(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo (cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (bombyx mori l )​

NGUYỄN HỮU DŨNGNGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NUÔI TRỒNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO Cordyceps militaris TRÊN GIÁ THỂ TẰM DÂU Bombyx mori L.”.. LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập tại trường Đại học Lâm n

NGUYỄN HỮU DŨNG

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NUÔI TRỒNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris) TRÊN GIÁ

THỂ TẰM DÂU (Bombyx mori L.)”

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS BÙI VĂN THẮNG,

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập tại trường Đại học Lâm nghiệp, được sự đồng ý của nhà trường, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, tôi đã thực hiện luận

văn tốt nghiệp với đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông

trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)”

Để hoàn thành tốt bài luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ tận tình của cá nhân và tập thể

Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS Bùi Văn Thắng, giảng viên trường Đại học Lâm nghiệp, người đã hướng dẫn, chỉ bảo chu đáo, tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện nghiên cứu đề tài khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo và các thầy cô giáo giảng dạy trong Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã dạy bảo, trang bị cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học vừa qua

Bài luận văn tốt nghiệp là một trong những dấu mốc quan trọng đánh dấu sự trưởng thành và kết quả tổng kết đào tạo một học viên Sau khi học về chuyên ngành Công nghệ sinh học tại trường Đại học Lâm nghiệp Với nội dung nghiên cứu tôi đã rất nỗ lực và cố gắng áp dụng những gì đã và đang được học đưa vào thực hiện đề tài Mặc dù đã cố gắng nhưng do trình độ và thời gian có hạn nên luận văn không tránh khỏi những thiếu sót, kính mong thầy cô bạn đọc đóng góp ý kiến để bài luận văn của tôi được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 22 tháng 9 năm 2020

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hữu Dũng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tổng quan về nấm Đông trùng hạ thảo 3

1.1.1.Giới thiệu nấm Đông trùng hạ thảo 3

1.1.2 Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo 4

1.1.3 Vòng đời và cơ chế lây nhiễm của Đông trùng hạ thảo vào cơ thể côn trùng 5

1.1.4 Sự lây nhiễm của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào cơ thể côn trùng 5

1.1.5 Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo 7

1.1.6 Thành phần hóa học trong nấm Đông trùng hạ thảo 8

1.1.7 Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris 11

1.1.8 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo 13

1.1.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi trồng nấm Cordyceps militari 21

1.2 Giới thiệu về tằm dâu 23

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU27 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 27

2.1.1 Mục tiêu tổng quát 27

2.1.2 Mục tiêu cụ thể 27

2.2 Vật liệu nghiên cứu 27

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 27

2.2.2 Hoá chất và thiết bị 27

2.3 Nội dung nghiên cứu 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu 28

2.4.1 Phương pháp gây nhiễm nấm vào giá thể con tằm 28

2.4.2 Nghiên cứu thời gian nuôi tối phù hợp cho phát triển hệ sợi trong con tằm 30 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả gây nhiễm nấm vào con tằm 34

3.1.1 Gây nhiễm bằng phương pháp tiêm 34

3.1.2 Gây nhiễm bằng phương pháp phun bề mặt 36

3.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi tối đến phát triển mầm quả thể nấm 38

3.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi trồng đến phát triển quả thể nấm 42

3.3.1 Ảnh hưởng độ ẩm phòng nuôi đến phát triển quả thể nấm 42

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ phòng nuôi đến phát triển quả thể nấm 43

3.3.3 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến phát triển quả thể nấm 45

3.4 Ảnh hưởng của phương thức nuôi trồng đến phát triển quả thể nấm 48

3.5 Kết quả phân tích hoạt chất Adenosine và Cordycepin trên giá thể tằm 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… ……….53 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo 7

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thể tích dịch giống nấm đến tỷ lệ nhiễm và ăn lan hệ sợi trên con tằm bằng phương pháp tiêm 35

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thể tích dịch giống nấm đến tỷ lệ nhiễm và ăn lan hệ sợi trên con tằm bằng phương pháp phun bề mặt 37

Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi tối đến phát triển mầm quả thể nấm 40

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của độ ẩm đến phát triển quả thể nấm 43

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phát triển quả thể nấm 44

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến phát triển quả thể nấm 47

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của cách gây nhiễm và phương thức nuôi đến phát triển quả thể nấm 49

