Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng tt

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN TIẾN SĨ: 1. Lý do chọn đề tài Isoflavone là một hợp chất thuộc nhóm flavonoid, thường có trong các cây họ đậu, có hoạt tính estrogen giúp chống lại các triệu chứng như loãng xương, trầm cảm, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, ung thư vú, v.v…thường xuất hiện ở phụ tiền mãn kinh. Do đó, isoflavone được giới khoa học trên thế giới quan tâm nhiều thập kỷ qua và được sử dụng chế biến các sản phẩm thực phẩm chức năng, dược phẩm, mỹ phẩm, nước giải khát và đồ uống trên trong nước và trên thế giới. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước về isoflavone còn ít, các sản phẩm thực phẩm bổ sung isoflavone hầu hết nhập ngoại có giá thành cao. Vì vậy cần xây dựng quy trình thu nhận isoflavone từ nguồn nguyên liệu dồi dào trong nước và ứng dụng vào sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone làm đa dạng hóa sản phẩm trong nước, giảm giá thành sản phẩm so với sản phẩm ngoại nhập, phát triển nền nông nghiệp và công nghiệp chiết xuất các hợp chất isoflavone. Do đó đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng” đã được lựa chọn. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ nguồn nguyên liệu cung cấp isoflavone sẵn có tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên bao gồm các quá trình trích ly, tinh chế và nâng cao hàm lượng hoạt tính sinh học cao isoflavone; Kiểm tra an toàn thực phẩm và hoạt tính sinh học của cao isoflavone; Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Nguyên liệu thực vật dùng để nghiên cứu trích ly isoflavone: Hạt đậu nành (Glycine max (L.) Merr), hạt đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek), củ sắn dây (Pueraria montana var. lobata (Wild) Sanjappa& Pradeep) và bã đậu nành. Phạm vi nghiên cứu: Đánh giá thành phần và hàm lượng isoflavone ở một số nguyên liệu thực vật tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên; Khảo sát các phương pháp trích ly, tinh chế và nâng cao hoạt tính cao isoflavone tinh chế; Kiểm tra chất lượng an toàn thực phẩm và hoạt tính sinh học của cao isoflavone; Ứng dụng cao isoflavone để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe; Khảo sát hàm lượng isoflavone trên 6 hợp chất: daidzein, genistein, glycitein, daidzin, genistin và glycitin. 4. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu trong luận án là phương pháp nghiên cứu thực nghiệm kết hợp với phân tích lý thuyết và tổng hợp tài liệu. Các phương pháp phân tích được sử dụng: Phân tích isoflavone theo phân tích sắc ký lỏng cao áp HPLC (AOAC 2008.83) và các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh được thực hiện theo tiêu chuẩn Việt Nam. Phương pháp đánh giá cảm quan: phép thử mô tả đặc tính của sản phẩm, phép thử cho điểm thị hiếu, phép thử so hàng thị hiếu, phép thử tam giác được thực hiện. Các thí nghiệm đều được thực hiện ít nhất 2 lần, kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, so sánh sự khác nhau có nghĩa ở mức =0,05. Tính toán quy hoạch thực nghiệm toàn phần 3 yếu tố 2 mức (TYT) 23 và phân tích ANOVA thực hiện trên phần mềm Minitab 18. 5- Bố cục của luận án Luận án gồm 137 trang, 50 Bảng biểu, 62 Hình ảnh. Nội dung của luận án gồm: Mở đầu (6 trang); Chương 1:Tổng quan (18 trang); Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (17 trang); Chương 3. Kết quả và thảo luận (92 trang); Kết luận và kiến nghị (4 trang). 6- Kết quả của luận án (1) Từ 4 loại nguyên liệu thực vật có sản lượng lớn tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên, nghiên cứu đã chọn hạt đậu nành và bã đậu nành làm nguyên liệu để thu nhận isoflavone. (2) Quá trình trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành đã được nghiên cứu bằng phương pháp chiết khuấy. Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi / nguyên liệu đến hàm lượng isoflavone chiết được nghiên cứu, được tiến hành quy hoạch thực nghiệm toàn phần với 2 mức 3 yếu tố và tối ưu hóa với mô hình Box-Wilson. Kết quả của việc tối ưu hóa cho thấy điều kiện tối ưu của chiết xuất isoflavone từ đậu nành là nhiệt độ 72,5oC, thời gian chiết là 67,5 phút, và tỷ lệ dung môi/đậu nành là 26,5/1(ml/g). Tương tự, điều kiện tối ưu của chiết xuất isoflavone từ okara là nhiệt độ 74,5oC, thời gian chiết 79,0 phút, và tỷ lệ dung môi/bã đậu nành là 26,5/1 (ml/g). Lượng isoflavone tổng thu được từ đậu nành và bã đậu nành lần lượt là là 1932,4µg / g chất khô và 160,0µg / g chất khô. (3) Luận án đã nghiên cứu cụ thể sự hấp phụ và giải hấp phụ tĩnh học của các hợp chất isoflavone thu nhận từ đậu tương và đậu bắp lên nhựa macroporous D101. Sự hấp phụ đã được chứng minh là phù hợp với các mô hình đẳng nhiệt Langmuir và Freundlich. Trong nghiên cứu hiện tại này, các điều kiện hấp phụ động cho quá trình tinh chế isoflavone trên cột đóng gói nhựa D101 đã được lựa chọn ở thể tích cột (BV) là 200 mL, thể tích nạp cột là 3,75 BV và tốc độ dòng 1,5 BV/h. Quá trình giải hấp động được thực hiện với dung dịch rửa giải 70% etanol, thể tích rửa giải 2,5 BV, và tốc độ dòng 1 BV / h. Hàm lượng isoflavone đạt được ở cao tinh chế đã cao gấp 8,7 lần so với cao thôđậu nành và hiệu suất thu hồi gần 80%. Sử dụng nhựa của macroporous D101 cho kết quả: chiết xuất tinh khiết / chiết xuất thô (mg / g chiết xuất) là 144,664 / 16,624. Kết quả cho thấy khả năng cao cho việc sản xuất isoflavone quy mô lớn để ứng dụng hơn nữa trên các sản phẩm thực phẩm chức năng hoặc dược phẩm. (4) Đề tài đã nâng cao hàm lượng aglycone trong dịch chiết tinh khiết nhờ sự thủy phân hoàn toàn liên kết -1-4-glycosidic giữa gốc glucose và aglycone của hợp chất glycoside bằng enzyme thương mại Celluclast 1,5 L có hoạt tính endoglucane. Trong thời gian thủy phân 360 phút, tỷ lệ thu hồi của daidzein, glycitein và genistein lần lượt là 91,8%, 71,6% và 84,3% và không có sự khác biệt có ý nghĩa (p> 0,05) so với 420 phút và 480 phút. Kết quả thí nghiệm cho thấy nhóm -glycoside đã được thủy phân hoàn toàn, tỷ lệ aglycone chiếm hơn 95% trong tổng lượng isoflavone. (5) Các chiết xuất isoflavone khô được đánh giá về hoạt tính sinh học (hoạt tính estrogen in vitro và in vivo, hoạt tính bảo vệ gan ngoại vi, hoạt tính chống viêm, lipid peroxide bằng MDA-test) và an toàn thực phẩm (hàm lượng kim loại nặng, độc tính cấp, ...). Các chiết xuất isoflavone thô và tinh khiết cho thấy có hoạt tính sinh học cao và an toàn thực phẩm. (6) Từ dịch chiết isoflavone thô và tinh khiết, luận án đã nghiên cứu xây dựng hai quy trình sản xuất sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe giàu isoflavone đảm bảo tiêu chuẩn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe, được Hội đồng cho điểm thị hiếu trên 4 chỉ tiêu cơ bản (trạng thái, màu sắc, mùi, vị) đạt điểm trung bình> 7 trên thang điểm 9. Đóng góp của luận án • Quá trình trích ly isoflavone từ hạt đậu nành và bã đậu nành bằng chiết khuấy đạt được thông số trích ly tối ưu, với việc tăng nhiệt độ trích ly và lượng dung môi sử dụng nên rút ngắn thời gian trích ly. • Tinh chế isoflavone từ đậu nành và bã đậu nành bằng sắc ký cột D101 là đề xuất mới cho quy trình tinh chế isoflavone quy mô công nghiệp, đáp ứng “SẢN XUẤT XANH”, thân thiện với môi trường. • Thử nghiệm in vitro đánh giá hoạt tính sinh học của cao thô và cao tinh isoflavone trên dòng tế bào MCF-7 (estrogen), dòng tế bào HepG2 (bảo vệ gan), hoạt tính chống peroxy hóa lipid màng tế bào trên dịch đồng thể gan được thực hiện đầu tiên tại Việt Nam. • Đề xuất 2 quy trình sản xuất sữa chua đậu nành - nước cốt dừa và nectar chanh dây đáp ứng các tiêu chuẩn của thực phẩm bảo vệ sức khỏe

UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

TRAN THI NGOC THU

A STUDY ON BUILDING UP THE TECHNOLOGICAL PROCESS FOR OBTAINING ISOFLAVONES

FROM BOTANICAL SOURCES

TO PRODUCE FUNCTIONAL FOOD

Major: Food Technology

Code: 9 54 01 01

SUMMARY OF DOCTORAL THESIS

Da Nang, 2022

UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

Supervisor:

1 Assoc Prof., PhD Truong Thi Minh Hanh

2 PhD Bui Xuan Vung

INTRODUCTION

1 Rationale

Isoflavone composes of structure close to estrogen, a female hormone that plays an important role for menopausal women, supporting to fight symptoms related to sudden decrease of estrogen such as osteoporosis, depression, prevention of cardiovascular diseases, breast cancer, etc., and of premenopausal women Therefore, isoflavones have been concerning for decades and are used for the processing of functional food products, pharmaceuticals, cosmetics, soft drinks, and beverages in the country and around the world However, there are few studies on isoflavones in Vietnam and isoflavone supplement products are in high cost Consequently it is necessary to build up a technological process for obtaining isoflavones from abundant raw materials in local and use them to produce health supplement products, aiming at not only reducing costs, but also developing agriculture and isoflavones extraction

industry.Thus, the study chosen for the thesis was “A study on building up the technological process for obtaining isoflavones from botanical sources to produce functional food”

2 Objectives

Building up the technological process obtaining isoflavones using materials from Central-Highland Central Vietnam, including extraction, purification, and Quantitative enhancement of isoflavones

in extracts; Assessing food quality and bioactivity of isoflavones

extracts; Applying production of health supplement with isoflavone

3 Contents

Evaluating the composition and isoflavone content of plant materials in Central Highland-Central Vietnam; Investigating

methods of isoflavones extraction, purification and enhancing the aglycone content of extracts; Assessing food quality and bioactivity

of isoflavones extracts; Building up a technological process for obtaining isoflavones; Proposing solutions for utilising by-product

after extracting isoflavone

4 Methods

The method in the thesis is empirical and combined with

theoretical computing and documentary analysis

5 Scientific and practical significance

The thesis used 23 full factorial designs and the Box-Wilson model for optimizing the conditions of isoflavones extraction from soybean seeds and okara The thesis has studied the static adsorption and desorption of isoflavone compounds extracted from soybean and okara onto D101 macroporous resin in a specific way The adsorption has been demonstrated to be suitable to the Langmuir and Freundlich isothermal models The dynamic adsorption and desorption of isoflavone extracts have been implemented on column chromatography D101, from there, it will provide a model of a large-scale purification

The thesis has completed a process of isoflavones collected from soybean and okara with some modifications, specifically: stirring extraction, purification by D101 resin, and enhancing aglycones amount using Celluclast®1.5 L The proposed process of isoflavones collection is easy in operation, low-cost, safe and minimizes environmental pollution due to the utilization of ethanol and water solvents The crude and purified isoflavone extracts have shown to be high biological activities and food safe The isoflavone extracts were used to develop health supplement products, satisfying the Vietnamese Standards

6 Thesis structure

The thesis has 137 pages,50Tables,62Figures Introduction

(6pages),Chapter 1 Overview(18pages),Chapter2.Materials andMethods (17 pages); Chapter 3: Results and discussion (92 pages),Conclution(4 pages)

CHAPTER 1 OVERVIEW

Presenting international andnationalresearcheson:

1.1 Introduction of isoflavones

Isoflavoneare a sub of the flavonoid group, found in legumes

(leguminosae) The botany resources with isoflavones wereresearched such as soybeans, red clover, alfalfa, , kudzu root, …While aglycone form (daidzein, glycitein, genistein) is with highbioavailability, β-glycoside form (daidzin, glycitin, genistin)accounsfor a large proportion of the total isoflavones content So, they areboth most interested in extraction and application

1.2 Literature review in Vietnam and international researches

on technology of extraction, purification and health supplement with isoflavones

In the world, in response to the added content of isoflavonesin

health food products, many studies on extraction and purificationmethods have been published and applied to the industrial production

in large-scale The process of isoflavones collection accords the

"green manufacturing", based on factors of raw materials and

"green" extraction techniques

Although Vietnam has a richness of agricultural commodities

containing isoflavone, studies on isoflavones extraction and thedevelopment of healthysupplementswithisoflavone are still limited

