Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN TIẾN SĨ: 1. Lý do chọn đề tài Isoflavone là một hợp chất thuộc nhóm flavonoid, thường có trong các cây họ đậu, có hoạt tính estrogen giúp chống lại các triệu chứng như loãng xương, trầm cảm, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, ung thư vú, v.v…thường xuất hiện ở phụ tiền mãn kinh. Do đó, isoflavone được giới khoa học trên thế giới quan tâm nhiều thập kỷ qua và được sử dụng chế biến các sản phẩm thực phẩm chức năng, dược phẩm, mỹ phẩm, nước giải khát và đồ uống trên trong nước và trên thế giới. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước về isoflavone còn ít, các sản phẩm thực phẩm bổ sung isoflavone hầu hết nhập ngoại có giá thành cao. Vì vậy cần xây dựng quy trình thu nhận isoflavone từ nguồn nguyên liệu dồi dào trong nước và ứng dụng vào sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone làm đa dạng hóa sản phẩm trong nước, giảm giá thành sản phẩm so với sản phẩm ngoại nhập, phát triển nền nông nghiệp và công nghiệp chiết xuất các hợp chất isoflavone. Do đó đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng” đã được lựa chọn. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ nguồn nguyên liệu cung cấp isoflavone sẵn có tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên bao gồm các quá trình trích ly, tinh chế và nâng cao hàm lượng hoạt tính sinh học cao isoflavone; Kiểm tra an toàn thực phẩm và hoạt tính sinh học của cao isoflavone; Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Nguyên liệu thực vật dùng để nghiên cứu trích ly isoflavone: Hạt đậu nành (Glycine max (L.) Merr), hạt đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek), củ sắn dây (Pueraria montana var. lobata (Wild) Sanjappa& Pradeep) và bã đậu nành. Phạm vi nghiên cứu: Đánh giá thành phần và hàm lượng isoflavone ở một số nguyên liệu thực vật tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên; Khảo sát các phương pháp trích ly, tinh chế và nâng cao hoạt tính cao isoflavone tinh chế; Kiểm tra chất lượng an toàn thực phẩm và hoạt tính sinh học của cao isoflavone; Ứng dụng cao isoflavone để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe; Khảo sát hàm lượng isoflavone trên 6 hợp chất: daidzein, genistein, glycitein, daidzin, genistin và glycitin. 4. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu trong luận án là phương pháp nghiên cứu thực nghiệm kết hợp với phân tích lý thuyết và tổng hợp tài liệu. Các phương pháp phân tích được sử dụng: Phân tích isoflavone theo phân tích sắc ký lỏng cao áp HPLC (AOAC 2008.83) và các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh được thực hiện theo tiêu chuẩn Việt Nam. Phương pháp đánh giá cảm quan: phép thử mô tả đặc tính của sản phẩm, phép thử cho điểm thị hiếu, phép thử so hàng thị hiếu, phép thử tam giác được thực hiện. Các thí nghiệm đều được thực hiện ít nhất 2 lần, kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, so sánh sự khác nhau có nghĩa ở mức =0,05. Tính toán quy hoạch thực nghiệm toàn phần 3 yếu tố 2 mức (TYT) 23 và phân tích ANOVA thực hiện trên phần mềm Minitab 18. 5- Bố cục của luận án Luận án gồm 137 trang, 50 Bảng biểu, 62 Hình ảnh. Nội dung của luận án gồm: Mở đầu (6 trang); Chương 1:Tổng quan (18 trang); Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (17 trang); Chương 3. Kết quả và thảo luận (92 trang); Kết luận và kiến nghị (4 trang). 6- Kết quả của luận án (1) Từ 4 loại nguyên liệu thực vật có sản lượng lớn tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên, nghiên cứu đã chọn hạt đậu nành và bã đậu nành làm nguyên liệu để thu nhận isoflavone. (2) Quá trình trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành đã được nghiên cứu bằng phương pháp chiết khuấy. Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi / nguyên liệu đến hàm lượng isoflavone chiết được nghiên cứu, được tiến hành quy hoạch thực nghiệm toàn phần với 2 mức 3 yếu tố và tối ưu hóa với mô hình Box-Wilson. Kết quả của việc tối ưu hóa cho thấy điều kiện tối ưu của chiết xuất isoflavone từ đậu nành là nhiệt độ 72,5oC, thời gian chiết là 67,5 phút, và tỷ lệ dung môi/đậu nành là 26,5/1(ml/g). Tương tự, điều kiện tối ưu của chiết xuất isoflavone từ okara là nhiệt độ 74,5oC, thời gian chiết 79,0 phút, và tỷ lệ dung môi/bã đậu nành là 26,5/1 (ml/g). Lượng isoflavone tổng thu được từ đậu nành và bã đậu nành lần lượt là là 1932,4µg / g chất khô và 160,0µg / g chất khô. (3) Luận án đã nghiên cứu cụ thể sự hấp phụ và giải hấp phụ tĩnh học của các hợp chất isoflavone thu nhận từ đậu tương và đậu bắp lên nhựa macroporous D101. Sự hấp phụ đã được chứng minh là phù hợp với các mô hình đẳng nhiệt Langmuir và Freundlich. Trong nghiên cứu hiện tại này, các điều kiện hấp phụ động cho quá trình tinh chế isoflavone trên cột đóng gói nhựa D101 đã được lựa chọn ở thể tích cột (BV) là 200 mL, thể tích nạp cột là 3,75 BV và tốc độ dòng 1,5 BV/h. Quá trình giải hấp động được thực hiện với dung dịch rửa giải 70% etanol, thể tích rửa giải 2,5 BV, và tốc độ dòng 1 BV / h. Hàm lượng isoflavone đạt được ở cao tinh chế đã cao gấp 8,7 lần so với cao thôđậu nành và hiệu suất thu hồi gần 80%. Sử dụng nhựa của macroporous D101 cho kết quả: chiết xuất tinh khiết / chiết xuất thô (mg / g chiết xuất) là 144,664 / 16,624. Kết quả cho thấy khả năng cao cho việc sản xuất isoflavone quy mô lớn để ứng dụng hơn nữa trên các sản phẩm thực phẩm chức năng hoặc dược phẩm. (4) Đề tài đã nâng cao hàm lượng aglycone trong dịch chiết tinh khiết nhờ sự thủy phân hoàn toàn liên kết -1-4-glycosidic giữa gốc glucose và aglycone của hợp chất glycoside bằng enzyme thương mại Celluclast 1,5 L có hoạt tính endoglucane. Trong thời gian thủy phân 360 phút, tỷ lệ thu hồi của daidzein, glycitein và genistein lần lượt là 91,8%, 71,6% và 84,3% và không có sự khác biệt có ý nghĩa (p> 0,05) so với 420 phút và 480 phút. Kết quả thí nghiệm cho thấy nhóm -glycoside đã được thủy phân hoàn toàn, tỷ lệ aglycone chiếm hơn 95% trong tổng lượng isoflavone. (5) Các chiết xuất isoflavone khô được đánh giá về hoạt tính sinh học (hoạt tính estrogen in vitro và in vivo, hoạt tính bảo vệ gan ngoại vi, hoạt tính chống viêm, lipid peroxide bằng MDA-test) và an toàn thực phẩm (hàm lượng kim loại nặng, độc tính cấp, ...). Các chiết xuất isoflavone thô và tinh khiết cho thấy có hoạt tính sinh học cao và an toàn thực phẩm. (6) Từ dịch chiết isoflavone thô và tinh khiết, luận án đã nghiên cứu xây dựng hai quy trình sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe giàu isoflavone đảm bảo tiêu chuẩn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe, được Hội đồng cho điểm thị hiếu trên 4 chỉ tiêu cơ bản (trạng thái, màu sắc, mùi, vị) đạt điểm trung bình> 7 trên thang điểm 9. Đóng góp của luận án • Quá trình trích ly isoflavone từ hạt đậu nành và bã đậu nành bằng chiết khuấy đạt được thông số trích ly tối ưu, với việc tăng nhiệt độ trích ly và lượng dung môi sử dụng nên rút ngắn thời gian trích ly. • Tinh chế isoflavone từ đậu nành và bã đậu nành bằng sắc ký cột D101 là đề xuất mới cho quy trình tinh chế isoflavone quy mô công nghiệp, đáp ứng “SẢN XUẤT XANH”, thân thiện với môi trường. • Thử nghiệm in vitro đánh giá hoạt tính sinh học của cao thô và cao tinh isoflavone trên dòng tế bào MCF-7 (estrogen), dòng tế bào HepG2 (bảo vệ gan), hoạt tính chống peroxy hóa lipid màng tế bào trên dịch đồng thể gan được thực hiện đầu tiên tại Việt Nam. • Đề xuất 2 quy trình sản xuất sữa chua đậu nành - nước cốt dừa và nectar chanh dây đáp ứng các tiêu chuẩn của thực phẩm bảo vệ sức khỏe

