khảo sát một số đặc tính azospirillum sp. và ảnh hưởng của chúng trên vài dạng cây trồng ngắn ngày

Việc sử dụng phân bón hóa học liên tục làm cho đất bị bạc màu và chua, vai trò của vi sinh vật đất giảm, chất lượng nông sản kém thậm chí gây ô nhiễm môi trường.. Trong khi đó, phân vi s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH AZOSPIRILLUM SP

VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG TRÊN VÀI DẠNG

CÂY TRỒNG NGẮN NGÀY

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến :

TS Trịnh Thị Hồng, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này

Quý thầy cô Khoa Sinh nói chung và Bộ môn Vi sinh nói riêng của Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt khóa học và giúp đỡ nhiệt tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận văn

Quý thầy cô và các bạn trong Bộ môn Vi sinh, Sinh lý Thực vật, Sinh hóa, Sinh học Phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên và Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực nghiệm

Gia đình ông Võ Văn Giúp và ông Nguyễn Ngọc Yên đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi thực hiện các thí nghiệm thực tiễn

Sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh An Giang, Ban Giám hiệu Trường Trung học Phổ thông Nguyễn Khuyến đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt khóa học

Và thật hạnh phúc biết bao khi trong cuộc sống, trong lao động và học tập luôn có sự chăm sóc, động viên, giúp đỡ của người thân, bạn bè Tôi luôn biết ơn

vì những tấm chân tình đó và gửi lời cảm ơn chân thành đến những người thân yêu của tôi – gia đình và bạn bè trong suốt thời gian qua

Nguyễn Thanh Đào

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn

Danh mục các ký hiệu, các chữ viếr tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Danh mục các đồ thị

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vai trò của đạm và tầm quan trọng của quá trình cố định đạm 4

1.1.1 Đạm trong cây và vai trò của đạm đối với đời sống của cây trồng 4

1.1.1.1 Tỷ lệ đạm và các dạng đạm trong cây 4

1.1.1.2 Vai trò của đạm đối với đời sống cây trồng 4

1.1.2 Tầm quan trọng của quá trình cố định đạm 7

1.1.2.1 Cố định đạm hóa học 7

1.1.2.2 Cố định đạm sinh học 9

1.2 Vi sinh vật cố định đạm và cơ chế của quá trình cố định đạm sinh học 10

1.2.1 Các loài vi sinh vật cố định đạm 10

1.2.1.1 Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do 10

1.2.1.2 Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh 10

1.2.1.3 Vi khuẩn cố định nitơ sống trên rễ hay trong rễ một số loài cỏ nhiệt đới 11

1.2.1.4 Đạm do vi sinh vật cố định được 11

1.2.2 Cơ chế của quá trình cố định đạm 11

1.3 Vi khuẩn Azospirillum 14

1.3.1 Đặc tính hình thái 14

1.3.2 Sự phân bố của Azospirillum trong đất 17

1.3.3Ảnh hưởng của Azospirillum đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật 18

1.3.3.1Ảnh hưởng nhiễm khuẩn đến sự phát triển bộ rễ 18

1.3.3.2Sự hình thành khuẩn lạc Azospirillum ở rễ 19

1.3.4Các cơ chế hoạt động của Azospirillum giúp tăng trưởng thực vật 21

1.3.4.1Sự cố định nitơ không khí của Azospirillum 21

1.3.4.2 Ảnh hưởng của hormon ngoại tiết Azospirillum lên sinh trưởng và phát triển ở thực vật 22

1.3.4.3 Azospirillum kích thích sự hấp thu các chất dinh dưỡng khoáng của thực vật 23

1.3.4.4Quan hệ giữa nitratreductase của cây chủ và vi khuẩn Azospirillum 24

1.4 Phân vi sinh vật 24

1.4.1 Định nghĩa 24

1.4.2 Phân loại 25

1.4.3 Mục tiêu của việc sử dụng phân vi sinh vật 26

1.4.4 Quy trình chung để sản xuất phân vi sinh vật từ vi khuẩn 26

1.4.5 Phân vi sinh từ Azospirillum 30

Chương 2 - VẬT LIỆU-NỘI DUNG-PHƯƠNG PHÁP 34

2.1 Vật liệu 35

2.1.1 Thiết bị và dụng cụ 35

2.1.2 Hóa chất và môi trường 35

2.1.3 Vật liệu thí nghiệm 39

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 40

2.2.1 Phân lập 40

2.2.2 Tuyển chọn chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm và sinh IAA tốt 41

2.2.3 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng được chọn 43

2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn 46

2.2.4.1 Chuẩn bị 46

2.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn trên cây mạ trong ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây lúa ngoài ruộng 47

2.2.5 Tạo chế phẩm “phân vi sinh” 52

2.2.5.1 Chuẩn bị 52

2.2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên cây lúa trong chậu và rau cải ngắn ngày 54

Chương 3 – KẾT QUẢ-THẢO LUẬN 57

3.1 Phân lập 58

3.2 Tuyển chọn chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm và sinh IAA tốt 61

3.2.1 Khả năng cố định đạm của 5 chủng A1 , A2 , A3 , A4 và A5 61

3.2.2Khả năng sinh IAA của 5 chủng A1 , A2 , A3 , A4 và A5 62

3.3 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng A2 và A3 65

3.3.1 Đặc điểm hình thái 65

3.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 66

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn 69

3.4.1 Thời gian thích hợp nhiễm dịch nuôi cấy vi khuẩn đạt hiệu quả 69

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy vi khuẩn trên cây mạ trong ống nghiệm, cây lúa trong chậu và cây lúa ngoài ruộng 71

3.4.2.1 Cây mạ trong ống nghiệm 71

3.4.2.2 Cây lúa trong chậu 76

3.4.2.3 Cây lúa ngoài ruộng 78

3.5 Tạo chế phẩm “phân vi sinh” 88

3.5.1 Chuẩn bị 88

3.5.1.1 Dịch nuôi cấy vi khuẩn 88

3.5.1.2 Chế phẩm “phân vi sinh” 95

3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên cây lúa trong chậu và rau cải ngắn ngày 97

3.5.2.1 Lúa trong chậu 97

3.5.2.2 Cải thìa 99

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 106

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc của 5 chủng trên môi trường NFb rắn có

bổ sung congo đỏ sau 5 ngày nuôi cấy 60

Bảng 3.2 Hàm lượng đạm của 5 chủng trong môi trường Dobereiner dịch thể 61 Bảng 3.3 Hàm lượng IAA trong dịch nuôi cấy (μg/ ml) theo thời gian 64

Bảng 3.4 Chiều cao trung bình cây lúa (mm) sau 7 ngày theo thời gian ngâm hạt 70

Bảng 3.5 Giá trị trung bình các lượng giá cây mạ sau 7 ngày cấy trong ống nghiệm của chủng A2 .73

Bảng 3.6 Giá trị trung bình các lượng giá cây mạ sau 7 ngày cấy trong ống nghiệm của chủng A3 .74

Bảng 3.7 Giá trị trung bình các lượng giá cây lúa trong chậu 77

Bảng 3.8 Chiều cao trung bình cây lúa ngoài ruộng (cm) của chủng A2 80

Bảng 3.9 Chiều cao trung bình cây lúa ngoài ruộng (cm) của chủng A3.81 Bảng 3.10 Số nhánh trung bình của cây lúa ngoài ruộng (nhánh/cây) vào thời điểm 45 ngày của chủng A2 và A3 83

Bảng 3.11 Ảnh hưởng A2 trên chỉ tiêu cây lúa vào thời điểm thu hoạch 85

Bảng 3.12 Ảnh hưởng A3 trên chỉ tiêu cây lúa vào thời điểm thu hoạch 86

Bảng 3.13 Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A2 theo thời gian 88

Bảng 3.14 Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A3 theo thời gian 89

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A2 và A3 dựa vào giá trị OD610nm 91

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của A2 và A3 dựa vào

giá trị OD610nm 93

Bảng 3.17 Mật độ tế bào A2 và A3 trong 1 gram chế phẩm theo thời

gian với sự thay đổi độ ẩm 95

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của NH3 lên sự gia tăng số lượng tế bào 96

Bảng 3.19 Sự biến đổi mật độ tế bào A2 và A3 theo thời gian 96

Bảng 3.20 Giá trị trung bình các lượng giá cây lúa trong chậu 98 Bảng 3.21 Số lá trung bình của cây cải thìa (lá/cây) 100 Bảng 3.22 Chiều cao trung bình của cây cải thìa (cm/cây) 102

Bảng 3.23 Giá trị trung bình các lượng giá cây cải thìa vào thời điểm thu

hoạch 104

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Phân lập Azospirillum từ đất vùng rễ lúa 58

