Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis TS Đinh Thị Thu Hằng

ĐẶT VẤN ĐỀ HỘI NGHỊ NỘI KHOA TOÀN QUỐC 2020 Thiết kế phản ứng TTSS1 real time loop mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis TS Đinh Thị[.]

HỘI NGHỊ NỘI KHOA TOÀN QUỐC 2020

Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated

isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn

Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis

TS Đinh Thị Thu Hằng

HỌC VIỆN QUÂN Y

Burkholderia pseudomallei và melioidosis

- Gram âm hoại sinh, gây bệnh melioidosis - viêm phổi, đa áp-xe,

Wiersinga, W J., et al (2012) "Melioidosis." N Engl J Med 367(11): 1035-44.

Chen, Y L., et al (2014) PLoS Negl Trop Dis 8(5): e2877.

“Bom hẹn giờ Việt Nam”

Áp-xe do melioidosis

3

White NJ (2003), Lancet, 361 (9370) , p1715–1722

Wiersinga, W J., et al (2012) "Melioidosis." N Engl J Med 367(11): 1035-44.

Rotz, L D., et al (2002) Emerg Infect Dis 8(2): 225-230.

Phân bố Melioidosis trên toàn cầu

- Bắc Australia (viêm phổi ->tử vong phổ biến nhất (Currie B J 2015))

- Đông Nam Á (Đông Bắc Thái Lan, bệnh nhiễm trùng tỷ lệ tử vong cao thứ 3, sau HIV/ AIDS và lao)

- 1 số vùng châu Á, châu Mỹ, châu Phi ( Limmathurotsakul D et al 2010, 2012).

- NC mô phỏng:165.000 ca melioidosis ở người/ năm, 89.000 ca tử vong/ 80 quốc gia

(Limmathurotsakul D et al 2016), (Gohler A et al 2017) -> khó khăn trong xét nghiệm.

4

B pseudomallei gây bệnh

Độc lực: nội độc tố (phức hợp protein - lipopolysacharit)

Đường lây:

• Sol khí, tiếp xúc với đất ô nhiễm qua da trầy xước: thể phổi, ápxe

phủ tạng, NKH Điều kiện thuận lợi cho lây nhiễm: tiếp xúc nhiều

với nước, bùn, động vật bị bệnh (ngựa, trâu, bò), suy giảm MD.

• Trong đất, cánh đồng lúa, nước tù đọng, thường gặp mùa mưa lũ

5 (Perumal Samy R et al 2017)

Phòng và điều trị

- Chưa có vắc xin, phòng không đặc hiệu

- Điều trị: Phẫu thuật làm sạch vết thương + Phối hợp thuốc

• Imipenem, doxycyclin, ceftazidim, …: 2 tháng tấn công, 3-6T

duy trì (thể nặng 12T).

• Thể phổi >6T, phẫu thuật cắt bỏ thuỳ phổi -loại bỏ các ápxe

phổi.

• Dễ tái phát, thời gian, kinh phí

=> Quân số, sức chiến đấu

6

B pseudomallei và vũ khí sinh học

• B pseudomallei được liệt kê trong danh mục các tác

nhân sinh học nhóm B, có tiềm năng sử dụng làm vũ khí sinh học (VKSH).

• Hệ gen B pseudomallei giống đến 99% so với B mallei -

được SD làm VKSH bởi quân đội Đức, Nhật, Nga

• Quân đội Mỹ đã nghiên cứu B pseudomallei để chế tạo

VKSH.

7

Hệ gen B pseudomallei

NST số 1: 3.460 CDS

Trao đổi chất, tăng trưởng

NST số 2: 2.395 CDS Thích ứng, tồn tại

8

Holden et al. (2004),10.1073/pnas.0403302101.

Gene TTSS1

AF074878

Các phương pháp xác định

Nuôi cấy: MT Ashdown - “tiêu chuẩn vàng”- 5-7 ngày

Huyết thanh học, miễn dịch: độ nhạy và độ đặc hiệu không cao

PCR, real-time PCR: nguồn điện ổn định, PTN, nhân lực

- chưa đáp ứng thực tế hiện trường

9

Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP

(Loop mediated isothermal Amplification)

- Khuếch đại DNA nhanh chóng - điều kiện đẳng nhiệt , sản phẩm

là DNA mạch vòm 10 9 -10 10 lần, hiệu quả cao (Notomi T et al

2000)

- Bst DNA polymerase & 4 mồi được thiết kế đặc biệt, sản phẩm có

thể đánh giá bằng mắt thường về độ đục, màu sắc

10

Ưu điểm của LAMP

• Tiết kiệm

• Độ nhạy, đặc hiệu cao

• Dễ dàng thực hiện, thích hợp cho các loại tác nhân

• Nhanh: khoảng 1-1,5 giờ

• Thiết bị ổn nhiệt để duy trì nhiệt độ không đổi từ 60 - 65°C.

• Không đòi hỏi DNA tinh sạch cao.

=> Tiêu chí ASSURED test (affordable, sensitive, specific, friendly, rapid and robust, equipment-free and deliverable to end users) - thực địa.

user-(Kaneko H et al 2007, (Njiru Z K 2012) 11

- real-time LAMP: kết hợp =>giúp rút ngắn thời gian, đơn giản

hóa quá trình phát hiện B pseudomallei

Thế giới

• Hơn 100 XN LAMP chẩn đoán mầm bệnh ở người và động

vật: virus Dengue (Parida M et al 2005), vi khuẩn lao (Geojith

G et al 2011), S aureus (Lim K T et al 2013), KST sốt rét

(Wu L et al 2015) (Eiken Chemical Co Ltd).