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRẦN TRẦN THỊ NGỌC THƯ THƯ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

THU NHẬN ISOFLAVONE TỪ MỘT SỐ NGUỒN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA-ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học:

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Isoflavone là một hợp chất thuộc nhóm flavonoid, thường có trong các cây họ đậu, có hoạt tính estrogen giúp chống lại các triệu chứng như loãng xương, trầm cảm, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, ung thư

vú, v.v…thường xuất hiện ở phụ tiền mãn kinh Do đó, isoflavone được giới khoa học trên thế giới quan tâm nhiều thập kỷ qua và được

sử dụng chế biến các sản phẩm thực phẩm chức năng, dược phẩm, mỹ phẩm, nước giải khát và đồ uống trên trong nước và trên thế giới Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước về isoflavone còn ít, các sản phẩm thực phẩm bổ sung isoflavone hầu hết nhập ngoại có giá thành cao Vì vậy cần xây dựng quy trình thu nhận isoflavone từ nguồn nguyên liệu dồi dào trong nước và ứng dụng vào sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone làm đa dạng hóa sản phẩm trong nước, giảm giá thành sản phẩm so với sản phẩm ngoại nhập, phát triển nền nông nghiệp và công nghiệp chiết xuất các hợp chất isoflavone Do đó đề

tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone

từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng” đã được lựa chọn

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ nguồn nguyên liệu cung cấp isoflavone sẵn có tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên bao gồm các quá trình trích ly, tinh chế và nâng cao hàm lượng hoạt tính sinh học cao isoflavone; Kiểm tra an toàn thực phẩm và hoạt tính sinh học của cao isoflavone; Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo

vệ sức khỏe bổ sung isoflavone

3 Nội dung chính của luận án

Đánh giá thành phần và hàm lượng isoflavone ở một số nguyên liệu thực vật tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên; Khảo sát các phương pháp trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành; Khảo sát các phương pháp tinh chế và nâng cao hoạt tính cao isoflavone tinh chế; Kiểm tra chất lượng an toàn thực phẩm và hoạt tính sinh học của cao isoflavone;

Đề xuất quy trình công nghệ thu nhận isoflavone; Ứng dụng cao isoflavone để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe; Đề xuất giải pháp

tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau khi trích ly isoflavone

4 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu trong luận án là phương pháp nghiên cứu thực nghiệm kết hợp với phân tích lý thuyết và tổng hợp tài liệu

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Luận án đã sử dụng quy hoạch thực nghiệm toàn phần 23 và mô hình thực nghiệm leo dốc Box-Wilson để tìm điều kiện trích ly isoflavone tối ưu từ hạt và bã đậu nành Luận án đã nghiên cứu cụ thể

sự hấp phụ và giải hấp phụ các hợp chất isoflavone từ cao trích ly hạt

và bã đậu nành theo mô hình hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir và Freundlich Quá trình hấp phụ và giải hấp phụ động học các hợp này cũng đã được thực hiện trên sắc kí cột D101, là cơ sở để xây dựng quy

trình tinh chế quy mô lớn

Luận án xây dựng được quy trình thu nhận isoflavone từ hạt và

bã đậu nành với một số công đoạn được cải tiến: trích ly bằng chiết khuấy, tinh chế bằng nhựa macroporous D101 và nâng cao hàm lượng aglycone bằng chế phẩm enzyme Celluclast1.5L Quy trình thu nhận isoflavone dễ vận hành, chi phí thấp, an toàn và giảm thiểu ô nhiễm môi trường thông qua việc sử dụng dung môi ethanol và nước Hai sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung giàu isoflavone từ cao

isoflavone là sữa chua đậu nành nước cốt dừa và nectar chanh dây đãđược kiểm tra và đánh giá đảm bảo các tiêu chuẩn trong nước