Hình 3.2 Hình dạng khuẩn lạc của các chủng sau 5 ngày nuôi cấy trên

môi trường NFb rắn có bổ sung congo đỏ 59

Hình 3.3 Định tính IAA của các chủng thông qua thuốc thử Salkowski 62

Hình 3.4 Phản ứng màu IAA với thuốc thử Salkowski của các chủng

nuôi cấy 5 ngày 65

Hình 3.5 Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dịch thể - NFb

của chủng A2 vàA3 67

Hình 3.6 Khả năng sử dụng nguồn carbon trên môi trường dịch thể

Andrade của chủng A2 vàA3 68

Hình 3.7 Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn (cây mạ 7 ngày tuổi trên môi

trường MS) 72

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A2 và A3 dựa

vào chỉ thị màu bromothymol blue 92

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của A2 và A3 dựa vào chỉ

thị màu bromothymol blue 94

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

cây (mm) sau 7 ngày trồng lúa trong ống nghiệm 71

Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn trên chiều cao cây lúa ngoài

ruộng (cm/cây) của chủng A2 và A3 ……… 79

Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng của sự nhiễm khuẩn đến khả năng phân nhánh của

cây lúa ngoài ruộng (nhánh/cây) vào thời điểm 45 ngày của

chủng A2 và A3……… 82

Đồ thị 3.6 Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A2 theo thời gian 89

Đồ thị 3.7 Sự thay đổi mật độ tế bào của chủng A3 theo thời gian 90

Đồ thị 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A2 và A3 dựa

Đồ thị 3.11 Ảnh hưởng của chế phẩm “phân vi sinh” trên chiều cao cây

cải thìa (cm/cây) 103

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ

IAA : Indole-3-acetic acid

LSD (Least significant difference test) trắc nghiệm phân hạng các lô thí nghiệm MT1 : Môi trường vô đạm NFb

MT2 : Môi trường vô đạm NFb rắn có bổ sung congo đỏ

MT3 : Môi trường Dobereiner và cộng sự

MT4 : Môi trường Andrade

MT5 : Môi trường nuôi cấy thử khả năng khử nitrate

MT6 : Môi trường MS

MS : Murashige & Skoog

N : Đạm

NFb : nitrogen-fixing broth

OD (Optical Density) : Mật độ quang

PL : Phân loại a, b, c, … trong xử lý thống kê

TN : Thí nghiệm

MỞ ĐẦU

Đồng Bằng Sông Cửu Long là nơi cung cấp gạo lớn nhất nước, góp phần xuất khẩu gạo ra thế giới Thế nhưng hàng năm lũ lụt kéo về đã gây thiệt hại về người cũng như mùa màng Nhằm chăm lo đời sống cho người dân vùng lũ đồng thời vẫn đáp ứng đủ gạo cho nhu cầu tiêu dùng và xuất khẩu, chính quyền khu vực chỉ đạo bao đê một số vùng ngập lũ An Giang cũng không thuộc ngoại lệ Từ đó, đất không còn độ màu mỡ do phù sa mang lại Chính vì vậy, để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho cây trồng, đất phải thường xuyên được bón phân

Việc sử dụng phân bón hóa học liên tục làm cho đất bị bạc màu và chua, vai trò của vi sinh vật đất giảm, chất lượng nông sản kém thậm chí gây ô nhiễm môi trường Trong khi đó, phân vi sinh vật là loại sản phẩm chứa một hoặc nhiều chủng vi sinh vật sống, có ích đã được tuyển chọn mà hoạt động của chúng tạo nên trong đất trồng các chất dinh dưỡng hay các chất có hoạt tính kích thích sinh trưởng, tạo điều kiện nâng cao năng suất hoặc chất lượng nông sản, tăng độ màu mỡ cho đất Các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, vật nuôi, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản Hiện nay người ta đã nghiên cứu sản xuất phân vi sinh vật bao gồm phân bón vi sinh vật cố định đạm, phân bón vi sinh phân giải các hợp chất phospho khó tan, phân bón vi sinh vật phân giải cellulose, phân bón vi sinh vật quang hợp

Các loại phân đạm vi sinh hiện nay đều được sản xuất từ các loại vi khuẩn

cố định đạm như Azotobacter và Azospirillum Các vi khuẩn này phân bố nhiều

trong đất và quanh vùng rễ Ngoài khả năng cố định đạm chúng có thể tiết ra một số hoạt chất có tác dụng kích thích sinh trưởng ở thực vật đưa vào môi trường đất

Đáng chú ý là khả năng cố định đạm của Azospirillum được Beijerinck phát hiện

từ năm 1922, nhưng vai trò của nó trong hoạt động cố định đạm vùng rễ cây hòa thảo chỉ được biết đến vào những năm đầu của thập niên 70 nhờ việc tìm ra nơi

cư trú của chúng

Khi đánh giá những dữ liệu thu thập khắp thế giới hơn 30 năm qua ở đồng

ruộng thử nghiệm nhiễm Azospirillum trên các đối tượng cây trồng khác nhau,

người ta kết luận rằng các vi khuẩn này có khả năng làm tăng năng suất trên những loại đất trồng khác nhau và ở những vùng khí hậu khác nhau

Ở Việt Nam, trong thời gian qua, người ta đã đề cập tới sự tồn tại, phân

lập, xác định đặc điểm của Azospirillum trong đất và rễ lúa khu vực ngoại thành Hà Nội và nghiên cứu khả năng cố định nitơ của một số chủng Azospirillum sp

trong điều kiện hội sinh với mầm lúa [8]

Được sự động viên và giúp đỡ nhiệt tình của TS Trịnh Thị Hồng, tôi đã có

cơ hội thực hiện đề tài này với lòng mong mỏi đóng góp phần nào cho công cuộc xây dựng quê hương An Giang giàu đẹp Nội dung của đề tài bao gồm :

- Phân lập và tuyển chọn Azospirillum có khả năng cố định đạm và sinh

IAA tốt

- Tìm hiểu một số đặc tính sinh lý, sinh hóa

- Bước đầu tạo chế phẩm “phân vi sinh” bằng cách cố định trên chất mang là than bùn

- Sơ bộ ứng dụng chế phẩâm “phân vi sinh” trên cây trồng ngắn ngày (lúa nước và cải thìa) trong phòng thí nghiệm và ngoài thực tiễn với quy mô nhỏ

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vai trò của đạm và tầm quan trọng của quá trình cố định đạm

1.1.1 Đạm trong cây và vai trò của đạm đối với đời sống của cây trồng 1.1.1.1 Tỷ lệ đạm và các dạng đạm trong cây

Tỷ lệ đạm trong cây biểu hiện từ 1 - 6% trọng lượng chất khô Tỷ lệ đạm trong bộ phận non cao hơn bộ phận già Trong thời kỳ hình thành quả, đạm tập trung chủ yếu ở các cơ quan sinh sản

Trong cây, đạm chủ yếu có trong thành phần protein và chiếm 15 - 17% Trong điều kiện bình thường, người ta tính được hàm lượng protein thô trong cây thông qua định lượng nitơ tổng số

Đạm trong cây còn tồn tại dưới dạng hợp chất đạm hữu cơ hòa tan (các amin và amid) Một lượng rất nhỏ đạm và trong điều kiện dinh dưỡng đạm không bình thường, đạm tồn tại trong cây dưới dạng NH4+ và NO3-

Tỷ lệ giữa đạm hữu cơ hòa tan và đạm vô cơ thể hiện tình trạng tổng hợp hữu cơ trong cây Thường khi thiếu glucid hoặc thiếu các điều kiện cần thiết cho việc khử nitrate, cho quá trình amin hóa thì tỷ lệ trên giảm xuống

Đạm vô cơ trong cây tồn tại chủ yếu dưới dạng NO3- vì sự tích trữ lượng

NH4+ nhiều làm cho cây dễ bị ngộ độc

1.1.1.2 Vai trò của đạm đối với đời sống cây trồng

Đạm là yếu tố quan trọng hàng đầu đối với cơ thể sống vì nó là thành phần cơ bản của protein - chất cơ bản biểu hiện sự sống

Đạm nằm trong nhiều hợp chất cơ bản cần thiết cho sự phát triển của cây như diệp lục và các enzyme, các base A,T,G,X - thành phần cơ bản của các nucleic acid, trong các DNA và RNA của tế bào - nơi cư trú của các thông tin di truyền, đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp protein

Do vậy đạm là yếu tố cơ bản của quá trình đồng hóa carbon, kích thích sự phát triển của bộ rễ và kích thích việc hút các yếu tố dinh dưỡng khác

