CHIẾT TÁCH và PHÂN TÍCH PHỔ xác ĐỊNH cấu TRÚC một số SAPONIN TRONG lá cây bùi BA HOA ILEX TRIFLORA BL

Ở nhiều vùng nước ta các loài chè đắng Ilexđược sử dụng làm nước uống hàng ngày giúp cho việc mát gan, kích thích tiêu hóa, thanh nhiệt,…Trên thế giới hiện nay có nhiều công trình nghiê

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LA ̣T

TRẦN THỊ NGA

CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN TÍCH PHỔ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ

SAPONIN TRONG LÁ CÂY BÙI BA HOA

ILEX TRIFLORA BL

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH HÓA PHÂN TÍCH

Lâm Đồng–2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LA ̣T

CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN TÍCH PHỔ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ

SAPONIN TRONG LÁ CÂY BÙI BA HOA

ILEX TRIFLORA BL

Chuyên ngành:Hóa phân tích

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH HÓA PHÂN TÍCH

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trịnh Thị Điệp

Học viên thực hiện: Trần Thị Nga

Lâm Đồng– 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn

của PGS.TS Trịnh Thị Điệp

Những kết quả nghiên cứu của người khác và các số liệu trích dẫn trong luận

văn đều được chú thích đầy đủ

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về sự cam đoan này

Lâm Đồng, ngày 29 tháng 11 năm 2019

Tác giả

Trần Thị Nga

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến PGS.TS Trịnh Thị Điệp, người đầu tiên đã đưa tôi đến với lĩnh vực Hóa học các hợp chất thiên nhiên Cô đã chỉ dạy, hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Xin gửi lời cảm ơn đến:

- Các thầy cô giáo giảng dạy trong suốt khóa học Cao học tại Khoa Sau đại học – Trường Đại học Đà Lạt

- PGS.TS Nguyễn Văn Hạ và ThS Nguyễn Thị Tố Uyên đã giúp đỡ tôi rất nhiều khi làm việc tại phòng thí nghiệm

- Các anh chị, bạn bè lớp HHK25BCH – Khoa Sau đại học – Trường Đại học

Đà Lạt

Và đặc biệt, con xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình đã luôn động viên, nhắc nhở để con có được thành quả như ngày hôm nay

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về chi Ilex 2

1.1.1 Vài nét về chi Ilex 2

1.1.2 Vài nét về loài Ilex triflora Bl 2

1.1.3 Tác dụng dược lí của một số loài Ilex 3

1.1.3.1 Theo kinh nghiệm dân gian 3

1.1.3.2 Một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học 3

1.2 Những nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Ilex 4

1.2.1 Flavonoid 5

1.2.2 Triterpenoid và triterpenoid saponin 6

1.2.3 Acid phenolic 10

1.2.4 Các nhóm hợp chất khác 11

1.2.5 Những nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Ilex triflora Bl 12

1.3 Các phương pháp chiết xuất và cô lập hợp chất thiên nhiên 13

1.3.1 Phương pháp chiết 13

1.3.1.1 Kĩ thuật chiết lỏng – lỏng 13

1.3.1.2 Kĩ thuật chiết rắn – lỏng 14

1.3.2 Các phương pháp sắc kí 14

1.3.2.1 Phân loại theo bản chất của hai pha sử dụng 15

1.3.2.2 Phân loại theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình tách chất 16

1.3.2.3 Phân loại theo hình dạng của pha tĩnh 17

1.4 Phương pháp chiết xuất và phân lập saponin 18

1.4.1 Phương pháp chiết xuất 18

1.4.2 Phương pháp phân lập 18

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp chiết xuất và phân lập 19

2.2.1 Phương pháp chiết 19

2.2.2 Phương pháp sắc ký cột 19

2.2.3 Phương pháp sắc ký bản mỏng 20

2.2.4 Phương pháp tinh chế sản phẩm 20

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 21

3.1 Điều chế các dịch chiết từ lá cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl 21

3.2 Phân lập các hợp chất từ lá cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl 21

3.2.1 Quy trình phân lập 21

3.2.2 Thông số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất phân lập được 22

3.2.2.1 ITS01 22

3.2.2.2 ITS02 23

3.2.2.3 ITS03 24

3.2.2.4 ITS05 25

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Quy trình phân lập 26

4.2 Xác định cấu trúc hợp chất 27

4.2.1 Hợp chất ITS01: Ilekudinoside R 27

4.2.2 Hợp chất ITS02 35

4.2.3 Hợp chất ITS03: Kudinoside A 44

4.2.4 Hợp chất ITS05: Latifoloside A 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 69 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

d Peak đôi

(Doublet)

dd Peak đôi của peak đôi

(Doublet of doublet) ESI-MS Phổ khối phun mù điện tử

(Electrospray Ionization Mass Spectrometry) EtOAc Ethyl acetate

EtOH Ethanol

HMBC Tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

(Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

1H-NMR Cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton Nuclear Magnetic Resonance) HSQC Tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

(Heteronuclear Single Quantum Correlation) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography)

Hz Hertz

IR Phổ hồng ngoại

(Infrared Spectrometry)

(Thin Layer Chromatography) UV-Vis Phổ tử ngoại khả kiến

(Ultra Violet – Visible Spectrometry)

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của một số loàiIlex dùng làm thức uống 4

Bảng 1.2 Thành phần tinh dầu có trong cây Ilex paraguariensis 11

Bảng 1.3 Phân loại sắc ký theo bản chất pha động và pha tĩnh 15

Bảng 4.1 Số liệu phổ NMR của ITS01 33

Bảng 4.2 Số liệu phổ NMR của ITS02 42

Bảng 4.3 Số liệu phổ NMR của ITS03 51

Bảng 4.4 Số liệu phổ NMR của ITS05 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl 3