6 Bố cục của luận án

Luậnán gồm 137trang, 50 Bảng biểu,62Hình ảnh Nội dung của

luận án gồm: Mở đầu (6 trang); Chương 1:Tổng quan (18trang); Chương2:Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (17 trang); Chương 3 Kếtquả và thảo luận (92trang); Kết luận và kiến nghị (4 trang)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Trình bàycácnghiên cứu trên thế giới và trong nước về các vấn đề:

1.1 Giới thiệu về isoflavone

Isoflavone là một phân nhánh thuộc nhóm flavonoid, có nhiều

trong các loại thực vật họ đậu (leguminosae) Các nguồn nguyên liệuthực vật giàu isoflavone đã và đang được nghiên cứu hiện nay như đậunành, cỏ ba lá đỏ, cỏ linh lăng, đậu trắng, củ sắn dây, v.v… Các nhómaglycone (genistein, daidzein và glycitein) có hoạt tính sinh học cao

và dạng-glycoside (genistin, daidzin và glycitin) ổn định với nhiệt

độ, chiếm lượng lớn trong tổng số thành phần isoflavone nên chúngđược quan tâm nhiều nhất để trích ly vàsử dụng

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về công nghệ thu nhận và ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone

Trên thế giới, nhằm đáp ứng hàm lượng bổ sung vào các sản phẩm

thực phẩm bảo vệ sức khỏe isoflavone, nhiều côngtrình nghiên cứu vềphương pháp trích ly và tinh chế đã được công bố và ứng dụng vào quy

mô sản xuất công nghiệp, tuân theo các kỹ thuật trích ly “xanh”, dựavào các yếu tố về nguồn nguyên liệu và công nghệ khai thác “xanh”

Tại Việt Nam, tuy có lợi thế về các nguồn nguyên liệu giàu isoflavone, song các nghiên cứu trong nước về thu nhận isoflavone và sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung cao isoflavone chưa được nghiên cứu một cách toàn diện

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu thực vật dùng nghiên cứu trích ly isoflavone: Hạt đậu

nành (Glycine max (L.) Merr), hạt đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek) được thu nhận tại Đại Lộc-Quảng Nam, củ sắn dây (Pueraria montana var lobata (Wild) Sanjappa& Pradeep) được thu nhận tại Thiệu Hóa,

Thanh Hóa và bã đậu nành được thu nhận tại cơ sở chế biến đậu phụ, sữa đậu nành tại Đà Nẵng Nguyên liệu được làm sạch, sấy khô, trộn đều, xay mịn và bảo quản trong hộp kín ở nhiệt độ -20±2oC

2.1.2 Hóa chất, chế phẩm sinh học và thiết bị sử dụng chính

Các chất chuẩn isoflavone, hóa chất phân tích được sử dụng trong nghiên cứu có xuất xứ từ hãng Merck (Đức), Sigma (Hoa kỳ) và các hãng khác, đạt chuẩn phân tích Các loại nhựa macroporous được sử dụng để nghiên cứu gồm: D101, AB8 (Anhui Sanxing Resin Technology Co., Ltd, Trung Quốc), Diaion HP20 (Mitsubishi Chemical Corporation, Nhật Bản) và Amberlite XAD4 (Acros, Pháp) Giống vi khuẩn lactic thương mại Yoflex Express 1.0 (Chr Hansen Đan Mạch), chế phẩm enzyme thương mại Celluclast 1,5L (Novozymes, Đan Mạch) được sử dụng trong nghiên cứu

2.2 Bố trí thí nghiệm

2.2.1 Đánh giá hàm lượng isoflavone và thành phần trong một số loại nguyên liệu thực vật

Khảo sát hàm lượng isoflavone và một số thành phần hóa học của

4 loại nguyên liệu: hạt đậu nành, hạt đậu xanh, củ sắn dây và bã đậu nành Hàm lượng isoflavone của các loại nguyên liệu này được đánh giá theo 6 hợp chất gồm: daidzein, genistein và glycitein (thuộc nhóm

aglycone), daidzin, glycitin và genistin (thuộc nhóm -glycoside)