Cây trồng được bón đủ đạm biểu hiện ở lá có màu xanh thẫm, sinh trưởng khỏe mạnh, chồi búp phát triển nhanh, năng suất cao

Bón thừa đạm, lá có màu xanh tối, thân mềm, tỷ lệ nước cao nên dễ bị sâu bệnh Tình hình lốp đổ của các giống lúa thân dài cũng là hậu quả của việc bón thừa đạm Ngoài ra, bón thừa đạm sinh trưởng của cây bị kéo dài, chín muộn, chất lượng nông sản kém, nitrate bị kéo xuống làm ô nhiễm mạch nước ngầm

Cây thiếu đạm, lá có màu vàng, sinh trưởng và phát triển kém, còi cọc có khi bị thui chột thậm chí rút ngắn chu kỳ sống, năng suất thấp

y Tác dụng của đạm đối với cây lúa [10]

Đạm là yếu tố dinh dưỡng chủ yếu, nó có ảnh hưởng nhiều đến thu hoạch

vì chỉ khi đủ đạm các chất khác mới phát huy tác dụng Đạm kết hợp với các chất đường, bột ở lá tạo ra amino acid rồi từ đó hình thành nên các loại protein cần thiết cho đời sống cây lúa Đạm là một thành phần cấu tạo của chất diệp lục thúc đẩy quá trình quang hợp Nếu thiếu đạm, trong cây sẽ có nhiều đạm tự do, cây lúa sẽ có sức sống yếu dễ bị sâu bệnh phá hại

Cây lúa hút đạm ở hai dạng : amôn (NH4+) và nitrate (NO3-) Trong ruộng ngập nước lúa hút amôn nhiều hơn, còn trong ruộng cạn nước lúa hút nitrate nhiều hơn

Đạm amôn hút vào rễ có thể kết hợp ngay với các loại acid hữu cơ ở đó tạo thành các dạng amino acid và sẽ được chuyển lên lá để tổng hợp protein

Các giống lúa Indica thân cao hút đạm ít hơn so với giống lúa Japonica

thân thấp

Yêu cầu về đạm của cây lúa thay đổi trong quá trình sinh trưởng của nó Lúa cần đạm nhiều trong thời kỳ đẻ nhánh, nhất là khi đẻ rộ và giảm dần khi lúa đứng cái thôi đẻ nhánh Lúa cũng cần nhiều đạm trong thời kỳ phân hóa đòng và phát triển đòng thành bông, thời kỳ hình thành các bộ phận sinh sản Các giống

lúa thân cao thường có hai đỉnh cao về nhu cầu đạm đó là lúc đẻ nhánh và lúc sắp trổ bông Còn các giống lúa thân thấp thì thường có nhu cầu về đạm tăng đều suốt thời kỳ đẻ nhánh đến lúc trổ bông, chỉ sau khi trổ nhu cầu về đạm mới giảm xuống

Vì vậy trong kỹ thuật bón phân cần cung cấp đủ đạm cho lúa đẻ nhánh và làm đòng, nhưng nếu thừa đạm cũng không tốt vì lúa thừa đạm dễ bị lốp đổ, giảm sức chống chịu với sâu bệnh và các điều kiện không thuận lợi khác Kết hợp bón phân hữu cơ với phân đạm sẽ dễ thỏa mãn các yêu cầu về đạm Bón phân đạm viên một lần sau khi cấy cũng sẽ cung cấp, điều hòa đạm cho cây trong suốt thời gian sinh trưởng mà không dẫn đến hiện tượng thừa đạm tạm thời rồi lại thiếu đạm như hiện tượng bón vãi nhiều lần

y Tác dụng của đạm đối với rau [25]

Cây trồng hấp thu một lượng lớn đạm từ đất thông qua hệ thống rễ Đối với dưỡng chất NH4+, khi cây trồng hấp thu vượt trội NO3-, dẫn đến sự phóng thích H+ từ rễ và sẽ tạo acid hóa môi trường bên ngoài Ngược lại, đối với dưỡng chất NO3-, khi cây trồng hút NH4+ trội hơn sẽ làm cho môi trường kiềm hơn

Nhiều nghiên cứu cho thấy cây trồng hấp thu NH4+ nhanh hơn NO3- trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, trong khi cây hấp thu NO3- nhiều hơn NH4+ khi cây ở giai đoạn sinh trưởng sinh thực Khi NH3 tự do tích lũy trong cây với lượng lớn sẽ gây ngộ độc cho cây nên khi được hút vào thường bị đồng hóa ngay bằng nhiều cách

Trước hết NH3 được đồng hóa bằng con đường amin hóa trực tiếp các cetoacid để tạo thành các amino acid như : amin hóa α-cetoglutaric để tạo thành glutamic acid, amin hóa oxaloacetic acid để tạo thành aspatic acid, amoniac cũng có thể kết hợp ngay với pyruvic acid để tạo thành alanin … Các loại amino acid tham gia vào các quá trình đồng hóa sơ cấp amoniac như α-cetoglutaric acid,

Nitrate có thể bị khử hoàn toàn ở rễ thành dạng amôn, là dạng đạm tham gia trực tiếp trong quá trình tạo amino acid Nếu bón nhiều đạm mà thiếu lân hay không bón lân, kali cân đối, đặc biệt là thiếu nguyên tố vi lượng Mo thì quá trình khử nitrate sẽ bị chậm lại và dẫn đến tình trạng tồn dư nitrate trong cây Lượng nitrate tồn dư trong cây còn do bón cho cây cận ngày thu hoạch làm hàm lượng nitrate không đủ thời gian để khử thành amôn, tạo thành amino acid và protid có ích cho cây

1.1.2 Tầm quan trọng của quá trình cố định đạm

1.1.2.1 Cố định đạm hóa học

Trong không khí, phân tử nitơ thường tồn tại ở trạng thái liên kết hai nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ nối ba bền vững (N≡N) Năng lượng cần cho sự phá vỡ liên kết này khoảng 225kcal nên cây trồng (cũng như các loài động vật) không có khả năng đồng hóa nguồn nitơ này Vì vậy việc nghiên cứu phá vỡ các liên kết này để tạo ra dạng nitơ dễ hấp thu đối với cây xanh là hết sức cần thiết [3]

Năm 1905 lần đầu tiên con người tìm được phương pháp phá vỡ và liên kết với CaC 2 để tạo ra một dạng phân đạm hóa học đầu tiên là CaCN 2

Muốn thực hiện phản ứng người ta duy trì một nhiệt độ cao từ 1000 –

1100oC :

Ít lâu sau các nhà khoa học Nauy lại tìm được cách liên kết N2 với O2 để tạo thành một dạng phân đạm hóa học khác (nitrate) phản ứng này cũng đòi hỏi nhiệt độ cao đến 4000oC :

Năm 1908 nhà khoa học Đức Ga-be đã tìm được phương pháp liên kết N2với H2 để tạo thành NH3 Phản ứng này không những đòi hỏi nhiệt độ cao (600oC), áp suất cao (1000atm) mà còn đòi hỏi có mặt một số chất xúc tác đắt tiền (Os, Ru)

Từ đó đến nay ngành công nghiệp hóa học đã có những tiến bộ rất lớn Người ta sản xuất rộng rãi nhiều loại phân đạm hóa học khác nhau với sản lượng ngày càng tăng Nếu như năm 1913 toàn thế giới sản xuất được 0,51 triệu tấn phân đạm thì đến năm 1964 con số này đã tăng lên 29 lần (14,5 triệu tấn) trong khi đó phân kali chỉ tăng 8,4 lần, phân phospho tăng có 5,8 lần [3]

Dù sao thì phân đạm hóa học trên toàn thế giới cũng bù đắp được một phần nhỏ số lượng đạm trong đất bị lấy đi hàng năm Có một thống kê cho biết hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới lấy đi khỏi đất khoảng 100 -

110 triệu tấn đạm, con số này vượt đến bảy lần so với phân đạm hóa học sản xuất ra ở các nước gộp lại hàng năm Phân đạm có tác dụng rất lớn đến mùa màng, ví dụ : bón 1kg đạm thu hoạch thêm được khoảng 10 -20kg thóc, 15 - 20kg ngô hoặc 15 - 40kg cỏ khô (G.Colarva P.Greenland, 1963)

1000 o C CaC 2 + N 2 CaCN 2 + C

Khó khăn chủ yếu làm cản trở việc mở rộng nhanh chóng hơn nữa việc sản xuất phân đạm hóa học là vì điều kiện để phá vỡ các liên kết trong phân tử nitơ không phải là đơn giản (cần nhiệt độ cao, áp suất cao, chất xúc tác đắt tiền)

