khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn streptomyces dicklowii

đó đã thoả mãn được những tính chất cần thiết để có thể sử dụng trong bảo vệ thực vật, như: - Không gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây.Ở một số nồng độ thích hợp chúng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

- Nguyễn Hoàng Minh Huy

NGƯỜI HƯỚNG DẨN KHOA HỌC:

TS TRẦN THỊ THANH

Tp HCM, 2006

LỜI CÁM ƠN

Trên hết, tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ TRẦN THỊ THANH, người đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài; với tất cả tinh thần tình thương và trách nhiệm cô đã giúp tôi hoàn thành luận văn, bên cạnh đó tôi đã học hỏi được nhiều kiến thức quí báu nơi cô cũng như phương pháp nghiên cứu khoa học

Tôi chân thành cám ơn thầy cô ở khoa sinh, khoa hóa - trường đại học sư phạm tp HCM, thầy cô ở bộ môn sinh hóa - trường đại học khoa học tự nhiên, đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài luận văn cũng như thầy cô công tác tại phòng thí nghiệm vi sinh - sinh hóa, phòng thí nghiệm sinh lý thực - trường đại học sư phạm tp HCM đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian làm đề tài

Tp HCM, tháng 3 năm 2006 NGUYỄN HOÀNG MINH HUY

MỤC LỤC

Trang

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn:

1.1.1 Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn:

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái

1.1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn

1.1.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn:

1.1.2.1 Khái niệm về chất kháng sinh

1.1.2.2 Những nghiên cứu trên thế giới và ở nước ta về

1.1.2.5 Cơ chế tác động của chất kháng sinh

1.1.3 Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh

1.1.3.1 Tách chiết kháng sinh từ sinh khối

1.1.3.2 Tách chiết kháng sinh từ dịch lọc

1.1.3.3 Tinh sạch chất kháng sinh

1.2 Các nhóm chất kháng sinh chính có nguồn gốc từ xạ khuẩn:

1.2.1 Phân loại các chất kháng sinh từ xạ khuẩn

1.2.2 Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn

1.3 Vai trò của xạ khuẩn và chất kháng sinh trong phòng chống

nấm bệnh và tuyến trùng hại cây trồng:

1.3.1 Thực trạng về bệnh hại cây trồng

1.3.2 Vai trò của xạ khuẩn, chất kháng sinh trong phòng

chống bệnh và tuyến trùng hại cây trồng

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2.1.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh –

phương pháp khuếch tán trên thạch

2.2.1.3 Phương pháp xác định sinh khối vi sinh vật

2.2.2 Phương pháp hóa sinh

2.2.2.1 Phương pháp xác định khả năng phân giải các hợp

chất cao phân tử của xạ khuẩn

2.2.2.2 Phương pháp xác định khả năng sinh chất kích

thích sinh trưởng thực vật

2.2.3 Phương pháp hóa lý

2.2.3.1 Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt của

chất kháng sinh

2.2.3.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh

2.2.3.3 Phương pháp xác định các nhóm chức trong cấu

trúc hóa học của chất kháng sinh

2.2.3.4 Phương pháp xác định khả năng hoà tan trong các

dung môi của chất kháng sinh

2.2.4.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi

cấy xạ khuẩn lên khả năng nảy mầm của hạt

2.2.4.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi

cấy xạ khuẩn lên sự phát triển của cây con

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn

Streptomyces dicklowii

3.1.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

3.1.2 Đặc điểm sinh trưởng phát triển trên các môi trường

nuôi cấy khác nhau

3.1.3 Đặc điểm sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn

3.2 Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn

Streptomyces dicklowii

3.2.1 Thử họat tính kháng sinh

3.2.2 Lựa chọn môi trường thích hợp cho việc tạo kháng

sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii

3.3. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất

kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii

3.3.1 Ảnh hưởng pH ban đầu:

3.3.2 Ảnh hưởng chế độ thông khí:

3.3.3 Xác định thời gian sinh kháng sinh tối ưu:

3.3.4 Ảnh hưởng nguồn hydratcacbon:

3.3.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ:

3.4 Tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces

dicklowii lên các tác nhân gây hại cây trồng

3.5.1 Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên

nấm bệnh hại cây trồng:

3.5.2 Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên

tuyến trùng hại cây trồng

3.6 Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces

dicklowii đến hoạt động sinh lý của cây trồng

3.6.1 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy lên khả năng nảy mầm của

Ở ĐẦU

Thiệt hại kinh tế của bệnh cây là điều thấy rất rõ: làm giảm năng suất cây trồng, giảm phẩm chất nông sản khi thu hoạch và bảo quản, ảnh hưởng xấu đến đất trồng và cơ cấu cây trồng Từ thế kỷ 18 Anton De Bary đã đặt nền móng môn khoa học bệnh cây (1853) Để khắc phục những thiệt hại do bệnh cây gây ra, người ta đã sử dụng nhiều biện pháp như: kỹ thuật canh tác, thuốc hóa học, … trong đó sử dụng thuốc hóa học để phòng ngừa và ngăn chặn bệnh hại cây trồng là được nhiều người ưa chuộng do tính dễ sử dụng, hiệu quả cao nếu kết hợp với biện pháp canh tác thì việc phòng bệnh cho cây đạt hiệu quả lớn

Tuy nhiên, sau thời gian dài sử dụng thuốc hóa học cũng như phân hóa học người ta đã nhận thấy chúng ảnh hưởng đến môi trường sống rất lớn Chúng tác động xấu đến cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm môi trường đất, nước làm cho người và gia súc bị ngộ độc Đáng ngại hơn, một số thuốc trừ sâu chậm phân hủy đã lưu tồn lâu trong đất (DDT lưu tồn được 25 năm) sự lưu tồn lâu trong đất của các chất hoá học này làm nồng độ của chúng tăng dần theo thời gian Đồng thời việc sử dụng tuỳ tiện liều lượng, thời gian phun thuốc hóa học đã tạo nên dư lượng lớn không cho phép trong rau màu và lương thực, gây nên những vụ ngộ độc thực phẩm lớn mà con người mà chúng ta từng biết trong thời gian qua

Để khắc phục nhược điểm này của thuốc hóa học cũng như bảo vệ môi sinh, người ta đã tìm kiếm các biện pháp và phát hiện vai trò của vi sinh vật trong việc điều chỉnh cân bằng sinh học của hệ sinh thái Bằng các biện pháp khống chế sinh học, người ta đã từng bước sản xuất ra nhiều chế phẩm vi sinh vật ở qui mô lớn và được sử dụng trong công tác phòng trừ sâu bệnh

Càng ngày người ta càng sử dụng rộng rãi những chế phẩm kháng

đó đã thoả mãn được những tính chất cần thiết để có thể sử dụng trong bảo vệ thực vật, như:

- Không gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây.Ở một số nồng độ thích hợp chúng còn kích thích khả năng nảy mầm của hạt và sinh trưởng của cây

- Không gây hại cho người và gia súc

- Có hiệu lực trong một thời gian nhất định ở ngoài môi trường tự nhiên

- Có tác dụng tiêu diệt một cách có chọn lọc vi khuẩn gram dương, hoặc vi khuẩn gram âm, kháng nấm mạnh

Dicklow.M.B cùng cộng sự vào năm 1996 đã công bố patent số

5549889 về loài Streptomyces dicklowii, loài có khả năng kháng nấm và tuyến

trùng hại cây trồng, rất thích hợp sử dụng làm vi sinh vật khống chế sinh học trong nông nghiệp