2.2.2 Khảo sát các phương pháp trích ly đến hiệu quả thu nhận isoflavone từ hạt đậu nành và bã đậu nành

Khảo sát điều kiện trích ly isoflavone trên nguyên liệu đã lựa chọn bằng 2 phương pháp: chiết khuấy và dùng sóng siêu âm; tiến hành tối ưu hóa điều kiện trích ly theo hàm lượng isoflavone bằng quy hoạch thực nghiệm toàn phần 2 mức 3 yếu tố và leo dốc tìm cực trị theo mô hình Box-Wilson

2.2.3 Khảo sát các phương pháp tinh chế cao isoflavone thu nhận

từ hạt và bã đậu nành

Khảo sát lựa chọn tinh chế isoflavone gồm trích ly rắn-lỏng và sắc ký cột (hạt pha tĩnh là các loại nhựa macroporous) Khảo sát nâng cao hàm lượng aglycone bằng thủy phân glycoside isoflavone sử dụng chế phẩm enzyme Celluclast1.5L

2.2.4 Kiểm tra chất lượng an toàn thực phẩm và hoạt tính sinh học

của cao isoflavone

Cao isoflavone được kiểm tra an toàn thực phẩm (hàm lượng kim loại nặng, độc tính cấp v.v ) và kiểm tra hoạt tính sinh học (hoạt tính

estrogen in vitro và in vivo, hoạt tính bảo vệ gan ex vivo, hoạt tính

chống peroxy hóa lipid v.v )

2.2.5 Đề xuất quy trình thu nhận isoflavone từ hạt và bã đậu nành

Đề xuất quy trình công nghệ với 1 số giải pháp công nghệ được cải tiến

2.2.6 Ứng dụng isoflavone để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Xây dựng 2 quy trình sản xuất sữa chua đậu nành-nước cốt dừa và nectar chanh dây bổ sung isoflavone từ đậu nành và bã đậu nành đạt chất lượng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe theo tiêu chuẩn Việt Nam

2.2.7 Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau khi trích ly isoflavone

Đánh giá thành phần hóa học và đề xuất giải pháp sử dụng phụ phẩm bột đậu nành sau khi trích ly isoflavone ứng dụng chế biến các sản phẩm thực phẩm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Một số phương pháp nghiên cứu được sử dụng:

Phân tích isoflavone theo phân tích sắc ký lỏng cao áp HPLC (AOAC 2008.83) và các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh được thực hiện theo tiêu chuẩn Việt Nam

Phương pháp đánh giá cảm quan: phép thử mô tả đặc tính của sản phẩm, phép thử cho điểm thị hiếu, phép thử so hàng thị hiếu, phép thử tam giác được thực hiện

Các thí nghiệm đều được thực hiện ít nhất 2 lần, kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, so sánh sự khác nhau có nghĩa ở mức =0,05 Tính toán quy hoạch thực nghiệm toàn phần 3 yếu tố 2 mức TYT23 và phân tích ANOVA thực hiện trên phần mềm Minitab 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đánh giá hàm lượng isoflavone và thành phần hóa học từ một

số nguyên liệu thực vật

Hàm lượng isoflavone tổng trong đậu nành cao nhất, gấp 14,30 lần so với bã đậu nành, và gấp 4,25 lần so với củ sắn dây Đậu xanh hạt chỉ xuất hiện genistein với hàm lượng rất thấp Mặt khác đậu nành

là cây ngắn ngày, thâm canh từ 2-3 vụ trong năm, cho sản lượng lớn, giá rẻ Trong khi sắn dây chỉ thu hoạch 1 lần/năm nên giá thành cao Việc sử dụng bã đậu nành để trích ly isoflavone vừa đóng vai trò quan trọng về mặt tận dụng giá trị dinh dưỡng còn lại, vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường Do đó nghiên cứu chọn nguyên liệu đậu nành và

bã đậu nành để tiến hành khảo sát trích ly nhóm hợp chất isoflavone

3.2 Ảnh hưởng của một số phương pháp trích ly đến hiệu quả thu nhận isoflavone từ hạt đậu nành