1.1.2.2 Cố định đạm sinh học

Tương tự như quá trình cố định đạm hóa học, quá trình cố định đạm sinh học cũng là quá trình phá vỡ các liên kết trong phân tử nitơ không khí để tạo thành các dạng nitơ dễ hấp thu cho cây trồng Nhưng ở quá trình này việc phá vỡ các liên kết của phân tử nitơ xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường Chính vì vậy mà vai trò của quá trình cố định đạm sinh học có ý nghĩa hết sức lớn lao đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền công nghiệp phân đạm chưa phát triển

Quá trình cố định đạm sinh học là một giai đoạn của chu trình tuần hoàn nitơ trong tự nhiên, được thực hiện bởi các nhóm vi sinh vật như là: vi khuẩn, tảo lam, xạ khuẩn

Các loại vi sinh vật này có thể sống độc lập như những vi sinh vật sống tự

do hoặc có thể quan hệ ở những mức độ khác nhau với vi khuẩn, thực vật và động vật khác Mối quan hệ này thay đổi từ quan hệ hội sinh kết hợp đến quan hệ cộng sinh bắt buộc Trong đó thực vật chủ là vi sinh vật quan hệ trên mức độ phân tử và chức năng sinh lý chung Trung tâm của cả hệ thống này là vi khuẩn

Procaryote cố định đạm chứa phức hợp enzyme nitrogenase (đảm nhiệm sự

chuyển hóa N2 thành NH3) Chỉ vài loài Procaryote xác định mới có khả năng cố

định đạm Thực vật (ngoại trừ các loại tảo và các thực vật cộng sinh) không có

khả năng cố định đạm mà chỉ có những loài Procaryote sống chung với thực vật

mới có khả năng cố định đạm

Quá trình cố định đạm sinh học hàng năm cung cấp cho đất từ 100 - 180 triệu tấn đạm và đóng góp 65% lượng nitơ được sử dụng trong nông nghiệp

(Burris và Robert, 1993) Phần lớn lượng nitơ này được tạo ra qua quá trình cố định đạm cộng sinh, không cộng sinh và cố định đạm kết hợp

1.2 Vi sinh vật cố định đạm và cơ chế của quá trình cố định đạm sinh học 1.2.1 Các loài vi sinh vật cố định đạm [3]

1.2.1.1 Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do

Từ năm 1893 Winogradski đã phân lập được vi khuẩn kị khí cố định nitơ

Clostridium pasteurianum và tiếp đó năm 1901 Beijerink phân lập được 2 loài vi khuẩn hiếu khí cố định nitơ là Azotobacter chroococum và A agilis

Cho đến nay người ta đã phát hiện được rất nhiều loài vi khuẩn cố định

nitơ sống tự do Chúng có thể là hiếu khí (Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia, Derxia), kị khí không bắt buộc (Aerobacter, Klebsiella, Bacillus polymyxa, B macerrans), kị khí bắt buộc (nhiều loài Clostridium, Desulphovibri, Dsulphotomaculum )

Một số loài vi khuẩn lam (như Aulosia fertilissima, Tolipothrix tenuis, Nostoc sp.) cũng có khả năng cố định nitơ

1.2.1.2 Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh

Năm 1866, H.Hellriegel và Hwilfath phát hiện ra khả năng cố định nitơ của các cây họ Đậu Năm 1888, M.W.Beijerinck phân lập được những vi khuẩn nốt sần đầu tiên từ rễ các cây họ Đậu Năm 1889, B.Frank đặt tên cho vi khuẩn

nốt sần là Rhizobium

Trong nhiều năm qua người ta đã phát hiện thấy một số loài vi sinh vật cố định nitơ có khả năng cộng sinh với rất nhiều loại cây không thuộc họ đậu Các cây này thuộc về các chi thực vật khác nhau Các vi sinh vật này thuộc các nhóm

như xạ khuẩn (Frankia), vi khuẩn, vi khuẩn lam

1.2.1.3 Vi khuẩn cố định nitơ sống trên rễ hay trong rễ một số loài cỏ

Các loài vi khuẩn được phát hiện gồm có: Azotobacter, Beijerinckia, Dexia, và một số vi khuẩn hình xoắn là Azospirillum [4]

1.2.1.4 Đạm do vi sinh vật cố định được

Đối với vi khuẩn nốt sần cộng sinh với cây bộ đậu lượng đạm cố định được phụ thuộc vào loài, vào cây chủ, biến động trong khoảng 30 - 50 kg/ha/năm (đối

với cây Phaseolus Vulgaris) [4] Tổng số đạm hàng năm do vi khuẩn cộng sinh

cây bộ đậu cố định được vào khoảng 50 - 600kg/ha/năm [11]

Đối với một số loài vi khuẩn cộng sinh với cây không thuộc bộ đậu như

Azospirillum cộng sinh với cỏ Pangola cố định hàng năm từ 5 - 30kg đạm/ha Các

vi sinh vật sống tự do trong đất (Azotobacter, Clostridium, Bluegreenalgae ) cũng

cung cấp hàng năm cho mỗi hecta đất khoảng 5 - 20kg đạm Gặp điều kiện thuận lợi tảo lam có thể cung cấp mỗi hecta đến 50kg đạm [19]

1.2.2 Cơ chế của quá trình cố định đạm

Cơ chế của quá trình cố định đạm được Winogradski và về sau được nhiều tác giả nghiên cứu, nhưng cho tới nay vẫn còn có chỗ chưa giải quyết được hoàn toàn Cái khó nhất lúc đầu gặp phải là phân tử nitơ có sức “trơ” rất cao, lực “ì” của nó là do hai nguyên tử nitơ (N≡N) được liên kết với nhau bằng 3 mối liên kết bền vững Trong công nghiệp phân đạm muốn phá vỡ các liên kết này để tạo ra

các dạng đạm cho cây hấp thu được cần phải dùng nhiệt độ cao, áp suất cao Theo tính toán, muốn tổng hợp ra một tấn NH3 từ N2 và H2 cần năng lượng tương đương với năng lượng sinh ra do đốt cháy 5 tấn than đá Trong khi đó, ở tế bào vi sinh vật, quá trình phá các lực “ì” diễn ra ở nhiệt độ và áp suất bình thường, đó là

vì tế bào vi sinh vật có hệ enzyme nitrogenase Ở vi khuẩn đã biết khá rõ bản đồ gen nif [3], [22] Chính hệ enzyme này đã xúc tác làm cho nitơ của khí quyển

liên kết với hydro sinh ra trong quá trình trao đổi chất nội bào Đây là một ưu điểm của sản xuất phân vi sinh

Lúc đầu khi người ta chưa biết rằng chỉ ở điều kiện áp suất khí nitơ rất cao (1051atm) thì N2 mới có khả năng kết hợp với nước, nên lưu hành giả thuyết “liên kết thuỷ phân” để giải thích sự biến đổi N2 thành hydroxylamin hoặc nitrite amon:

Cơ chế của quá trình cố định đạm được tóm tắt bằng sơ đồ 1.1 :

Con đường khử Con đường Oxy hóa

Giả thuyết khác cho rằng trong tế bào Azotobacter đã thực hiện một phản

ứng, mà N2 được khử bằng hydro hoạt tính để biến thành NH3 Giả thuyết này dựa trên cơ sở khi nuôi cấy vi sinh vật cố định đạm người ta đã phát hiện NH3trong môi trường

Có hai con đường chủ yếu (con đường oxy hoá và con đường khử) biến nitơ phân tử thành NH3 (Kretovich V.P.1964; 1971)

Trong thực nghiệm, người ta phát hiện những hợp chất loại khử trong môi trường nuôi cấy và trong dịch chiết vô bào của vi khuẩn cố định đạm như phát hiện NH3 đánh dấu khi dùng N18 và N15, thấy hydroxylamin (NH2OH) ở

Azotobacter vinelandii, nhờ phương pháp đồng vị phóng xạ, phát hiện thấy

hydrazin và hai hợp chất này có thể kết hợp với các ketoaxit để thành các amino acid (Bem den A.A, 1966) Trong môi trường có vi sinh vật cố định đạm thế oxy hoá khử ở mức thấp, hiệu suất năng lượng của quá trình cố định đạm ở điều kiện

kỵ khí cao hơn ở điều kiện hiếu khí Tất cả những điều đó cho phép chúng ta kết luận rằng con đường khử N2 thành NH3 ở vi sinh vật cố định đạm có nhiều cơ sở vững chắc hơn

Quá trình cố định nitơ phân tử là một quá trình khử liên tục N2, sản phẩm đầu tiên có thể thu được là NH3 nếu công nhận trong quá trình này có sự vận chuyển 2 điện tử thì có thể dự đoán sản phẩm của quá trình này là diimit và hydrazin