Hình 4.1 Sơ đồ quy trình phân lập các saponin từ lá cây Ilex triflrora Bl 26

Hình 4.2 Phổ IR của hợp chất ITS01 27

Hình 4.3 Phổ 1H-NMR của ITS01 28

Hình 4.4 Phổ 13C-NMR của ITS01 29

Hình 4.5 Phổ DEPT của ITS01 29

Hình 4.6 Phổ khối của hợp chất ITS01 30

Hình 4.7 Phổ HSQC của ITS01 31

Hình 4.8 Phổ HMBC của ITS01 31

Hình 4.9 Cấu trúc hóa học của ITS01 32

Hình 4.10 Một số tương tác HMBC quan trọng của ITS01 33

Hình 4.11 Phổ IR của ITS02 36

Hình 4.12 Phổ 1H-NMR của ITS02 37

Hình 4.13 Phổ 13C-NMR của ITS02 37

Hình 4.14 Phổ DEPT của ITS02 38

Hình 4.15 Phổ khối lượng của ITS02 38

Hình 4.16 Phổ HSQC của ITS02 39

Hình 4.17 Phổ HMBC của ITS02 40

Hình 4.18 Cấu trúc hóa học của ITS02 41

Hình 4.19 Một số tương tác HMBC quan trọng của ITS02 41

Hình 4.20 Phổ IR của ITS03 44

Hình 4.21 Phổ 1H-NMR của ITS03 45

Hình 4.22 Phổ 13C-NMR của ITS03 46

Hình 4.23 Phổ DEPT của ITS03 46

Hình 4.24 Phổ HSQC của ITS03 47

Hình 4.25 Phổ HMBC của ITS03 48

Hình 4.26 Phổ COSY của ITS03 48

Hình 4.27 Phổ khối lượng của ITS03 49

Hình 4.28 Cấu trúc hóa học của ITS03 50

Hình 4.29 Một số tương tác HMBC quan trọng của ITS03 50

Hình 4.30 Phổ IR của ITS05 54

Hình 4.31 Phổ 1H-NMR của ITS05 55

Hình 4.32 Phổ 13C-NMR của ITS05 55

Hình 4.33 Phổ DEPT của ITS05 56

Hình 4.34 Phổ HSQC của ITS05 57

Hình 4.35 Phổ HMBC của ITS05 57

Hình 4.36 Phổ khối lượng của ITS05 58

Hình 4.37 Cấu trúc hóa học của ITS05 59

Hình 4.38 Một số tương tác HMBC quan trọng của ITS05 59

MỞ ĐẦU

Từ bao thế kỉ qua, con người đã biết sử dụng thảo mộc trong nhiều bài thuốc y học cổ truyền để làm thuốc chữa bệnh Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật công nghệ phát triển, các loài thảo mộc được tiếp cận và nghiên cứu theo nhiều hướng hiện đại khác nhau (thành phần hóa học, hoạt tính sinh học, dược tính…) nên đã nâng cao được khả năng ứng dụng của chúng trong điều trị bệnh cho con người Ở nhiều

vùng nước ta các loài chè đắng (Ilex)được sử dụng làm nước uống hàng ngày giúp

cho việc mát gan, kích thích tiêu hóa, thanh nhiệt,…Trên thế giới hiện nay có nhiều công trình nghiên cứu công bố về thành phân hóa học và hoạt tính sinh học quý báu

có trong một số loài Ilex như: saponin, triterpenoid, flavonoid, acid phenolic…Hiện tại ở Việt Nam, lá chè đắng Cao Bằng (Ilex kudingcha) đã được nghiên cứu và khai

thác tạo sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng hỗ trợ điều hòa huyết áp, giảm

lượng cholesterol trong máu,… Loài Ilex triflora (tên gọi thông thường là bùi ba

hoa) là một loài chè đắng tự nhiên ở Lâm Đồng, đã được người dân sử dụng làm trà uống Năm 2016, Trần Thị Ngọc Hạnh đã phân lập và nhận dạng được cấu trúc của

5 hợp chất triterpen là lupeol, uvaol, 3β-palmitoyloxy-urs-12-en-11-on, acid ursolic

và 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-α-kudinlactone từ lá loài cây này [4] Kết quả định tính nhóm chất trong lá bùi ba hoa của Trần Thị Ngọc Hạnh cho thấy saponin là một trong những nhóm chất chính, các nghiên cứu về

saponin trong các loài Ilex cũng cho thấy đây là nhóm chất có nhiều hoạt tính sinh

học, góp phần tạo nên giá trị làm thuốc của dược liệu Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Chiết tách và phân tích phổ xác định cấu trúc một số saponin trong lá cây bùi ba

hoa Ilex triflora Bl.”nhằm góp phần làm rõ thành phần saponin có trong loài cây

này

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, mặc dù rất cố gắng song do thời gian hạn hẹp cũng như vốn kiến thức và kinh nghiệm bản thân có hạn nên luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót nhưng hy vọng nó sẽ là tài liệu ban đầu góp phần phục vụ cho việc phát triển các loài cây thuốc mới ở Lâm Đồng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về chi Ilex

Chi Ilex có vị trí phân bố trong giới thực vật như sau:

Loài: Ilex triflora Blume

1.1.1 Vài nét về chi Ilex

Một số loài thuộc chi Ilex thường được gọi là chè Ở Việt Nam, chè Ilex có

khoảng 40 loài Đa số loài trong chi này được gọi là cây bùi kèm theo tính từ để phân biệt như bùi ba hoa, bùi trái to, bùi tía, bùi bắc bộ,… Chúng phân bố rải rác từ

miền Nam (có ở Côn Đảo) ra miền Bắc Riêng loài Ilex kaushue đã phát hiện ở Lào

Cai (Sa Pa), Hoà Bình (Lạc Thuỷ), Ninh Bình (Vườn quốc gia Cúc Phương) và đặc biệt ở Cao Bằng (Hạ Lang, Thạch An, Quảng Hoà, Nguyên Bình…) [7]

1.1.2 Vài nét về loài Ilex triflora Bl

Cây bùi ba hoa có tên khoa học là Ilex triflora Bl hay còn được gọi là cây bùi

ba hoa Về thực vật, cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl được mô tả như sau [5]:

Thân: cao 3 – 4 m, nhánh non có lông mịn

Lá: có phiến thon, to vào 83, đầu nhọn, đáy tà, bìa nguyên hay có răng thấp, mặt dưới nâu, rất tươi Lúc khô mặt trên nâu, mặt dưới nâu rất tươi, có đốm nhỏ, cuống 10 – 15 mm chụm ở nách

Hoa: đơn phái, cọng dàu 3 – 6 mm Lá đài 4, cao 1 mm Cánh hoa 4, cao 3,5 – 4,5 mm Tiểu nhụy 4, nhụy cái lép Hoa cái có noãn sào cao 3 mm

Quả: nhân cứng, tròn, to 7 mm, nhân 4 cao 4 mm

Sinh thái: Mọc rải rác trong rừng thường xanh cây lá rộng, vùng núi đá vôi, ven suối hoặc trong rừng thư bên sườn núi, ở độ cao khoảng 600 – 1000 m

Hình 1.1 Cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl

1.1.3 Tác dụng dƣợc lí của một số loài Ilex

1.1.3.1 Theo kinh nghiệm dân gian

Lá chè đắng (Ilex kaushue) là thành phần trong bài thuốc điều trị đái tháo đường

theo kinh nghiệm cổ truyền trong cộng đồng dân tộc ít người ở vùng núi phía Bắc

Việt Nam bao gồm giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) (phần trên mặt đất), chè đắng (Ilex kaushue) (lá) [6]

1.1.3.2 Một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học

 Giải độc, bảo vệ gan, ức chế xơ gan:

- Thử nghiệm saponin trong chè đắng (I.kudingcha) trênmô hình thực nghiệm

bằng CCl4, kết quả cho thấy saponin có tác dụng làm giảm độ tăng của hoạt tính men gan PGT (28,03%), bilirubin (11,96%) và giảm hàm lượng colagen (30,6%) ở gan chuột bị gây tổn thương gan và gây xơ gan bằng CCl4 [1]

