nghiên cứu sử dụng trái thanh long (hylocereus undatus) để chế biến nước uống lên men

Giống Dekkera: 2 loài, tế bào thường hình nhọn đầu, còn có hình cầu, êlip, ống, hoặc hình kéo dài, nảy chồi nhiều phía, không có khuẩn ty, có khuẩn ty giả, có thể tạo váng, bào tử túi h

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ KIỀU OANH

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TRÁI

THANH LONG (Hylocereus undatus) ĐỂ

CHẾ BIẾN NƯỚC UỐNG LÊN MEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2005

LỜI CẢM ƠN

Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Trần Thị Thanh – cán bộ giảng dạy của trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Sinh và cán bộ giảng dạy lớp cao học khóa 13 chuyên ngành Vi sinh vật đã tận tâm giảng dạy và truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trong suốt khóa học

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, cán bộ phụ trách phòng thí nghiệm sinh lý-sinh hóa- vi sinh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt luận văn này

Cảm ơn các bạn cùng khóa đã đóng góp nhiều ý kiến, giúp đỡ động viên trong suốt thời gian qua

Con xin chân thành kính tỏ lòng biết ơn bố mẹ và anh Lê Kim Nhật đã động viên an ủi và là chỗ dựa tinh thần cũng như vật chất tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn này

Học viên

Lê Thị Kiều Oanh

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan I

Mục lục II

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt VI

Danh mục các bảng VII

Danh mục các hình X

Danh mục các đồ thị XI

MỞ ĐẦU………1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 3

Chương 1: Nấm men và lên men etylic 3

1.1 Đặc điểm hình thái nấm men 3

1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 3

1.3 Phân loại nấm men 12

Chương 2: Ứng dụng của nấm men trong công nghiệp chế tạo đồ uống lên men 23 2.1 Đồ uống có độ rượu nhẹ 23

2.2 Đồ uống có độ rượu cao 32

2.3 Thực trạng chế biến thức uống lên men ở Việt Nam 33

Chương 3: Những hiểu biết về trái thanh long 36

3.1 Đặc điểm của cây, trái thanh long 36

3.2 Tình hình sản xuất và sử dụng trái thanh long 37

3.3 Những khó khăn khi sử dụng trái thanh long chế biến thành nước uống lên men 39

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……….40

Chương 4: Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 40

4.1 Nguyên liệu 40

4.2 Hóa chất 41

4.3 Thiết bị 41

4.4 Các loại môi trường nghiên cứu 41

Chương 5: Các phương pháp nghiên cứu 45

5.1 Các phương pháp vi sinh vật 45

5.2 Các phương pháp hóa lý 51

5.3 Các phương pháp toán học 55

5.4 Phương pháp đánh giá cảm quan 55

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 56

Chương 6: Kết quả xử lý và chế biến trái thanh long thành dịch quả làm môi trường nuôi cấy nấm men 56

6.1 Khảo sát thành phần dịch trái thanh long Bình Thuận 56

6.2 Chế biến và xử lý trái thanh long làm môi trường nuôi cấy nấm men 58

Chương 7: Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men phù hợp với yêu cầu chế biến đồ uống lên men từ dịch trái thanh long 63

7.1 Phân lập và thuần khiết các chủng nấm men có nguồn gốc khác nhau 63

7.2 Tuyển chọn các chủng nấm men phù hợp với yêu cầu chế biến đồ uống lên men từ dịch trái thanh long 65

Chương 8: Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men LT 2 78

8.1 Đặc điểm hình thái 78

8.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men LT 2 81

8.3 Khảo sát khả năng tạo chất kháng sinh của chủng nấm men LT 2 85

8.4 Tìm hiểu khả năng kháng một số kháng sinh của chủng LT 2 88

8.5 Định danh 90

Chương 9: Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chủng Saccharomyces cerevisiae LT 2 trong quá trình nhân giống 93

9.1 Xác định thời gian sinh trưởng và chế độ lắc thông khí thích hợp đối với chủng Saccharomyces cerevisiae LT 2 trong quá trình nhân giống 93

9.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu 95

9.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường 96

9.4 Sử dụng dịch ép trái thanh long làm môi trường nhân giống 98

Chương 10: Khảo sát khả năng sử dụng chủng Saccharomyces cerevisiae LT 2 lên men tạo nước giải khát từ dịch trái thanh long 105

10.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên quá trình lên men etylic ở môi trường dịch trái thanh long của chủng Saccharomyces cerevisiae LT 2 105

10.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình lên men etylic ở môi trường dịch trái thanh long của chủng Saccharomyces cerevisiae LT 2 110

Chương 11: Khảo sát động thái lên men rượu của chủng Saccharomyces cerevisiae LT 2 trong quá trình lên men tạo nước giải khát từ dịch trái thanh long 115

11.1 Khảo sát giai đoạn lên men hiếu khí 115

11.2 Khảo sát giai đoạn lên men kị khí 117

11.3 Khảo sát lên men kị khí ở nhiệt độ thấp 120

11.4 Hoàn thiện sản phẩm 122

11.5 Xây dựng quy trình chế tạo nước uống lên men từ trái thanh long ở quy mô phòng thí nghiệm 129

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 132

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

C: Cacbon

[C]: Nồng độ glucose

CP: Centipoise

N: Nitơ

Sac: Saccharomyces cerevisiae

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

TL: Thanh long

TL450, TL465, TL580: lượng dịch thu được lần lượt là 450, 465, 480ml/1kg

trái thanh long được trích ly bằng nhiệt độ cao

V/p: Vòng/phút

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Thành phần dinh dưỡng của trái thanh long Bình Thuận 37

Bảng 6.1 Thành phần hóa học dịch trái thanh long Bình Thuận 56

Bảng 6.2 Thành phần một số dịch quả được sử dụng trong sản xuất rượu vang 57

Bảng 6.3 Dịch trái thanh long (100ml) được xử lý bằng Ca(OH)2 và lòng trắng trứng gà 61

Bảng 7.1 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men 64

Bảng 7.2 Khả năng tạo hương thơm của các chủng nấm men 66

Bảng 7.3 Khả năng kết lắng của các chủng nấm men 67

Bảng 7.4 Hoạt lực lên men của các chủng nấm men trên môi trường sirô (MT12) và môi trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) 69

Bảng 7.5 Khảo sát hoạt lực lên men và đánh giá cảm quan sản phẩm lên men của các chủng nấm men đơn lẻ và tổ hợp các chủng nấm men trên môi trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) 71

Bảng 7.6 Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men mạnh trên môi trường thanh long thích hợp 73

Bảng 7.7 Hoạt lực lên men của chủng nấm men LT 2 trên các loại môi trường nước trái thanh long đã xử lý ……… ……… 76

Bảng 8.1 Đặc điểm hình thái của chủng nấm men LT 2 79

Bảng 8.2 Khả năng lên men các loại đường của chủng nấm men LT 2 83

Bảng 8.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của nấm men LT 2 83

Bảng 8.4 Ảnh hưởng của pH ban đầu lên sự sinh trưởng của chủng nấm men LT 2 84 Bảng 8.5 Khả năng chịu nồng độ cồn của chủng nấm men LT 2 85