Nitrogenase là tổ hợp nhiều enzyme chứa sắt không liên kết với các nhóm -hem và nhóm -SH, nó không chỉ khử nitơ phân tử mà còn khử acetylen

N 2 N≡N

ATP 2[H]

HN=NH diimit

ATP 22[H]

ATP 2[H]

H 2 N – NH 2

hydrazin

2NH 3 NH 3

(HC≡CH) Khả năng khử acetylen thấy ở nốt sần cây họ Đậu và ở những vi sinh

vật cố định nitơ kị khí sống tự do trong đất

Dịch vô bào Clostridium có khả năng cố định nitơ phân tử, lại có khả năng

khử acetylen khi có ATP, feredoxin và ion Mg+ Điều đó, một mặt mở ra triển vọng mới nghiên cứu quá trình cố định nitơ phân tử và các thành phần của nó, mặt khác cho phép phát hiện những sản phẩm trung gian của các khâu cố định nitơ

1.3 Vi khuẩn Azospirillum

1.3.1 Đặc tính hình thái

Azospirillum được phân lập lần đầu tiên vào năm 1925 từ đất pha cát

nghèo nitơ ở Hà Lan Sau đó vi khuẩn này cũng được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau : đất và rễ của nhiều loài cỏ nhiệt đới [17]

Hội nghị quốc tế lần thứ nhất về cố định nitơ năm 1974 tại Phần lan Dobereiner và Day là những tác giả đầu tiên đã thông báo về sự hội sinh giữa

Azospirillum với rễ các cây Hòa thảo và những cây khác trồng ở vùng nhiệt đới

Từ đó đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này, trong đó có nhiều thông tin về khả năng tăng năng suất các cây Hòa thảo do nhiễm

Azospirillum [1]

Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn dị dưỡng carbon, vi hiếu khí, tế bào hình

que hơi cong, kích thước tế bào (0,9 -1,2μm), tế bào di động nhờ tiên mao đơn ở một đầu, trong tế bào có những chuỗi hạt poly-β-hydroxybutyrate (PHB) [23]

Trong môi trường dịch thể tế bào có một tiên mao đơn ở cực còn khi nuôi một vài loài trên môi trường rắn ở 30oC có thêm vài tiên mao mọc ra bên cạnh

tiên mao đơn [23] Các khuẩn lạc của Azospirillum tạo màu hồng nhạt hay màu

hồng đậm trên môi trường thạch khoai tây [11], [23] Nhiệt độ tối ưu các loài

Azospirillum vào khoảng 34 - 37oC Một vài chủng phát triển tốt ở pH 7, một vài

chủng khác thì phát triển tốt trên môi trường acid Chúng cố định nitơ trong không khí trong điều kiện vi hiếu khí Vài chủng có thể khử NO3- thành NO2- hoặc N2O và N2 [23]

Nguồn carbon được hầu hết các loài sử dụng thường là các muối của acid

hữu cơ như malate, lactate, succinate, pyruvate, một vài carbon hydrate cũng được sử dụng làm nguồn carbon chính Một vài chủng cần biotin Các loài này có thể sống tự do trong đất hoặc sống cộng sinh với rễ của các loại ngũ cốc, cỏ… nhưng không tạo nốt sần [23]

Môi trường phân lập Azospirillum là môi trường vô đạm (NFb) Trong môi trường NFb bán lỏng các tế bào của Azospirillum tạo dạng đĩa sinh trưởng sau 48-

96 giờ, dạng đĩa này vận động tới sát bề mặt môi trường và sau đó lan toả ra Đó là phản ứng vi hiếu khí Còn trên môi trường NFb rắn các khuẩn lạc của

Azospirillum thường là tròn, khô, đục, rìa trơn hoặc nhăn Trên môi trường NFb bổ sung thêm congo đỏ rất dễ phát hiện các khuẩn lạc Azospirillum vì chúng có

đặc điểm là bắt màu với congo đỏ trong khi đó khuẩn lạc của các loài vi khuẩn cố định đạm khác không bắt màu với congo đỏ [10]

Người ta đã phân lập và định danh được 5 loài đó là: A.lipoferum, A.brasilense (Tarrand et al., 1978), A.amazonense (Magalhas et al., 1983), A.hapraeferans (Reinhold et al., 1987), A.irakense (Khammas et al., 1989) [23], [29] Gần đây nhất đã phân lập thêm được 2 loài đó là : A.largomobile (Ben Dekhil et al., 1997) sau đó loài này được đặt lại tên là : A.lagimobile (Sly and Stackebrandt, 1999) và A.dobereinerae [21], [23]

Bảng 1.1 Các đặc điểm phân loại của các loài Azospirillum [23]

Ghi chú : + : hơn 90% các chủng dương tính

- Bề rộng tế bào (µm) 0,8-1,0 1,0 -1,2 0,7-1,4 0,6-0,9 1,0 -1,5

- Sự sắp xếp của tiên

mao trên tế bào trong

môi trường dịch thể

+ Một đến ba tiên mao ở

một hoặc hai cực

- - - - -

- Vài tiên mao mọc ra hai

bên khi phát triển trên

môi trường agar

- + + +

- Nhiệt độ tối ưu (tp) 35oC 37oC 41oC 30-33oC 37oC -Sinh trưởng trong môi

trường bán lỏng vô đạm

chứa nguồn C duy nhất

- Khoảng pH tối ưu 5,7-6,5 6,0 -7,3 6,8 - 8,0 5,5 – 8,5 5,7 - 6,8

− : hơn 90% các chủng âm tính

± : đa số các chủng dương tính, vài chủng âm tính

d : 11 - 89 % các chủng dương tính

1.3.2 Sự phân bố của Azospirillum trong đất

Nhóm Azospirillum có biên độ sinh thái rộng, chúng phân bố hầu hết trong

các loại đất : từ các vùng đất nông nghiệp cho đến các vùng đất hoang hoá nghèo

chất dinh dưỡng, số lượng của Azospirillum trong đất nông nghiệp thường cao hơn

đất hoang hoá [9] Trong đất nông nghiệp thì những vùng đất chuyên canh trồng

lúa có số lượng Azospirillum cao hơn những vùng đất luân canh lúa màu rất nhiều

[9]

Ở nước ta theo kết quả nghiên cứu của một vài tác giả, thì số lượng

Azospirillum ở trong đất trồng lúa đồng bằng sông Hồng là khá cao Nhìn chung mật độ tế bào Azospirillum trong các chân đất là từ vài chục đến vài vạn tế bào/gam đất khô, trong đất không ngập nước thì số lượng Azospirillum thấp nhất

[9]

Cùng điều kiện ngập nước như nhau số lượng Azospirillum trong đất canh

tác lớn hơn đất hoang, phân bón hữu cơ là yếu tố dẫn đến sự chênh lệch số lượng

Azospirillum giữa đất canh tác và đất hoang Theo Charyulu và Rao (1980), vào giai đoạn phân rữa thân lúa, số lượng Azospirillum tăng lên khá cao so với bình

thường [9]

Trong đất chuyên canh lúa sự biến động số lượng Azospirillum không thể

hiện rõ như ở đất luân canh lúa mùa Điều đó nói lên vai trò của đất ngập nước

đối với sự khu trú của Azospirillum [9]

Điều đáng chú ý là số lượng Azospirillum ở vùng rễ lúa luôn lớn hơn nhiều

so với số lượng trong đất, sự chênh lệch này có thể đạt tới vài trăm lần Mật độ vi

khuẩn cao ở rễ thể hiện mối tương quan hội sinh khá chặt chẽ giữa nhóm vi khuẩn này và rễ cây lúa nước [9]

1.3.3 Ảnh hưởng của Azospirillum đến sự sinh trưởng và phát triển của

thực vật [17]

Trong quá trình nhiễm khuẩn Azospirillum vào rễ có thể tạo ra những thay

đổi quan trọng các chỉ số sinh trưởng ở thực vật như : tăng trọng lượng khô, tăng hàm lượng nitơ trong thân và hạt, tăng đẻ nhánh, tăng số lượng bông, thời hạn làm đòng và ra hoa ngắn hơn, trọng lượng hạt cao hơn đối chứng Tuy nhiên, những thay đổi về sinh trưởng và phát triển do xử lý vi khuẩn khó quan sát tại đồng ruộng, do đó, chỉ có thống kê một cách kỹ lưỡng mới có thể nhận thấy được sự gia tăng sản lượng sau thu hoạch do nhiễm khuẩn

Cơ chế tác động của vi khuẩn Azospirillum sau khi nhiễm vào rễ cho đến

nay vẫn là điều bí ẩn, có lẽ vì thế mà những kết quả thực nghiệm thu được cả trên đồng ruộng lẫn trong phòng thí nghiệm đều có biên độ dao động rất lớn