Bảng 3.8 Kết quả phân tích hàm lượng Adenosine và Cordycepin trong nấm đông trùng hạ thảo nuôi trồng trên giá thể tằm nguyên con 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Đông trùng hạ thảo C militaris ngoài tự nhiên (Nguồn: Biological Resource Center, NITE – NBRC) 4Hình 1.2 Công thức của một số nucleotid trong Đông trùng hạ thảo 10Hình 1.3 Vòng đời tằm dâu 25Hình 2.1: Lây nhiễm nấm vào tằm bằng phương pháp tiêm A - tiêm dung dịch giống nấm vào phần đầu; B- đặt con tằm sau tiêm nằm ngang trên giấy thấm; C- đặt con tằm sau tiêm vào ống nhựa đen 29Hình 2.2: Lây nhiễm nấm vào tằm bằng phương pháp phun dịch giống nấm lên thân con tằm 30Hình 3.1 Con tằm bị nhiễm với 150 µl dung dịch giống nấm sau 10 ngày gây nhiễm, nuôi tối, nhiệt độ phòng nuôi 22OC, độ ẩm 60% A: Con tằm sau gây nhiễm đặt đứng trong ống nhựa đen; B: Con tằm sau gây nhiễm đặt nằm ngang trên giấy thấm vô trùng 35Hình 3.2 Con tằm bị nhiễm với thể tích dung dịch giống nấm khác nhau sau 10 ngày gây nhiễm, nuôi tối, nhiệt độ phòng nuôi 22OC, độ ẩm 60% 38Hình 3.3 Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 5 ngày và chuyển sang nuôi sáng A: nuôi tối 5 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày 40Hình 3.4 Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 9 ngày và chuyển sang nuôi sáng A: nuôi tối 9 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày 41Hình 3.5 Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 12 ngày và chuyển sang nuôi sáng A: nuôi tối 12 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày 41Hình 3.6 Con tằm bị nhiễm nấm nuôi tối 15 ngày và chuyển sang nuôi sáng A: nuôi tối 15 ngày; B: sau nuôi sáng 20 ngày 41Hình 3.7 Quả thể nấm phát triển trên con tằm nuôi ở các điều kiện nuôi độ ẩm khác nhau A- độ ẩm 80%; B- độ ẩm 85%; C- độ ẩm 90% và D- độ ẩm 95% 43

Hình 3.8 Quả thể nấm phát triển trên con tằm nuôi ở các điều kiện nhiệt độ nuôi khác nhau A- nhiệt độ phòng nuôi 18OC; B- nhiệt độ phòng nuôi 20OC; C- nhiệt

độ phòng nuôi 22O

C và D- nhiệt độ phòng nuôi 25OC 45Hình 3.9 Quả thể nấm phát triển trên con tằm nuôi ở các điều kiện cường độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85% 47Hình 3.10 Quả thể nấm phát triển trên con tằm nuôi đặt nằm ngang trên giấy thấm sau 40 ngày chiếu sáng ở các điều kiện: cường độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85% A- gây nhiễm nấm bằng cách phun dịch giống nấm trên bề mặt con tằm; B- gây nhiễm nấm bằng cách tiêm dịch giống nấm vào phần đầu con tằm 49Hình 3.11 Quả thể nấm phát triển trên tằm nuôi đặt thẳng đứng trong ống nhựa đen sau 40 ngày chiếu sáng ở các điều kiện: cường độ ánh sáng 700 lux, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, nhiệt độ nuôi 22OC độ ẩm 85% 50Hình 3.12 Nấm đông trùng hạ thảo trên tằm nguyên con tươi thu hoạch (A) và nấm đông trùng hạ thảo trên tằm nguyên con khô được sấy bằng phương pháp sấy thăng hoa (B) 50

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, tình hình gia tăng các loại bệnh hiểm nghèo đang là mối lo ngại của các quốc gia trên trế giới Các nhà khoa học đang dày công nghiên cứu, tìm ra các liệu pháp hữu hiệu để giải quyết vấn đề trên Con người đang dần chuyển hướng từ việc sử dụng các loại thuốc được tổng hợp hóa học sang ưu tiên sử dụng các loại thực phẩm chức năng, các loại thuốc có nguồn gốc hữu cơ từ thiên nhiên Và các loài nấm dược liệu là đối tượng được chú ý nhiều nhất vì sự đa dạng về các hợp chất sinh học mà chúng chứa trong sinh khối Từ xưa, con người đã biết sử dụng một số loại nấm bổ sung trong các phương thuốc cổ truyền để chữa bệnh cũng như bồi bổ sức khỏe, như nấm linh chi, nấm lim xanh, nấm tuyết (mộc nhĩ trắng), v.v, và đặc biệt là nấm Đông trùng hạ thảo

Nấm Đông trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps là loài nấm ký sinh trên

sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loài côn trùng Hơn 400

phân loài nấm thuộc chi Cordyceps đã tìm thấy và mô tả, tuy nhiên chỉ có

khoảng 36 loài được nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo để sản xuất quả thể