Bảng 8.6 Khả năng tạo chất kháng sinh kháng các vi khuẩn kiểm

định của chủng nấm men LT2 86 Bảng 8.7 Khả năng kháng một số kháng sinh của chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae LT 2 95 Bảng 9.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình tăng sinh

khối của chủng Saccharomyces cerevisiae LT 2 97 Bảng 9.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình nhân giống

trên môi trường dịch trái thanh long 99 Bảng 9.5 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình nhân giống trên

môi trường dịch trái thanh long 100 Bảng 9.6 Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến quá trình nhân giống trên

môi trường dịch trái thanh long 101 Bảng 9.7 Ảnh hưởng của nguồn nitơ là hỗn hợp (NH4)2SO4 và

pepton hoặc cao nấm men đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long 103 Bảng 10.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men của chủng

Saccharomyces cerevisiae LT 2 106 Bảng 10.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men của

Bảng 10.3 Ảnh hưởng của hàm lượng giống đến khả năng lên men

Bảng 10.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng lên men

Bảng 10.5 Ảnh hưởng của hàm lượng hỗn hợp (NH4)2SO4 và

Saccharomyces cerevisiae LT 2 113 Bảng 11.1 Quá trình lên men tạo nước giải khát từ dịch trái thanh

Bảng 11.2 Khảo sát thời gian lên men kị khí ở 300C của chủng

Saccharomyces cerevisiae LT 2 trên môi trường dịch trái thanh long 119

Saccharomyces cerevisiae LT 2 trên môi trường dịch trái thanh long 121 Bảng 11.4 Kết quả phân tích các chỉ tiêu về chất lượng sản phẩm đồ

uống lên men từ dịch trái thanh long 123 Bảng 11.5 Một số chỉ tiêu chất lượng nước thanh long lên men sau

thời gian bảo quản 124

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 4.1 Trái thanh long ruột trắng Bình Thuận 40

Hình 8.1 Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm men LT 2 78

Hình 8.2 Hình thái tế bào nấm men LT 2 (×100) 79

Hình 8.3 Nang bào tử của nấm men LT 2 (×100) 80

Hình 8.4 Khuẩn ty của chủng nấm men LT 2 (×40) 81

Hình 8.5 Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ vô cơ của chủng nấm men LT 2 82

Hình 8.6 Chủng nấm men LT 2 kháng E coli và Bacillus pimitilis 87

Hình 8.7 Chủng nấm men LT 2 kháng Salmonella typhimurium và Klebsiella 87

Hình 8.8 Chủng nấm men LT 2 kháng Serratia sp và Streptococcus sp………87

Hình 8.9 Khả năng kháng chloramphenicol và ceftazidime 89

Hình 8.10 Khả năng kháng gentamycin và kanamycin 89

Hình 8.11 Khả năng kháng neomycin và acid nalidixic 89

Hình 11.1 Sản phẩm nước thanh long lên men 127

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Trang Biểu đồ 7.1 Khả năng kết lắng của các chủng nấm men 67 Biểu đồ 7.2 Hoạt lực lên men của các chủng nấm men trên môi

trường sirô (MT12) và môi trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) 69 Biểu đồ 7.3 Hoạt lực lên men của chủng nấm men đơn lẻ và tổ hợp

các chủng nấm men trên môi trường dịch trái thanh

long qua lọc (MT13) 72

Biểu đồ 7.4 Hoạt lực lên men của chủng nấm men LT 2 trên môi

trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) và môi trường dịch trái thanh long không lọc (MT14) 74

Biểu đồ 7.5 Hoạt lực lên men của chủng nấm men LT 2 trên các loại

môi trường nước trái thanh long đã xử lý 76

Biểu đồ 9.1 Động thái sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae

Biểu đồ 9.2 Ảnh hưởng pH ban đầu đến quá trình tăng sinh khối

Saccharomyces cerevisiae LT 2 96 Biểu đồ 9.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình tăng

Biểu đồ 9.4 Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến quá trình nhân giống trên

môi trường dịch trái thanh long 102 Biểu đồ 9.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ là hỗn hợp (NH4)2SO4 và

pepton hoặc cao nấm men đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long 103 Biểu đồ 10.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men của

Biểu đồ 10.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men của

Biểu đồ 10.3 Ảnh hưởng của hàm lượng giống đến khả năng lên

Biểu đồ 10.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng lên

Saccharomyces cerevisiae LT 2 113 Biểu đồ 11.1 Động thái quá trình lên men tạo nước giải khát từ dịch

trái thanh long trong điều kiện hiếu khí 116 Biểu đồ 11.2 Hàm lượng chất khô trong giai đoạn lên men kị khí 119

MỞ ĐẦU

Đồ uống lên men đã được con người biết đến và sử dụng cách đây vài thế kỷ Dần dần sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, đặc biệt khi ngành công nghệ thực phẩm và công nghệ vi sinh ngày càng phát triển thì các sản phẩm về đồ uống được cải tiến không ngừng về chất lượng và cả về chủng loại nhằm đáp ứng thị hiếu người tiêu dùng Hơn nữa, con người ngày càng hiểu rõ hơn giá trị dinh dưỡng và hiệu quả kinh tế lớn lao của các sản phẩm về đồ uống mà giờ đây chúng có mặt ở hầu hết các nước trên thế giới

Đồ uống lên men thường sử dụng nguồn nguyên liệu tinh bột hoặc từ các loại trái cây Trong tất cả các loại đồ uống, đồ uống lên men từ trái cây rất được quan tâm bởi ngoài hương vị thơm ngon tự nhiên nó còn chứa các chất dinh dưỡng như các loại muối khoáng, đường, vitamin…chứa sẵn trong trái cây

Việt Nam với đặc điểm là nước nông nghiệp nhiệt đới thích hợp cho việc trồng các loại cây ăn quả nên có nguồn nguyên liệu rất phong phú thuận lợi cho việc sản xuất các loại đồ uống lên men

Trong các loại quả hiện có của Việt Nam, trái thanh long ở các tỉnh của miền Nam có sản lượng lớn và chất lượng cao nhưng hiện nay trái thanh long chỉ mới được sử dụng làm thức ăn tráng miệng, chế biến coctail, thờ cúng và xuất khẩu trái tươi [17] [20] Để góp phần làm đa dạng hóa các sản phẩm đồ uống lên men và sử dụng có hiệu quả hơn nguồn đặc sản dồi dào là trái thanh long ở các địa phương, chúng tôi đề xuất một hướng mới nghiên cứu sử dụng trái thanh long

với đề tài “Nghiên Cứu Sử Dụng Trái Thanh Long (Hylocereus undatus) Để

Chế Biến Nước Uống Lên Men”

Mục tiêu của đề tài: chế biến trái thanh long làm nước uống lên men

nhằm làm đa dạng hóa các sản phẩm từ trái thanh long vừa có giá trị giải khát, bổ sung dinh dưỡng vừa có tác dụng trị liệu

Nhiệm vụ của đề tài:

1 Phân lập các chủng nấm men để làm nguồn giống nấm men cho quá trình tuyển chọn

2 Tuyển chọn các chủng nấm men thích hợp với yêu cầu lên men dịch trái thanh long

3 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men chọn được, trên cơ sở đó tiến hành định danh

4 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát triển và lên men của chủng đã chọn trên môi trường dịch trái thanh long để tạo nước giải khát lên men đạt chất lượng cao

