Việc tạo ra các vật liệu thay thế mới phục vụ cho nhu cầu y học thì quá trình đánh giá sự tương thích hay không của các loại vật liệu trên cơ thể động vật trước khi đưa vào sử dụng ở bện
Trang 1BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH
SINH HỌC ĐỘNG VẬT
CHỦ ĐỀ
ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG HỢP SINH HỌC CỦA VẬT LIỆU
TRÊN MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT
Nhóm I-2
Thành viên nhóm:
1 Tạ Gia Bảo – 18150075
2 Lê Thị Kiều Duyên – 18150099
3 Trương Triệu Mỹ Duyên – 18150104
4 Trương Gia Hưng – 18150147
TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 08 năm 2021
Trang 2MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1
1.1 Tính tương hợp của vật liệu ghép 1
1.2 Sự thải loại trong cấy ghép 1
1.3 Đánh giá tính tương hợp sinh học của vật liệu 2
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2
2.1 Vật liệu 2
2.2 Phương pháp tiến hành 2
2.2.1 Bố trí thí nghiệm 2
2.2.2 Phương pháp cấy ghép vật liệu 3
2.2.3 Phương pháp xác định số lượng bạch cầu tổng 3
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4
3.1 Kết quả 4
3.2 Biện luận 5
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5
4.1 Kết luận 5
4.2 Kiến nghị 6
TÀI LIỆU THAM KHẢO 6
BẢNG THUẬT NGỮ CHUYÊN NGÀNH 7
Trang 3Việc tạo ra các vật liệu thay thế mới phục vụ cho nhu cầu y học thì quá trình đánh giá sự tương thích hay không của các loại vật liệu trên cơ thể động vật trước khi đưa vào sử dụng ở bệnh nhân là một quy trình rất quan trọng Vì vậy, chủ đề
“Đánh giá sự tương hợp sinh học của vật liệu trên mô hình động vật” được đưa vào chương trình giảng dạy là một điều thực sự cần thiết
Mục tiêu bài học giúp cho sinh viên hiểu được tầm quan trọng của việc tạo mô hình động vật để đánh giá độ tương hợp của vật liệu Từ đó đưa ra kết quả và đi đến kết luận cuối cùng của nghiên cứu
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tính tương hợp của vật liệu ghép.
Vật liệu có tính tương hợp sinh học không gây độc, không gây dị ứng, không làm thay đổi cấu trúc protein, không tạo ra các phản ứng miễn dịch, không gây ung thư hay đột biến, không gây sốc phản vệ sau khi cấy ghép các vật liệu này vào cơ thể trong thời gian dài Việc tương hợp sinh học xảy ra là một trong những tiêu chí quan trọng dẫn đến sự thành công cấy ghép lâm sàng [5]
Trang 4Qua các nghiên cứu nhận thấy rằng những vật liệu sau khi ghép vào cơ thể xảy ra các phản ứng hóa học một cách tối thiểu thì mang lại hiệu quả nhất [9] Do
đó việc đáp ứng sinh học đối với vật liệu phụ thuộc ba yếu tố: thành phần và cấu trúc của vật liệu, đặc điểm của vật liệu, chức năng của vật liệu [1]
Cấy ghép là đưa một vật liệu có chức năng sinh lý bình thường vào trong cơ thể người bệnh thay thế cho các mô, cơ quan nội tạng bị tổn thương hoặc đưa lên các mô hình động vật dùng trong nghiên cứu [1] Dựa vào nguồn gốc vật ghép được chia thành syngeneic, allogeneic và xenogeneic [2] Sự thải ghép xảy ra là do sự khác nhau về mặt di truyền của các gene mã hoá cho các cho các phân tử major histocompatibility complex (MHC), antibody (Ab) và antigene (Ag), các gene này khác nhau ở giữa người với người và với các loài khác [8]
Trang 5Khi đưa một vật ghép vào cơ thể sống thì đầu tiên chúng sẽ nhận diện vật ghép là một Ag lạ và hình thành các màng bao quanh, qua một thời gian nhận diện nếu vật ghép an toàn thì hợp nhất với cơ thể, nhưng nếu xảy ra bất thường thì sẽ thải loại [6] Cơ thế sẽ huy động một lượng lớn các antigene presenting cell, T helper cell, cytotoxic T cell, B cell, macrophage, monocyte,…đến tấn công vật ghép Tuỳ thuộc vào thời gian thải loại phát sinh, mức độ và loại tế bào miễn dịch người ta chia thành hyperacute rejectionacute rejection và chronic rejection [4, 7, 10]
1.3 Đánh giá tính tương hợp sinh học của vật liệu.