3.2.1 Phương pháp chiết khuấy

Nghiên cứu đã khảo sát đơn biến 5 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình

trích ly sử dụng phương pháp chiết khuấy Giữa 3 mẫu trích ly có sự khác nhau về pH môi trường (pH 2,5, pH 7,1; pH 9), mẫu có pH 7,1 cho hàm lượng isoflavone cao nhất và không có sự khác biệt có nghĩa giữa các mẫu (p>0,05) Kết quả cho các yếu tố nồng độ ethanol, tỉ lệ DM/NL, nhiệt độ và thời gian trích ly có tác dụng đáng kể đến hàm lượng isoflavone thu nhận (hình 3.5 và 3.7)

3.2.2 Phương pháp dùng sóng siêu âm

Qua phân tích 2 chiều ANOVA

về hàm lượng isoflavone của các

mẫu thí nghiệm, nghiên cứu đã

chọn được điều kiện siêu âm đạt

giá trị hàm lượng isoflavone tổng

siêu âm tại mức NLSA 70% giữ

được hoạt tính chống oxi hóa của

các hợp chất isoflavone và rút

ngắn được thời gian trích ly

nhưng khó ứng dụng trong công

3.3 Tối ưu hóa điều kiện trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành bằng phương pháp chiết khuấy

Ứng dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm toàn phần để đánh giá ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố là nhiệt độ (x1), thời gian (x2)

và tỉ lệ DM/NL (x3) đến quá trình trích ly isoflavone Qua tính toán và phân tích đã xây dựng được phương trình hồi quy (pt 3.1)

Tiếp tục tối ưu hóa quá trình trích ly bằng mô hình leo dốc tìm cực trị Box-Wilson, đã tìm được điều kiện tối ưu: nhiệt độ 72,5oC trong 67,5 phút, với tỉ lệ DM/NL=26,5/1 (ml/g), đạt hàm lượng isoflavone tổng số là 1932,4 μg/g nguyên liệu khô

Quá trình trích ly isoflavone từ bã đậu nành cũng đã được thực hiện tối ưu hóa bằng quy hoạch thực nghiệm toàn phần tương tự như ở hạt đậu nành Kết quả thực nghiệm cũng thu được phương trình hồi quy bậc nhất (pt 3.2) Tối ưu hóa quá trình trích ly bằng mô hình leo dốc

tìm cực trị Box-Wilson đã chọn được điều kiện trích ly là 74,5° ở 79,0 phút và tỉ lệ dung DM/NL= 26,5/1 (ml/g) đạt hàm lượng isoflavone cực đại 160,2 (g/g)

Ỹbã đậu nành = 133,52+5,99x1+5,10x2+5,28x3 (pt 3.2)

Như vậy, quá trình trích ly isoflavone từ hạt đậu nành và bã đậu nành bằng phương pháp chiết khuấy phù hợp với mô hình thực nghiệm toàn phần, thể hiện sự ảnh hưởng đồng biến của 3 yếu tố nhiệt

độ, thời gian và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu trên cả 2 nguyên liệu

3.4 Ảnh hưởng của phương pháp tinh chế cao isoflavone thô thu nhận từ hạt và bã đậu nành

3.4.1 Tinh chế cao isoflavone thô thu nhận từ hạt đậu nành bằng phương pháp trích ly lỏng-rắn

Thực hiện khảo sát trên hệ đơn dung môi (ethanol, 2-propanol, ethyl acetate và dichloromethane) và hệ hai dung môi

(dichloromethane/ethanol, acetone/nước) Trong các hệ dung môi nêu

trên, chỉ hệ dichlomethane/ethanol có tỉ lệ 1/3 (v/v) cho hàm lượng thu nhận cao trích ly cao nhất, đạt 35,501±0,313(mg/g)) và hiệu suất thu hồi trên 50%

3.4.2 Khảo sát một số loại nhựa macroporous dùng tinh chế isoflavone từ hạt đậu nành

Bốn loại hạt nhựa macroporous đều hấp phụ và giải hấp phụ tốt với các isoflavone

Cụ thể, khả năng hấp phụ của tổng số isoflavone, daidzin và genistin nằm trong khoảng 4,89-5,32 mg/g, 1,31 -1,45 mg/g hạt nhựa

và 2,19-2,35 mg/g hạt nhựa , tương ứng Tỷ lệ hấp phụ của 4 loại nhựa nằm trong khoảng 76,1-82,1% đối với isoflavone tổng số, 64,0-71,0% đối với daidzin và 79,3-85,1% đối với genistin