 Chống oxi hóa:

- Saponin trong chè đắng (I.kudingcha) có tác dụng chống oxi hóa mạnh, làm

giảm 24,34% hàm lượng MDA ở gan chuột gây tăng oxi hóa bằng CCl4 (P < 0,05) [1]

 Tác dụng lợi mật:

- Saponin trong chè đắng (I kudingcha) có tác dụng lợi mật, làm tăng tiết mật

25,41% khối lượng mật so với lô đối chứng [1]

 Tác dụng trên thần kinh

- Saponin trong chè đắng (I kudingcha) có tác dụng theo hướng kích thích

thần kinh, chống stress, làm tăng khả năng nhận thức, duy trì nhận thức và có tác dụng an thần, trấn tĩnh sau khi uống 20 phút [1]

1.2 Những nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Ilex

Thành phần hóa học trong lá chè đắng khá đa dạng và phong phú Trong đó nhóm chất được quan tâm nhất là saponin có hoạt tính sinh học và tác dụng dược lí cao

Một số loài Ilex khác nhau được sử dụng làm thức uống ở nhiều nước trên thế giới như: trà xanh, trà mate (Ilex paraguariensis), kudingcha lá lớn (Ilex kudingcha

và Ilex latifolia) Những nghiên cứu về thành phần hóa học được trình bày ở bảng 1

[12]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của một số loài Ilex dùng làm thức uống

tổng (%)

Saponin tổng

Chưa được thống kê >5 -

Trà eagle >30% Chưa được

thống kê >10 >1%

Các chất trong lá chè đắng Cao Bằng (I kudingcha) được xác định được với

thành phần như sau: saponin toàn phần 5,1 - 5,5%, flavonoid toàn phần 0,5 - 0,6%, polysaccharid toàn phần 2,8 - 3,4%, carotenoid (tính theo β-caroten) 5,0 - 5,8% [3]

Năm 2014 trong lá loài Ilex urceolatus xác định được sự có mặt của các nhóm

hợp chất như hemiterpen glycoside, triterpenoid saponin, triterpen, sterol, monoterpen glycoside [40] Sau đó vào năm 2016, cũng từ lá loài này, các nhà khoa học đã phân lập ra được 24 hợp chất và xác định được sự hiện diện của nhóm triterpenoid, lignanoid, coumarin, flavonoid và một số hợp chất khác [18]

1.2.1 Flavonoid

Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan gồm có 2 vòng benzene nối với nhau qua một dây có 3 cacbon Chúng là nhóm chất lớn nhất của các hợp chất phenolic thiên nhiên, tồn tại rất phổ biến, dạng tự do và liên kết glycoside Cho đến

nay có khoảng 4000 chất đã được xác định [8, 9]

Từ lá của cây Ilex paraguariensis, nhóm nghiên cứu ở Hàn Quốc đã phân lập

được 3 flavonoid là rutin, quercetin, kaempferol 3-O-rutinoside [39] Ngoài ra, ba

flavonoid này còn được xác định là có trong lá của cây Ilex latifolia với hàm lượng cao hơn trong trà xanh Camellia sinensis [24]

Hai flavonoid phân lập được trong lá chè đắng Cao Bằng là hợp chất quercetin

và acid dihydrocaffeic, trong đó quercetin có trong thành phần chính của trà xanh

Camellia sinensis [2,20]

R1 R2 Quercetin OH H Rutin OH rutinose kaempferol 3-O-rutinoside H rutinose

1.2.2 Triterpenoid và triterpenoid saponin

Về mặt cấu trúc hóa học, triterpenoid có công thức tổng quát C30Hn được tạo bởi 6 đơn vị isopren, do 2 mảnh C15 nối với nhau ở giữa theo cách nối đầu với đầu Cấu trúc hóa học của các triterpenoid có tới hơn 40 khung sườn carbon cơ bản

Các phân tích hóa học từ Ilex cho biết hàm lượng triterpenoid là rất cao Các

triterpenoid phân lập được từ loài này chủ yếu là các loại có khung carbon là ursan, oleanan, lupan …

Saponin triterpenoid là một glycoside có phần đường gắn với phần sapogenin

là triterpenoid Trong các hợp chất saponin Ilex, phần đường phổ biến là D-glucose,

D-galactose, L-arabinose, L-rhamnose, D-xylose, …

a Khung ursan

Các triterpenoid khung ursan với nhóm chức lacton ở vị trí C-20 với C-28 được gọi là các α-kudinlactone, β-kudinlactone, γ-kudinlactone Nhóm các nhà nghiên

cứu ở Trung Quốc và Nhật Bản đã cô lập từ lá của cây Ilex kudingcha được hai

triterpen là β-kudinlactone, α-kudinlactone và 26triterpenoid saponintrong đó 9 hợp chất có khung α-kudinlactone là: kudinodise D, kudinodise E, kudinodise J, ilekudinoside K, ilekudinoside N, ilekudinoside O, ilekudinoside P, ilekudinchoside

C, ilekudinchoside D; 15 hợp chất có khung β-kudinlactone là: kudinodise A, kudinodise B, kudinodise C , kudinodise I, ilekudinoside I, ilekudinoside J, ilekudinoside L, ilekudinoside Q, ilekudinoside R, ilekudinoside U, ilekudinchoside

B, ilekudinchoside F, ilekudinchoside G, kudinosideLZ2, β-kudinlactone và 2 hợp chất có khung γ-kudinlactone là: ilekudinoside M, ilekudinoside S[27, 31-32, 35-36, 41-43]

α-Kudinlactone β-Kudinlactone

Từ vỏ của cây Ilex latifolia các nhà khoa học Nhật Bản đã cô lập được hai

triterpenoid saponin là latifoloside I và latifoloside J [21]

R4 OGlc OGlc

R5

H

H

Từ lá của loài Ilex latifolia đã phân lập được 2 hợp chất triterpen (C và D) và 2

hợp chất triterpen glycosid (E, F) [16]

Trong lá chè đắng Cao Bằng nhóm nghiên cứu phân lập được một số triterpenoid saponins: kudinoside A, kudinoside C, kudinoside D, kudinoside E [10-11]

b Khung olean

Từ cây Ilex kudingcha các nhà khoa học Nhật Bản đã phân lập được các hợp

chất β-amyrin, erythrodiol và acid oleanolic và các nhà khoa học Trung Quốc cũng phân lập được 2 hợp chất triterpenoid saponin là: kudinoside N, kudinoside O [19, 33]

β-Amyrin Erythrodiol Acid oleanolic

Từ cây Ilex latifolia phân lập được các hợp chất glycosid có khung olean là

latifoloside B, latifoloside C, latifoloside H, latifoloside O, latifoloside P và latifoloside Q [28, 29-30]