Vật liệu sinh học được thiết kế phải có khả năng tăng cường chức năng của tế bào sau khi ghép cũng như kích thích sự phát triển của mô tự thân Nếu không đạt yêu cầu của thử nghiệm tiên quyết thì các vật liệu này không được đánh giá tính tương hợp sinh học Các cách đánh giá tính tương hợp sinh học qua mô hình động vật: thử nghiệm không chức năng (vật liệu bất kỳ được ghép dưới mô mềm thông qua tiểu phẫu), thử nghiệm ex vivo (vật liệu thu từ cơ thể qua thử nghiệm vật liệu và đưa lại cơ thể động vật), thử nghiệm chức năng (ghép vật liệu có chức năng) [3]
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Trang 62.1 Vật liệu.
Dụng cụ: bộ buồng đếm hồng cầu (1); lamelle; đèn cồn; khay mổ (1); kẹp gắp (2); kéo (2); bercher 50mL; đĩa petri (1); bộ kim khâu và chỉ sinh học; bông gòn thấm; eppendorf 1,5mL; micropipette; đầu tip; kim tiêm; pipette pha loãng hồng cầu; dao lam
Hóa chất: dung dịch ly giải hồng cầu; thuốc gây mê (0,11ml); thuốc sát trùng Povidine (Pharmedic)
Thiết bị: kính hiển vi quang học (Euromex – Hà Lan)
Mẫu vật: chuột nhắt trắng (Mus musculus var Albino) trọng lượng 44g.
2.2.1 Bố trí thí nghiệm.
Trang 7Ngày thứ 1 (đếm bạch cầu tổng): chuẩn bị dụng cụ theo danh sách vật liệu đã liệt kê Sau đó, đếm và ghi nhận lượng bạch cầu tổng để theo dõi phản ứng viêm
Ngày thứ 3 (ghép vật liệu): Cân và ghi nhận trọng lượng chuột trước khi cấy ghép vật liệu Sau đó, tiến hành thao tác trên chuột để ghép các vật liệu theo yêu cầu
ở mỗi nhóm Cuối cùng, chăm sóc chuột theo quy định và quan sát
Ngày thứ 10 (đếm bạch cầu tổng và quan sát đại thể): xác định lượng bạch cầu tổng và cân trọng lượng chuột sau thí nghiệm và quan sát đại thể để phân tích kết quả thông qua các chỉ số trên Tiếp theo, giải phẩu thu vùng da đã cấy ghép vật liệu và quan sát hình dạng và các phản ứng viêm xung quanh của mô
Bảng 2.1 Các lô thí nghiệm.
Nhóm thí nghiệm (1,2) Cấy màng tim bò đã khử tế bào
Nhóm đối chứng âm (3) Cắt da lưng chuột và khâu lại
Nhóm đối chứng dương (4) Cấy màng tim bò chưa khử tế bào
2.2.2 Phương pháp cấy ghép vật liệu.
Trang 8Chuẩn bị hoá chất: pha loãng Povidine trong nước cất vào đĩa petri; tính toán lượng thuốc mê cần tiêm cho chuột theo công thức (0,1ml tương ứng với 40g trọng lượng chuột), đối với chuột 44g thì cần tiêm chính xác 0,11ml
Thao tác giải phẫu và cấy ghép vật liệu trên chuột: tiêm thuốc gây mê vào bắp đùi chuột, sau đó tiến hành cạo sạch vùng lông trên da ở vị trí cấy ghép và bôi dung dịch Povidine để sát khuẩn (sử dụng bông gòn thấm dung dịch) Tiếp tục tiến hành cắt một đường 0,5cm tại vị trí cần cấy ghép và cấy vật liệu theo yêu cầu (lưu ý mọi thao tác đều được thực hiện xung quanh đèn cồn) Cuối cùng, khâu vết mổ sau khi cấy ghép và sát khuẩn bằng dung dịch Povidine một lần nữa, chờ chuột tỉnh hẳn rồi thả lại vào chuồng để chăm sóc và quan sát phân tích kết quả