Chúng tôi nhận được chủng Streptomyces dicklowii từ phòng thí

nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm Tp Hồ Chí Minh, chủng xạ khuẩn này được nhập từ Mỹ Để tiến tới sử dụng có hiệu quả chủng xạ khuẩn này trong điều kiện môi trường Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ

CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii”

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn:

1.1.1 Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn:

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái:

Xạ khuẩn sống rất phổ biến trong tự nhiên cũng như trong đất, chúng

có nhiều đặc điểm giống vi khuẩn và khác với nấm mốc như kích thước tế bào nhỏ, thành tế bào không chứa cenllulose hay kitin, phân chia tế bào theo kiểu

vô ti (Amytoz), không phân biệt giới tính; tuy nhiên, xạ khuẩn cũng có những đặc điểm giống nấm mốc hơn như có hệ sợikhuẩn ty phân nhánh, nhưng ở xạ khuẩn hệ sợikhông có vách ngăn Sự phân hoá của khuẩn ty khí sinh bắt đầu

từ những mấu lồi xuất hiện trên bề mặt của sợi khuẩn ty sau đó mấu lồi lớn lên thành chồi, chồi phát triển dài ra thành sợi, cuối cùng tạo thành hệ sợi dầy đặc Đường kính mỗi sợi khuẩn ty là 0,5µm – 1,5µm (R.E Buchanan, 1998)

Khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn phát triển ra bên ngoài không khí trên bề mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn; khuẩn lạc xạ khuẩn dạng hình tròn do khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm (xem hình 1.1), khác với khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc và

vi khuẩn, khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, bề mặt có mấu lồi, có nếp nhăn hoặc sần sùi Theo Procofieva Bengopxkaia (1936), cho rằng khuẩn lạc của xạ khuẩn có 3 lớp: lớp ngoài gồm các sợi bện chặt lại với nhau, lớp trong tương đối xốp hơn, và lớp giữa thì có cấu trúc tổ ong Khuẩn lạc của xạ khuẩn có thể mang các màu sắc khác nhau như: màu đỏ, màu lam, màu xám, màu tím

Hình 1.1: Các dạng khuẩn lạc của xạ khuẩn

Các khuẩn ty mọc phía dưới khuẩn lạc và cắm sâu vào trong môi trường là khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty cơ chất có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng

để cung cấp dinh dưỡng cho toàn bộ cơ thể nên còn gọi là khuẩn ty dinh dưỡng Đường kính khuẩn ty cơ chất thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty không có vách ngăn và không bị đứt đoạn Tuỳ loại môi trường mà khuẩn ty

cơ chất có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố trong đó có sắc tố hòa tan được trong nước có sắc tố hòa tan được trong dung môi hữu cơ

Sau thời gian phát triển, trên đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nên những sợi phân hóa gọi là cuống sinh bào tử; tuỳ theo từng loài mà cuống sinh bào tử có thể thẳng hay uốn cong, xoắn lò so hay xoắn ốc; chúng có thể mọc đơn, mọc đối, mọc vòng, mọc thành chùm, số vòng xoắn của cuống sinh

bào tử có thể từ 5 – 10 vòng, đường kính vòng xoắn có thể thay đổi từ 5 – 7nm (xem hình 1.2)

Hình 1.2: Các dạng cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn

Bào tử của xạ khuẩn được hình thành từ cuống sinh bào tử, thường

có hình cầu, hình ovan, hình que … bề mặt bào tử có các dạng như: dạng nhẵn (hình 1.4), dạng xù xì, dạng gai (hình 1.3), dạng tóc

Hình 1.3: Bào tử dạng gai ở Streptomyces africanus chủng CPJVR-HT (hình

chụp dưới kính hiển vi điện tử theo ijs.sgmjournals.org/ / medium/frontcover.gif )

Hình 1.4: Bào tử dạng nhẵn ở Streptomyces violazeoruber (hình chụp dưới

kính hiển vi điện tử theo www.ncl.ac.uk/biol/ assets/MSc-IB.jpg )

1.1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn:

1.1.1.2.1 Đặc điểm sinh lý nuôi cấy:

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong môi trường đất - xạ khuẩn chiếm 20 – 40% tổng số vi sinh vật trong đất, tập trung nhiều ở lớp đất

trên bề mặt (sâu xuống khoảng 40cm) Hầu như trong các loại đất đều có mặt của xạ khuẩn, đa số xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số xạ khuẩn

ưa nhiệt Xạ khuẩn thường sống tốt trong môi trường có pH trung tính

Xạ khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng nên nguồn hydratcacbon mà chúng

sử dụng có thể là tinh bột, đường, polysaccaric… nguồn nitơ mà xạ khuẩn sử dụng bao gồm: muối amon, muối nitrat (nguồn nitơ vô cơ); protein, pepton, cao ngô, …(nguồn nitơ hữu cơ)

1.1.1.2.2 Khả năng sinh enzym của xạ khuẩn:

Enzym là một chất xúc tác sinh học được tạo thành trong tế bào vi sinh vật, nó đóng một vai trò quan trọng trong trao đổi chất của vi sinh vật

Enzym không những hoạt động xúc tác những phản ứng chuyển hóa trong cơ thể mà còn xúc tác những chuyển hóa bên ngoài môi trường – điều này có ý nghĩa lớn trong việc ứng dụng enzym vi sinh vật vào công nghiệp, nông nghiệp,…

Ở xạ khuẩn, người ta đã thu nhận các loại enzym như:

- Enzym amylaza: thu nhận từ các loài Streptomyces aureofaciens, Streptomyces diastochromogens, …

- Enzym cenllulaza: thu nhận từ các loài Streptomyces antibioticus, Streptomyces sp 0143, …

- Enzym proteaza: thu nhận từ Streptomyces kinoluteus, Streptomyces verticillatus var zynogenes, Actinomyces fradiae, …

- Enzym kitinaza: thu nhận từ Streptomyces griseus, …

Trong đó enzym proteaza của xạ khuẩn được ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm – có tác dụng làm mềm thịt Các chế phẩm được bán

trên thị trường như: PRONAZA của Nhật (thu nhận từ Streptomyces griseus);

M – zim của Mỹ (thu nhận từ Streptomyces fradiae) (Nguyễn Trọng Cẩn,

1998)

Ngoài ra người ta còn chú ý một loại enzym quí ở xạ khuẩn là glucoza izomeraza, enzym này giúp biến đổi đường glucose thành đường fructose với độ ngọt cao hơn (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998)

CH2OH

Để thu enzym người ta thường thu canh trường nuôi cấy của chúng Thành phần dinh dưỡng của môi trường cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzym, nên để tăng sự tổng hợp enzym thì môi trường nuôi cấy phải

có đầy đủ các thành phẩn dinh dưỡng đặc biệt cần bổ sung “chất cảm ứng” tổng hợp enzym, thường là cơ chất tương ứng của enzym cần tổng hợp

Thí dụ: trong tổng hợp proteaza của Actinomyces cần chất cảm ứng

là protein đậu nành hay protein động vật

1.1.1.2.3 Khả năng sinh vitamin của xạ khuẩn:

- Vitamin B12: Cũng như vi khuẩn, xạ khuẩn có khả năng tổng hợp tốt vitamin B12, là loại vitamin mà ở động vật và thực vật không có khả năng tổng hợp Nên trong công nghệ tổng hợp vitamin B12 thì con đường sản xuất chủ yếu là con đường sinh học mà xạ khuẩn và vi khuẩn là hai loài vi sinh vật

người ta quan tâm nhất – các loài xạ khuẩn đó là: Actinomyces olivaceus, Actinomyces griseus, Actinomyces aureopacieus, Actinomyces pradiae, Actinomyces autibioticus, …Đáng kể nhất là xạ khuẩn Actinomyces olivaceus

và loài vi khuẩn Propionibacterium shermanii là những chủng vi sinh vật

được sử dụng trong công nghiệp sản xuất vitamin B12

- Caroten (tiền vitamin A): khi vào cơ thể người và động vật sẽ

chuyển thành vitamin A Các chủng xạ khuẩn được quan tâm là: Blakeslea trispora, Mycobacterium smegmatis, Streptomyces chrestomyceticus …