Mức tăng trưởng ở thực vật do nhiễm Azospirillum trong điều kiện đồng

ruộng thường nằm trong giới hạn từ 10 đến 30% Cho đến nay đã có những tài

liệu đánh giá tổng hợp kết quả xử lý nhiễm khuẩn Azospirillum đến năng suất

của lúa mì ở các thí nghiệm đồng ruộng như sau : tăng sản trung bình do nhiễm khuẩn là 60% so với đối chứng trong đó tăng sản ở lúa trồng vụ hè là 75% còn trồng vụ đông là 50% Thí nghiệm xử lý vi khuẩn đối với nhiều loại cây rau quả khác cũng cho sản lượng tăng từ 70 - 75% so với đối chứng

1.3.3.1 Ảnh hưởng nhiễm khuẩn đến sự phát triển bộ rễ

Ảnh hưởng dễ thấy nhất do nhiễm khuẩn Azospirillum là sự biến đổi hình

thái bộ rễ [30] Tuy nhiên, sự biến động đó lại liên quan trực tiếp đến mật độ vi khuẩn khi xử lý : nếu xử lý vi khuẩn cao hơn mật độ tối thích thì chúng sẽ kìm hãm sự phát triển chiều dài rễ, trong khi ở nồng độ thấp hơn hiệu quả tác động

của vi khuẩn đối với rễ không rõ rệt Mật độ vi khuẩn nhiễm vào mạ và hạt giống của nhiều loại cây rau quả và cây công nghiệp khoảng 105 - 106tế bào/ml, cho bắp là 107tế bào/ml, và cho cà chua invitro là hơn 108tế bào/ml Thông thường, mật độ 108 - 1010tế bào/ml ức chế rễ phát triển kéo dài Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn nêu trên không cho phép khẳng định là cần nhiễm bao nhiêu vi

khuẩn Azospirillum cho một hạt hay một cây để nhận phản ứng tăng sản dương

tính Đối với lúa nước, mật độ vi khuẩn trong dung dịch xử lý 106tế bào/ml có ảnh hưởng dương tính đến chiều cao và trọng lượng khô cây mạ [17]

Ảnh hưởng dương tính do nhiễm khuẩn còn thể hiện qua các chỉ số phát triển rễ, kể cả sự tăng trưởng chiều dài, đặc biệt là tại vùng sinh trưởng của rễ, tăng số lượng và chiều dài của rễ phụ và do đó làm tăng thể tích rễ, tăng trọng lượng rễ, làm xuất hiện sớm và tăng số lượng các lông hút, tăng diện tích tiếp xúc của các lông rễ, thay đổi sự sắp xếp các tế bào chóp rễ [17]

Cắt ngang rễ của cây bắp và câp lúa mì bị nhiễm khuẩn thấy các tế bào ở những rễ này sắp xếp một cách bất bình thường, ở lớp ngoài vùng vỏ Đặc biệt là

các hoạt động của những enzyme oxy hoá, lipid và các chất bần thu được ở

những rễ nhiễm thấp hơn rễ không nhiễm [27]

Theo một số nghiên cứu thì hàm lượng các chất : NO3-, K+ và H2PO4- trong các rễ nhiễm khuẩn cao hơn trong các rễ không nhiễm khuẩn [27]

1.3.3.2.Sự hình thành khuẩn lạc Azospirillum ở rễ

Sự phân bố của Azospirillum trên bề mặt rễ và các hoạt động xâm nhiễm

vào rễ của cây lúa mì và cây bắp thì cũng giống như những vi khuẩn khác Trong suốt ba ngày đầu, các khuẩn lạc tập trung chủ yếu ở vùng đầu non của lông rễ

Vài chủng Azospirillum xâm nhiễm vào vài loại cây trồng như lúa mì, lúa miến,

bắp Sự xâm nhiễm đó làm thay đổi hình thái rễ [27]

Azospirillum có thể bám trên bề mặt rễ hoặc xâm nhập vào bên trong rễ

để hình thành các tập đoàn với vô số hợp phần là các tế bào đơn Các khuẩn lạc này ẩn vào phía trong lớp nhầy ở mặt rễ Cả rễ đã chết lẫn rễ còn sống đều bị vi

khuẩn xâm nhiễm Trong rễ, Azospirillum hình thành các khuẩn lạc ở gian bào

vi khuẩn Azospirillum khỏi rễ [17]

Sự bám dính thường xảy ra rất nhanh trong vòng vài phút đầu và mặt rễ sẽ bão hoà vi khuẩn sau chừng hai giờ kể từ khi tiếp cận Tuy nhiên, cho đến nay

vẫn chưa khám phá ra cơ chế Azospirillum tự bám vào mặt rễ Có thể các yếu tố

hoá học, dinh dưỡng, môi trường và sinh lý sẽ kích thích hoặc kìm hãm

Azospirillum bám vào rễ Sự liên kết qua lecithin được coi như là một cơ chế bám

dính và agglutinin được coi như là phương tiện bám dính vào mặt rễ [17]

Bằng kỹ thuật hiển vi đôi khi cũng đã phát hiện thấy khuẩn lạc có trong

gian bào của các tế bào mô chóp rễ Tuy nhiên, ở cỏ Kallar thường chỉ thấy sự hiện diện dày đặc tế bào Azospirillum trên mặt rễ, các quần thể Azospirillum

bên trong rễ chưa bao giờ thấy được [17]

Nếu như vi khuẩn Azospirillum hiện diện trong gian bào thì câu hỏi được đặt ra là bằng cách nào Azospirillum xâm nhập vào bên trong được ? Có các khả

năng :

+ Vi khuẩn thâm nhập vào bên trong qua các mô rễ bị tổn thương, nơi rễ phụ từ rễ cái mọc ra

+ Vi khuẩn thâm nhập vào bên trong qua các lông hút đã chết hoặc qua những chỗ tổn thương cơ học thường gặp trong quá trình sinh trưởng của cây

+ Vi khuẩn dùng enzyme pectinase hoà tan pectin và do đó mở lối thâm nhập vào bên trong

1.3.4.Các cơ chế hoạt động của Azospirillum giúp tăng trưởng thực vật

Cơ chế hoạt động giúp tăng trưởng thực vật của Azospirillum cho đến nay

vẫn chưa xác lập, nhưng theo một số tác giả có ba nguyên nhân chính làm cho

các chủng Azospirillum cộng sinh với cây trồng làm tăng năng suất [1]

+ Sự hình thành và chuyển vào cây lượng nitơ cố định bởi vi khuẩn (Renie, 1980)

+ Vi khuẩn tiết ra các hormon thực vật (Tiên và cộng sự, 1979)

+ Sự kích thích đưa các chất dinh dưỡng vào cây (Lin và cộng sự, 1985)

Một vài nghiên cứu của một số tác giả, thì các chủng Azospirillum ngoài

khả năng cố định nitơ, còn có khả năng sinh ra chất kích thích sinh rễ đó là indole

-3- acetic acid (IAA) Cây mạ có xử lý Azospirillum ra rễ nhiều hơn và cao hơn

đối chứng, chứng tỏ hormon thực vật đã phát huy tác dụng tốt Màu xanh đậm hơn và lá to bản hơn thể hiện nitơ được sử dụng nhiều hơn ở những cây thí nghiệm [1]

Ngoài ra thì Azospirillum có thể tăng hoạt tính nitratereductase ở rễ và do

đó cây không tích lũy nhiều nitrate trong rễ [17]

1.3.4.1.Sự cố định nitơ không khí của Azospirillum

Tất cả các chủng Azospirillum phân lập được đều có khả năng cố định

đạm khá hiệu quả, khi sống tự do cũng như khi tồn tại trong quan hệ tổ hợp với thực vật Khả năng cố định nitơ không khí được đánh giá bằng phản ứng khử

acetylen, đã phát hiện thấy sự gia tăng nitơ tổng số ở thân và hạt do nhiễm

Azospirillum.Vì thế đã coi cố định nitơ như là cơ chế chủ yếu và đầu tiên của các hoạt động kích thích tăng trưởng thực vật của Azospirillum Mặc dầu sự cố định

nitơ không khí được diễn tả bằng phản ứng khử acetylen, nhưng chính xác hơn cả là những dẫn liệu thu được khi sử dụng kỹ thuật hấp thu và pha loãng 15N đã xác định được sự gia tăng hoạt tính nitrogenase ở rễ nhiễm khuẩn, kết quả đó phù hợp với sự gia tăng tổng lượng nitơ ở cây chủ nhiễm khuẩn Kết quả nhiễm