2.2.3 Phương pháp xác định số lượng bạch cầu tổng.
Trang 9Chuẩn bị hóa chất và dụng cụ: sử dụng becher 50ml chứa dung dịch ly giải hồng cầu; lau sạch buồng đếm hồng cầu và lamelle; chuẩn bị kính hiển vi
Thao tác xác định lượng bạch cầu tổng ở chuột: sử dụng kim tiêm để lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột và dùng pipette pha loãng hồng cầu hút đến vạch 0.5 sau đó chuyển sang hút dung dịch ly giải hồng cầu cho đến vạch 11, trộn đều trong 3 phút
và cho vào eppendorf Hút thêm dung dịch ly giải cho vào eppendorf để tiếp tục pha loãng, sau đó dùng micropipette hút 20ml dung dịch đã được pha loãng để nạp vào buồng đếm có lamelle (bỏ 3 giọt đầu) và chuyển lên kính hiển vi quan sát và đếm Tiến hành đếm ở 4 ô lớn ở 4 góc của buồng đếm (mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ), đếm theo nguyên tắc “cạnh trên bên trái” theo chiều từ trái sang phải theo hướng ziczac (lưu ý cần đếm nhanh vì nhiệt từ bóng đèn của kính hiển vi dễ làm vỡ các tế bào) Ghi nhận số liệu để tính toán và phân tích kết quả
Công thức tính tổng số lượng bạch cầu: N=(A/4) x D x 10 4 (tế bào/mL)
(trong đó N là số bạch cầu đếm; A là tổng số bạch cầu đếm được trong 4 ô; D là độ pha loãng =11/0,5=22)
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trang 103.1 Kết quả.
Hình 3.1 Số lượng bạch cầu trước và sau Hình 3.2 Vùng da ghép
thí nghiệm của bốn nhóm vật liệu của bốn nhóm.
Quan sát biểu đồ (Hình 3.1) ta nhận thấy ở chứng âm và thí nghiệm 1 lượng bạch cầu tổng sau thí nghiệm giảm hơn so với lượng bạch cầu tổng ban đầu, ở chứng dương và thí nghiệm 2 thì lượng bạch cầu tổng tăng hơn so với lượng bạch
Trang 11cầu tổng ban đầu Cả bốn thí nghiệm có lượng bạch cầu tổng đều thuộc trong phạm
vi bình thường ở chuột (4500-11500 tb/mm3) [1] (Chú thích hình 3.2: TN1: nhóm thí nghiệm 1; TN2: nhóm thí nghiệm 2; (+) chứng dương; (-) chứng âm.)
Quan sát đại thể dựa vào (Hình 3.2) nhận thấy ở thí nghiệm chứng âm thì mảnh da tại vị trí cấy ghép có hiện tượng tụ máu; thí nghiệm chứng dương tại vị trí cấy ghép có lớp màng bao quanh vật liệu; thí nghiệm 1 ở vị trí cấy ghép có hiện tượng tụ máu và hơi viêm; thí nghiệm 2 tại vị trí cấy ghép bị bao bởi lớp màng dày màu xanh, tụ máu nhiều và to ra do hiện tượng viêm