Glc Rha Ara Rha Ara Rha Ara Rha Glc Glc Glc

Betulin Acid betulinic

1.2.3 Acid phenolic

Các hợp chất acid phenolic dùng để chỉ chung các hợp chất mà trong đó cấu

trúc có vòng benzen mang một hoặc nhiều nhóm chức –OH và –COOH

Trong thân cây Ilex rotunda ở Nhật Bản có các hợp chất caffeoyl tannin: acid

1-caffeoylquinic, acid neochlorogenic, acid chlorogenic [26]

Acid 1-caffeoylquinic Acid neochlorogenic

Từ cây Ilex kudingcha C.J Tseng một lượng lớn các acid caffeoylquinic được

phân lập [37]

Caffeoyl

R1 R2 R3 R4 3-CQA

(acid 3-O- caffeoylquinic) H caffeoyl H H

5-CQA H H H caffeoyl 3,4-diCQA H caffeoyl caffeoyl H 3,5-diCQA H caffeoyl H caffeoyl 4,5-diCQA H H caffeoyl caffeoyl

1.2.4 Các nhóm hợp chất khác

a Xanthine alkaloid

Trong lá và thân cây Ilex paraguariensis các nhà khoa học Brazil cho biết có

chứa các hợp chất caffein, theobromin và theophylline [34]

Theobromin Theophylline Caffein

b Tinh dầu

Nghiên cứu cây Ilex paraguariensis bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký khí

kết hợp với phổ khối đã phân lập được 22 thành phần tinh dầu với sự hiện diện của các nhóm chức ancol, aldehyd, ceton, ete, ester… [17]

Bảng 1.2 Thành phần tinh dầu có trong cây Ilex paraguariensis

1 E-2-Hexanal 9 Limonene 17 Geranyl

acetone

2 α- Pinene 10 n-Nonanal 18 β-(E)-Ionone

3 Hepten-2-one 11 α-Terpineol 19 Heptadecane

4 Myrcene 12 Geraniol 20 n-heneicosane

7 n-Octanal 15 β-(Z)-Damascone

8 Linalool 16 β-(E)-Damascone

1.2.5 Những nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Ilex triflora Bl

Năm 2016, trong lá loài Ilex triflora Bl xác định được sự có mặt của các nhóm

hợp chất như: saponin, flavonoid, alkaloid, antharanoid, phytosterol, chất béo và tanin Đồng thời, nhóm nghiên cứu đã phân lập và định danh được được 5 hợp chất triterpen là lupeol, uvaol, 3β-palmitoyloxy-urs-12-en-11-one, acid ursolic và 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-α-kudinlactone [3]

Lupeol (Lup-20(29)-ene-3-ol Uvaol (Urs-12-ene-3,28,diol)

acid ursolic

3β-palmitoyloxy-urs-12-en-11-on

1.3.1.1 Kĩ thuật chiết lỏng – lỏng

Kĩ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi (Solvent extraction)

Nguyên tắc căn bản của phương pháp này là sự phân bố (partition) của một chất tan (solute) vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau Dựa vào hằng số phân bố K của một chất tan, cho biết được khả năng hòa tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng

Kĩ thuật chiết lỏng – lỏng thường được dùng để:

- Chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu

- Phân chia cao thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những đoạn có tính phân cực khác nhau

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết thực hiện nhiều lần, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gộp lại, làm khan với các chất như Na2SO4, MgSO4, CaSO4… đuổi dung môi, thu được cao chiết [8]

1.3.1.2 Kĩ thuật chiết rắn – lỏng

Kĩ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation) được sử dụng phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp Quá trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngấm kiệt

đã bão hòa mẫu chất sẽ được thay thế liên tục bằng dung môi tinh khiết

Kĩ thuật chiết ngâm dầm (Maceration), kĩ thuật này tương tự kĩ thuật chiết ngấm kiệt nhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp, dễ dàng thao tác với lượng lớn mẫu Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 24 giờ Sau đó dịch chiết được lọc qua giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Chiết nhiều lần đến khi chiết kiệt

Kĩ thuật chiết bằng máy Soxhlet là phương pháp chiết các chất ra khỏi nguyên liệu ban đầu bằng một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi với một dụng cụ chuyên dụng đặc biệt gọi là bình Soxhlet

Kỹ thuật chiết hồi lưu: Chiết hồi lưu là phương pháp chiết các chất trong nguyên liệu ban đầu ở nhiệt độ sôi của dung môi Kỹ thuật này giúp làm giảm thời gian chiết so với chiết ngâm dầm nhưng đồng thời chiết theo nhiều tạp chất hơn [8]

1.3.2 Các phương pháp sắc kí

Trong các phương pháp phân tách hiện nay, sắc kí là phương pháp hữu hiệu nhất để tách các chất dù có màu hay không màu, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn ra khỏi hỗn hợp, ngay cả những hỗn hợp phức tạp về thành phần và khác nhau

về hàm lượng như dịch chiết các hợp chất từ cây cỏ

Về nguyên tắc, sắc kí là phương pháp vật lí để tách hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại

hợp chất đó với một hệ thống gồm hai pha là pha động (pha chuyển động) và pha tĩnh (pha không chuyển động)

Việc tách hợp chất nào đó ra riêng có đạt được kết quả tốt hay không tùy thuộc vào hệ số phân bố K Hệ số phân bố K được tính như sau:

K = Cs

CM =

Nồng độ của hợp chất trong pha tĩnhNồng độ của hợp chất trong pha độngPhân loại và gọi tên các phương pháp sắc kí dựa theo các tiêu chí khác nhau:

- Theo bản chất của hai pha sử dụng

- Theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình tách chất

- Theo hình dạng của pha tĩnh [8]

1.3.2.1 Phân loại theo bản chất của hai pha sử dụng

Cách phân loại này được trình bày trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Phân loại sắc ký theo bản chất pha động và pha tĩnh

Chất lỏng Chất rắn Sắc ký lỏng – rắn (gọi chung là sắc ký lỏng) Chất khí Chất rắn Sắc ký khí – rắn (gọi chung là sắc ký khí)

Chất lỏng Chất lỏng Sắc ký lỏng – lỏng (gọi chung là sắc ký lỏng) Chất khí Chất lỏng Sắc ký khí – lỏng (gọi chung là sắc ký khí)

Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng Chất rắn thường dùng là alumin hoặc silicagel đã được xử lí, có thể được nạp vào cột nén hoặc được tráng thành một lớp mỏng phủ trên bề mặt tấm kính, tấm nhôm hoặc nhựa.Chất lỏng có thể được tẩm lên

bề mặt một chất mang rắn hoặc một chuỗi dây cacbon dài được gắn lên trên chất mang rắn

Pha động có thể là chất lỏng (gọi là dung môi giải li) hoặc chất khí (gọi là khí mang hay khí vectơ) [8]

1.3.2.2 Phân loại theo bản chất của hiện tƣợng xảy ra trong quá trình tách chất

 Sắc kí phân bố (Partition Chromatography)

Nguyên tắc dựa vào việc mỗi hợp chất của hỗn hợp có hệ số phân bố khác nhau giữa pha tĩnh (chất lỏng tẩm trên bề mặt của pha tĩnh) với pha động (cũng là một chất lỏng)