Azospirillum vào lúa mì và bắp cho thấy trong toàn bộ lượng nitơ của cây thì chỉ

có 18% là do cố định từ không khí, và trong toàn bộ lượng nitơ cố định cây chủ hấp thu được chừng 5% mà thôi Tuy nhiên, chỉ một lượng nhỏ như thế cũng đủ để lý giải cho sự gia tăng hàm lượng nitơ tổng số ở cây chủ và do đó lượng nitơ của phân bón dù có cao đến mức ức chế hoạt tính nitrogenase cũng không ảnh hưởng đến tăng sản dương tính ở cây chủ khi được nhiễm khuẩn [17]

1.3.4.2 Aûnh hưởng của hormon ngoại tiết Azospirillum lên sinh trưởng và

phát triển ở thực vật [17]

Trong quá trình sinh trưởng nhiều loài Azospirillum sản sinh ra các hormon

ngoại tiết có tác dụng điều hòa sinh trưởng ở thực vật như indole-3-pyruvic acid

và indole-3-acetaldehyde là IAA ở A.lipoferum Có bằng chứng cho sự tồn tại con đường tạo IAM ở A.brasilense, đó là sự hiện diện của indole-3-ethanol, indole-3- methanol (IM) và indole-3-lactate (ILA) trong môi trường nuôi cấy A.brasilense

Hiệu quả của hormon ngoại tiết đến cây trồng hoàn toàn phụ thuộc vào nồng độ sử dụng Nồng độ sử dụng quá thấp thì ít có hiệu quả Nồng độ thấp (khoảng vài ppm đến vài chục ppm) sẽ gây hiệu quả kích thích sinh trưởng (tăng chiều cao, tăng sinh khối) Nồng độ sử dụng ở mức cao (hàng nghìn ppm) sẽ gây ức chế sinh trưởng Nồng độ rất cao (trên chục nghìn ppm) sẽ gây nên sự hủy diệt bộ phận của toàn cây [18]

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng ảnh hưởng mạnh đến khả

năng khử acetylen của Azospirillum Bằng chứng cho thấy khi xử lý các chất điều

hòa sinh trưởng (cả tổng hợp nhân tạo lẫn tách chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn), hình thái và sự phát triển của rễ được khôi phục hoàn toàn giống như khi xử lý

Azospirillum Cụ thể là tạo ra những thay đổi về chiều dài rễ, rễ tạo ra nhiều lông

hút hơn, tăng tốc độ phân bào và biệt hóa mô tạo vùng sinh trưởng của rễ Các

chủng cha mẹ Azospirillum và các thể đột biến tạo IAA ngoại tiết trong dịch nuôi

cấy ảnh hưởng mạnh đến phát triển hình thái của rễ, trong khi các thể đột biến mất khả năng tạo IAA ngoại tiết thì không có khả năng làm thay đổi hình thái

của rễ Nhiễm Azospirillum đã cải thiện sự cân bằng hormon ở các cá thể lúa mì

đột biến mất khả năng tạo hormon Gần đây phát hiện được một lượng đáng kể

IAA và IBA ở rễ ngô do nhiễm Azospirillum, trong khi ở rễ ngô không nhiễm thì

hoàn toàn không có

1.3.4.3 Azospirillum kích thích sự hấp thu các chất dinh dưỡng khoáng của

thực vật [17]

Ngoài sự tăng hoặc giảm các chỉ số sinh trưởng và phát triển của rễ, vi

khuẩn Azospirillum còn ảnh hưởng đến thay đổi các chỉ số về lá Sự thay đổi có

liên quan trực tiếp đến sự hấp thu NO3-, NH4+, PO43-, K+, Rb+ và Fe2+ Đó là nguyên nhân của sự gia tăng hàm lượng chất khô do tích lũy khoáng chất ở thân và lá Người ta cho rằng việc tăng cường khoáng chất được coi là nguyên nhân

tăng thể tích và trọng lượng khô của rễ [24] Thực vậy, nhiễm khuẩn Azospirillum

làm cho lượng ion trong đất tăng lên và do đó giúp cây khắc phục được tình trạng

nghèo chất dinh dưỡng Chính điều đó giải thích vì sao khi xử lý Azospirillum nif

-cây vẫn hấp thu rất hiệu quả nitơ mặc dù trong đất có rất ít Chính vì thế, dù lượng nitơ bón vào đất có thấp hơn nhu cầu vẫn đảm bảo được sản lượng thu hoạch ổn định Vài nghiên cứu đã chứng minh rằng hoạt tính tiếp nhận proton

liên quan trực tiếp đến sự cân bằng ion ở rễ Xử lý Azospirillum đã làm cho hoạt

tính thu nhận proton ở rễ lúa mì tăng lên một cách rõ rệt

Nhiễm khuẩn Azospirillum còn cải thiện được chế độ nước ở cây Các cây

cao lương được nhiễm khuẩn chịu hạn tốt hơn do tích lũy được nhiều nước ở lá Tiềm năng giữ nước tăng cao hơn đồng thời nhiệt độ tán lá cũng thấp hơn so với

cây đối chứng không nhiễm Azospirillum

1.3.4.4 Quan hệ giữa nitratereductase của cây chủ và vi khuẩn

Azospirillum [17]

Hiện nay có nhiều giả thuyết cho rằng nitratereductase (NR) của vi khuẩn là nguyên nhân khởi đầu tạo nên sự tích lũy nhiều nitơ ở cây chủ do nhiễm

Azospirillum : cho nhiễm Azospirillum NR+ vào rễ cây làm cho hoạt tính của

enzyme này ở lá giảm hẳn và ngược lại, nhiễm Azospirillum NR- làm cho hoạt

tính của enzyme này ở lá tăng hơn so với nhóm Azospirillum NR+ Kết quả thử

nghiệm xử lý Azospirillum brasilense sp 245 bố mẹ NR+ và thể đột biến của nó là

NR- đã xác nhận thể đột biến có hiệu ứng tăng sản ít hơn rất nhiều so với chủng bố mẹ NR+ Điều đó cũng chứng tỏ cố định nitơ không phải là cơ chế duy nhất giúp cho cây tăng sản bởi vì cả chủng bố mẹ lẫn chủng đột biến đều có khả năng cố định nitơ không khí Có lẽ chủng bố mẹ giúp cây trồng khử nitrate ngay rễ và

do đó giảm được sự chuyển nitrate lên lá Trong khi chủng đột biến NR- không có khả năng làm được điều đó nên nitrate tiếp tục được di chuyển lên lá

1.4 Phân vi sinh vật [7]

1.4.1 Định nghĩa

Phân vi sinh vật là loại sản phẩm chứa một hoặc nhiều chủng vi sinh vật

sống, có ích đã được tuyển chọn mà hoạt động của chúng tạo nên trong đất trồng các chất dinh dưỡng hay các chất có hoạt tính kích thích sinh trưởng, tạo điều kiện nâng cao năng suất hoặc chất lượng nông sản, tăng độ màu mỡ cho đất Các

chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, vật nuôi, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản (Theo “Quy định tạm thời về chất lượng phân bón vi sinh vật cho cây trồng” ban hành kèm theo quyết định số 161/QĐ-TĐC ngày 04-03-1995 của Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường)

Phân vi sinh vật gồm hai thành phần : thành phần hoạt động và chất mang Thành phần hoạt động là sinh khối các loại vi sinh vật có ích, tạo nên tác dụng của loại phân này với cây trồng và đất đai Thành phần chính này không thể nhìn thấy bằng mắt thường Còn chất mang là vật liệu dùng để cố định vi sinh vật Chúng tạo nên hình thái của sản phẩm, dễ nhận thấy và phân biệt được, nhưng chỉ đóng vai trò như những chiếc xe tải chuyên chở sinh khối vi sinh vật từ nơi sản xuất đến nơi áp dụng

1.4.2 Phân loại

Có nhiều cách phân loại phân vi sinh vật Theo chức năng sử dụng người

ta có thể có các loại sau :

- Phân bón vi sinh vật cố định đạm : tên thương phẩm là phân đạm vi sinh

- Phân bón vi sinh vật phân giải các hợp chất phospho khó tan : tên thương phẩm là phân lân vi sinh

- Phân bón vi sinh vật phân giải cellulose

- Phân bón vi sinh vật quang hợp

Các loại phân này chỉ mang tính lý thuyết vì trên thực tế hầu hết các loại phân vi sinh đều sử dụng một hỗn hợp nhiều loại vi sinh vật có nhiều chức năng khác nhau

Chế phẩm phân vi sinh thường dùng các loại chất mang như : than bùn, đất với bụi xơ dừa hay bột đậu nành, trộn đất với than củi, vermiculite, mùn cưa bị phân hủy, phân trộn trấu, mùn vỏ cà phê… Các chất mang có thể hấp khử trùng hay không từ đó người ta có thể chia thành hai loại :