5 Ứng dụng chủng nấm men chọn được để lên men tạo nước giải khát trên môi trường dịch trái thanh long

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG 1: NẤM MEN VÀ LÊN MEN ETYLIC 1.1 Đặc điểm hình thái nấm men

Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau: hình tròn, hình trứng như

Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoideus, hình quả chanh như Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hình chai như Saccharomyces Ludwigu hoặc hình ống dài như Pichia Một số tế bào nấm men có hình dài, nối tiếp nhau tạo thành dạng sợi gọi là khuẩn ty giả như Endomyces, Endomycopsis, Candida… Nhiều loài nấm men chỉ tạo khuẩn ty giả khi sống trong môi trường

thiếu oxy [32]

Nói chung hình dáng của tế bào nấm men ở các loài khác nhau thì khác nhau, trong cùng một loài hình dáng của tế bào có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào

Tế bào nấm men có kích thước trung bình 3-5× 5-10μm, kích thước của tế bào nấm men thay đổi nhiều tùy thuộc vào loài, giống và điều kiện của môi trường sống …[64] Trong môi trường lỏng có nhiều loài nấm men có khả năng

sinh ra một lớp màng bao bọc như tấm voan mỏng như ở Saccharomyces hoặc dày

ở Drojdiile micodermice Trên môi trường đặc, khuẩn lạc nấm men có nhiều hình

dạng khác nhau, màu trắng đục, vàng hoặc hồng nhạt Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nảy chồi vẫn dính với nhau tạo thành chuỗi [32]

1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Nấm men là nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động và sinh sản chủ yếu bằng cách nảy chồi [34], sống dị dưỡng [54]

Nấm men có khả năng sinh sản rất nhanh và tạo được lượng lớn sinh khối trong thời gian ngắn Sinh khối nấm men rất giàu protein, vitamin và lipid

Để quan sát hình thái và đo kích thước tế bào nấm men người ta thường sử

nấm men có hình dài, nối tiếp nhau tạo thành dạng sợi gọi là khuẩn ty giả Nhiều

quan sát khuẩn ty giả, người ta cấy những đường ngắn nấm men trên môi trường

Nhiều loài nấm men có khả năng sinh bào tử túi Nấm men thường tạo bào tử túi sau 5-7 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch-mạch nha [6]

1.2.1 Lên men etylic [31] [32]

Lên men rượu là quá trình hô hấp kị khí, trong đó đường bị phân giải thành

Phương trình phản ứng tổng quát:

C6H12O6 n a ám m e n 2 C2H5OH + 2 CO2 + 113,4 KJ

Glucose etylic

1.2.1.1 Các giai đoạn lên men rượu

Có thể chia quá trình lên men rượu thành 2 giai đoạn:

Giai đoạn tăng sinh khối nấm men:

Giai đoạn này nấm men nảy chồi và phát triển mạnh để tăng sinh khối vì

Giai đoạn lên men:

Quá trình này thực chất rất phức tạp, gồm nhiều phản ứng hoá học liên tiếp để tạo thành etanol Có thể chia thành 5 giai đoạn chính:

™ Giai đoạn phosphorin hóa

™ Giai đoạn cắt đôi mạch :

D-glyceraldehyd 3 phosphat

Trong tế bào dioxyacetophosphat có thể biến đổi hoàn toàn thành

glyceraldehyd 3 phosphat

Dioxyacetophosphat D-glyceraldehyd 3 phosphat

™ Giai đoạn oxy hóa:

1,3-diphosphoglycerat + ADP 3-phosphoglycerat + ATP

™ Giai đoạn tạo piruvat:

™ Giai đoạn piruvat tạo thành etanol

Kết thúc quá trình trên ta thu được rượu etylic, ngoài ra còn thu được hỗn

hợp các sản phẩm phụ khác (nguồn gốc là amin và các chất khác) Do đó các đồ

uống lên men có giá trị dinh dưỡng cao

1.2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men etylic

Nấm men đòi hỏi phải có những điều kiện nhất định mới có thể lên men Trong sản xuất rượu, ngoài việc lựa chọn chủng nấm men, còn phải nghiên cứu tạo điều kiện thích hợp để đạt hiệu suất lên men cao Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn Mỗi vi sinh vật có một yêu cầu về nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của mình

Nhiệt độ càng cao lên men càng sớm bắt đầu, tốc độ nhanh và kết thúc sớm, nhưng hàm lượng đường còn lại với một lượng khá lớn Điều này có thể là nguy hiểm, vì hàm lượng đường sót có thể được vi khuẩn lactic sử dụng để tạo thành acid lactic ảnh hưởng nhiều đến chất lượng của sản phẩm

Ngoài ra nhiệt độ còn ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp và các sản phẩm phụ Nhiệt độ càng cao càng dễ sinh và tích tụ các sản phẩm phụ ngày càng nhiều Điều này không có lợi cho sản phẩm chính [22]

Trong công nghiệp rượu cồn người ta thường dùng các chủng nấm men thích hợp cho lên men ở 30-35°C, lên men rượu vang 20-30°C và dưới 10°C trong thời gian tàng trữ (lên men phụ)

Ảnh hưởng pH của môi trường

pH môi trường có ý nghĩa quan trọng trong quá trình lên men rượu Đối với

men rượu vang khoảng pH thích hợp là 2,8-3,8, Saccharomyces vini pH=3,5 So với men rượu (Saccharomyces cerevisiae) và men bia (Saccharomyces carbergensis) thì men rượu vang chịu được acid cao hơn Các loài khuẩn làm

hỏng rượu hoạt động ở pH cao hơn 3,5 nhưng yếu hơn ở pH thấp hơn 3,5 Do đó giữ pH trong giới hạn 3-3,5 là để ức chế hoạt động của khuẩn hại [22]

Ảnh hưởng của hàm lượng đường

Hàm lượng đường có ảnh hưởng rất lớn đến năng lực lên men Hàm lượng đường thích hợp nhất là 13-15% tương đương với nồng độ chất khô từ 16-18% Nếu hàm lượng đường quá cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men Nếu hàm lượng đường thấp sẽ không tạo điều kiện cho quá trình lên men Trong thực tế, ở hàm lượng đường 30-35% thì sự lên men bị đình chỉ cho dù có loại nấm men có khả năng lên men được ở hàm lượng đường lên đến 60% [34]

Nồng độ rượu và khí CO 2

Đa số nấm men chỉ lên men được tới nồng độ rượu 13-14%, chỉ có một số

cho môi trường luôn bị khuấy động, kéo dài được trạng thái lơ lững của nấm men

do đó làm tăng nhanh sự lên men Qua đó ta thấy một điều phổ biến chính sản phẩm của sự trao đổi chất khi đạt tới một nồng độ nào đó sẽ có tác dụng ức chế đối với bản thân vi sinh vật đó [34]

1.2.2 Khả năng sử dụng các hợp chất cao phân tử [32]

1.2.2.1 Hydratcacbon

Đối với nấm men nguồn cacbon thích hợp nhất là các loại đường như glucose, fructose, sacarose, maltose, rafinose, lactose, dextrin Đối với các chủng

thuộc loài Saccharomyces cerevisiae có khả năng đồng hoá được các loại đường

hexose và nói chung không đồng hoá được đường pentose

Các chủng nấm men riêng biệt sử dụng các nguồn đường rất khác nhau Ví dụ: các chủng nấm men rượu sử dụng nguồn đường glucose; với các giống men bia, sử dụng đường maltose