1.1.1.2.4 Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật của xạ khuẩn:

Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng của vi sinh vật được phát hiện

từ rất sớm Năm 1925, Saubert phát hiện auxin trong môi trường nuôi cấy nấm Rhizopus suinus, Kurosawa (1926) trích ly Gibberellin (GA) từ nấm Fusarium moniliforme

Năm 1926 E.Kurosawa (người Nhật) tìm thấy một loài nấm mốc tên

Gibberella fugikuroi Ông chứng minh rằng khi nấm nhiễm vào cây con,

chúng làm cây con tăng trưởng với tốc độ cao

Năm 1930 người ta đã phân lập và kết tinh một chất từ Gibberella nay được gọi là gibberellin Trong vòng 30 năm trở lại đây có hơn 70 chất khác nhau được phân lập từ nấm mốc và nhiều thực vật có hoa cũng được xếp vào nhóm gibberellin (GAs) Gibberellin thường được sử dụng trong các thí nghiệm là GA3 hay acid gibberellic

Có rất nhiều xạ khuẩn trong đất cũng có khả năng sinh tổng hợp Auxin - một dạng phytohoocmon rất có ý nghĩa đối với cây trồng Auxin có vai trò quan trọng trong sự kiểm soát sự tăng dài của tế bào Vì tế bào thực vật có vách bao bọc, nên tế bào chỉ có thể tăng trưởng được khi vách có thể được kéo dài ra Vách được cấu tạo bởi phần lớn là đường đa mà thành phần chính là cellulose Ở vách sơ cấp, cellulose hiện diện dưới dạng những sợi dài liên kết với các đường đa khác để tạo ra một mạng lưới Khi tăng trưởng các liên kết có thể bị đứt tạm thời, do đó vách tế bào trở nên đàn hồi hơn và những vật liệu mới được chen vào Auxin có vai trò chính trong cả hai quá trình trên Trong các auxin, β – indole acetic acid (IAA) là một kích thích tố sinh trưởng thực vật được người ta quan tâm nhiều Đã có nhiều công trình

có khả năng tạo thành 33 μgIAA/ ml canh trường, Streptomyces olivochromoferus 1/294 có khả năng tạo thành 9μgIAA/ ml canh trường, …(

Lê Thị Hoa, 1998)

Qúa trình sinh tổng hợp IAA ở vi sinh vật diễn ra khá phức tạp, bằng phương pháp đồng vị phóng xạ người ta xác định được IAA có nguồn gốc từ Triptophan (hình 1.5)

Hình 1.5: Các con đường hình thành IAA ở vi sinh vật (theo Lê Thị Hoa,1998)

1.1.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn:

1.1.2.1 Khái niệm về chất kháng sinh:

Có nhiều lập luận khác nhau hoặc theo nguồn gốc hoặc theo hướng điều trị bệnhnhưng nhìn chung có thể hiểu chất kháng sinh (Antibiotic) là các chất có nguồn gốc vi sinh vật và thực vậtcó tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác một cách có chọn lọc ngay khi ở nồng độ thấp Chất kháng sinh là một chất hóa học có hoạt tính kháng lại các vi sinh vật như: vi khuẩn gây bệnh cho người và động vật; nấm gây bệnh ở động vật

và thực vật Các vi sinh vật mẫn cảm với chất kháng sinh ở những mức độ khác nhau, đa số các vi khuẩn gram dương mẫn cảm với chất kháng sinh hơn các vi khuẩn gram âm

1.1.2.2 Những nghiên cứu trên thế giới và ở nước ta về kháng sinh:

- Trên thế giới: Kể từ khi Penicillin được Alexander Fleming phát hiện vào 1928, và được Abraham, Chain và Florey tinh chế ở dạng ổn định có tác dụng chữa bệnh vào 1941 (www.vinachem.com.vn), trong hơn nữa thế kỷ qua, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thần kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực dược phẩm của thế giới, với những kết quả ngày càng mới

lạ, với nhu cầu ngày càng tăng và với lượng sản xuất ngày càng lớn Hơn thế nữa, cạnh bên chất Penicillin đầu đàn, có thêm nhiều loại kháng sinh được chiết xuất từ nấm, từ vi khuẩn, từ xạ khuẩn Những thành tựu tách chiết kháng sinh từ xạ khuẩn có minh chứng qua một số patent: patent số 3968204 Hamill,

1976 tách chiết kháng sinh A-2315 từ Actinoplanes philippinensis NRRL

5462; patent số 4331658 Hamill, 1982 tách chiết kháng sinh A-32887 từ

Streptomyces albus NRRL 11109; patent số 4537770 Michel, 1985 tách chiết kháng sinh A41030 từ Streptomyces virginiae NRRL 12525; patent số

4637981 Hershberger, 1987 tách chiết kháng sinh A-4696G từ Actinoplanes missouriensis; patent số 4659660 Hamill, 1987 tách chiết kháng sinh A47934

từ Streptomyces toyocaensis NRRL 15009; patent số 5229362 Kirst, 1993 tách chiết kháng sinh A10255 từ Streptomyces gardneri. Đó là những patent của

Mỹ, Mỹ cũng là một trong những nước sản xuất kháng sinh hàng đầu trên thế giới, bên cạnh các nước phát triển công nghiệp kháng sinh thì Hàn Quốc cũng

đã có nền công nghiệp sản xuất kháng sinh, ngoài những kháng sinh tinh khiết dùng điều trị bệnh còn có kháng sinh dưới dạng chế phẩm sinh học như

Biocontrol dưới dạng lỏng có thành phần bao gồm một số chủng Streptomyces sp.; Trung Quốc cũng là nước hết sức chú trọng phát triển công nghiệp kháng

Trường Sa, Hắc Long Giang, Quảng Châu để sản xuất các nguyên liệu và các thành phẩm kháng sinh từ vi sinh vật

- Ở Việt Nam: chúng ta cũng đã có nhiều cố gắng trong việc tìm kiếm và sản xuất chất kháng sinh phục vụ cho nhu cầu điều trị bệnh, tách chiết cũng như nổ lực hợp tác với nước ngoài để sản xuất kháng sinh mặc dù kết quả chưa đáp ứng được so với nhu cầu thực tế Những cố gắng ấy có thể tổng kết qua các mốc thời gian sau: Năm 1950, trong kháng chiến chống Pháp, GS Ðặng Văn Ngữ đã nuôi cấy Pénicillum và dùng dịch nuôi cấy để chữa vết thương cho thương binh; Năm 1962 - 1965, Liên Xô (cũ), theo yêu cầu của ta,