CHAPTER 2 MATERIALS AND METHODS

2.1 Materials and chemicals

2.1.1 Materials

Soybean seed (Glycine max (L.) Merr), mung bean seed (Vigna radiata L Wilczek) was collected at Dai Loc-Quang Nam, kudzu roof (Pueraria montana var lobata (Wild) Sanjappa& Pradeep) was

obtained at Thieu Hoa-Thanh Hoa, and okara was obtained at Da Nang Raw materials were cleaned, dried, mixed, milled, and stored

at -20±2oC

2.1.2 Chemicals

Isoflavone standards, analysis grade chemicals were purchased from Merck (Germany), Sigma (USA), D101, AB8 macroporous (Anhui Sanxing Resin Technology Co., Ltd, China), Diaion HP20 (Mitsubishi Chemical Corporation, Japan), and XAD4 (Acros, France); Comercial starter culture Yoflex Express 1.0 (Chr Hansen Denmark); Celluclast1.5L (Novozymes, Denmark)

2.2.2 Assessing of methods for isoflavone extraction from soybean seed and okara

Assessing of isoflavone extraction conditions on selected materials by two methods: stirring and using ultrasound waves; optimizing extraction conditions of total isoflavone by the

experimental design of 2 levels of 3 factors (temperature, extraction time, and ratio of solvent/material) and Box-Wilson model

2.2.3 Investigation of isoflavone purification method and enhancement of aglycone content in purified isoflavones

Selecting the isoflavone purification method between liquid extraction and column chromatography (stationary phase particles uses macroporous resins);Enhancing of aglycone content by isoflavone glycoside hydrolysis using Celluclast1.5L

solid-2.2.4 Evaluating for biological activity and food safety of dry isoflavone extracts from soybean seed and okara

Dry isoflavones extracts are assessed about bio-activity

(estrogenic activity in vitro and in vivo, ex vivo hepatoprotective

activity, anti inflammatory activity, lipid peroxidation by MDA-test)

and food safety (heavy metal content, acute toxicity, )

2.2.5 Proposing to build up a technological process for obtaining isoflavones from soybean seed and okara

Proposing to build up a process of isoflavones obtainment with alternative modifications

2.2.6 Producing health supplements with dry isoflavone extracts

Developping 2 productions are soy-coconut yogurt and passion fruit nectar, fortified isoflavones from dry extracts, quality of health

supplements according to Vietnamese standards

2.2.7 Proposing solutions for utilising by-products after extracting isoflavone

Soybean flour after isoflavone extraction was assessed chemical components and proposed to process food productions

2.3 Analysis method

Determination of isoflavone from soybean using HPLC (AOAC

2008.83) Physic-chemical and microorganism properties of samples were analyzed according to Vietnamese standards

Sensory evaluation methods: product characteristics test, hedonic test (9-scale), ranking test, triangle test is performed

The experiments were performed at least 2 times, the results are presented as mean± standard deviation, compared with the significant difference at the level = 0.05 Calculated experimental design of 3 factors 2 level and ANOVA analysis were performed on Minitab ver 18 software

CHATER 3 RESULS AND DISCUSSIONS

3.1 Evaluation of several isoflavone-rich sources

The total isoflavone content in soybean found to be significantly higher than from okara and kudzu root by 14.30 times and 4.25 times, respectively Mung beans only contain genistein in very low level Soybean is a short-term crop and intensively cultivated with 2-

3 crops yearly, large yield, and low expenditure while kudzu root crop only harvests once a year The utilization of okara for isoflavones extraction plays an important role in exploring remaining

nutritional value and solving environmental pollution issue

Figure 3.1 and 3.3 demontrated the HPLC chromatograms of 6

isoflavones in soybean seed and okara

Thus, soybean seed and okara were chosen to investigate the condition of isoflavone extraction

3.2 Effects of extraction methods on isoflavone extraction effectiveness from soybean

3.2.2.Ultrasound-assisted extraction method

Using the two-way analysis

of variance (ANOVA), the highest

isoflavone content with 1773.0

± 21.7g/g dry basis obtained at

15 min and the power ultrasound

(US) 70% (figure 3.11)

3.2.3 Efficiency evaluation of stirring extraction and ultrasound- assisted extraction

However, this process is

not feasibility to apply in

the industrial scale The stirring extraction shown in higher extraction efficiency, this method is simple and easy in operation, lowers energy costs compared to ultrasound- assisted extraction (figure 3.12) Therefore, stirring extraction was chosen as the appropriate extraction method to extract isoflavone in the following experiments

3.3 Optimization of isoflavones extraction from soybean seed and okara using stirring method

The application of 23 full factorial design was conducted to evaluate the simultaneous influence of factors such as temperature (x1), time (x2), and solvent/material ratio (x3) on isoflavone extraction Through calculation and analysis, the regression equation has been built (eq 3.1)