Các tế bào nấm men trước khi sử dụng các loại đường có trong môi trường đều phải thực hiện một trong hai quá trình sau:

maltotriose có khả năng thấm thấu trực tiếp qua màng tế bào

thuỷ phân trước bởi enzim ngoại bào rồi sau đó các sản phẩm thuỷ phân này mới

được hấp thu

Như vậy nấm men chỉ sử dụng các loại đường có trong môi trường mà không có khả năng phân giải nguồn nguyên liệu tinh bột bằng enzim Do đó cần giai đoạn đường hóa các nguyên liệu trước khi tiến hành các quá trình lên men

1.2.2.2 Protein

Sự phát triển của nấm men liên quan đến sự hấp thu nitơ, chủ yếu là các loại acid amin Chúng được tế bào sử dụng để tổng hợp protein và các hợp chất chứa nitơ khác Nấm men tiêu hoá tốt các acid amin, kém hơn là pepton và hoàn toàn không tiêu thụ được protein tự nhiên

Đối với nấm men rượu không phải tất cả các acid amin đều sử dụng được Người ta chia các acid amin thành các nhóm:

asparatic acid

glyxin, acid glutamic, lơxin

1.2.2.3 Lipid

Trong suốt quá trình lên men, nấm men hấp thụ các acid béo tự do, phần lớn chúng được kết hợp lại thành các lipid cấu trúc trong thành tế bào nấm men

Nấm men Saccharomyces cerevisiae và những loài gần với chúng có nhu

cầu acid béo không no trong quá trình phát triển ở điều kiện hiếu khí và kị khí, thì trong quá trình hô hấp nấm men có nhu cầu tiêu thụ acid béo không no gấp 4 lần so với bình thường do tham gia vào quá trình phosphoryl hoá để tổng hợp ATP [32]

1.2.3 Khả năng tạo chất kháng sinh của chủng nấm men

1.2.3.1 Kháng sinh và các con đường tổng hợp

Theo Waksman định nghĩa rằng: Kháng sinh là những chất hóa học có nguồn gốc từ cơ thể sống có tác dụng ức chế sự sinh trưởng hay tiêu diệt một số

vi sinh vật khác một cách một chọn lọc ngay khi ở nồng độ thấp [59]

Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh từ

vi sinh vật:

dưỡng, thường chất kháng sinh không có một vai trò rõ rệt đối với tế bào sinh ra chúng

đổi chất, do đó mà sự mất khả năng hình thành chất kháng sinh không làm mất khả năng sinh trưởng

Chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra chúng cũng đa

dạng như: vi khuẩn Staphylococcus aureus 209 P hoặc Bac mycoides HB (loại nhẵn) và nấm Penicillium notatum cho chất kháng sinh penicilline, kháng sinh streptomycine thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces griseus, kháng sinh kanamycin thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces fradie [59]

Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau nhưng quá trình tổng hợp gần như theo một số con đường nhất định Cơ chế sinh tổng hợp chất kháng sinh từ vi sinh vật có thể qua một số con đường sau:

nhất Ví dụ chloramphenicol, chất kháng sinh thuộc nhóm nucleozit

ví dụ lincomycin

đổi chất bậc một sau đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác; có thể phân biệt thành bốn dạng:

amin

hợp polymersaccarit: neomicine, streptomycine

acetat, propionat

izopreonit từ các đơn vị acetat [25]

1.2.3.2 Chất kháng sinh có từ nấm men

Ketler toxin hay còn gọi là zymocine: là loại chất kháng sinh được một số chủng nấm men và vi nấm tiết ra nhằm chống lại sự cạnh tranh giữa các chủng cùng loài hoặc chủng thuộc họ gần Hiện tượng này lần đầu tiên được Bevan và

Macower phát hiện năm 1936 trên chủng nấm men Saccharomyces Cho đến nay

khả năng sinh zymocine đã được tìm thấy ở nhiều chủng nấm men thuộc họ khác

nhau như: Pichia, Kluyveromyces, Debaryomyces, Hanseniaspora, Zygosaccharomyces, Candida, Sporidiobolus, Cryptcoccus (Schmitt và

Neuhansen, 1994, Magliani et al., 1997, Vondrejs và Palkova, 1997) Tất cả các zymocine được biết đến đều là những polypeptid hoặc glycoprotein Đặc tính sinh học có thể được mã hóa trên ARN mạch kép, DNA plasmid và mạch thẳng trên chromosome Do tính chất chọn lọc rất cao, zymocine có tiềm năng như những chất kháng sinh hữu hiệu chống lại một số bệnh nang y [45] Khả năng tạo chất kháng sinh của một loài nấm men được nhiều công trình nghiên cứu, ứng dụng

nhắc tới đó là chủng nấm men Saccharomyces boulardii với công trình nghiên

cứu “Xây dựng quy trình nuôi cấy và thử tác dụng trị loạn khuẩn của chủng nấm

men Saccharomyces boulardii” Thạc sĩ Nguyễn Kim Minh Tâm cho thấy khả

năng có thể sản xuất một loại thuốc trị loạn khuẩn đường ruột mới với ưu điểm vượt trội so với các loại thuốc trị loạn khuẩn khác: có khả năng đề kháng các chất kháng sinh Trong tương lai có thể sản xuất loại thuốc nói trên với chi phí thấp Bên cạnh đó các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy nấm men

Saccharomyces boulardii còn có khả năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của Clostridium difficile, vi khuẩn gây viêm ruột kết màng giả cũng như trung hòa được nội độc tố E coli và Vibrio cholerae nên có thể dùng trong dự phòng tiêu

chảy cấp tính [37]

Hiện nay công ty dược của Mỹ đã chế tạo kháng sinh từ nấm men

Saccharomyces boulardii ở dạng viên nén, lọ 50 viên [69].

1.3 Phân loại nấm men

1.3.1 Phương pháp phân loại nấm men

Để phân loại nấm men, người ta sử dụng phương pháp phân loại cổ điển (dựa vào các đặc điểm hình thái học, sinh lý sinh hóa) và phương pháp phân loại dựa vào kết quả của phân tích kỹ thuật di truyền [27] [32]

1.3.1.1 Phương pháp dựa vào đặc điểm hình thái học, đặc điểm sinh lý sinh hóa

Chủng nấm men được cấy vào các đĩa petri chứa môi trường Hansen để quan sát hình thái khuẩn lạc (hình dạng, kích thước, màu sắc), hình dạng tế bào, kích thước tế bào, hình thức nảy chồi, xác định khả năng sinh bào tử của các chủng nấm men, quan sát khuẩn ty, khả năng lên men các nguồn hydratcacbon, thử khả năng sinh trưởng trên môi trường agar chứa muối nitrat, ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, khả năng phân giải urê…[6] [27]

1.3.1.2 Phương pháp phân loại dựa vào kỹ thuật di truyền

Phân loại theo phương pháp cổ điển có độ chính xác không cao và bị hạn chế khi xác định các chủng có đặc điểm gần giống nhau Mặc khác thời gian kiểm tra thường bị kéo dài [32]