Tương tự, khả năng giải hấp và tỷ lệ giải hấp của tổng số isoflavone, genistin và daidzin giảm theo thứ tự Amberlite® XAD4> D101> AB-8> HP-20 Khả năng giải hấp của daidzin, genistin và tổng

số isoflavone trên nhựa D101 lần lượt là 1,45 mg/g hạt nhựa, 2,21 mg/

g hạt nhưa và 4,48 mg/g hạt nhựa và có sự khác biệt không đáng kể (p> 0,05) giữa nhựa D101 và Amberlite® XAD4

So với nhựa Amberlite® XAD4 có thành cao, nhựa D101 lại có giá thành rẻ hơn và năng lực hấp phụ và giải hấp phụ tương tự như XAD-4

Do đó, nhựa D101 được lựa chọn là nguyên liệu cho quá trình tinh chế isoflavone

3.4.3 Nghiên cứu tinh chế isoflavone từ cao thô thu nhận từ hạt đậu nành bằng nhựa macroporous D101

Theo đồ thị hình 3.20 cho thấy quá trình hấp phụ đẳng nhiệt của isoflavone từ đậu nành phù hợp với mô hình Langmuir và Freundlich

Trên mô hình hấp phụ sắc kí cột (hình 3.22) đã chọn được thể tích dung dịch isoflavone hấp phụ là 3,75 BV, tức 750ml với tốc độ với tốc

độ hấp phụ là 1,5 BV/h

Kết quả thực nghiệm khảo sát khả năng giải hấp phụ qua cột D101 (hình 3.23) cho thấy lượng ethanol 70% cần để rửa giải các hợp chất isoflavone hoàn toàn ở 2,5BV với tốc độ rửa giải là 1 BV/h Trong đó, đường cong rửa giải tập trung từ 0,5BV đến 1,5BV, đạt đỉnh tại 0,625BV cho daidzin, genistin và isoflavone tổng cho thấy khả năng rửa giải hấp phụ nhanh chóng (hình 3.22 và 3.23) Cao isoflavone tinh chế đạt được 144,664±1,214 (mg/g), gấp 8,73±0,06 lần so với cao thô

và gấp 3 lần so với cao dichlomethane/ethanol thực hiện bằng phương

trong cao isoflavone tinh chế bằng phương pháp thủy phân nhóm

-glycoside sử dụng chế phẩm enzyme Celluclast1.5 L Khảo sát đã cho thấy các yếu tố thủy phân là nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất và thời gian thủy phân đã ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển hóa các hợp chất -glycoside sang các hợp chất aglycone tương ứng Tại thời điểm thủy phân là 360 phút, hiệu suất thủy phân của daidzin, glycitin và genistin đạt trên 96% và đạt hiệu suất thu hồi daidzein, glycitein và genistein lần lượt là 91,8, 71,6 và 84,3 và không có sự khác biệt có nghĩa (p>0,05) so với thời điểm 420 phút và 480 phút Kết quả nghiên cứu đã cho thấy chế phẩm enzyme Celluclast1.5 nồng độ với nồng

độ enzyme là 0,16%, trong thời gian 360 phút và nồng độ cơ chất 17,5 mg/ml đã thủy phân hoàn toàn nhóm -glycoside thu được hàm lượng nhóm aglycone chiếm trên 95% hàm lượng isoflavone tổng

Hình 3.27 thể hiện hàm lượng aglycone tăng và các pic của hàm lượng glycoside hầu như không xuất hiện sau khi thủy phân

3.4.5 Nghiên cứu tinh chế isoflavone thu nhận từ bã đậu nành bằng nhựa macroporous D101

Isoflavone từ bã đậu nành cũng cho thấy phù hợp với 2 mô hình hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir và Freundlich (hình 3.30)

Trên mô hình sắc kí cột, cao isoflavone tinh chế từ bã đậu nành đạt được 36,216 (mg isoflavone /g cao), tăng gấp 7,090 lần so với cao thô, đạt hiệu suất thu hồi là 74,82%