Ỹsoybean= 1803,63+65,00x1+24,96x2+68,99x3 - 44,98x1x3 (eq 3.1) According to the regression equation, the variables of temperature, time, the ratio of solvent/material were in a proportional effect on the total extracted amount of isoflavones Meanwhile, the interaction between temperature and the ratio of solvent/material had

a reversed effect on the target function Ỹ Figure 3.13 also presents

factors affecting mainly the regression equation in three dimensional surface plots

Conduct steepest ascent experiments to find out the maximum value of target function according to Box-Wilson model: temperature

of 72.5°C, extraction time of 67.5 min, the ratio of solvent/material

of 26.5/1 at which the total amount of isoflavones achieved the maximum of 1932.4 (g/g)

The study optimize the extraction conditions from okara similar

to soybean, we obtained the first-order regression equation (eq 3.2) and selected the extraction condition of 74.5 at 79.0 min and the ratio

of solvent/material=26.5/1 reached the maximum isoflavone content

of 160.2 (g/g)

Ỹ okara= 133,52+5,99x1+5,10x2+5,28x3 (eq 3.2)

Thus, isoflavones extraction from soybean and okara were fitted with full factorial design, shown that the positive effects of temperature, time extraction and ratio of solvent/material on both materials

3.4 Purification of isoflavones from crude soybean and okara extracts

3.4.1 Isoflavones purification by soilid-liquid method

The experiment was carried out on single solvent system (ethanol, 2-propanol, ethyl acetate and dichloromethane) and binary

solvent (dichloromethane/ethanol, acetone/water) Among the above solvent systems, the solvent dichlormethane/ethanol (1/3, v/v) gave the highest extraction yield (35.501±0.313mg isoflavone/g dry extract) and the recovery yield of isoflavone over 50%

3.4.2 A screening test of four macroporous resins

All four resins showed high adsorption (figure 3.18) Specifically, the adsorption capacities of the total isoflavones, daidzin, and genistin were in the range of 4.89-5.32 mg/g, 1.31-1.45 mg/g, and 2.19-2.35 mg/g, respectively The adsorption ratios of the

4 resins were in the range of 76.1-82.1% for total isoflavones, 71.0% for daidzin, and 79.3-85.1% for genistin The adsorption capacity and adsorption ratio of D101 and Amberlite® XAD4 resins were considerably higher than the others, and there was no significant difference in adsorption ability among them (p > 0.05)

64.0-Similarly, the desorption capacities and desorption ratios of total isoflavones, genistin, and daidzin decreased in the order of

Amberlite®XAD4 >D101>AB-8>HP-20 (figure 3.19) The desorption capacities of daidzin, genistin, and total isoflavones on D101 resin were 1.45 mg/g, 2.21 mg/g, and 4.48 mg/g, respectively, and there were insignificantly different (p>0.05) from Amberlite® XAD4 As compared to high-priced Amberlite®XAD4 resin, in this study, D101 resin, which has a cheaper price, fairly possessed the same adsorption and desorption performances

Therefore, D101 resin was chosen for isoflavone purification from the crude extract

3.4.3 Purification of isoflavones from crude soybean extract using D101 macroporous resins

Figure 3.20 showed that the adsorption isotherms data of total

isoflavones, daidzin, and genistin on the D101 resin fitted well with the Langmuir and Freundlich model

The dynamic adsorption conditions for the purification process

of isoflavones on the D101 resins packed column were selected at

the bed volume (BV) of 200 mL, feed volume of 3.75 BV, and flow rate of 1.5 BV/h (figure 3.22) The dynamic desorption was carried out with the elution solution of 70% ethanol, elution volume of 2.5

BV, and flow rate of 1 BV/h (figure 3.23) The total isoflavones content in the purified isoflavones solid extract was enriched to 144.664 ± 1.210 (mg/g), being more than 8.7 folds higher than that in the crude soybean extract with a recovery yield of nearly 80%, higher than the solid-liquid method, using solvent dichlormethane/ ethanol (1/3, v/v)

3.4.4 Enhancement of aglycones content in purified soybean extract by enzyme cellulase

This study was aimed at increasing aglycone content in purified soybean extracts by enzymatic glycoside hydrolysis mehod using Celluclast 1.5 L (cellulase) The investigation results showed the efficiency of the glycoside conversion into corresponding aglycones was affected by enzyme concentration, substrate concentration, and hydrolysis time During the hydrolysis time (from 60-480 minutes), the hydrolysis ratio of daidzin, glycitin, and genistin reached over 96% Figure 3.27 have shown increasing the aglycones and the peaks

of glycosides almost disappeared after hydrolysis

For the hydrolysis time of 360 minutes the recovery ratio of daidzein, glycitein, and genistein were 91.80.2%, 71.65.8% và