Ngày nay cùng với sự tiến bộ của sinh học phân tử nhiều phương pháp phân loại mới với độ chính xác cao đã được nghiên cứu và ứng dụng Trong đó phương pháp phân tích trình tự chuỗi RNA ribosom của tế bào nấm men đã được biết đến như một phương pháp phân loại hiện đại, nhanh chóng và có độ tin cậy cao [27]

Phương pháp này dựa vào trình tự chuỗi RNA của các gen r18S, 26S và ITS

ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC

Mồi cho khuếch đại một phần gen 26S rRNA vùng D1/D2:

NC1: GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG

NC4: GGTCCGTGTTTCAAGAAGG

PCR

Sản phẩm được tinh sạch bằng kít Wizard PCR Preps DNA purification system (Promega, Southampton, United Kingdom) theo hướng dẫn sử dụng của hãng

rRNA được tiến hành bằng việc sử dụng các kít phản ứng Applied Biosystem ABI

được sử dụng cho xác định trình tự chuỗi của gen 18S rRNA là:

Các cặp mồi được sử dụng cho xác định trực tiếp trình tự chuỗi của gen ITS2 rRNA là:

Sản phẩm PCR này được tinh sạch và điện di trên gen polyacrylamide Trình tự chuỗi được đọc tự động bằng máy Sequencer 373 Acid DNA (Appied Biosystem GmbH-Germany)

Kết quả trình tự chuỗi của gen 18S rRNA, ITS rRNA, 26S rRNA của nấm men được phân tích so sánh với các trình tự chuỗi có sẵn trong ngân hàng gen với sự trợ giúp của phần mềm editor (ae2) alignment (DSMZ-Germany) Phần trăm giống nhau giữa các trình tự chuỗi của gen của nấm men được trình bày dưới dạng ma trận

1.3.2 Khóa phân loại nấm men

Phân loại nấm men là công việc không đơn giản Từ trước đến nay có rất nhiều khóa phân loại nấm men của nhiều tác giả khác nhau

Hansen là người đưa ra khóa phân loại nấm men đầu tiên, ông chia nấm

men thành 8 giống: Saccharomyces, Saccharomycopsis, Monospora, Zygosaccharomyces, Pichia, Nematospora, Saccharomycodes, Willia

Năm 1907, Klocker chia nấm men thành 12 giống với 3 giống phụ:

Saccharomyces (giống phụ Zygosaccharomyces), Hanseniaspora, Nadsonia,

Torulaspora, Pichia (giống phụ Pichia và giống phụ Zygopichia), Monospora, Atichia, Debaryomyces, Schwanniomyces, Saccharomycodes, Nematospora

Năm 1920, Guilliermond chia nấm men thành hai nhóm với 18 giống

Nhóm nấm men thật:

Schizosaccharomyces, Nadsonia, Saccharomycodes, Hansenia, Monospora, Zygosaccharomyces, Schwanniomyces, Saccharomycopsis, Pichia, Nematospora, Debarymyces, Torulaspora, Saccharomyces, Willia

Nhóm nấm men giả:

Torula, Mycoderma, Pseudosaccharomyces, Cryptococcus

Năm 1952, J.Lodder cùng với Kreger Van Rij tổng kết lại một cách khá hoàn thiện về vấn đề phân loại nấm men Năm 1971, bổ sung và sửa chữa lại tài liệu phân loại nấm men đầy đủ nhất và có uy tín nhất hiện nay

Năm 1954, Kudriavtxev (Liên Xô) đã xếp nấm men vào bộ

Unicellomycetables bao gồm 3 họ: Saccharomycetaceae, Schizosaccharomycetaceae và Saccharomycodaceae

Năm 1962, Phương phương Tâm (Trung Quốc) đã chia nấm men 31 giống và 11 giống phụ Mặc dù hệ thống phân loại của Kudriavtxex (Liên Xô) và Phương Phương Tâm đáng được chú ý nhưng đến nay vẫn không được sử dụng rộng rãi và thông dụng như hệ thống phân loại của Lodder và Kreger Van Rij Theo khóa phân loại của Lodder (1971) nấm men được chia thành 39 giống

và 4 nhóm [22]

Nhóm thứ 1: Nhóm nấm men hình thành nang (túi) thuộc lớp nấm túi

(Ascomycetes) gồm 22 giống:

Giống Citeromyces: 1 loài, tế bào hình cầu hay hình elip, nảy chồi nhiều

phía, không có khuẩn ty, khuẩn ty giả hoặc váng, bào tử túi hình cầu, chỉ có một

bào tử túi, túi có thành mỏng, bào tử túi có thành sần sùi, có khả năng đồng hóa nitrat

Giống Coccidiascus: 1 loài, tế bào hình cầu hay hình chữ nhật, nảy chồi

nhiều phía, không có khuẩn ty, khuẩn ty giả hoặc váng, bào tử túi hình thoi (fusiform), có thể có 8 bào tử túi

Giống Debaryomyces: 8 loài tế bào hình cầu, hình elip, hình kéo dài, nảy

chồi nhiều phía, không có khuẩn ty, một số có khuẩn ty giả, có thể tạo váng, bào tử túi hình cầu, bầu dục, sần sùi, có 1- 4 bào tử túi, tiếp hợp ngay trước khi hình thành túi

Giống Dekkera: 2 loài, tế bào thường hình nhọn đầu, còn có hình cầu, êlip,

ống, hoặc hình kéo dài, nảy chồi nhiều phía, không có khuẩn ty, có khuẩn ty giả, có thể tạo váng, bào tử túi hình mũ, có 1-4 bào tử túi, sinh acid acetic, có hoặc không có khả năng đồng hóa nitrat

Giống Endomycopsis: 10 loài, tế bào có hình dạng thay đổi, nảy chồi nhiều

phía, có khuẩn ty, khuẩn ty giả, một số tạo váng, có 1-4 bào tử túi, hình cầu, mũ, hình lưỡi liềm, túi có khuẩn ty giả Túi nằm ở đầu ở giữa khuẩn ty Nhiều loài có khả năng đồng hóa hóa tốt tinh bột

Giống Henseniaspora: 3 loài, tế bào hình quả chanh Châu Âu hoặc hình

ong, hình bầu dục, nảy chồi nhiều phía, không sinh khuẩn ty và váng, một số ít có khuẩn ty giả, có 1-4 bào tử túi hình mũ cát, hình mũ sắt, hình quả hồ đào Tất cả các loài đều cần sử dụng inôzitol và pantotenat

Giống Hansenula: 25 loài, tế bào hình cầu, hình êlip, hình chữ nhật, hình

ống, nảy chồi hình phía, có hoặc không có khả năng sinh khuẩn ty, khuẩn ty giả và váng, có 1-4 bào tử túi hình mũ, hình bán cầu, hình cầu, khuẩn lạc có dạng nhầy, dạng bơ hay dạng phấn đục Nhiều loài sinh photphamannan hoặc Sphingolipit Có khả năng đồng hóa nitrat

Giống Kluyveromyces: 18 loài, tế bào hình cầu, hình êlip, hình ống, hình

kéo dài, nảy chồi nhiều phía, không có khuẩn ty, nhiều loài có khuẩn ty giả và đôi khi tạo váng, có một hoặc nhiều bào tử túi hình bán nguyệt, hình thận, hình kéo dài với đầu tù, hình cầu, hình cầu dài-êlip, có thể tạo sắc tố đỏ (không phải carotenoit) trên môi trường sinh bào tử