Hệ số phân bố tùy thuộc vào khả năng hòa tan của hợp chất vào mỗi pha và vào tính chất phân cực của: mỗi hợp chất, pha động và pha tĩnh

 Sắc ký hấp thu (Adsorption Chromatography)

Nguyên tắc là các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu hoặc dính lên bề mặt của chất rắn pha tĩnh Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh, hệ quả là trong quá trình pha động di chuyển, chúng sẽ tách nhau ra

Có rất nhiều loại chất hấp thu dùng làm pha tĩnh, phổ biến nhất là silica gel và alumina… trong đó silica gel được sử dụng phổ biến hơn, còn alumina thường được dùng để tách các hợp chất có tính acid Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm silanol –OH; đây là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạng với những hợp chất được sắc ký Silica gel có thể được chế hóa bằng cách cho các nhóm chức silanol của silica tác dụng với nhiều loại clorur silil khác nhau để tạo thành những chất hấp thu mới với các đặc tính vật lí đổi khác, được gọi là silica gel tạo nối

 Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography)

Pha tĩnh là chất lỏng Pha động là các hạt nhựa (gồm nhựa trao đổi cation và nhựa trao đổi anion)

Nguyên tắc: sự tách riêng các chất của một hỗn hợp dựa vào việc hợp chất nào của hỗn hợp có mang điện tích ngược dấu với điện tích của hạt nhựa, bị hạt nhựa giữ lại trong cột Hợp chất mang nhiều điện tích gắn mạnh vào pha tĩnh, hợp chất nào mang ít điện tích gắn yếu và không mang điện không gắn và ra khỏi cột trước

 Sắc ký lọc gel (Size Exclusion Chromatography/Gel Filtration

Chromatography)

Nguyên tắc: sự tách riêng các chất của một hỗn hợp dựa vào những phân tử có kích thước nhỏ có thể chui vào những lỗ rỗng và bị lưu giữ lâu trong cột, còn những phân tử có kích thước lớn, không thể lọt vào lỗ rỗng, bị giải li ra khỏi cột

Các loại gel có độ tạo mạng ngang lớn như Sephadex G-10 và G-15 rất thường dùng để tách những hợp chất thiên nhiên tan trong nước như cacbohidrat hoặc các peptit dây ngắn

Trong hóa học các hợp chất thiên nhiên, các loại cao chiết từ cây cỏ thường có chứa nhiều tạp chất, thường gặp nhất là các diệp lục tố (chlorophyll a, b, .) Các hợp chất này gây nhiều khó khăn cho quá trình cô lập tinh sạch các hợp chất hữu

cơ Các chlorophyll thường có trọng lượng phân tử tương đối lớn hơn nhiều so với phần lớn những hợp chất hữu cơ thông thường hay gặp trong cây cỏ nên muốn loại

bỏ các hợp chất này, người ta thường sử dụng gel sephadex LH-20 [8]

1.3.2.3 Phân loại theo hình dạng của pha tĩnh

 Sắc kí lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC) dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silica gel hay oxid alumin) Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hay tấm plastic

Sắc ký lớp mỏng là công cụ cần thiết cho việc phân lập hợp chất thiên nhiên bởi nó

có nhiều công dụng Chẳng hạn như: để biết đặc điểm của hợp chất vừa tách chiết cô lập; để so sánh hai hợp chất; để biết được số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp ban đầu; để kiểm tra độ tinh khiết… Bên cạnh đó, sắc ký lớp mỏng có nhiều ưu điểm như:

sử dụng rất ít mẫu phân tích; quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian

ngắn có thể biết ngay kết quả

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf, được tính:

Rf = ab

Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi

Sau khi giải li, các hợp chất có màu sẽ được nhìn thấy bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần

sử dụng phuơng pháp vật lý (phát hiện bằng tia tử ngoại UV) hay dùng phương pháp hóa học (phun các thuốc thử để hiện hình)

1.4 Phương pháp chiết xuất và phân lập saponin

1.4.1 Phương pháp chiết xuất

Chiết xuất saponin toàn phần bằng dung môi methanol, ethanol, nước hoặc hỗn hợp ethanol : nước Sử dụng ether dầu hỏa hoặc n-hexan để loại bỏ các hợp chất lipophilic Dịch chiết xuất sau đó được hòa vào trong nước (có thể tan hoặc tạo nhũ tương) và lắc với n-butanol bão hòa với nước, thu lấy dịch chiết n-butanol [35]

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Lá cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl được thu hái ở Đà Lạt, Lâm Đồng vào tháng

Cột: Sử dụng các loại cột sắc ký có kích thước khác nhau tùy thuộc vào khối

lượng mẫu chạy sắc ký

Pha động: Tùy thuộc bản chất của mẫu đưa vào mà sử dụng các hệ dung môi

giải hấp khác nhau như: chloroform – methanol, chloroform – methanol – nước, …

Pha tĩnh: Sắc ký cột được thực hiện với chất hấp phụ là silica gel (cỡ hạt 40-63

μm và 63-200 μm, Merck) Lượng chất dùng làm pha tĩnh với lượng mẫu theo tỉ lệ 30/1 g

Ổn định cột: Pha tĩnh sau khi trộn đều với dung môi đầu tiên khai triển, được

rót vào cột, mở khóa của cột cho dung môi chảy từ từ xuống, sau đó tiếp tục rót dung môi này vào cột để ổn định trong khoảng thời gian từ 1 – 2 giờ

Đưa mẫu phân tích vào cột: dùng theo 2 cách:

Cách 1: Nếu mẫu hòa tan tốt trong dung môi đầu tiên khai triển, hòa tan mẫu với một ít dung môi rồi bơm đều vào cột đã được ổn định

Cách 2: Với mẫu không thể hòa tan hết trong dung môi đầu tiên khai triển, hòa tan mẫu với methanol, sau đó thêm silica gel với tỉ lệ 2/1 g mẫu, lắc đều và cô loại methanol ở áp suất thấp đến khi khô Sau đó, đưa bột silica gel đã tẩm mẫu vào cột

đã ổn định

Khai triển cột: hứng các phân đoạn sau đó dùng sắc ký bản mỏng kiểm tra để

xác định thời điểm đổi hệ dung môi và gộp chung những phân đoạn có cấu tử giống nhau, cô loại dung môi để tiến hành các bước phân tích tiếp theo

2.2.3 Phương pháp sắc ký bản mỏng

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254(Merck) và silica gel RP (Merck) Thuốc thử hiện màu là dung dịch acid sulfuric 10% và đèn tử ngoại bước sóng 254 và 365 nm

2.2.4 Phương pháp tinh chế sản phẩm

- Tiến hành chạy cột sắc kí thu lấy phân đoạn sạch nhất

- Tinh chế các chất phân lập được bằng phương pháp kết tinh lại Các bước của quá trình kết tinh bao gồm việc chọn dung môi, hòa tan nóng và lọc, để kết tinh lạnh, lọc hút tinh thể và làm khô Sản phẩm được kết tinh nhiều lần trong dung môi thích hợp

