PTTP_Chương 4_Các phương pháp sắc kí (đọc thêm)

PowerPoint Presentation 1 CHƯƠNG 4 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ (ĐỌC THÊM) 2 1 1 Cơ sở của phương pháp sắc kí 1 2 Phân loại các phương pháp sắc kí 1 3 Lựa chọn phương pháp 1 4 Sắc kí đồ 1 5 Hiệu quả tách củ[.]

CHƯƠNG 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ (ĐỌC THÊM)

1.1 Cơ sở của phương pháp sắc kí

1.2 Phân loại các phương pháp sắc kí

1.1 Cơ sở của phương pháp sắc kí

 Thí nghiệm của Mikhail Tsvett:

- Hòa tan các sắc tố thực vật trong ete dầu hỏa

- Đưa hỗn hợp này lên cột đã nhồi CaCO3

- Tiếp tục cho ete dầu hỏa tinh khiết đi qua cột

- Sau một thời gian sắc nhât định, sắc tố thực vật đã tách thànhcác dải riêng biệt

- Chất tan ở pha tĩnh  Không di chuyển.

- Chất tan ở pha động  Di chuyển theo các ái lực tương táckhác nhau

 Sau mỗi lần hấp thu và giải hấp  Chất tan di chuyển đượcnhững quãng đường khác nhau

- Pha động tiếp tục qua cột  Chất tan tiếp tục di chuyển 

khoảng cách giữa các chất càng lớn  Tách ra khỏi nhau

 Định nghĩa: Sắc kí là quá trình tách dựa trên sự phân chia

liên tục chất tan lên hai pha, một pha có khả năng hấp thu chấttan gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là phađộng Do ái lực khác nhau của pha tĩnh với từng hợp phần cótrong pha động, chất tan sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau vàtách ra khỏi nhau

CS là tổng nồng độ chất tan trong pha tĩnh

CMlà tổng nồng độ chất tan trong pha động

 Cân bằng phân bố: cân bằng động; cân bằng giữa pha lỏng –lỏng, khí – lỏng hoặc rắn – lỏng

 Giá trị KD lớn khi pha động là chất khí và giá trị KD nhỏ khi haipha ở trạng thái đông đặc (lỏng, rắn)

Nguyên tắc: Phân loại theo bản chất của các pha

Pha tĩnh:

+ Sắc kí cột: pha tĩnh được nhồi trong một ống nhỏ và phađộng di chuyển qua pha tĩnh nhờ trọng lực và áp suất

+ Sắc kí phẳng: pha tĩnh ở dạng phẳng trên một bảnphẳng hoặc giấy xenlulo; pha động di chuyển bằng hiện tượngmao dẫn

Pha động: Sắc kí lỏng và sắc kí khí

1.2 Phân loại các phương pháp sắc kí

Phân loại các phương pháp sắc kí trên cột

Phân loại chung Phương pháp

Lỏng – pha ghép Chất hữu cơ liên kết hóa

học với bề mặt chất rắn

Phân bố chất lỏng

và bề mặt ghép Lỏng – Rắn Chất rắn Hấp phụ

Trao đổi ion Nhựa trao đổi ion Trao đổi ion Lỏng - gel Chất lỏng trong kẽ hở

 Sắc kí phân bố li tâm (Centrifugal Partition Chromatography):

Pha tĩnh được giữ trong máy bằng lực li tâm

Pha động được bơm qua pha tĩnh

1 Pha tĩnh được làm đầy trong máy (pha tĩnh nhẹ)

2 Bơm mẫu phân tích

- Sắc kí rây phân tử (Sắc kí loại cỡ):

Pha tĩnh là chất rắn xốp: chất tan có kích thước lớn bị rửagiải trước; chất tan có kích thước nhỏ phân tán trên pha tĩnh vàtách ra sau

Thứ tự rửa giải trên cột

1.2.1 Sắc kí lỏng:

 Sắc kí trao đổi ion:

Pha tĩnh là nhựa trao đổi ion: các polyme có chứa cácnhóm ion: chất có khả năng trao đổi cation gọi là cationit; chất cókhả năng trao đổi anion gọi là anionit

Lực liên kết giữa ion chất tan và pha tĩnh chủ yếu là liênkết tĩnh điện, phụ thuộc vào điện tích của ion chất tan, pH củadung dịch và bán kính hidrat hóa của các ion chất tan

1.2.1 Sắc kí lỏng:

 Sắc kí ái lực:

Pha tĩnh là một chất mang rắn mà trên đó người ta cố địnhmột thành phần có ái lực đối với một chất tan của mẫu phân tích(ái lực giưa enzym - cơ chất, hormon – recepteur, kháng nguyên– kháng thể…)

Chất gây nhiễu

 Tính chất của chất phân tích:

Chất tan là chất khí; chất lỏng dễ bay hơi; chất lỏng ít bayhơi; chất rắn; phân tử lượng lớn; chất hữu cơ; hợp chất ion; độphân cực…

 Mục đích phân tích:

Nhận dạng một thành phần trong một hỗn hợp; cần thiếthay không sự liên kết sắc kí với một phương pháp phổ; kiểm tra

độ tinh khiết; tinh chất sản phẩm (sắc kí điều chế); theo dõi mộtphản ứng hóa học để tối ưu hóa điều kiện; định lượng…

1.3 Lựa chọn phương pháp

1.3 Sắc kí đồ

 Sắc kí đồ: Đường cong thể hiện sự biến đổi theo thời gian liên

quan đến nồng độ của chất tan ở đầu cột tùy theo thời gian rửagiải

 Sự rửa giải: Sự kéo chất tan qua pha tĩnh bằng pha động

 Phân tích sắc kí đồ: Cho phép phân tích:

Định tính: Dựa vào vị trí pic của phân tíchĐịnh lượng: Dựa trên diện tích pic của chất phân tích

W1/2: độ rộng pic ở nửa chiều cao h: chiều cao của pic

 Hệ số dung lượng k’:

Hay

1 < k’ < 10 đổi với những chất tan khác nhau trong một hỗn

1.4 Hiệu quả của cột

1.4.1 Đĩa lí thuyết

 Đĩa lí thuyết n: phần nhỏ của cột có thể đạt được khi đạt

được sự cân bằng phân bố chất tan

n càng lớn, pic càng hẹp

1.4.2 Độ phân giải và cách cải thiện độ phân giải

 Độ phân giải R: Mức độ tách của các cấu tử ra khỏi nhau

 Cách cải thiện độ:

- Dựa trên sự thay đổi cấu trúc của cột:

+ Tăng chiều dài cột

+ Sử dụng chất nhồi có kích thước hạt nhỏ hơn, đồng đều hơn+ Thay đổi pha tĩnh

+ Giảm đường kính cột

- Dựa trên thay đổi vận hành cột:

+ Tối ưu hóa tốc độ pha động

+ Giảm lượng mẫu

+ Giảm nhiệt độ cột

+ Thay đổi thành phần pha động

Hiệu quả của chiều dài cột đối với sự phân giải

1.5 Tối ưu hóa quá trình sắc kí

 Tối ưu hóa: Chọn điều kiện tốt nhất để thực hiện tốt qui trình

sắc kí: tách thành công một hoặc nhiều cấu tử mong muốn trongthời gian ngắn nhất

 Độ phân giải và thời gian lưu: hai yếu tố quan trọng nhất

Sắc kí đồ của một quá trình tách Pha động là hỗn hợp của

1.6 Phân tích định lượng bằng sắc kí

1.6.1 Diện tích pic

S = w h/2

 Phần mềm sắc kí: mô tả chính xác chương trình sắc kí; cho

phép thu được sắc kí đồ, phân tích dữ kiện, định lượng

1.6.2 Phương pháp chuẩn ngoại

 Sử dụng chất chuẩn của chính chất phân tích

 Chuẩn hóa một điểm:

- Sử dụng một phép đo của chất chuẩn đã biết trước nồng độ,

đo độc lập và song song với phép đo chất cần phân tích

Cpt, Ctc là nồng độ chất phân tích có trong mẫu và nồng độ chất chuẩn

Spt, Stc là diện tích pic của chất phân tích và chất chuẩn

 Phương pháp đường chuẩn

1.6.3 Phương pháp chuẩn nội

S

C C

1.6.4 Phương pháp thêm chuẩn

 Chất chuẩn phân tích đã biết nồng độ được thêm vào dungdịch phân tích  Nồng độ chất phân tích có trong mẫu

2 SẮC KÍ KHÍ

 Nguyên tắc:

- Mẫu phân tích được hóa hơi và được bơm vào đầu cột

- Sự rửa giải diễn ra nhờ một dòng khí trơ gọi là khí mang: Phađộng

- Không có sự tương tác giữa chất phân tích và pha động

Khí mang

2.1 Khí mang

 Yêu cầu của khí mang:

- Đảm bảo tính khuyếch tán quyết định hiệu suất cột

- Phù hợp với độ nhạy cần thiết và nguyên lí hoạt động của đầu

- Rút ngắn thời gian phân tích

 Lưu lượng: 25 – 100 ml/phút đối với cột nhồi

2.2 Bơm mẫu phân tích

 Mẫu phân tích: 1 µl đến 10 µl được

bơm qua một vách ngăn trong buồng

hóa hơi được đặt ở đầu cột

Vách ngăn Xơ ranh

Khí

Cột

Ống đệm

Khe thoát chung

 Nhiệt độ bơm: Cho phép hóa hơi

nhưng tránh phân hủy mẫu ( 50°C,

thấp hơn nhiệt độ bay hơi của cấu tử

+ Chế độ chia dòng Split: Khí mang bơm vào trong bình hóa

hơi với lưu lượng lớn, ví dụ 50 ml/phút, nhưng chỉ đi vào cộtmột lưu lượng rất nhỏ, ví dụ 1% của 50 ml/phút, tức 0,5 ml/phút

 1% mẫu phân tích được đưa vào cột

+ Chế độ không chia dòng Splitless: Dùng để phân tích dung

dịch vô cùng loãng (phân tích lượng vết)

2.3 Chọn cột tách

- Cột WCOT: có thành trong gần như phẳng phủ pha tĩnh, dày

0,25 µm Cột có đường kình trong 0,25 mm

- Cột SCOT: cột thành trong có lớp chất đỡ sau đó phủ pha

tĩnh, dày 20 µm, đường kính trong của cột 0,5 mm

Cột nhồi

Cột mao quản

 0,53 mm

 Cột:

 Pha tĩnh: được áp dụng rộng rãi có dạng lỏng, thường là các

hợp chất hữu cơ có khối lượng phân tử lớn

- Yêu cầu:

+ Liên kết mạnh với chất này nhưng yếu với chất kia  làmchênh lệch hệ số phân bố, tăng hệ số tách

- Ít bay hơi, không phân hủy ở nhiệt độ làm việc của cột

- Phải không có những phản ứng bất thuận nghịch giữa chấtphân tích và pha tĩnh cũng như khí mang

- Một số chất sử dụng làm pha tĩnh:

Pha tĩnh Tên thương

mại

Nhiệt độ cao nhất/°C

siloxan

OV-3, SE-52 350 Este của axit béo, ancaloid,

thuốc, hợp chất chứa halogen

50% phenyl

polydimeyl siloxan

OV-17 250 Thuốc, steroid, dư lượng

thuốc trừ sâu, các glycol 50% Trifloropropyl

polydimeyl siloxan

OV-210 200 Hợp chất thơm chứa clo,

nitro; ankylbenzen Polyetilen glycol Carbowax 20M 250 Axit tự do; ancol; été; tinh

dầu, glycol 50% Cyanopropyl

polydimeyl siloxan

OV-273 240 Axit béo không bão hòa; axit

tự do, ancol…

2.4 Một vài đầu được sử dụng

 Hiệu năng của đầu dò:

- Detector ion hóa ngọn lửa (Flame Ionization Detector – FID)

- Detector bắt điện tử (Electron Capture Detector – ECD)

- Detector nhiệt ngọn lửa (Flame Thermionic Detector – FTD)

- Detector quang hóa ngọn lửa (Flame Photometric Detector –FPD)

2.5.2 Định lượng

 Lập đường chuẩn với chuẩn đối chiếu ở ngoài mẫu thử

 Thêm chuẩn đối chiếu vào mẫu phân tích

 Nội chuẩn

 Chuẩn hóa diện tích : Hàm lượng phần trăm của một thànhphần trong mẫu phân tích được xác định bằng tỷ số (tính bằng

%) của diện tích pic của thành phần đó và tổng diện tích của tất

cả các thành phần có mặt trong mẫu (trừ pic của dung môi, củathuốc thử và các thành phần có hàm lượng nhỏ hơn giới hạnphát hiện của chúng)

Thực phẩm và hương liệu : Các chất dầu mỡ, tinh dầu, chất

thơm, axit hữu cơ, đồ uống, các sản phẩm tự nhiên

 Công nghệ hóa học : Các ancol, andehit, amin, các hợp chất

thơm, été và các dung môi

 Công nghệ dầu khí : Khí đốt, hydrocacbon nhẹ, dầu hỏa, các

sản phẩm dầu mỏ

 Sinh học, y dược: Dược phẩm, các chất có hoạt tính sinh học.

Phân tích amino axit

Phân tích axit béo trong bơ

Phân tích đường

Phân tích độc tố

t (phút)

Phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong táo

7 phút

3.1 Nguồn gốc của HPLC

3.2 Phân loại

3.3 Thiết bị HPLC

3.4 Bơm cao áp

3.5 Van bơm mẫu

3 SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (Hight Performance Liquid Chromatography – HPLC)

3.6 Cột sắc kí và pha tĩnh 3.7 Pha động

3.8 Đầu dò (Detector) 3.9 Ứng dụng

3.3 Thiết bị HPLC

Nguồn He

2

Nắp van vào

Bơm

3

4

Nắp van ra

Khử xung

Van xả

10 Mồi bơm

Lọc dung môi

Điều hòa P ngược

Chuyển đổi P

Van bơm

Cột Đầu dò

Van trộn dung môi

2. Bình dung môi

3 Đầu phun

Phần đầu vào cấp pha động + mẫu

Phần tách: Cột Phần phát hiện và xử lí số liệu

 Bơm phải đạt được áp suất cao khoảng 250-600 bar, thậm chí

1000 Bar và tạo dòng liên tục

 Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 10ml/phút

3.5 Van bơm mẫu

 Van bơm mẫu thông dụng là van 6 cửa, có vòng mẫu dungtích khác nhau từ 5 µl < V < 500 µl

3.5 Van bơm mẫu

mà lắp vòng mẫu có dung tích khác nhau

3.5 Van bơm mẫu

3.6 Cột sắc kí và pha tĩnh

3.6.1 Cột sắc kí

 Thường có dạng hình ống, làm bằng thép không rỉ, chiều dài

và đường kính trong tùy theo từng loại

 Cột sắc kí chuẩn: Chiều dài 10 cm; đường kính trong 4,5 mm

 Một số loại cột có đường kính trong nhỏ: 2 – 4 mm; 1 – 2 mm;0,1 – 1 mm

Cột Lọc

Bảo vệ cột

Nối

 Sự thay đổi nhiệt độ của cột sẽ làm thay đổi thời gian lưu 

Đẳng nhiệt cột và dung môi để đảm bảo sự lặp lại của phép phântích

Ảnh hưởng của nhiệt độ cột lên sự tách: a) 25°C; b) 35°C; c) 45°C

3.6.2 Pha tĩnh

 Để phép sắc kí có độ phân giải và hiệu quả tách cao; cần thúcđẩy nhanh sự cân bằng chất giữa hai pha động và tĩnh trong cột