Giống Lipomyces: 3 loài, tế bào hình êlip, hình cầu, nảy chồi nhiều phía,

không có khuẩn ty, khuẩn ty giả, dẹp-êlip, hình thấu kính lồi, bào tử túi màu nâu, chồi “hoạt động” có thể tiếp hợp hoặc thành túi (asci), tế bào có thể sản sinh nhiều lipid

Giống Lodderomyces: 1 loài, tế bào hình cầu, hình êlip, hình ống, nảy chồi

nhiều phía, không có khuẩn ty, có khuẩn ty giả không tạo váng, 1-2 bào tử túi hình kéo dài với đầu tù, hình cầu dài-êlip, kích thước khá rộng, có khả năng đồng hóa tốt parafin

Giống Metschnikowia: 5 loài, tế bào hình cầu, hình êlip, hình quả lê, hình

ống, nảy chồi nhiều phía, không có khuẩn ty, nhiều loài có khuẩn ty giả và một số loài tạo váng, có 1-2 bào tử túi hình kim với phần phụ (appendage), túi hình kéo dài, một số loài có bào tử áo (chlamydospore), một vài loài sinh pulcherimin

Giống Nadsonia: 2 loài, tế bào hình ống hay hình quả chanh Châu Âu, hay

hình bầu dục, hình kéo dài, nảy chồi theo 2 cực hay phân cắt chồi (bud fission), không có cả khuẩn ty lẫn khuẩn ty giả, một số có thể tạo váng, có 1-2 bào tử túi hình cầu sần sùi, chồi tiếp hợp ngay với tế bào mẹ, phát triển tốt ở nhiệt độ thấp

Giống Nematospora: 1 loài, hình dạng thay đổi (dị hình), nảy chồi nhiều

phía, có khuẩn ty, thường khuẩn ty giả, không tạo váng, túi rộng chứa 2 bó, mỗi

Giống Pachysolen: 1 loài, tế bào có hình êlip, hình cầu, nảy chồi nhiều

phía, không có khuẩn ty, không tạo váng, có hoặc không có khuẩn ty giả, có 4 bào tử túi hình bán cầu với rìa hẹp, túi phát triển ở đầu của một ống dài, sinh ra ngoài tế bào photphomannan có dạng nhầy, có khả năng đồng hóa nitrat

Giống Pichia: 35 loài, tế bào hình cầu, hình êlip, hình chữ nhật, nảy chồi

nhiều phía, thường có khuẩn ty giả, một ít loài có khuẩn ty thật, có hoặc không có khả năng tạo váng, có 1-4 bào tử túi hình cầu, hình mũ, hình sao Thổ, sần sùi, khuẩn lạc, có dạng nhầy, dạng bột nhão (pasty) hay dạng phấn đục Một số loài sinh photphomannan

Giống Saccharomyces: 41 loài, tế bào hình cầu, hình êlip, hình ống, hình

kéo dài, nảy chồi nhiều phía, không tạo váng, có hoặc không có khuẩn ty giả, có 1-4 bào tử túi hình cầu, hình cầu dài-êlip, khuẩn lạc có dạng bột nhão, hơi bóng

Giống Saccharomycodes: 1 loài, tế bào hình ong hay hình quả chanh châu

Âu, hình kéo dài nảy chồi, không có khuẩn ty, không tạo váng, có hoặc không có khuẩn ty giả, có 4 bào tử túi hình cầu, tế bào lớn, bào tử tiếp hợp ngay trong túi, bào tử có một rìa rất hẹp

Giống Saccharomycopsis: 1 loài, tế bào hình bầu dục, hình ống, hình nảy

chồi nhiều phía, không có khuẩn ty, không tạo váng, có khuẩn ty giả, có 1-4 bào tử túi hình bầu dục, hình ống, bào tử có 2 lớp thành, sống trong đường tiêu hóa của thỏ và một động vật gặm nhấm khác, chỉ phát triển ở nhiệt độ giữa 30 và

Giống Schizosaccharomyces: 4 loài, tế bào hình cầu, hình ống, sinh sản

theo lối phân cắt tế bào, có hoặc không có khuẩn ty, không có khuẩn ty giả, không tạo váng, có 4-8 túi hình cầu, hình bầu dục, thành tế bào không chứa kitin (chitin)

Giống Schwanniomyces: 4 loài, tế bào hình bầu dục, hình cầu, hình kéo

dài, hình ống, nảy chồi nhiều phía, không có khuẩn ty và khuẩn ty giả, không tạo váng, có 1-2 bào tử túi hình quả hồ đào (walnut), sần sùi, chồi phân bào giảm nhiễm (meiosis), tất cả các loài đều có khả năng đồng hóa tinh bột tan

Giống Wikerhamia: 1 loài, tế bào hình bầu dục, hình kéo dài, hình ong hay

hình quả chanh châu Âu, nảy chồi theo 2 cực hay phân cắt chồi, không sinh khuẩn ty và khuẩn ty giả, không tạo váng, có 1-16 bào tử túi hình mũ (cap), sinh

Giống Wingea: 1 loài, tế bào hình cầu, hình elip, nảy chồi nhiều phía,

không có khuẩn ty và khuẩn ty giả, có hoặc không có khả năng tạo váng, có 1- 4 bào tử túi hình cầu dẹp-êlip hoặc hình thấu kính lồi [5]

Nhóm thứ 2: Nhóm nấm men giả thuộc bộ Ustilaginales

Gồm 2 giống:

Giống Leucosporidium: 6 loài, tế bào hình bầu dục, hình kéo dài, có nảy

chồi, có khuẩn ty thật nhiều loài có khuẩn ty giả, không tạo váng Khác với

Candida ở chỗ không phát triển được ở 370C, nhiều loài có khả năng sản sinh tinh bột, nhiều loài làm dịch hóa gelatin, có bào tử động

Giống Rhodosporidium: 4 loài, tế bào có hình cầu, hình bầu dục, hình kéo

dài, có nảy chồi, có khuẩn ty, không tạo váng, có hoặc không có khuẩn ty giả,

sinh sắc tố hồng, không lên men Khác với Rhodotorula ở chổ có bào tử động [6] Nhóm thứ 3: Nhóm nấm men giả thuộc họ Sporobolomycetaceae

Gồm 3 giống:

Giống Bullera: 3 loài, tế bào có hình cầu, hình bầu dục, có nảy chồi, không

có khuẩn ty và khuẩn ty giả, không tạo váng, không có bào tử động, có bào tử bắn với hình dạng đối xứng, có hoặc không sinh sắc tố carotenoit

Giống Sporidiobolus: 2 loài, tế bào hình bầu dục, hình kéo dài, hình ống,

có nảy chồi, có khuẩn ty, có tạo váng, có hoặc không có khuẩn ty giả, sinh sắc tố carotenoit, có bào tử bắn với hình dạng không đối xứng, có bào tử áo với thành dày màu nâu

Giống Sporobolomyces: 9 loài, tế bào hình bầu dục, hình kéo dài, có nảy

chồi, có hoặc không có khuẩn ty, khuẩn ty giả và váng, có bào tử bắn với hình dạng không đối xứng, nhiều loài sinh sắc tố carotenoit [6]

Nhóm thứ 4: Nhóm nấm men không sinh bào tử không thuộc họ

Sporobolomycetaceae:

Gồm 12 giống:

Giống Bretlanomyces: 7 loài, tế bào hình nhọn đầu (ogival), hình êlip, hình

cầu, hình kéo dài, nảy chồi nhiều phía, có khuẩn ty giả, không có khuẩn ty, có hoặc không có váng, không có bất kỳ bào tử nào, sản sinh acid acetic, kháng xicloheximit, sinh trưởng chậm

Giống Candida: 81 loài, tế bào hình cầu, hình bầu dục, hình kéo dài, nảy

chồi nhiều phía, có khuẩn ty giả, một số ít loài có khuẩn ty, có hoặc không có váng, một số ít loài có bào tử áo

Giống Cryptococcus: 17 loài, tế bào hình cầu, hình bầu dục, hình kéo dài,

nảy chồi nhiều phía, không có khuẩn ty, một ít loài tạo váng và có khuẩn ty giả, một số ít loài có bào tử áo, có hoặc không sinh sắc tố, tế bào của đa số các loài có bao nhầy (capsules)

Giống Kloeckera: 4 loài, tế bào có hình ong, hình bầu dục, hình kéo dài,

nảy chồi 2 cực, có hoặc không có khuẩn ty giả, không có khuẩn ty và không tạo váng Hoàn toàn có nhu cầu đối với inôzitol và pantotenat

Giống Oosporidium: 1 loài, tế bào có hình dạng thay đổi, nảy chồi nhiều

phía, có khuẩn ty giả, không có khuẩn ty, không tạo váng, có bào tử nội (endospores), có sinh sắc tố Tế bào thường xếp thành chuỗi

Giống Pityrosporum: 3 loài, tế bào hình chai, hình cầu, hình êlip, nảy chồi

theo 2 cực hoặc cắt phân chồi, một số ít loài có khuẩn ty và khuẩn ty giả, không tạo váng, không có bất kỳ loại bào tử nào, sinh trưởng cần lipid

Giống Phodotorula: 9 loài, hình cầu, hình bầu dục, hình kéo dài, nảy chồi

nhiều phía, một số ít loài có khuẩn ty và khuẩn ty giả, không tạo váng, có sắc tố thuộc loại carotenoit tạo màu từ hồng đến da cam

Giống Schizoblastosporion: 1 loài, tế bào hình êlip, hình ống, hình chai,

nảy chồi theo 2 cực hoặc phân cắt chồi, có hoặc không có khuẩn ty giả, không có khuẩn ty, không tạo váng, không có bất kỳ bào tử nào

Giống Sterigmatomyces: 3 loài, tế bào hình cầu, hình bầu dục, sinh sản

bằng bào tử trần (conidia) trên những cuống mọc từ tế bào mẹ, tạo váng, không có khuẩn ty và khuẩn ty giả

Giống Torulopsis: 36 loài, tế bào hình cầu, hình bầu dục, hình kéo dài, nảy

chồi nhiều phía, một số ít loài có khuẩn ty giả và tạo váng, không có khuẩn ty, không có bất kỳ loại bào tử nào

Giống Trichosporon: 8 loài, tế bào có hình dạng thay đổi, có khuẩn ty,

khuẩn ty giả, có hoặc không có váng, có bào tử đốt, một số loài có bào tử vô tính

Giống Trigonopsis: 1 loài, tế bào hình tam giác và nảy chồi ở đỉnh, có tạo

váng, không có khuẩn ty và khuẩn ty giả, không có bất kỳ bào tử nào [6]

CHƯƠNG 2: ỨNG DỤNG CỦA NẤM MEN TRONG CÔNG NGHIỆP

CHẾ TẠO ĐỒ UỐNG LÊN MEN

Hiện nay các loại đồ uống lên men trên thế giới rất phong phú và đa dạng Dựa vào nồng độ rượu, người ta chia đồ uống lên men thành 2 nhóm: đồ uống có độ rượu nhẹ và đồ uống có độ rượu cao [8]

2.1 Đồ uống có độ rượu nhẹ

Tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu chế biến mà ta có đồ uống từ tinh bột và đồ uống từ trái cây

2.1.1 Đồ uống từ tinh bột

2.1.1.1 Bia

Bia là loại thức uống có độ rượu nhẹ và có tính giải khát cao, được nhiều người ưa chuộng Bia có từ hàng ngàn năm trước công nguyên và hiện nay không

nước nào trên thế giới là không sản xuất hoặc tiêu thụ bia

Bia được sản xuất từ malt hoặc kết hợp với các nguyên liệu có chứa tinh bột (không phải là malt), hoa houblon và nước

Thành phần của bia gồm có 80-90% nước; 1,5-7% cồn; 3-10% chất hòa

glucose và một ít pentose, các protein và sản phẩm thủy phân của nó (anbumin, pepton, các acid amin), các chất khoáng (muối kali, natri, phospho, canxi,

đắng, chất thơm của hoa houblon [32]

Sơ đồ 2.1 Công nghệ sản xuất bia (theo Lương Đức Phẩm, năm 2001)

Bã dùng chăn nuôi

Nấu với hoa Làm lạnh

Đóng chai hoặc lon

Bia chai hoặc bia lon

Bia hơi thành phẩm Lắng cặn

2.1.1.2 Sản phẩm trên thế giới

Nước uống có cồn-Bubju của Triều Tiên [23]

Nguyên liệu: gạo 25%, gạo nếp 11%, nước 60%, Nuruk 2%, koji 2%

Quy trình sản xuất:

Đặc tính vật lý: dạng dung dịch, màu trắng, có cồn

Đặc tính hóa học: cồn etylic 16%

Vi sinh vật chủ yếu: Saccharomyces sp

Sản xuất theo qui mô công nghiệp

Bouza một loại đồ uống ở Ai Cập được chế biến từ lúa mì Loại đồ uống

này có vị chua và có thành phần rượu 4-5% v/v Thổ Nhĩ Kỳ và một số nước khác có sản phẩm Bouza là một loại nước uống lên men, được chế biến từ lúa mì, có hàm lượng rượu thấp (0,5-1,2 % khối lượng) với độ chua 1,3 độ Sản phẩm này có màu trắng đục, vị chua ngọt đặc trưng do kết quả của kiểu lên men hỗn hợp giữa lên men rượu và lên men lactic [8]

Ở Nga có Kvass là loại nước uống truyền thống làm từ malt đại mạch,

malt lúa mạch đen, bột mì và thường bổ sung bạc hà Đây là loại thức uống lên men hỗn hợp cả lên men rượu và lên men lactic Kvass có nhiều loại với thành phần trung bình như sau: nồng độ chất khô (xác định bằng sacaromet) 5-6%; độ

chua 2-3 độ; hàm lượng rượu etylic 0,3-0,5% v/v [8]

Ở Châu Mỹ La Tinh có nhiều thức uống chế biến từ ngô và ngô nảy mầm

như Chicha, Tesquino Những sản phẩm lên men từ ngô này có vị chua và có

chứa 2-4% rượu etanol [8]

Ở Châu Á có một loạt các sản phẩm lên men rượu từ gạo như Sakê (Nhật Bản), Basi (Philippine), Shaosing chu (Trung Quốc), Tapeketan (Inđônêxia), Pachwai (Ấn Độ)