đã khảo sát và thiết kế cho Việt Nam một nhà máy sản xuất thuốc kháng sinh,

dự định đặt ở Phú Thọ (Bắc bộ), nhưng sau đó phải ngưng lại vì chiến tranh

mở rộng ra miền Bắc; Năm 1968, Trung Quốc giúp ta thiết kế xưởng Tetracyclin 5 tấn/năm, trước dự định xây dựng ở Cao Bằng, sau chuyển về Sơn Tây rồi Việt Trì, nhưng do quan hệ giữa hai nước lúc đó có trục trặc nên công trình bỏ dở; Năm 1970, Ðơn vị nghiên cứu chuyên đề kháng sinh do GS Trương Công Quyền làm chủ nhiệm ra đời, giáo sư và cộng sự đã có nhiều công trình nghiên cứu về kháng sinh: phân lập được một tập hợp khá lớn các chủng vi sinh vật trong đó đặc biệt có xạ khuẩn sinh kháng sinh có nguồn gốc

từ đất Việt Nam Đã tiến hành nghiên cứu sinh lý sinh hoá các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh và tách chiết, định loại được một số kháng sinh Từ 1985 đến 1990, trong chương trình nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước mã số 64C,

Bộ Y tế đã cho nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclin Cũng trong thời gian này (từ 1985 – 1990), Liên Xô (cũ) thỏa thuận giúp ta xây dựng nhà máy kháng sinh 5 tấn/năm tại Xí nghiệp Dược phẩm TW 24, TPHCM Công việc đang triển khai thì tình hình chính trị ở Liên Xô cũ chuyển biến không thuận lợi, nên công trình đình lại vào năm

1992 (theo Nguyễn Duy Cương, 2005)

Đến nay, chúng ta cũng đã có một số dây chuyền bào chế kháng sinh đạt tiêu chuẩn GMC Aseane nhưng nguyên liệu phải nhập từ nước ngoài như:

tại xí nghiệp dược 24 tại thành phố Hồ Chí Minh nguyên liệu Ampicinlin và Amocillin từ nguyên liệu trung gian 6-APA nhập từ Belarut; bên cạnh đó vào 1999- 2000 tổng công ty dược Việt Nam đã chủ trì đề tài “Nghiên cứu công nghệ điều chế 6-APA, 7-ADCH và cephalexin từ penicillin G” và đề tài

“Nghiên cứu áp dụng công nghệ sản xuất các kháng sinh mới, hiệu quả bằng nguyên liệu trong nước” Gần đây lãnh đạo Tổng công ty Hóa chất và tổng công ty Dược đã có văn bản trình chính phủ về hợp tác xây dựng nhà máy sản xuất 300 tấn/ năm các cephalexin bán tổng hợp thế hệ 1 và thế hệ 3 từ nguyên liệu trung gian 7-ADCA và 7-ACA nhập khẩu Từ tình hình trên cho thấy sản xuất nguyên liệu kháng sinh trong nước là một nhu cầu hết sức cấp bách đối với chiến lược quốc gia phát triển ngành dược Việt Nam Trong chiến lược phát triển khoa học công nghệ Việt Nam từ nay đến 2010 (do thủ tướng Phan Văn Khải ký) đã xác định Việt Nam phải sản xuất kháng sinh và phải sản xuất

tự túc 60% thuốc dùng trong nước.(theo www.vinachem.com.vn )

Với tiêu chí trên cho thấy rất cần những công trình nghiên cứu và tiến tới sử dụng các chủng vi sinh vật trong đó đặc biệt là xạ khuẩn để sản xuất các kháng sinh dùng cho nhu cầu rất lớn được đặt ra hiện nay

1.1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh:

1.1.2.3.1 Điều kiện nuôi cấy:

- Độ thông khí: yếu tố thông khí ảnh hưởng quyết định đến sinh tổng hợp chất kháng sinh Các xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nên

độ thông khí để đạt hiệu suất cực đại đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng khả năng sinh kháng sinh; lượng không khí cung cấp vào môi trường nuôi cấy là lưu lượng thổi khí 1 thể tích môi trường /1 phút

- Nhiệt độ: có những loài xạ khuẩn ưa nhiệt hay sống tốt khi nhiệt

độ của môi trường cao nhưng đa số các xạ khuẩn sinh kháng sinh mà chúng ta khảo sát thường phát triển tốt ở nhiệt độ 28OC – 30OC (nhiệt độ phòng thí

- pH: sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc đáng kể vào độ pH của môi trường Độ pH thích hợp để sinh tổng hợp chất kháng sinh là pH trung tính, ở pH acid và kiềm sẽ ức chế quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh

- Nhân giống: Qua thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp chất kháng sinh không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng, nghĩa là tuổi và khả năng đồng đều về mặt di truyền và hoạt tính trao đổi chất của giống phản ánh điều kiện nuôi cấy Điều kiện của môi trường nhân giống cũng như thời gian nhân giống cũng khác nhau tùy vào từng chủng và tuổi của bào tử giống

- Hình thức lên men: trong sinh tổng hợp chất kháng sinh phương pháp nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định; Qui trình sản xuất chất kháng sinh thường được nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có khuấy đảo và sục khí

1.1.2.3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy:

Sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật phụ thuộc chặt chẽ vào môi trường lên men Trước hết là nguồn C, N và phosphat vô cơ Các vi sinh vật khi đã phát triển trên môi trường nhân giống và cấy truyền lên môi trường lên men có nguồn gốc C, N và các thành phần môi trường khác nhau sẽ dẫn đến khả năng sinh các chất khác nhau

- Nguồn cacbon: quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng sâu sắc thông qua các nguồn cacbon khác nhau Tuỳ thuộc vào từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp; các loại đường đơn: Glucose, Manitole, … hay các loại đường kép: Saccarose, Lactose, … cũng có thể là các loại tinh bột hoặc các chất có thành phần không xác định như rỉ đường, đại mạch, …Đối với xạ khuẩn, nhiều chủng có hoạt tính amylaza cao nên nguồn cacbon thích hợp đối với chúng là tinh bột

- Nguồn nitơ: nguồn và nồng độ nitơ trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh Sự dư thừa các ion amin hoặc các nitơ chuyển hóa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp chất kháng sinh

như Erytromoxin, Leucomicin, Novobioxin, … Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn thường đòi hỏi có cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ trong môi trường nguồn nitơ hữu cơ thích hợp là các hợp chất từ thực vật như: bột đậu tương, bột đậu xanh, cao ngô, … nguồn nitơ vô cơ là: muối amon hoặc nitrat

1.1.2.4 Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh:

Có nhiều quan điểm về chất kháng sinh, có quan điểm cho rằng chất kháng sinh là sản phẩm thải của quá trình trao đổi chất của xạ khuẩn, cũng có quan điểm cho rằng chất kháng sinh là chất tham gia cạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trường sống tự nhiên Dù theo quan điểm nào đi nữa thì các con đường sinh ra chất kháng sinh từ xạ khuẩn được tóm tắt như sau:

- Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất trao đổi sơ cấp duy nhất (như chất kháng sinh cloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm nucleozit)

- Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau (như các chất kháng sinh lincomicin, novobiocin)

- Chất kháng sinh được tổng hợp bằng cách polyme hóa các chất trao đổi bậc 1, sau đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác Có thể phân biệt thành 4 dạng:

+ Chất kháng sinh nhóm polypeptit theo con đường trùng hợp các acid amin: bacitracin, polymycin

+ Chất kháng sinh được tạo thành nhờ phản ứng polyme hóa các đơn

vị acetat, propionat: chất kháng sinh nhóm macrolit, tetracilin, rifamicin

+ Chất kháng sinh aminoglycozit được tạo thành nhờ các phản ứng trùng hợp polysacarit: neomicin, streptomycin

+ Chất kháng sinh được hình thành theo con đường tổng hợp các hợp chất izopreonit từ các đơn vị acetat…

Thành tế bào vi khuẩn có cấu tạo từ peptidoglycan gồm các đơn vị murein, đó là disacarit pentapeptit (N – acetylglucozamin, acid N – acetyl muramic) gắn với chuổi peptapeptit