3.2 Thảo luận.
Chứng âm: xuất hiện hiện tượng tụ máu với số lượng bạch cầu tổng giảm có thể là do sai sót trong việc đếm hoặc thao tác sai trong quy trình thí nghiệm Còn tụ máu có thể là vị trí cấy ghép bị nhiễm trùng
Chứng dương: xuất hiện lớp màng bao quanh vật liệu với số lượng bạch cầu tổng tăng nhưng không xảy ra viêm như dự định ban đầu Lý do thời gian thí nghiệm ngắn không đủ để gây ra viêm, nếu để thời gian lâu sẽ có hiện tượng viêm
Trang 12Thí nghiệm 1: mẫu da hơi viêm với số lượng bạch cầu tổng giảm nhưng do ở đây là thí nghiệm ghép màng tim bò đã khử tế bào và chỉ còn lại lớp ECM nên khả năng gây viêm ở phía vật liệu gây ra hoàn toàn thấp, việc xảy ra viêm có thể do thao tác chưa chính xác Còn số lượng bạch cầu tổng giảm là do thao tác đếm bị sai
Thí nghiệm 2: tương tự thí nghiệm 1, nhưng ta thấy hiện tượng viêm nặng và
số lượng bạch cầu tổng tăng mạnh có thể là do thao tác sai sót lúc cấy dẫn đến nhiễm trùng nên số lượng bạch cầu trong cơ thể chuột tăng lên để phản ứng với quá trình nhiễm trùng chứ không phải đáp ứng với vật liệu
PHẦN 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận: khảo sát sự tương hợp sinh học của màng tim bò đã khử tế bào thất
bại do một số nhóm thao tác thí nghiệm sai cho nên dẫn đến kết quả cho thấy cơ thể chuột đào thải và không dung hợp với vật liệu cấy ghép
Trang 134.2 Kiến nghị: thời gian thí nghiệm nên được kéo dài thêm để có kết quả chính
xác hơn (thấy rõ được sự dung hợp hay thải loại của vật liệu cấy ghép), ngoài ra
thao tác cần cẩn thận và chính xác hơn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Trần Lê Bảo Hà, T.M.Q., Đoàn Nguyên Vũ, Lê Thị Ngọc Hương, Nguyễn
Thị Ngọc Mỹ, Vũ Thái Kim Thi, Đinh Thị Huyền Trang, Nguyễn Thị Thu
Thảo, Giáo trình thực tập vật liệu sinh học 2014, Nhà xuất bản Đại học
Quốc gia TP Hồ Chí Minh
2 Trần Văn Hiếu, Miễn dịch học: Chức năng và các bất thường của hệ miễn
dịch 2019: Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh.
Tiếng Anh:
Trang 143 Anderson, J.M., F.J Schoen, and N.P Ziats, In vivo assessment of tissue
compatibility, in Biomaterials Science 2020, Elsevier p 869-877.
4 Benzimra, M., G.L Calligaro, and A.R Glanville, Acute rejection Journal of
thoracic disease, 2017 9(12): p 5440.
5 Boutrand, J.-P., Biocompatibility and performance of medical devices 2019:
Woodhead Publishing
6 Cascalho, M and J.L Platt, Basic mechanisms of humoral rejection
Pediatric transplantation, 2005 9(1): p 9-16.
7 Imomjonovich, I.I., S.S Fayzullayevich, and N.J.-S Erkinovich,
Immunogenesis of Kidney Transplantation, Maintenance of Vital Signs of Transplanted Kidney Annals of the Romanian Society for Cell Biology,
2021: p 6794-6798
8 Kulski, J.K., T Shiina, and J.M Dijkstra, Genomic diversity of the major
histocompatibility complex in health and disease 2019, Multidisciplinary
Digital Publishing Institute
9 Mozafari, M., Handbook of Biomaterials Biocompatibility 2020: Woodhead
Publishing
Trang 16BẢNG THUẬT NGỮ CHUYÊN NGÀNH
1 Acute rejection Thải loại cấp tính
2 Allogeneic Ghép dị cá thể
5 Antigene presenting cell Tế bào trình diện kháng nguyên
chuyên nghiệp
7 Chronic rejection Thải loại mãn tính
8 Cytotoxic T cell Tế bào T gây độc
9 Hyperacute rejection Thải loại siêu cấp
10 Macrophage Đại thực bào
11 Major histocompatibility Phức hợp tương hợp mô chính complex
12 Monocyte Bạch cầu đơn nhân
14 T helper cell Tế bào T giúp đỡ
15 Xenogeneic Ghép dị loài
