b ng công cụ MUSCLE của phần mềm MEGAX Bên cạnh

đó, mô hình tiến hóa thích hợp cho mỗi trình tự barcode được lựa chọn dựa trên phần mềm Jmodeltest Cây phát sinh chủng loại được xây dựng b ng phương pháp Maximum likelihood với giá trị bootstrap 1000 thông qua phần mềm MEGAX

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đ C ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CÁC MẪU NGHIÊN CỨU

Quá trình thực tế lấy mẫu tại các địa điểm ở Quảng Ninh, Vĩnh Phúc và Lai Châu, ghi nhận các loài Tế tân phân bố ở độ cao từ 700 m trở lên so với mặt nước biển, cây thường mọc theo dọc sườn núi, cạnh lối đi, nơi có nhiều sương mù và độ ẩm cao Mẫu Tế tân tại núi Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc có đặc

điểm giống loài Tế tân pételoti (Asarum petelotii Schmidt) như mô tả trong từ

điển Cây thuốc Việt Nam của Võ Văn Chi, xuất bản năm 2012; và cuốn Cây

cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ, xuất bản năm 1999: thân bò có đường kính

4 mm – 5 mm, thân đứng mang 2 lá, lá có phiến dạng lá môn, chóp lá nhọn, hình tim, có tai to tròn, cỡ 21 cm x 9 cm, không có lông, cuống lá dài hơn phiến lá, lúc khô màu nâu đỏ

Cả 2 mẫu Tế tân thu được ở núi Yên Tử, tỉnh Quảng Ninh và tại vị trí gần cột mốc 1337 biên giới Việt Trung thuộc huyện Hải Hà, tỉnh Quảng Ninh

là cây thảo sống lâu năm, có thân rễ dài, mọc ngang, đường kính 2 mm - 3

mm, các đốt rễ ngắn dưới 1 cm, có nhiều rễ nhỏ mọc thành chùm, tại mỗi chồi mọc ra một hoặc 2 lá, cuống lá dài 14 cm – 28 cm, hình tim thon dài cân đối, chóp lá nhọn, mặt trên lá bóng có màu xanh đậm đồng nhất, cả 2 mặt không

độ trung bình năm từ 23 0

C – 24 0C, những ngày lạnh nhất nhiệt độ xuống đến

0 0C Theo người dân địa phương gọi đây là cây trầu một lá, chỉ mọc ở nơi nào thường có sương mù và gần trên đỉnh núi Dựa trên các đặc điểm hình

thái thân lá và rễ cho thấy loài này có tên khoa học A yentuense N Tuan &

Sasamoto (Xem hình 3.1)

(a) (b)

(c)

Hình 3.1: Vị trí và hình dạng lá, thân, rễ Tế tân Yên Tử (A yentuense) tại Yên

Tử (Hình chụp bởi Lê Đình Kỳ) (a) Định vị khu vực cây mọc; (b) Cây mọc trong tự nhiên; (c) Toàn bộ cây

Loài Tế tân ở Bắc Phong Sinh, Quảng Ninh mọc dưới rừng phòng hộ, trên tỉnh lộ 341 đối diện cột mốc 1337 biên giới Việt Trung thuộc xã Quảng Sơn, huyện Hải Hà, tỉnh Quảng Ninh ở độ cao trên 900 m so với mặc nước biển, nhiệt độ trung bình năm ở đây khoảng 22,4 0

C - 23,3 oC, thường xuyên

có sương mù bao phủ Dựa trên các đặc điểm hình thái thân lá và rễ cho thấy

loài này có tên khoa học A yentuense (Xem hình 3.2)

(c)

Hình 3.2: Vị trí và hình dạng lá, thân, rễ Tế tân Yên Tử (A yentuense)

tại Bắc Phong Sinh (Hình chụp bởi Lê Đình Kỳ)

(a) Định vị khu vực mọc; (b) Cây mọc trong tự nhiên; (c) Bộ rễ cây và

mầm chồi lá

Loài Tế tân ở trên núi Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc rất hiếm và khó tìm, người địa phương cũng gọi là cây trầu một lá Tại ví trí tìm thấy cây Tế tân ở

độ cao trên 1200 m so với mặt nước biển, tại đây khí hậu luôn mát mẻ, độ ẩm cao, nhiệt trung bình năm từ 18 0

C – 19 0C, quanh năm có sương mù bao phủ Dựa trên các đặc điểm hình thái thân lá và rễ cho thấy loài này có tên khoa

học A petelotii (Xem hình 3.3)

(c)

(Hình 3.3: Vị trí và hình dạng lá, thân, rễ Tế tân pételot (A petelotii) tại Tam

Đảo (Hình chụp bởi Lê Đình Kỳ) (a) Định vị khu vực mọc; (b) Cây mọc trong tự nhiên; (c) Toàn bộ rễ cây

Loài Tế tân Thanh Thành thu thập gần Đồn biên phòng tỉnh Lai Châu

có đặc điểm nhận dạng khác, là loài được người dân mang về trồng, cây cao khoảng 10 cm - 15 cm, thân bò ngang, rễ phát triển thành chùm mạnh mẽ có nhiều đốt, thân đứng 1 lá, lá hình tim tròn đều, dài 10 cm - 12 cm, mặt trên lá

có màu xanh lá lấp lánh ánh bạc Cuống lá màu tím, bộ lá được thay mới vào mùa xuân Có thể do điều kiện chưa phù hợp nên nhiều năm qua cây vẫn chưa

ra hoa Dựa trên các đặc điểm hình thái thân lá và rễ cho thấy loài này có tên

khoa học Asarum splendens (Xem hình 3.4)