Cycloserin có cấu tạo tương tự D – alanin, nó có thể cạnh tranh với

D – alanin để gắn vào các enzyme alanin – racemaza và D – alanin – D alanin synthetaza ngăn cản sự tạo thành D – alanin – D – alanin

Các chất kháng sinh β – lactam thấm qua thành tế bào dễ dàng gắn lên màng sinh chất: ở đây một số protein có khả năng gắn với chất kháng sinh gọi là PBP (penicillin binding protein) mỗi protein có ái lực riêng với một loại

β – lactam ảnh hưởng trực tiếp lên quá trình sinh tổng hợp murein

1.1.2.5.2 Ức chế tổng hợp protein:

- Các chất kháng sinh ức chế tổng hợp protein:

Một số chất kháng sinh như cloramphenicol gắn vào tiểu đơn vị 50S của riboxom, chất này phong bế peptiditranpheraza ngăn cản sự kéo dài mạch polypeptit.(xem hình 1.6)

Các chất kháng sinh thuộc nhóm macrolit như: erythromycin, lincomycin, … ức chế việc giải phóng acid amin khỏi phức hệ aminocyl – ARNt – ribixom – ARNm (xem hình 1.6)

Tetracilin gắn lên receptor ở cả đơn vị 30S và 50S ức chế quá trình tổng hợp protein (xem hình 1.6)

Puromycin, chất ức chế dịch mã có cấu trúc gần giống với đầu 3’của một tyrocyl – ARNt ở vị trí A, do đó nó có thể tác dụng với peptidyl – puromycin Peptidyl – puromycin không chuyển sang vị trí P, không tham gia vào quá trình vận chuyển, do đó không tiếp tục quá trình kéo dài chuổi polypeptit và tách ra khỏi riboxom

- Các chất kháng sinh dẫn đến sinh tổng hợp protein bất thường:

Một số chất có thể gắn với phần 30S của riboxom làm thay đổi cấu hình không gian của tiểu thể này, ảnh hưởng đến việc gắn RNAm vào riboxom làm rối loạn đọc

Ví dụ: Streptomycin tác dụng làm cho codon UUU mã hóa cho phenyl bị đọc sai thành AUU, mã hóa cho izolơcin do vậy acid amin phenylalanime bị thay bằng izolơcin.(xem hình 1.6)

Hình 1.6: Sự ức chế tổng hợp protein của một số chất kháng sinh

1.1.2.5.3 Phá hủy màng nguyên sinh chất:

Đó là các chất kháng sinh như Bacitracin, Polymicin

Polymycin làm phá vỡ lớp phospholipid của cấu trúc màng nguyên sinh chất làm cho các chất khuếch tán ra khỏi tế bào, tế bào sẽ chết

Chất kháng sinh polyen tác động lên thành phần sterol của màng Màng tế bào vi khuẩn không chứa sterol nên thường không bị kháng sinh thuộc nhóm này tác động, ngoại trừ tế bào nấm, tế bào động vật và tế bào người (do có thành phần sterol trên màng)

1.1.2.5.4 Ức chế tổng hợp acid nucleic:

Những chất kháng sinh như: mitomycin, actinomycin, mitramycin,

Một số chất kháng sinh chống virus như vidarabin, axiclovir có cấu trúc giống acid nucleoic do đó có thể gắn với enzym cần tổng hợp DNA của virus

Rifamycin, novobiocin ức chế RNA polymeraza, flucitocin ức chế timidilatsintetaza, ảnh hưởng trực tiếp đến tổng hợp RNA

1.1.2.5.5 Ức chế cạnh tranh:

Những chất kháng sinh này có cấu trúc gần giống với chất trao đổi bình thường (acid amin, coenzym) nên chúng có thể tranh chấp enzym hoặc có thể thay thể chất trao đổi và làm bất hoạt cơ chất này

Ví dụ: ở vi khuẩn, acid folic (vitamin B9) là chất thiết yếu để tổng hợp tạo thymin, chất này được tạo thành qua quá trình chuyển hóa từ acid paminobenzoic (APAB) Sulfamit do có cấu trúc giống APAB nên có thể thay thế APAB và không tạo acid folic

1.1.3 Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh:

Chất kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp nên vừa nằm trong tế bào vừa nằm trong dịch nuôi cấy – chúng có thể không hoà tan hay hòa tan trong dịch nuôi cấy, do vậy trong tách chiết chất kháng sinh người ta thường tiến hành tách chiết kháng sinh từ tế bào (sinh khối) và từ dịch nuôi cấy Có nhiều phương pháp khác nhau để tách chiết chất kháng sinh như:

- Tách chiết chất kháng sinh bằng phương pháp hấp phụ: hấp phụ nhằm mục đích gắn hợp chất cần thiết có trong dung dịch nước ở nồng độ thấp vào một chất hấp thụ gắn thích hợp Sau đó lại phải giải hấp phụ chất đã gắn ở trên bằng một thể tích nhỏ của một dung dịch khác ở một pH chính xác Phương pháp này cho phép: cô lập, tinh chế, cô đặc sản phẩm cần thu nhận Trong các phòng thí nghiệm và trong sản xuất công nghiệp, người ta sử dụng các chất hấp thụ như than hoạt tính có ưu điểm là ít tính đặc hiệu, ít nhạy cảm với pH

và có diện tích tiếp xúc lớn, thường đối với xạ khuẩn người ta sử dụng 2% than hoạt tính trong dịch nuôi cấy xạ khuẩn đã loại bỏ sinh khối và pH = 7 khuấy 1 giờ và lọc qua giấy lọc Than hoạt tính được giải hấp phụ bằng dung

môi hữu cơ (aceton) với tỉ lệ 1:3 trong 6 giờ.; ngoài than hoạt tính còn có Oxit nhôm và Gel silic là 2 chất được nạp vào các cột dùng trong các quá trình phân ly của các sắc tố hay một số steroit (Nguyễn Đức Lượng, 2001)

- Tách chiết kháng sinh bằng nhựa trao đổi ion: các loại nhựa này là những phân tử của styren trùng hợp với sự có mặt của một lượng nhất định divinyl benzen, sự kết hợp đến 12% divinylbenzen sẽ tạo các cầu nối giữa các mạch trong quá trình trùng hợp, cho phép tạo các mạng polyme làm tăng độ xốp của chúng và làm khung cho nhiều nhóm hóa học, tạo ra tính đặc biệt cho mỗi loại nhựa những nhựa cationit mạnh chứa tới 3 nhóm sunfonic trong các phân tử benzen làm cho nhựa có tính acid mạnh Những chất trao đổi ion cenllulotic là những este của cenlluloza, chúng đóng vai trò của chất trao đổi anion hay cation Ngoài ra chúng còn có những tính chất đặc biệt như hút nước, khả năng trao đổi tăng nhanh hơn 5m Eq/g Đối với tách chiết sản phẩm trao đổi ở xạ khuẩn thường người ta sử dụng 5% nhựa trao đổi ion trong dịch nuôi cấy xạ khuẩn đã loại bỏ sinh khối và lắc trên máy lắc 2 giờ Sau khi loại dịch lọc, nhựa trao đổi được rửa bằng nước cất Giải hấp phụ bằng NH4OH 1N

và HCl 1N, sau khi giải hấp phụ đem cô chân không ở 60OC và tủa kháng sinh bằng aceton (theo Nguyễn Đức Lượng, 2001)