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý và các phương pháp phổ bao gồm: phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối lượng Phổ IR được ghi trên máy Nicolet IS5 FT-IR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY được ghi trên máy Brucker Avance-500 MHz, chuẩn nội TMS Phổ khối ESI-MS được ghi trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM

3.1 Điều chế các dịch chiết từ lá cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl

2 kg lá Ilex triflora Bl khô đã được xay thô, chiết ngâm dầm 6 lần với ethanol

70%, mỗi lần ngâm từ 3 – 5 ngày Thể tích ethanol 70% sử dụng cho các lần ngâm lần lượt là: 9,4 lít; 5,0 lít; 3,5 lít; 3,5 lít; 3,5 lít; 3,2 lít Thu lấy dịch chiết, lọc qua giấy lọc Các dịch chiết được gộp lại và cất loại ethanol đến còn 1,5 lít dung dịch đậm đặc Kết tủa hợp chất hữu cơ ít phân cựcbằng cồn 30%, đun nóng (không đun sôi), để qua đêm Lọc phần dịch lọc, cô cách thủy cho bay hơi dung môi đến còn khoảng 1/2 thể tích.Chuyển dung dịch đậm đặc này sang bình chiết quả lê và chiết phân đoạn lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần: chloroform, ethyl acetat Cất loại hết dung môi thu lấy phân đoạn chiết tương ứng: chloroform (7,16 g), ethyl acetat (3,69 g) và nước (74,77 g)

3.2 Phân lập các hợp chất từ lá cây bùi ba hoa Ilex triflora Bl

3.2.1 Quy trình phân lập

Cắn chiết nước (74,77 g) hòa tan trong nước tiến hành sắc kí cột Diaion

HP-20 Rửa cột với nước cất đến khi dịch rửa không màu Sau đó rửa giải với hỗn hợp methanol – nước nồng độ 50% và với methanol 100% thu được 46 phân đoạn methanol – nước (MH1 – MH46), 20 phân đoạn methanol (M1 – M20), phân đoạn nước không sử dụng

- Phân đoạn M4-5 (2,33 g) tiến hành sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel 200µm, Merck), hệ dung môi giải hấp chloroform – methanol (8,5 : 1,5) thu được

(63-200 phân đoạn A1-(63-200 Gộp phân đoạn A13-50 (300 mg) tiến hành sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel (40-63µm, Merck), hệ dung môi giải hấp chloroform – methanol (9:1) cho 40 phân đoạn B1-40

+ Phân đoạn B15-16 để kết tinh trong ống nghiệm thu được 5mg chất

ITS02

+Phân đoạn B20 để kết tinh trong ống nghiệm thu được 10 mg chất ITS01

- Phân đoạn M2-3 (10,6 g) tiến hành sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel (40-63µm, Merck), hệ dung môi giải hấp chloroform – methanol theo tỉ lệ lần lượt

là 6 : 1; 5 : 1; 4 : 1; 3 : 1; 2 : 1; 1 : 1 cho 60 phân đoạn C1-60

+Phân đoạn C32-34 tiến hành sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel (40-63µm, Merck), hệ dung môi giải hấp chloroform – methanol (4 : 1) thu được 48 phân đoạn D1-48 Gom phân đoạn D19-41 sau đó cho kết tinh trong hệ dung

môimethanol – aceton – diethyl ether (1 : 8: 2) thu được hợp chất ITS03

+ Phân đoạn C23-26 tiến hành sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel (40-63µm, Merck), hệ dung môi giải hấp chloroform – methanol (7 : 1) thu được

45 phân đoạn E1-45 Gom phân đoạn E24-33 sau đó cho kết tinh trong hệ dung môi

methanol – aceton – diethyl ether (1 : 8 : 2) thu được hợp chất ITS05

3.2.2 Thông số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất phân lập đƣợc

3.2.2.1 ITS01

Hơ ̣p chất ITS01 thu được dưới da ̣ng chất kết tinh không màu

Phổ IR (KBr): max, cm-1: 3417 (OH); 2943(C-H); 1729 (COO)

Phổ ESI-MS: m/z 800,3 [M+HCl]- , M = 764 (C41H64O13)

Phổ 1NMR (500 MHz, MeOD) δ, ppm: 5,46 (1H, brs, 12); 5,13 (1H, s, 1”); 4,58 (1H, d, 4,5Hz, H-1’); 3,91 (1H, brs, H-2”); 3,86 (1H, m, H-5’a); 3,82 (1H,

H-m, H-5”); 3,81 (1H, H-m, H-4’); 3,79 (1H, H-m, H-2’); 3,76 (1H, H-m, H-3’); 3,72 (1H, dd, 9,5; 3,0Hz, H-3”); 3,51 (1H, dd, 11,5; 2,5Hz, H-5’b); 3,41 (1H, m, H-4”); 3,17 (1H,

dd, 11,5; 4,5,); 2,31 (1H, m, H-21a); 2,25 (1H, m, H-16a); 1,91 (2H, m, H-11, H-9); 1,90 (1H, m, H-2a); 1,83 (3H, m, H-2b, H-22); 1,78 (2H, m, H-1a, H-11); 1,70 (1H,

m, H-21b); 1,61 (1H, m, H-15); 1,58 (1H, m, H-6a); 1,52 (2H, m, H-7); 1,39 (1H,

m, H-6b); 1,37 (3H, s, H-30); 1,36 (1H, m, H-16b, 3H, s, H-29); 1,35 (3H, s, H-27); 1,25 (3H, ,d, 6,5Hz, H-6”); 1,22 (1H, m, H-15b); 1,12 (1H, m, H-1b); 1,05 (3H, s, H-23); 0,97 (3H, s, H-25); 0,88 (1H, m, H-5); 0,86 (3H, s, H-24); 0,85 (3H, s, H-26)

Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD) δ, ppm: 39,87 1); 28,66 2); 90,54 3); 40,33 (C-4); 57,14 (C-5); 19,29 (C-6); 36,25 (C-7); 42,75 (C-8); 45,65 (C-9);

37,89 10); 27,11 11); 67,58 12); 147,27 13); 44,73 14); 29,56 15); 26,64 (C-16); 45,15 (C-17); 138,54 (C-18); 75,05 (C-19); 86,99 (C-20); 28,66 (C-21); 33,22 (C-22); 28,62 (C-23); 17,05 (C-24); 16,96 (C-25); 18,46 (C-26); 23,55 (C-27); 177,67 (C-28); 25,15 (C-29); 19,37 (C-30); 104,78 (C-1’);76,87 (C-2’); 73,05 (C-3’); 68,38 (C-4’); 63,71 (C-5’); 102,04 (C-1”); 72,19 (C-2”, C-3”); 73,91 (C-4”); 70,23 (C-5”); 17,98 (C-6”)