Sakê là loại thức uống đặc trưng của văn hóa Nhật Bản Rượu Sakê quý nhất là Ghiugiô, có hương vị thơm thoảng như táo, chuối, dứa Trước đây Ghiugiô sản xuất ít thường được sử dụng trong những đợt thi nếm Ngày nay do cạnh tranh với bia, rượu vang, Ghiugiô được sản xuất nhiều hơn, với hương vị đặc biệt rượu Sakê đã trở nên nổi tiếng trên thế giới, trong khu vực là một biểu tượng của đời sống văn hóa tương đối cầu kỳ nhưng tinh tế của người Nhật [66]

2.1.2 Đồ uống từ trái cây

2.1.2.1 Rượu vang [4] [9] [30]

Rượu vang (vin, wine) đúng nghĩa là rượu lên men không cất từ nước ép quả nho Gần đây người ta mở rộng khái niệm rượu vang để chỉ cả các loại rượu hoa quả khác (không cất) [4] Rượu vang thường có độ rượu 9-14%

Đặc điểm nước quả và các yêu cầu về nguyên liệu làm rượu vang

Nguyên liệu làm rượu vang là các loại quả Quả chín sau khi thu hoạch chọn loại quả tươi, chất lượng tốt đem ép lấy nước hoặc ngâm với đường để thu dịch nước quả dùng cho lên men

Tất cả các loại quả đều có đường, nhiều vitamin, nhiều acid hữu cơ, trong đó có nhiều vitamin C, có đầy đủ chất khoáng và một lượng protein đáng kể Ngoài ra, nước quả còn có chứa tanin, pectin Trong các loại quả dùng làm rượu vang trước hết phải kể là nho, dưa, mơ, dâu, mận, táo…

Các chủng nấm men trong sản xuất rượu vang

Trong quá trình sản xuất rượu vang, người ta ít dùng chủng nấm men dại sẵn có trong nguyên liệu mà thường dùng các chủng nấm men thuần chủng bởi chúng có ưu điểm hơn chỗ: chất lượng lên men cao, tạo hàm lượng đường sót ít, khả năng kết lắng tốt, làm trong dịch rượu nhanh, chịu được độ rượu cao và độ acid của môi trường, tạo được hương vị thơm ngon tinh khiết Các chủng nấm men thường dùng trong rượu vang là:

¾ Saccharomyces vini: có khả năng kết lắng nhanh, sinh sản theo lối nảy

chồi, tạo thành bào tử, có khả năng khử đường sacarose thành fructose và glucose Tuy nhiên, giai đoạn cuối của quá trình lên men các tế bào

Saccharomyces vini bị già và chết nhanh

¾ Saccharomyces uvarum: khả năng sinh bào tử mạnh Chịu được độ cồn

12-13 độ trong dung dịch nước nho

¾ Saccharomyces oviformis: chịu đường cao, cồn cao, lên men kiệt đường

và tạo tới 18 độ cồn, có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau

Qua phân tích người ta nhận thấy để lên men nước quả không nên dùng một chủng đơn độc mà có thể phối hợp các chủng chịu cồn cao để có thể sử dụng triệt để đường trong dịch lên men và cho độ cồn cao

Lên men

Quá trình lên men được thực hiện qua hai giai đoạn: lên men chính và lên men phụ

¾ Lên men chính: tỷ lệ tiếp giống vào lên men chính là 3-10% Nhiệt độ

nhanh, rượu tăng chậm và chậm lại Dịch lên men chính thường đạt được 8-10% độ cồn

¾ Lên men phụ ở 15-180C trong 15-20 ngày Sau khi lên men phụ độ cồn

tách cặn và có thể hoàn thành sản phẩm hoặc tàng trữ tiếp Rượu vang càng tàng trữ lâu chất lượng càng được cải thiện và hương vị càng đậm đà

Phân loại rượu vang

Rượu vang được phân loại theo nhiều tiêu chí khác nhau như: theo nguồn nguyên liệu (vang dâu, vang nho, vang dứa…), hoặc theo độ rượu, hàm lượng đường, hàm lượng acid còn lại trong vang (vang ngọt, vang dịu, vang khô) hoặc theo màu sắc sản phẩm (vang đỏ, vang trắng, vang hồng…) Theo xu hướng chung, người ta chia thành hai loại vang chính là vang không ga (rượu cay, rượu nửa cay, rượu nửa ngọt, rượu nặng, rượu điểm tâm, rượu tạo hương) và rượu vang có ga (sâm banh, rượu vang bọt) [32]

Một số loại rượu vang tiêu biểu

Ở Việt Nam:

Ở Việt Nam có một số loại rượu vang như: vang Đà Lạt đỏ, vang Đà Lạt

trắng, vang Đà Lạt dâu tây, vang Thăng Long, vang dâu (Hà Nội) [60] [67] Sản phẩm ở nước ngoài:

Rượu trái cây của Philippine [23]

Nguyên liệu: có thể sử dụng nhiều loại trái cây khác nhau như táo, chuối, đào lộn hột,…100%, đường và giống vi sinh vật một lượng rất nhỏ

Quy trình sản xuất:

Trái cây tươi → rửa sạch → bóc vỏ → tách nước hay ép lấy dịch → cho thêm đường → thanh trùng hay đun sôi khoảng 1 giờ → làm lạnh ở nhiệt độ phòng → cho thêm giống vi sinh vật → lên men ở nhiệt độ phòng 3-4 ngày → lên

men phụ khoảng 2 năm → tách cặn → thanh trùng Pasteur → đóng chai → thành phẩm

Đặc tính vật lý: dạng lỏng, có cồn, chua và ngọt

Đặc tính hóa học: pH=4; độ acid 0,5-1%, cồn 12%

Giá trị dinh dưỡng: đường 10%

Sản xuất công nghiệp: 2000 lít/năm

Rượu Koha của New zealand [23]

Đặc tính vật lý: dạng lỏng, màu vàng ánh kim

Vi sinh vật chủ yếu: Saccharomyces cerevisiae R92

Thời gian bảo quản và sử dụng 2 năm ở điều kiện lạnh

2.1.2.2 Nước giải khát lên men

™ Định nghĩa: nước giải khát lên men thực chất là sản phẩm của quá

trình lên men rượu chưa kết thúc Đây là loại thức uống thơm ngon, bổ dưỡng, có

lợi cho sức khỏe người dùng, có tác dụng kích thích tiêu hóa [24]

™ Đặc điểm của nước giải khát lên men

Do là sản phẩm của quá trình lên men rượu chưa kết thúc nên các quá trình sinh học vẫn tiếp diễn; Sản phẩm không bảo quản được lâu dù ở nhiệt độ rất thấp (4°C); Nên sử dụng ngay trong ngày và uống khi còn tươi; Thành phần giàu dinh dưỡng, hương vị hài hòa đặc trưng, có tác dụng kích thích tiêu hóa

Nhìn chung, các loại nước giải khát lên men đều có đặc điểm tương đồng về hàm lượng như sau:

Nồng độ chất tan theo phần trăm trọng lượng là 5-8%; Nồng độ rượu theo phần trăm thể tích là: 0,5-1,5%V (nhẹ hơn rượu vang quả cỡ chục lần); Độ chua: 2-4 (số mol NaOH/100ml dịch lên men); Thời gian tàng trữ: 5-6 giờ; Thời gian bảo quản bình thường 2 ngày