- Phương pháp tách chiết chất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ: quá trình tách chiết bằng dung môi hữu cơ thường được thực hiện qua 2 giai đoạn: đầu tiên là giai đoạn trộn 2 pha nước và dung môi để tăng bề mặt tiếp xúc, đảm bảo các phân tử của các chất lỏng tiếp xúc chặt chẽ với nhau thời gian khuấy phải đủ để cho phép khuyếch tán mạnh các sản phẩm phải chiết vào dung môi hữu cơ; cuối cùng là giai đoạn nhũ dịch sau khi lắng, các dung môi được dùng bao gồm các chất như sau: các ancol (butanol, isopropanol, propanol.), các este (acetal, butyl, amyl), các ceton (metyl ityl aceton, metylbutyl ceton), các ete (ete izopropilic, dioxan), benzen, phenol, pyridin,

lực của nó với chất cần tách chiết, trong đó độ hoà tan của dung môi lại phụ thuộc vào nhiệt độ, ta chọn nhiệt độ sao cho độ hoà tan của dung môi là nhỏ nhất

1.1.3.1 Tách chiết kháng sinh từ sinh khối:

Có nhiều phương pháp tách chiết gồm các phương pháp sau: phương pháp cơ học và siêu âm (dùng thiết bị Edebo,và thiết bị Rogers), phương pháp enzym (sử dụng chính enzym của tế bào phá vở tế bào đối với tế bào nấm men hoặc sử dụng enzym bên ngoài để phá vở những thành phần tương ứng trên thành tế bào của vi sinh vật), phương pháp hóa lý (gây sốc nhiệt), phương pháp hoá học Với phương pháp tách chiết kháng sinh bằng hóa học dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh của 1 số hóa chất, người ta cho 1 số hóa chất vào như NaCl, Foluen, Cồn … các chất này sẽ tạo ra một áp suất thẩm thấu đủ mạnh để làm tế bào bị vỡ và giải phóng các chất trong tế bào ra (Nguyễn Đức Lượng, 2001), bên cạnh đó, để việc tách chiết kháng sinh đạt hiệu quả cao từ sinh khối đòi hỏi khả năng hoà tan của chất kháng sinh trong tác nhân chiết phải lớn, hay khả năng tách chiết phụ thuộc vào độ hoà tan của chất dùng để tách chiết

Trước khi tách chiết, sinh khối cần rửa bằng nước để loại bỏ thành phần môi trường; các dung môi dùng để tách chiết có nhiều loại như: etyl acetat, butanol, etanol, metanol, … nhưng trong đó aceton là dung môi có cực thấp nhất thường hay được sử dụng nhiều hơn trong tách chiết chất kháng sinh

1.1.3.2 Tách chiết kháng sinh từ dịch lọc:

Cũng tương tự như tách chiết kháng sinh từ sinh khối, các chất kháng sinh trong dịch lọc có trọng lượng phân tử thấp thường hoà tan trong nước và dung môi hữu cơ nên người ta thường lựa chọn dung môi hòa tan chất kháng sinh mạnh để tách kháng sinh ra khỏi môi trường dịch lọc; butanol là dung môi thường được sử dụng

Dù tách chiết kháng sinh từ dịch lọc hay từ sinh khối đều phải trải qua quá trình loại bỏ dung môi bằng cách cô chân không ở nhiệt độ thường dưới 60OC, sau đó làm giảm khả năng hoà tan của chất kháng sinh vào dung môi bằng cách hạ nhiệt xuống thấp Chất kháng sinh thu được từ sinh khối và dịch lọc gọi là kháng sinh thô là nguyên liệu cơ sở cho tinh sạch kháng sinh 1.1.3.3 Tinh sạch chất kháng sinh:

Để tinh sạch chất kháng sinh, người ta có thể thay đổi dung môi hay chất hấp phụ kháng sinh (than hoạt tính) để loại bỏ các tạp chất có đặc tính hoà tan được trong dung môi tách chiết trước đó

Tuy nhiên, phương pháp tinh sạch chất kháng sinh có hiệu quả cao được thực hiện là bằng phương pháp sắc ký hấp phụ, sắc ký bản mỏng, hay sắc ký lỏng cao áp

1.2 Các nhóm chất kháng sinh chính có nguồn gốc từ xạ khuẩn:

1.2.1 Phân loại các chất kháng sinh từ xạ khuẩn:

Có nhiều khoá phân loại khác nhau để phân loại chất kháng sinh như: theo cấu trúc hoá học, theo vị trí tác dụng, theo phương thức tác dụng, theo phổ tác dụng đối với vi khuẩn thậm chí trong y học, trong nông nghiệp, trong hoá dược người ta cũng có những cách phân loại kháng sinh khác nhau, trong luận văn này chúng tôi dựa vào khoá phân loại của Masaji Sezaki & Shinji Miyadoh, 2001; chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn được phân chia 12 nhóm sau:

1.2.1.1 Các kháng sinh β-lactam:

Các chất kháng sinh này có khung cơ bản là một vòng betalactam, là một amin vòng 4 cạnh; vòng này được gắn với một vòng thiazolidin tạo thành khung penam (vòng thiazolidin có 5 cạnh no), các cephem (vòng có 6 cạnh chưa no), các penem (có vòng 5 cạnh chưa no), các monobactam (chỉ có vòng betalactam) – đó là 4 phân nhóm trong nhóm kháng sinh betalactam Các

Hình 1.7: Kháng sinh penicilin.(B: vòng betalactm; A: vòng thiazolidin)

Các chất kháng sinh trong nhóm này có tác dụng lên vỏ vi khuẩn, ngăn phản ứng sinh tổng hợp của vỏ này, nên các loại kháng sinh thuộc nhóm này có ác dụng kìm vi khuẩn tuy nhiên ở vi khuẩn gram ( - ) màng tế bào ngoài cùng có 1 lớp lipid, ngăn cản trực tiếp của chất kháng sinh

1.2.1.2 Các kháng sinh aminoglycosid:

Các kháng sinh này có cấu trúc heterosid bao gồm một phần genin thuộc nhóm aminocyclitol gắn với các phần đường trong đó có phần đường amino (osamin) Các genin là những polyol vòng (cyclitol) trong đó có 2 nhóm hydrocyl được thay thế bằng các chức amin hay guanidin Những kháng sinh thuộc nhóm này bao gồm: Streptomycin (hình 1.8), Neomycin, Gentamicin, …

Hình 1.8: Kháng sinh Streptomycin Các chất kháng sinh có nguồn gốc vi sinh vật thuộc nhóm này được

tách chiết từ môi trường nuôi cấy của các chủng: Streptomyces, Microspora và Bacillus Việc chiết aminosid từ môi trường nuôi cấy thường thực hiện qua

trao đổi cation để giữ các kháng sinh có tính base (theo Nguyễn Khang, 2005), với sơ đồ tách chiết sau:

Sơ đồ tách chiết 1 aminosid (theo Nguyễn Khang, 2005)

1.2.1.3 Các kháng sinh Macrolide:

Là các kháng sinh có heterosid mà genin là một vòng lactor có chứa nhiều nguyên tử (vòng lớn – macrocycle) số lượng các nguyên tử của vòng thường từ 12 – 17 hay nhiều hơn

Người ta còn xếp cạnh các macrolid này với các chất synergistin và lincosamid Các kháng sinh là: Erythromycin, Oleandomycin, Azithromycin (hình 1.9), …

Hình 1.9: Kháng sinh Azithromycin Các chất kháng sinh thuộc nhóm này có vòng 14 nguyên tử với nhóm –N(CH3)2 của đường amin có tác dụng quyết định về kháng sinh gắn vào riboxom của vi khuẩn