(C-3.2.2.2 ITS02

Hơ ̣p chất ITS02 thu được dưới da ̣ng chất kết tinh không màu

Phổ IR (KBr):max, cm-1: 3413 (OH); 2914 (C-H); 1703 (COO)

Phổ ESI-MS: m/z 450,5 [M-Rha-Ara-H2O]+, M = 746(C41H62O13)

Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ, ppm: 7,02 (1H, dd, 10,5; 3,0 Hz, H-11); 5,84 (1H, dd, 10,5; 1,5Hz, H-12); 5,13 (1H, s, H-1’’); 4,58 (1H, d, 4,5 Hz, H-1’);3,91 (1H, brs, H-2”); 3,86 (1H, m, H-5’b); 3,82 (1H, m, H-5”); 3,81 (1H, m, H-4’); 3,79 (1H, m, H-2’); 3,76 (1H, m, H-3’); 3,72 (1H, d, 7,5Hz, H-3”); 3,51 (1H,

dd, 11,5; 2,5Hz, H-5’a); 3,41 (1H, m, H-4”); 3,17 (1H, dd, 11,5 ; 4,0 Hz , H-3);2,31 (1H, m, H-21a); 2,29 (1H, m, H-16a); 2,06 (1H, m, H-9); 1,94 (1H, m, H-1a, 1H, m, H-2a); 1,83 (2H, m, H-22); 1,81 (1H, m, H-2b); 1,68 (1H, m, H-21); 1,65 (1H, m, H-6a); 1,60 (1H, m, H-15a); 1,46 (1H, m, H-6b); 1,42 (2H, m, H-7); 1,40 (3H, s, H-

29, 1H, m, 16b); 1,36 (3H, s, 30); 1,24 ( 3H, d, 6,0Hz, 6’’); 1,17 (1H, m, 15b); 1,10 (1H, m, H-1b); 1,04 (3H, s, H-23); 1,04 (3H, s, H-27); 0,97 (3H, s, H-25); 0,90 (1H, m, H-5); 0,89 (3H, s, H-24); 0,76 (3H, s, H-26)

H-Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD) δ, ppm: 39,25 1); 26,92 2); 90,44 3); 40,39 (C-4); 56,37 (C-5); 19,21 (C-6); 33,75 (C-7); 43,15 (C-8); 55,59 (C-9); 37,58 (C-10); 127,71 (C-11); 129,51 (C-12); 142,64 (C-13); 43,19 (C-14); 26,49 (C-15); 26,81 (C-16); 44,60 (C-17); 134,22 (C-18); 75,07 (C-19); 84,14 (C-20); 29,00 (C-21); 33,39 (C-22); 28,28 (C-23); 16,51 (C-24); 18,73 (C-25); 16,97 (C-26); 18,83 (C-27); 177,81 (C-28); 23,36 (C-29); 19,40 (C-30); 104,83 (C-1’); 76,89 (C-2’); 73,06 (C-3’); 68,40 (C-4’); 63,71 (C-5’); 102,08 (C-1”); 72,18 (C-2”, C-3”); 73,90 (C-4”); 70,23 (C-5”); 17,96 (C-6”)

(C-3.2.2.3 ITS03

Hơ ̣p chất ITS03 thu được dưới da ̣ng chất kết tinh không màu

Phổ IR(KBr):max, cm-1: 3420 (OH); 2942 (C-H); 1728 (COO)

Phổ ESI-MS: m/z 949,2 [M+Na]+ , m/z 803,4 [M-Rha+Na]+ , m/z 747,5

[M-Glc-H2O+H]+, m/z 485,1 [M-Glc-Rha-Ara-H]+, M = 926 (C47H74O18)

Phổ 1NMR (500 MHz, MeOD) δ, ppm: 5,46 (1H, brs, 12); 5,24 (1H, s, 1”); 4,54 (1H, d,6,5Hz, H-1’); 4,52 (1H, d, 8,0Hz, H-1’’’); 4,06 (1H, m, H-4’); 3,91 (1H, m, H-5’a); 3,95 (1H, brs, H-2”); 3,90 (1H, m, H-2’, 1H, m, H-3’); 3,88 (1H, m, H-5”); 3,86 (3H, m, H-5’’’); 3,71 (1H, dd, 12,0; 5,0Hz, H-6’’’); 3,74 (1H, dd, 9,5; 3,0Hz, H-3”); 3,54 (1H, dd, 12,0; 2,5Hz, H-5’b); 3,42 (1H, m, H-4”, 1H, m, H-3’’’); 3,37 (1H, m, H-4’’’); 3,34 (1H, m, H-5’’’); 3,32 (1H, m, H- 2’’’); 3,21 (1H, dd,11,5; 4,5Hz, H-3); 2,31 (1H, m, H-21a); 2,25 (1H, m, H-16a); 1,90 (2H, m, H-2a, H-9); 1,86 (1H, m, H-11); 1,83 (3H, m, H-2a, H-22a, b); 1,77 (1H, m, H-1a); 1,76 (1H, m, H-11b); 1,70 (1H, m, H-21b) 1,61 (1H, m, H-15a); 1,58 (1H,m, H-6a); 1,52 (2H, m, H-7); 1,39 (1H, m, H-6b); 1,37 (3H, s, H-30); 1,36 (1H, m, H-16b, 3H,

H-s, H-29); 1,35 (3H, H-s, H-27); 1,25 (3H, d, 6,5Hz, H-6”); 1,22 (1H, m, H-15b); 1,13 (1H, m, H-1a); 1,05 (3H, s, H-23); 0,96 (3H, s, H-25); 0,87 (3H, s, H-24); 0,85 (3H,

s, H-26); 0,85 (1H, m, H-5)

Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD) δ, ppm: 40,02 1); 28,63 2); 89,67 3); 40,40 (C-4); 57,26 (C-5); 19,20 (C-6); 36,23 (C-7); 42,74 (C-8); 45,65 (C-9); 37,87 (C-10); 27,23 (C-11); 67,59 (C-12); 147,23 (C-13); 44,72 (C-14); 29,54 (C-15); 26,59 (C-16); 45,15 (C-17); 138,40 (C-18); 75,06 (C-19); 87,07 (C-20); 28,63 (C-21); 33,16 (C-22); 28,63 (C-23); 17,24 (C-24); 17,01 (C-25); 18,43 (C-26); 23,56 (C-27); 177,84 (C-28); 25,13 (C-29); 19,37 (C-30); 105,07 (C-1’); 75,22 (C-2’); 82,01 (C-3’); 68,46 (C-4’); 64,61 (C-5’); 101,90 (C-1”); 72,06 (C-2”, C-3”); 73,78 (C-4”); 70,26 (C-5”); 17,98 (C-6”); 104,24 (C-1’’’); 74,99 (C-2’’’); 77,95 (C-3’’’, C-5’’’); 71,15 (C-4’’’); 62,34 (C-6’’’)

(C-3.2.2.4 ITS05

Hơ ̣p chất ITS05 thu được dưới da ̣ng chất kết tinh không màu

Phổ IR(KBr):max, cm-1: 3423 (OH); 2936 (C-H); 1734 (COO)