 tính chất và cấu trúc của pha tĩnh thay đổi

 Silica gel: Vật liệu cơ sở của pha tĩnh Sắc kí pha thường

Tetraetoxysilan Hạt sol - gel Khung polyme

ure - formon 3 – 6 µm

t°C, O2

Ure, focmon,

- Tách đa dạng:không phân cực, ítphân cực và phâncực

 Silica ghép

- Khi cho ankylsilan kết hợp với silicagel, các nhóm ankyl khácnhau có thể gắn vào bề mặt silicagel

- Sắc kí pha liên kết ngược: Silica gel có gắn gốc ankyl mạch

dài, không phân cực; R=C18H37 ( RP-C18 hay ODS) là loại thôngdụng nhất; pha động phân cực; sử dụng để tách các chất có độphân cực rất đa dạng

- Sắc kí pha liên kết thường: Silica gel gắn gốc ankyl có ít

cacbon mang các nhóm chức phân cực như:

Nhóm chức amin: R=-(CH2)n–NH2, R=-(CH2)n–NMe2Nhóm chức nitrile: R=-(CH2)n–CN

Nhóm chức diol: R=-(CH2)3–O-CH2–CH(OH)-CH2-OH

 Pha tĩnh phân cực mang những tính chất khác nhau; pha độngkhông phân cực

3.7 Pha động

 Sắc kí pha thường: Pha động không phân cực như benzen, hexan… Sắc kí pha đảo: Pha động phân cực như nước,axetonitril, metanol…

n-Pha thường

Yếu

Mạnh Hợp chất phân

cực được giữ lâu

n-hexan

ToluenCloroformeDiclometan

EteEtyl axetatAxetonitrilMetanolNước

Pha đảo Mạnh

Yếu Hợp chất phân cực

Khả năng rửa giải

 Sử dụng hỗn hợp 2 hay 3 dung môi, thu được dung môi có độphân cực khác nhau Khi tách hỗn hợp mẫu phức tạp, thay đổithành phần của hỗn hợp để thu được pha động có độ phân cựcmong muốn.

 Pha động phải thỏa mãn các yêu cầu sau đây:

- Trơ với pha tĩnh,

- Hòa tan được mẫu phân tích,

- Bền vững trong thời gian chạy sắc kí,

- Có độ tinh khiết cao (dung môi HPLC),

- Phù hợp với đầu dò,

- Không quá đắt

Độ phân cực của một vài loại hợp chất

Độ phân cực của một vài kiểu pha tĩnh

3.8 Đầu dò

 Đầu dò là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phươngpháp, gồm 2 loại:

- Theo dõi tính chất của pha động

- Theo dõi tính chất của chất phân tích

 Loại theo dõi tính chất của pha động: theo dõi tính chất vật kíhay hóa học của pha động mà liên quan đến chất phân tích Sựliên quan này được đánh giá bằng sự tăng hay giảm tính chấtcủa pha động, tỷ lệ với sự có mặt của chất tan trong dung dịchnên có thể định lượng được

 Thực tế: đôi khi theo dõi cả hai

3.8 Đầu dò

 Một số loại đầu dò:

- Đầu dò quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS

- Đầu dò huỳnh quang

3.9 Ứng dụng

- Công nghiệp hóa học; Chế biến nông sản thành thực phẩm;Sinh học, y dược…

Ví dụ phân tích aflatoxin trong sản phẩm nông nghiệp

 Aflatoxine: nhóm mycotoxin tạo ra bởi Aspergillus flavus,

Aspergillus parasiticus và Aspergillus nomius

 Liều lượng gây chết bằng đường uống của Aflatoxine B1

 Chiết: Vật liệu nghiên cứu được nghiền nhỏ (khoảng 500 mg),chiết bằng cloroform hoặc metanol 80 %

 Làm sạch: Bằng phương pháp chiết pha rắn

- Cột EASI-EXTRACT

 Phân tích: HPLC/MS hoặc LC/MS/MS

Pha tĩnh: Cột Zorbax Eclipse XDB-C8 hoặc RP-18Pha động: H2O/MeOH/ACN, v/v/v; 350 µl HNO3 và 119 mgKBr được thêm vào 1 lít pha động

Sắc kí đồ chỉ ra sự tách của 10 mycotoxin: Aflatoxin B1, B2, G1 và G2, Citrinin, Axit cyclopiazonic, Axit mycophenolic,

Ochroatoxin A, Axit penicilic và Penitrem A

 Một vài ví dụ về kết quả phân tích aflatoxin trong sản phẩmnông nghiệp

4 SẮC KÍ TRAO ĐỔI ION

 Pha tĩnh = Nhựa trao đổi ion, thường là polyme hữu cơ

 Nhựa cationit: trao đổi cation

R-G-/X+ + canion+  R-G-/canion+ + X+

 Nhựa anionit: trao đổi anion

R-G+/Y- + anion-  R-G+/anion- + Y

-4.1 Tổng hợp ionit

 Ionit vô cơ hoặc hữu cơ tự nhiên không đáp ứng được nhucầu phân tích do dung lượng trao đổi thấp và độ lặp lại của phépphân tích kém

 Các ionit tổng hợp có ưu điểm do:

- Dung lượng trao đổi cao,

- Độ bền lí học và hóa học tốt,

- Độ lặp lại của phép tách sắc kí tốt

4.1.1 Điều chế cationit axit mạnh

 Trùng hợp Styren và divinyl benzen (DVB)

- Khi cho thêm DVB làm cho mạch cao phân tử được nối lại vớinhau Lượng DVB càng lớn, số lượng liên kết ngày càng nhiều,mạch cao phân tử trở nên chắc chắn hơn Trong thực tế, sửdụng 8-12% DVB là phù hợp

 Bước tiếp theo là sunforic hóa

4.1.2 Điều chế cationit axit yếu

 Sử dụng axit acrilic (CH2=CH-COOH) trùng hợp với DVB Khi

đó mạch cao phân tử có các nhóm axit yếu

4.1.3 Điều chế anionit

 Trùng hợp Styren và divinyl benzen (DVB)

 Clo metyl hóa

MeOCH2Cl

CH Cl

MeOH

4.2 Phân loại ionit

 Ionit loại 1: ionit thể hiện tính chất như một axit mạnh

(cationit) hoặc bazo mạnh (anionit)

- Đặc điểm: Có thể làm việc ở mọi giá trị pH

Hấp dung ít thay đổi theo pH

Là ionit đơn chức (-SO3H)

- Ví dụ: Cationit: KY-2 (Nga); Dowex 50 (Mỹ); Amberlite

IR-200 (Anh)…

Anionit: Dowex 1 (Mỹ); SBW (Đức); Amberlite

IRA-400 (Anh)…

 Ionit loại 2: ionit thể hiện tính chất như một axit yếu (K) hoặc

bazo yếu (A)

- Đặc điểm: Làm việc ở một giá trị pH xác định

Hấp dung ít thay đổi khi pH thay đổiThường đơn chức

- Ví dụ: Cationit: Kb4 (COOH); Ambelit IRC50 (COOH, OH); Wofarit CP (-COOH)…

-Anionit: AH-2 (N; =NH; -NH2); Ambelit IR4B(=NH, -NH2); Wofatit AD 40 (N; =NH)…