1.2.1.4 Các kháng sinh polyene macrolide:

Các kháng sinh thuộc nhóm này có vòng lacton lớn Theo Berdy (1974) chất kháng sinh này có 3 – 7 dây nối đôi và được chia thành các nhóm nhỏ: dien, trien, tetraen, pentaen, hexaen, heptaen với công thức tổng quát: -

CH2-(CH=CH)8-CH2- Hầu hết các chất kháng sinh thuộc nhóm này có nhân amino saccaroza (mycozamin) đính vào vòng lacton bằng liên kết glucozit Một vài chất kháng sinh thuộc nhóm phụ heptaen có nhân thơm (4-amino acetophenose) hoặc N-metyl (4-amino acetophenol) liên kết hóa trị với các nguyên tử cacbon của vòng lớn Một đặc điểm khác của nhóm kháng sinh macrolic polyen là sự có mặt rất nhiều các nhóm hydroxyl trong phân tử của chúng; sự có mặt của các nhóm này cùng với nối đôi trong cấu tạo phân tử làm cho kháng sinh có tính chất lưỡng tính Chất kháng sinh ít tan trong ete, rượu nhưng tan trong dung môi có cực Các chất kháng sinh thuộc nhóm này có tác

dụng phá vỡ tính thẩm thấu của màng tế bào chất, gắn vào sterol của màng rồi phá hủy làm rối loạn tính thấm

Nhiều chất kháng sinh nhóm polien có hoạt phổ kháng khuẩn khác nhau, có loại ức chế cả protozoa, tế bào ung thư, tuyến trùng gây bệnh thực vật các kháng sinh có thể kể như: Rimocidin (hình 1.10), Pimaricin, …

Hình 1.10: Kháng sinh Rimocidin 1.2.1.5 Các kháng sinh macrocyclic lactose khác:

Chất kháng sinh thuộc nhóm này có chứa vòng lactone lớn nối các aminosacarose

Monorden

Hình 1.11: Kháng sinh Monorden

1.2.1.6 Các kháng sinh amino acid và peptide:

Các chất kháng sinh thuộc nhóm này có cấu trúc hóa học bao gồm các chuỗi acid amin, cơ bản là cấu trúc peptit mạch vòng Các chất kháng sinh thuộc nhóm này có đại diện là: polymicin, bacimycin, Sinanomycin (hình 1.12), …

Hình 1.12: Kháng sinh Sinanomycin 1.2.1.7 Các kháng sinh glycopeptide:

Nhóm kháng sinh này có cấu trúc hóa học giống như nhóm peptide gồm các chuỗi acid amin mạch vòng, nhưng có gắn thêm các nhóm chức glycose Các kháng sinh thuộc nhóm này là: Vancomycin (hình 1.13), Bleomycin, …

Hình 1.13: Kháng sinh Vancomycin Các kháng sinh thuộc nhóm này chỉ có tác dụng mạnh với vi khuẩn gram (+) và không kháng với những vi khuẩn gram (-)

1.2.1.8 Các kháng sinh Tetracycline:

Là các kháng sinh có 4 vòng, những kháng sinh của nhóm này là dẫn chất của octahydronaphtalen được lấy từ môi trường nuôi cấy một số loài

Streptomyces Những chất kháng sinh này có phổ kháng sinh rộng bao gồm

các vi khuẩn gram âm, như các kháng sinh: Tetracycline (hình 1.14), Minocycline, …

Hình 1.14: Kháng sinh Tetramycin

1.2.1.9 Các kháng sinh quinone và anthracycline:

Là các kháng sinh có cấu trúc 3 vòng anthracene và có gắn các phân

tử oxy bởi nối đôi (cấu trúc quinone) Các kháng sinh gồm: Nogalamycin (hình 1.15), Streptonigrin, …

Hình 1.15: Chất kháng sinh Nogalamycin

1.2.1.10 Các kháng sinh ansamycin:

Các kháng sinh ansamycin là những kháng sinh phát triển từ nhóm kháng sinh macrolactam có nguồn gốc vi sinh vật, các kháng sinh này có cấu trúc 1 vòng mà trong đó có 1 nhánh aliphatic ansa dưới hình thưc là 1 cầu nối giữa 2 vị trí không nằm kế cận của vòng π – system; những kháng này kháng nấm, kháng khuẩn, kháng u những đại diện cho nhóm kháng sinh này là những benzenic ansamycin với 17 cacbon và 1 nguyên tử N chuổi ansa (hình 1.16a)

Hình 1.16a: Cấu trúc của kháng sinh Ansamycin

Các kháng sinh nguồn gốc từ xạ khuẩn thuộc nhóm này như:

geldanamycin (hình 1.16b), herbimycin A, …

Hình 1.16b :1.2.1.11 Các kháng sinh Nucleoside:

Các nhóm kháng sinh thuộc nhóm này có cấu trúc hóa học dựa trên cấu trúc nucleotic (bao gồm pyrimidin hay purine) nhưng có sự thay đổi trên gốc đường và trên phần baze sự thay đổi này có ảnh hưởng sâu sắc đến tác động sinh học Các kháng sinh này có khả năng kháng virus, kháng vi khuẩn, kháng u (ung thư) Những kháng sinh nucleoside có nguồn gốc từ xạ khuẩn gồm: tunicamycin, polyoxin, puromycin, …

Hình 1.17: chất kháng sinh Tunicamycins 1.2.1.12 Các kháng sinh Polyether:

Là các lọai kháng sinh trong cấu trúc có nhiều nối ether (-o- )

Hình 1.18: Chất kháng sinh Nanchangmycin 1.2.2 Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn:

Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn phải kể sớm nhất là chất kháng sinh Nistatin được thu nhận từ dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn

Streptomyces noursei (do Hansen và Brown, 1942) để chữa trị bệnh nấm cho

người; về sau người ta đã thu nhận được nhiều chất kháng sinh có nguồn gốc

vi sinh vật phần lớn từ môi trường nuôi cấy xạ khuẩn thuộc chủng

Streptomyces; các kháng sinh thuộc nhóm này phần lớn thuộc nhóm kháng

kích cở vòng genin, quan trọng nhất là các chất kháng sinh có vòng 14 đến 16 nguyên tử hóa học

1.3 Vai trò của xạ khuẩn và chất kháng sinh trong phòng chống nấm bệnh

và tuyến trùng hại cây trồng:

1.3.1 Thực trạng về bệnh hại cây trồng:

Ở các nước sản xuất nông nghiệp, bệnh cây đã gây ra những thiệt hại kinh tế nghiêm trọng Các dịch bệnh đạo ôn hại lúa, bệnh bạc lá (do vi khuẩn gây ra), bệnh vàng lụi (do virus gây ra), bệnh khô vằn (do nấm gây ra), …đã gây tổn thất lớn không những về năng suất mà còn làm mất tính ổn định của giống cây trồng Theo thống kê của tổ chức lương nông thế giới cho thấy: các loại cây trồng trên đồng ruộng hiện nay phải chống đở với 100.000 loài sâu hại khác nhau, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh; thiệt hại hàng năm khoảng 20% (tức 1/5) sản lượng lương thực thực phẩm trên thề giới bị mất trắng

Sau đây là một số bệnh gây thiệt hại lớn phổ biến ở Việt Nam:

1.3.1.1 Bệnh đạo ôn trên lúa (do Piricularia oryzae gây ra):

Là bệnh phổ biến ở các nước trồng lúa kể cả ở Việt Nam, tại đồng bằng sông cửu long, hàng năm thường có 2 thời điểm xuất hiện bệnh nhiều nhất là vào tháng 11 -12 dương lịch và tháng 5 -6 dương lịch Các huyện Châu thành, Cai lậy, chợ gạo Tiền giang; Phú tân, Chợ mới An giang; Thạnh trị Cần thơ là những nơi thường có bệnh