(c)

Hình 3.4: Vị trí và hình dạng lá, thân, rễ Tế tân Thanh Thành (A splendens)

tại Lai Châu (Hình chụp bởi Lê Đình Kỳ) (a) Định vị khu vực cây mọc; (b) Cây trồng trong vườn; (c) Bộ rễ cây

Tóm lại, trong 4 lần thu thập mẫu vừa qua tại 4 địa điểm khác nhau, chúng tôi đã thu được 4 mẫu Tế tân nhưng trong đó chỉ có 1 mẫu Tế tân

Thanh Thành (A splendens) ở gần Đồn biên phòng tỉnh Lai Châu, 2 mẫu Tế tân Yên Tử (A yentuense) thu thập ở gần cột mốc 1337 biên giới Việt Trung,

xã Bắc Hà, huyện Hải Hà, tỉnh Quảng Ninh và ở núi Yên Tử, thành phố Uông

Bí, tỉnh Quảng Ninh và 1 mẫu Tế tân pételot (A pételotii) thu thập ở núi Tam

Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Tuy nhiên, toàn bộ các mẫu đều được sử dụng trong nghiên cứu và có sự so sánh phân tích các chỉ thị DNA của các mẫu với nhau

nh m bổ sung cho bộ số liệu DN các loài đang có tại Việt Nam

3.2 NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ NA A CO ING CỦA CÁC MẪU NGHI N CỨU

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ các mẫu Tế tân

Tách chiết DN là bước đầu tiên cho các thí nghiệm tiếp theo Để có được các kết quả tốt ở các bước PCR và giải trình tự, chất lượng của DNA tổng số đóng một vai trò rất quan trọng Đặc điểm của một dải DNA tốt là rõ ràng, nguyên vẹn và ít đứt gãy thành các băng mờ có kích thước thấp (xem hình 3.5) Phương pháp để đánh giá độ tinh khiết phổ biến nhất là tỷ số giữa

độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm trên độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm DNA chất lượng tốt sẽ có tỷ lệ A260/A280 trong khoảng 1,8 - 2,0 Thông thường, kết quả thấp hơn 1,8 cho thấy có sự chưa tinh sạch do lẫn protein, trong khi sự tạp nhiễm RN thường sẽ cho kết quả cao 2,0 260 / 230 được sử dụng làm thước đo thứ cấp về độ tinh khiết của axit nucleic

Trong nghiên cứu này, DNA tổng số của bốn mẫu lá Tế tân (LC: mẫu Lai châu, BPS: mẫu Bắc Phong Sinh, TD: mẫu Tam Đảo, YT: mẫu Yên Tử) được tách chiết b ng phương pháp CT B như đã đề cập B ng cách sử dụng đệm chiết CT B đã có thay đổi để phù hợp với mẫu nghiên cứu, kết hợp với loại bỏ protein và tạp chất b ng hỗn hợp dung dịch phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), kết tủa với CH3COONa 3M, EtOH 100 % và RNase, DNA tổng số đã được tách thành công và có chất lượng tốt, thể hiện qua kết quả điện di trên gel agarose Hình 3.5 cho thấy băng DN tổng số rõ ràng, không có vệt gãy và RN đã bị loại bỏ Sau đó, phép đo OD được thực hiện b ng cách sử dụng máy đo quang phổ Nanodrop để xác định nồng độ của DNA và kiểm tra lại độ tinh khiết của DNA tổng số Trong quá trình tách

chiết DNA của các mẫu Tế tân cho thấy do lá thân của cây thường chứa nhiều hợp chất thứ cấp như tinh dầu và hợp chất khác nên có gây khó khăn khi chưa tinh sạch DNA sau vài lần đầu tiên Sau đó, chúng tôi đã lặp lại việc kết tủa

và chiết với chloroform thì chất lượng DN đã sạch hơn nhiều Kết quả cho thấy, các mẫu đều có tỉ lệ A260 /A280 n m trong khoảng cho phép 1,8 - 2,0 Nồng độ của các mẫu DN là cũng n m trong ngưỡng khá cao như vậy các mẫu đủ điều kiện để sử dụng cho các bước tiếp theo trong nghiên cứu

Hình 3.5: Kết quả điện di DNA tổng số của bốn mẫu Tế tân

Chú thích: M: thang DNA chuẩn, LC: DNA mẫu Lai Châu, BPS: DNA mẫu Bắc Phong Sinh, TD: DNA mẫu Tam Đảo, YT: DNA mẫu Yên Tử

3.2.2 Kết quả khuếch đại các đ ạn chỉ hị NA b ng PCR

Trong nghiên cứu này, các đoạn mồi ITS1, ITS2, matK và rpoC được

sử dụng để khuếch đại các đoạn gen tương ứng của 4 mẫu Tế tân quan tâm

Kết quả điện di các sản phẩm PCR (Xem hình 3.6) cho thấy, ITS1 có băng ở

vị trí chính xác (khoảng 300 bp), tuy nhiên có xuất hiện sản phẩm phụ là một băng không đặc hiệu với kích thước trên 500 bp phía trên băng đúng kích thước, do đó cần tiến hành tinh sạch qua gel agarose để thu được đoạn gen

ITS1 mong muốn Các chỉ thị còn lại cho băng đặc hiệu ở kích thước khoảng

400 bp, 800 bp và 500 bp, tương ứng với lần lượt ITS2, matK và rpoC như dự

đoán khi thiết kế mồi nhân gen Kết quả này cũng tương đồng ở cả 3 mẫu nghiên cứu còn lại, cho thấy kết quả thiết kế mồi đã thành công Từ đó, có thể