• B pseudomallei: Kỹ thuật LAMP gen đích TTSS1 và đánh giá

ở Đông Bắc Thái Lan, ngưỡng: 38 copy/ phản ứng, mẫu lâm sàng Se 44%, Sp 98,4% (Chantratita N et al 2008)

• Năm 2016: LAMP với hóa chất đông khô chưa được mô tả chi

tiết (Michelle Wong Tzeling J et al 2016)

12

B pseudomallei ở Việt Nam?

• Đến 1973, có 343 ca melioidosis được ghi nhận trên lính Mỹ

tham chiến tại Việt Nam (Schulin T et al 2001)+ một số chó

nghiệp vụ ~225.000 lính Mỹ có khả năng bị phơi nhiễm B

pseudomallei khi trở về nước (Perumal Samy R et al 2017)

• 6 BN nhiễm B pseudomallei ngoại thành Hà Nội (1993)

• 73 (+)/ 147 cánh đồng lúa miền Nam (1999)

• Báo cáo các ca lâm sàng: BV Chợ Rẫy 2009-2011, 80 ca/ năm;

BV TƯ Quân đội 108 (2015), BV Bạch Mai (2016),…;

• TT Trung&cs(2016) NC đặc điểm phân bố B pseudomallei ở

Bắc Trung Bộ, real-time PCR: 77 chủng/ 70 BN.

• Mưa lũ lịch sử, đến hết tháng 11/2020, ghi nhận số ca tăng đột

biến, 5 ca tử vong.

13

BV quân đội + địa bàn đóng quân, lân cận?

Công cụ phát hiện tại thực địa?

Quyết định 6101/QĐ-BYT 30/12/2019 HD chẩn đoán & điều trị bệnh Whitmore

Đề tài cấp BQP: “Xây dựng QT và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhanh tại hiện trường VK B pseudomallei” Mã số: 2019.75.027.

Mẫu chủng

B p

PCR, cloning

Đánh giá

• Độ nhạy, độ đặc hiệu

• So sánh

GenBank

PCR, real-time PCR real-time LAMP

15

B pseudomallei, B cepacia,

P aeruginosa

Primer 3 PrimerExplorer V.5

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

PP: Thực nghiệm mô tả,

phân tích trong PTN.

LAMP và Real-time LAMP: các set primer LAMP gồm 2-3 cặp

FIP/ BIP, F3/ B3, LB/LF vùng gene TTSS1 (The type III secretion system)

TTSS1

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Nhân dòng thiết lập chứng dương gen TTSS1

PCR TTSS1-orf11 trên gel agarose 1,2%

M: Marker 100bp (Thermo Scientific); 1: ĐC âm;

2- 6: Mẫu B pseudomallei Bp1-Bp5

17

723 bp

TT Tên mồi Trình tự (5’-3’) T o gắn mồi

(Ta: o C)

Kích thước (bp)

Sự thay đổi màu khi bổ sung SYBR Green I

Sự phát quang sau khi chiếu tia UV

NC Đối chứng âm là nước khử ion

Thiết kế, thử nghiệm các phản ứng real-time LAMP

Bộ mồi 1

(65 o C/ 1m)/30 chu kỳ; (80 o C->98 o C)/ 0,5 o C/s

Hệ thống Genie III

Điện di sản phẩm của real-time LAMP gel agarose 2,0%

1 Mẫu Bp1; 2, 4, 6 Mẫu Bc1, Bc2, Pa1 (Bộ mồi 2); 3, 5, 7 Mẫu Bc1-4T, Bc2-4T, Pa1-4T (Bộ mồi 3).

Bộ mồi 2 và bộ mồi 3 (oligo 4T)

Tối ưu và đánh giá phản ứng real-time LAMP

Tối ưu nồng độ mồi trong phản ứng real-time LAMP (bộ 2,

máy Genie III)

Giá trị mồi tối ưu là 1X với nồng độ cụ thể của 3 cặp mồi Bp-FIP/BIP, Bp-F3/B3, Bp-LB/LF lần lượt là 1,6; 0,2; 0,4 µM

LOD: 4 copy/ µl (6/6 lần lặp lại), CV<2,5%

Chú thích: Mean Giá trị trung bình, NA Không xác định

KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ

Thiết lập thành công p/ư real-time LAMP phát hiện

nhanh VK B pseudomallei.

Đánh giá trên các chủng B pseudomallei, B cepacia,

P aeruginosa, ngưỡng phát hiện 4 copy/μl, Se, Sp,

LOD tương đương LAMP truyền thống, LOD thấp hơn

Tối ưu, phát triển thành kit, đánh giá hiệu quả lâm sàng - công cụ hữu ích góp phần dự phòng, điều trị bệnh melioidosis.

XIN TRÂN TRỌNG

CẢM ƠN

Công trình được hoàn thành nhờ sự tài trợ của Chương trình CNSH phục vụ

AN, QP (Bộ Quốc phòng) thông qua NV “Xây dựng QT và chế tạo bộ kit

LAMP để chẩn đoán nhanh tại hiện trường VK B pseudomallei” Mã số:

2019.75.027.

28

29