- Phân bón vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng

- Phân bón vi sinh vật trên nền chất mang không thanh trùng

1.4.3 Mục tiêu của việc sử dụng phân vi sinh vật

Việc sử dụng các loại phân vi sinh vật trong nông, lâm nghiệp đều hướng tới các mục tiêu sau :

- Giảm nhu cầu sử dụng các hóa chất tổng hợp dùng trong trồng trọt, đặc biệt là các loại phân bón vô cơ và các loại thuốc bảo vệ thực vật, tạo điều kiện chuyển nền nông nghiệp hóa học sang nền nông nghiệp hữu cơ

- Nâng cao chất lượng môi trường và bảo vệ các nguồn lợi tự nhiên của hệ sinh thái

- Nâng cao khả năng sử dụng các nguồn lợi có sẵn trong thiên nhiên, của các loại phế phụ phẩm nông nghiệp sẵn có trong từng địa phương

- Bảo đảm chất lượng và độ an toàn của các loại nông sản

1.4.4 Quy trình chung để sản xuất phân vi sinh vật từ vi khuẩn

Các loại phân đạm vi sinh hiện nay đều được sản xuất từ các loại vi khuẩn cố định đạm Quá trình sản xuất chế phẩm phân vi sinh vật hầu hết đều được thực hiện theo các bước cơ bản sau :

Š Giữ giống và nhân giống vi khuẩn

Giống vi khuẩn có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong cả quá trình sản xuất Các chủng vi khuẩn dùng để sản xuất đều có những đặc tính hữu ích như : khả năng cố định đạm, sức cạnh tranh, dễ nuôi cấy để thu sinh khối…

Quá trình giữ giống đòi hỏi phải đảm bảo duy trì độ thuần khiết về các đặc tính trên Thường người ta giữ các chủng vi khuẩn này ở dạng đông khô

Việc nhân giống vi khuẩn thực hiện bằng các biện pháp khác nhau, nhưng đều dựa trên nguyên tắc tăng sinh khối vi khuẩn để cung cấp cho sản xuất (lên men thu sinh khối) Biện pháp nhân giống phổ biến hiện nay là cấy trong bình

nón dung tích 200 - 300ml đặt lên các thiết bị lắc có tần số 100 - 300dao động/phút để cung cấp không khí cho vi khuẩn phát triển Phần lớn các quá trình sản xuất đều sử dụng môi trường thu sinh khối để nhân giống

Š Môi trường nhân sinh khối trong quá trình sản xuất phân vi sinh

Môi trường sản xuất phải bao gồm đầy đủ các chất dinh dưỡng tối ưu nhất cho sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình tạo sinh khối như : nguồn carbon, nitơ, pH, các nguyên tố vi lượng, các chất kích thích sinh trưởng … Mỗi loại vi khuẩn yêu cầu một nguồn dinh dưỡng khác nhau Do vậy phải căn cứ vào các đặc tính sinh lý của chúng mà thành lập môi trường nhân sinh khối để sản xuất cho thích hợp và có giá thành thấp

Một đặc điểm đáng lưu ý là các vi khuẩn cố định đạm có ít nhiều bị ảnh hưởng trong quá trình nuôi cấy trên môi trường tổng hợp Các chất đạm vô cơ đẩy mạnh quá trình phát triển của vi khuẩn tạo nên một lượng sinh khối phù hợp với yêu cầu sản xuất nhưng khả năng hình thành nốt sần và hoạt tính khử acetylen của chúng ít nhiều bị giảm Còn trong các môi trường không có đạm hầu hết các

vi khuẩn này phát triển yếu Điều này trong thực tế thường xảy ra, khi tiến hành nhiễm chế phẩm đạm vi sinh thì lượng phân bón cho cây đã được thay thế, nhưng lại cho kết quả âm tính, mà sự tăng sản do nhiễm chế phẩm có khi xảy ra trong điều kiện lượng phân đạm được bón rất cao đến mức có thể ảnh hưởng xấu đến số lượng vi khuẩn trong vùng rễ

pH và sự điều chỉnh pH trước khi nuôi cấy vi khuẩn cũng ảnh hưởng nhiều

đến quá trình tạo sinh khối Trong quá trình thu sinh khối Azospirillum để sản

xuất phân vi sinh cố định đạm trên môi trường acid hữu cơ, dịch nuôi cấy trở nên kiềm ở cuối quá trình Khi pH≥ 9, loại vi khuẩn này sẽ không có khả năng tồn tại

Do đó, trong quá trình nuôi cấy cần bổ sung đệm pH giúp cho quá trình đạt hiệu quả tốt hơn

Š Thanh trùng môi trường nhân sinh khối

Quá trình này nhằm loại bỏ hết các vi sinh vật lạ, không có lợi trước khi cấy giống vi khuẩn cố định đạm để lên men thu sinh khối Việc thanh trùng được thực hiện bằng hơi nước có áp suất 1atm/30 phút Trong nuôi cấy quy mô lớn hoặc nuôi cấy trên môi trường rắn, thời gian thanh trùng môi trường sản xuất dài hơn và phụ thuộc vào môi trường sản xuất

Š Nhân sinh khối

Người ta có thể sử dụng máy lắc có tần số dao động khoảng 100 - 500dao động/phút để thu sinh khối vi khuẩn trong các bình thủy tinh nhỏ (250 - 500ml) chứa môi trường lên men Người ta sử dụng các thiết bị lên men, sục khí qua môi trường nuôi cấy vi khuẩn để thu sinh khối của chúng Phương pháp này cho năng suất cao hơn, tiết kiệm năng lượng, sử dụng nhân công nhiều hơn biện pháp trên, nhưng yêu cầu trình độ thao tác thành thục, chế độ công nghệ được dày công nghiên cứu và thực hiện nghiêm túc, phù hợp với từng loại vi khuẩn Nếu không, loại hình nuôi cấy này rất dễ bị nhiễm các vi sinh vật lạ làm ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật cố định đạm

Ngoài ra, còn có phương pháp nhân sinh khối trong môi trường rắn Ở phương pháp này đòi hỏi thành phần, kích thước các phần tử của môi trường thích hợp, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phát triển của vi khuẩn Loại hình lên men này tuy đơn giản, có thời gian tàng trữ chế phẩm lâu, nhất là những loại môi trường đã được thanh trùng nhưng rất tốn công lao động và diện tích nhà xưởng, sản phẩm cho chất lượng không đồng đều và yêu cầu một lượng giống ban đầu khá lớn

Š Chất mang

Chất mang là những chất làm nhiệm vụ duy trì sự sống của vi khuẩn cố định đạm trong thời gian tàng trữ, vận chuyển chúng đến nơi áp dụng Chúng là thành phần quan trọng để tạo nên các loại phân vi sinh khác nhau

Chất mang được trộn thêm dịch vi khuẩn đã được lên men đạt yêu cầu để tạo ra sản phẩm là phân vi sinh vật Có nhiều loại chất mang khác nhau tuỳ thuộc vào điều kiện của từng địa phương Nhưng chúng đều phải có đầy đủ các yếu tố sau :

- Có độ hấp thụ cao, dễ chế biến

- Không độc đối với vi sinh vật dùng để chế tạo phân vi sinh vật

- Dễ thanh trùng

- Có sẵn ở địa phương và có giá thành rẻ

Š Tạo và đóng gói sản phẩm

Sau khi hoàn thành giai đoạn nhân sinh khối (đối với biện pháp thu sinh khối trên nền chất mang không thanh trùng) các sản phẩm lên men được nén thành dạng viên, dạng bột, … (đối với biện pháp thu sinh khối trên môi trường rắn có thanh trùng) chuyển một cách vô trùng sang các túi đựng sản phẩm ; hoặc trộn dịch lên men vào chất mang (trong điều kiện vô trùng), để lên men hỗn hợp trong thời gian ngắn, sau đó đóng gói sản phẩm Tùy theo điều kiện nuôi cấy khác nhau mà ta sử dụng phương thức đóng gói khác nhau Tuy nhiên cần phải thực hiện giai đoạn này một cách nghiêm ngặt để bảo đảm chất lượng sản phẩm

Š Bảo quản sản phẩm

Trong điều kiện nước ta, phân vi sinh rất khó bảo quản trong điều kiện tự nhiên Nhiệt độ cao làm cho độ sống sót của vi khuẩn giảm xuống Với nhiệt độ môi trường từ 25 - 35oC phân vi sinh chỉ có thời hạn bảo quản trong khoảng 3 - 4 tháng Việc bảo quản các loại phân này trong các kho lạnh đang là vấn đề đặt ra