Bệnh gây thiệt hại cho lúa ở giai đoạn mạ và nảy chồi; nếu nhiễm trể

ở giai đoạn trổ, bệnh làm thối đốt thân thối cổ gié nên làm đổ gãy, làm hạt lép hay làm giảm trọng lượng hạt ở Nhật - số liệu từ năm 1953 – 1960 cho thấy sản lượng thất thu hàng năm từ 1,4 – 7,3%, trung bình là 2,98% Tính riêng năm 1960, thất thu do bệnh cháy lá chiếm 24,8% trong tổng thất thu do sâu bệnh thiên tai đối với bệnh thối cổ gié , người ta tính cứ 10% gié bị nhiễm bệnh thì năng suất thất thu 6% và tỷ lệ hạt kém phẩm chất gia tăng 5% bệnh

do nấm Pyricularia oryzae gây ra, vết bệnh là các đốm hoặc vết thương trên lá

(Hình 1.19)

Hình 1.19: Triệu chứng đốm trên lá của bệnh cháy lá lúa do nấm Pyricularia oryzae gây ra

1.3.1.2 Bệnh héo vàng cây khoai tây (do Fusarium oxysporum gây ra):

Gây thiệt hại lớn ở các nước trồng khoai tây trên thế giới, ở Việt Nam có nơi bệnh gây thiệt hại 40% năng suất (theo Vũ Triệu Mân, 1998)

Fusarium oxysporum tấn công gây hại ở vị trí gốc thân, cổ rễ và củ

Ở gốc cây vết bệnh màu nâu hoặc xám nhạt bao quanh gốc thân gây hiện thối khô tóp lại, thường trên vết bệnh có bao phủ lớp nấm trắng thưa, ngoài ra bệnh còn gây hại ở củ và mầm củ, củ bị nấm xâm nhập nhìn bề ngoài bình thường nhưng phần thịt củ có nhiều vòng vân vàng hoặc nâu và ăn sâu vào trong củ, khi đó gọi là bệnh thối khô củ khoai tây

1.3.1.3 Bệnh khô vằn hại lúa: (do Rhizoctonia solani gây ra)

Bệnh phân bố ở diện rộng ở các vùng trồng lúa trên thế giới, ở nước

ta bệnh khô vằn là bệnh nghiêm trọng thứ 2 sau bệnh đạo ôn (do nấm

Pyricularia)

Phạm vi ký chủ của nấm Rhizoctonia sp bao gồm trên 180 loài cây

trồng, nấm phát sinh mạnh trong nhiệt độ cao, ẩm độ cao; vị trí gây bệnh là bẹ

(hình 1.20); tương tự ở lá và cổ bông Trên vết bệnh ở vi trí gây hại đều xuất hiện hạch nấm màu nâu, hạch nấm rất dễ dàng rơi ra khỏi vết bệnh và nổi lên mặt nước ruộng

Hình 1.20: Vết bệnh khô vằn trên lá lúa và hạch nấm Rhizoctonia solani

1.3.1.4 Bệnh thối gốc và lở cổ rễ:

Bệnh do nhiều loại nấm gây ra: Fusarium sp, Rhizoctonia solani, Pythium, Phytophthora spp., … Trong số đó chủ yếu gây hại do 3 chi: Fusarium, Rhizoctonia và Pythium Chi Fusarium phân bố rộng trong tự

nhiên, sống hoại sinh trong đất, trên xác thực vật và ký sinh trên cây Chúng thường tiết ra chất kích thích sinh trưởng (giberilin) làm cho cây dài ra, lá úa vàng, không ra hoa kết quả hoặc tạo ra các độc tố gây hại cho cây trồng như

acid furavic, phitonivnin Loài Fusarium oxysporum, gây bệnh thối rễ ở cây

lương thực, cây nông nghiệp, rau xanh và cây rừng Cây bị bệnh thối rể thường chết héo do không hút được nước cung cấp cho cây; loài này còn gây bệnh mốc sương, bệnh thối khô, thối ướt ở khoai tây gây thiệt hại cho năng suất cây trồng

Đây là bệnh phổ biến ở nước ta và trên thế giới; bệnh xuất hiện đặc trưng ở rễ, cổ rễ và gốc thân sát mặt đất, vết bịnh thâm đen làm rễ không hút được nước cung cấp cho cây làm cây chết đổ gục trên ruộng Lúc đầu vết bệnh chỉ là 1 chấm đen sau lan rộng ra rất nhanh bao quanh cổ rễ.(hình 1.21)

Hình 1.21: Bệnh lở cổ rể ở cây đậu do Nấm Rhizoctonia sp.

Pythium làm cây chết nhanh từ lúc 2 lá mầm Bệnh chết rạp thối rễ

phổ biến vào mùa mưa, nhiệt độ tương đối thấp phạm vi ký chủ rộng hại cây con cà chua, ớt, họ đậu (hình 1.22), vải, …bệnh thối rễ thường gây ra do một

nhóm nhiều loài nấm bao gồm: Pythium, Rhizoctonia solani, Fusarium solani,

… nguồn bệnh tồn tại lâu dài trong đất, chúng sống trên tàn dư cây trồng trong

đất, riêng Pythium có khả năng sống ẩn trong đất trồng mà không có tàn dư

cây trồng

Hình 1.22: Bệnh chết rạp thối rể trên cây đậu do Pythium sp gây ra

1.3.1.6 Tuyến trùng hại cây trồng:

1.3.1.6.1 Tác hại của tuyến trùng lên cây trồng:

Bên cạnh các bệnh do nấm gây nhiều tổn thất đến cây trồng thì một đối tượng động vật không xương: tuyến trùng cũng là đối tượng hết sức nguy hiểm cho cây trồng

Tuyến trùng gây hại thực vật (Phytonematodes) phần lớn sống trong

đất phá hại bộ rể của cây (xem hình 1.23, 1.24) chúng gây tác hại lớn đến sinh trưởng, năng suất và phẩm chất cây trồng Chúng tập trung nhiều ở tầng đất canh tác khoảng độ sâu 5 – 20 cm Tuyến trùng thực vật là một trong những đối tượng dịch hại nguy hiểm; chúng có mặt và gây hại trên các loại cây khác

nhau trên các loại đất khác nhau trong vườn ươm và trên đồng ruộng; triệu chứng gây hại dễ nhầm lẫn với triệu chứng do các nguyên nhân khác như thiếu chất dinh dưỡng, bệnh virus, côn trùng …

Ở nước ta đã có nhiều thiệt hại do tuyến trùng gây ra: theo Phạm Thị Nhất (1975) khảo sát có 90 – 95% diện tích cà chua bị nhiễm tuyến trùng nốt sưng ở vùng Gia Lâm và Thanh Trì, Hà Nội làm giảm 50% năng suất thậm chí mất trắng; khảo sát của Nguyễn Bá Khương từ 1976 – 1978 tuyến trùng gây hại trên 32 loại rau, tạo u sưng trên rễ thuốc lá với tỉ lệ 81,5%; khảo sát của Bùi Lạng từ 1978 – 1981 tuyến trùng gây hại trên cây thuốc lá làm giảm 21,7% chiều cao cây và giảm 37,2% tốc độ ra lá

Hình 1.23:Tuyến trùng lây nhiễmvào rễ (theo www.plantaardiy.com)

Tuyến trùng tuổi 2

Rể cây