Phổ ESI-MS: m/z 935,5 [M + Na]+ , M=912 (C47H76O17)

Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ, ppm: 5,34 (1H, d, 8,0Hz, H-1’’’); 5,31 (1H, brs, H-12); 5,11 (1H, s, H-1”); 4,58 (1H, d, 4,5Hz, H-1’); 3,91 (1H, m, H-5’a); 3,90 (1H, brs, H-2”); 3,82 (1H, m, H-6’’’a); 3,81 (1H, m, H-5”); 3,80 (1H, m, H-2’); 3,79 (1H, m, H-2’); 3,76 (1H, m, H-2’’’); 3,71 (1H, m, H-3’); 3,70 (1H, m, H-3”, 1H, m, H-6’’’b); 3,50 (1H, dd 11,5; 3,0Hz, H-5’b); 3,42 (1H, m, H-4’’’); 3,38 (1H, m, H-4”); 3,36 (1H, m, H-4’’’); 3,34 (1H, m, H-5’’’); 3,14 (1H, dd, 11,5; 4,5Hz, H-3); 2,62 (1H, m, H-16a); 2,53 (1H, s, H-18); 1,97 (1H, m, H-11a); 1,85 (1H, m, H-15a); 1,83 (1H, m, H-2a); 1,79 (1H, m, H-22a); 1,75(1H, m, H-2b, 1H,

m, H-21a); 1,68 (1H, m, H-9); 1,66 (1H, m, H-1a); 1,65 (2H, m, H-22b, H-16); 1,55 (1H, m, H-6a); 1,54 (1H, m, H-7a); 1,43 (1H, m, H-6b); 1,39 (1H, m, H-20); 1,35(3H, s, H-27); 1,32 (1H, m, H-7b); 1,30 (1H, m, H-11b); 1,27 (1H, m, H-21b); 1,25 (3H, d, 6,0Hz, H-6”); 1,22 (3H, s, H-29); 1,04 (3H, s, H-23); 1,03 (1H, m, H-1b); 1,02 (1H, m, H-15b); 0,98 (3H, s, H-25); 0,96 (3H, d, 5,0Hz, H30); 0,87 (3H, s, H-24); 0,80 (3H, s, H-26); 0,77 (1H, m, H-5)

Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD) δ, ppm: 39,98 1); 27,03 2); 90,75 3); 38,08 (C-4); 57,05 (C-5); 19,51 (C-6); 34,16 (C-7); 40,26 (C-8); 48,66 (C-9); 37,89 (C-10); 24,72 (C-11); 129,73 (C-12); 139,58 (C-13); 41,30 (C-14); 29,68 (C-15); 26,56 (C-16); 47,19 (C-17); 54,98 (C-18); 72,95 (C-19); 42,94 (C-20); 27,22 (C-21); 38,30 (C-22); 28,68 (C-23); 17,07 (C-24); 16,03 (C-25); 17,64 (C-26); 24,66 (C-27); 178,55 (C-28); 27,10 (C-29); 16,58 (C-30); 104,69 (C-1’); 76,86 (C-2’); 73,91 (C-3’); 68,27 (C-4’); 63,57 (C-5’); 102,04 (C-1”); 72,19 (C-2”, C-3”); 73,91 (C-4”); 70,23 (C-5”); 17,98 (C-6”); 95,80 (C-1’’’); 72,95 (C-2’’’); 78,33 (C-3’’’); 71,19 (C-4’’’); 78,56 (C-5’’’); 62,49 (C-6’’’)

(C-CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Quy trình phân lập

Hình 4.1 Sơ đồ quy trình phân lập các saponin từ lá cây Ilex triflora Bl

CC silica gel, CHCl3/MeOH

B20 B15-16

ITS01 (10 mg)

ITS02 (5 mg)

Kết tinh Kết tinh

CC silica gel, CHCl3/MeOH

CC silica gel,

CHCl3/MeOH

E24-33

Chiết ngâm dầm với cồn 70%

Nguyên liệu khô (2 kg)

(13,9 mg)

4.2 Xác định cấu trúc hợp chất

4.2.1 Hợp chất ITS01: Ilekudinoside R

Hợp chất ITS01 thu được dưới dạng kết tinh không màu, tan nhiều trong methanol, kết tinh trong hệ dung môi CHCl3 : MeOH (9 : 1) Trên bản mỏng không hiện màu ở nhiệt độ thường, đốt trong H2SO4 10% có màu tím

Phổ IR (KBr) (hình 4.2) của ITS01 cho thấy ở 3417 cm-1 xuất hiện peak tròn, đây là tín hiệu chứng tỏ sự có mặt của nhóm -OH (có nhóm chức ancol) Ở 1729

cm-1 có tín hiệu hấp thụ của nhóm este (-COO) Ở 2943 cm-1 có peak nhọn của C-H alkan

Hình 4.2 Phổ IR của hợp chất ITS01

Phổ 1

H-NMR (hình 4.3) của ITS01 cho thấy sự có mặt của 7 nhóm CH3 bậc ba [H0,85 (s, 3H); 0,86 (s, 3H); 0,97 (s, 3H); 1,05 (s, 3H); 1,35 (s, 3H); 1,36 (s, 3H); 1,37 (s, 3H)] và một cặp tín hiệu doublet của một nhóm CH3 bậc hai [H 1,25 (d, 6,5Hz, 3H)] 2 cặp tín hiê ̣u của proton anomeric của đường xuất hiê ̣n ở H 4,58 (d, 4,5 Hz, 1H) và 5,13 (s, 1H) Tín hiệu tại H 5,46 (brs, 1H) là của proton thuộc nhóm methin liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy >CH-OH Tín hiệu ở H 3,17 (dd, 11,5; 4,5Hz, 1H) rất đặc trưng cho H-3 của hợp chất triterpen

Phổ 13 C-NMR (hình 4.4) và phổ DEPT (hình 4.5) của ITS01 cũng cho thấy sự

có mặt của 41 tín hiệu carbon, trong đó có 8 nhóm CH3, 10 nhóm CH2, 13 nhóm CH

và 10 C Hai tín hiệu của carbon anomeric tại C 104,78 và 102,04 ppm khẳng định

sự có mặt của hai đơn vị đường.Tín hiệu cộng hưởng tại C 177,67 ppm cho thấy có một nhóm ester (COO) trong cấu trúc Hai tín hiệu carbon tại C 138,54 và 147,27 ppm khẳng định sự tồn tại của một liên kết đôi 7 tín hiệu carbon methin (CH) của 2 đơn vị đường xuất hiện trong vùng C từ 67,58 đến 76,87 ppm Hai nhóm methin liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy không phải của đường cô ̣ng hưởng ở C 90,54

và 86,99 ppm

Hình 4.3 Phổ 1H-NMR của ITS01

Hình 4.4 Phổ 13C-NMR của ITS01

Hình 4.5 Phổ DEPT của ITS01