(Wang, 1995; Sung, 1996; Li et al., 2006) Trong số những loài này, chỉ có loài C militaris đã được trồng thành công ở quy mô lớn và có chứa nhiều các chất có hoạt chất sinh học (Li et al, 2006) Loài nấm C militaris, phân bố ở

vùng núi có độ cao từ 2.000 - 3.000 m so với mực nước biển, có chứa hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong quả thể như: cordycepin, mannitol, cordypolysaccarid, superoxide dismutise và nhiều thành phần hoạt

chất quý khác Nhờ các hợp chất sinh học giá trị này nên loại nấm C militaris

được quan tâm nghiên cứu rất nhiều, đặc biệt là các công trình nghiên cứu về lâm sàng, như: nghiên cứu kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư máu

(Kim et al., 2006, Lee H.et al.,2006, Park C et al.,2005), ung thư phổi, ung thư vú (Ahn Y.J et al., 2001) Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có hiệu quả trong chữa trị rối loạn chức năng của gan (Nan J.X et al., 2001), sự

lão hoá, các chứng viêm tấy (Won S.Y and Park E.H., 2005) Ngoài ra còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipid, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng

thấp (Klaunig J.E and Kamendulis L.M., 2004, Balaban R.S et al., 2005),

Nấm này có khả năng duy trì tốt chức năng thận, phổi, chống lão hóa, điều

hòa giấc ngủ, viêm phế quản mãn tính (Das et al., 2010)

Hai loài C militaris và C sinensis hiện nay đang được nghiên cứu rất

nhiều về nuôi trồng, lên men, chiết xuất và sản xuất các dược chất; do có giá

tri dược liệu và giá tri kinh tế cao (Liu et al., 2001; Li et al., 2006) Loài C

sinensis là một loại nấm dược liệu có phân bố rất hạn chế trong tư nhiên và

đến nay chưa có công trình nào báo cáo nuôi cấy thành công nên rất khan

hiếm Loài C militaris chứa các hợp chất sinh học tương tự như loài

C.sinensis, nhưng dễ dàng nuôi trồng trong môi trường nhân tạo (Li et al

1995; Dong et al., 2012)

Do giá tri dược liệu, giá trị kinh tế cao nên hiện nay đã có rất nhiều

công trình nghiên cứu nuôi trồng loài nấm C militaris đã được công bố và áp

dụng vào sản xuất Tuy nhiên, hầu hết các công trình công bố là nuôi trồng

nấm C militaris trên môi trường tổng hợp bổ sung bột nhộng tằm, pepton,

cao nấm men hoặc nuôi cấy trên ký chủ nhộng tằm Với mong muốn, tạo ra

một sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo C militaris có chất lượng tốt, gần

giống với tự nhiên; chúng tôi tiến hành đề tài hiên cứu: “Nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu (Bombyx mori L.)”

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan về nấm Đông trùng hạ thảo

1.1.1 Giới thiệu nấm Đông trùng hạ thảo

Trong lịch sử phát triển của Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo (nấm ĐTHT) là một loại thuốc quý được sử dụng từ hàng ngàn năm trước và chỉ dùng cho các bậc vua chúa Theo đông y Trung Quốc, loại nấm này có tác dụng hỗ trợ chữa nhiều bệnh như bệnh về phổi, về thận, đổ mồ hôi trộm, đau lưng, yếu sinh lý v.v Chính vì vậy, nấm Đông trùng hạ thảo được người Trung Quốc xem như nhân sâm (Theo Sách y học cổ truyền Trung Quốc) Nấm Đông trùng hạ thảo (còn gọi là Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo đông trùng) là chỉ các loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loài côn trùng Vào mùa đông, sâu non, sâu trưởng thành của một số loài nằm dưới đất hoặc ở trên mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm và sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết Giai đoạn này nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh phát triển ở dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm chuyển giai đoạn, hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu Vì mùa đông nấm ký sinh trên côn trùng, mùa hạ mọc thành quả thể nấm nên có tên Đông trùng hạ thảo Để thu hoạch nấm người ta thường đào lấy cả xác sâu và nấm để làm thuốc

Ngày nay, hiệu quả sử dụng của các chất dinh dưỡng trong nấm Đông trùng

hạ thảo đã được khoa học chứng minh Nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã nghiên cứu, điều tra và thu thập nấm Đông trùng hạ thảo ngoài tự nhiên, nuôi trồng

để làm nguyên liệu sản xuất ra thực phẩm chức năng phục vụ cho con người

Cordyceps militaris là loài nấm thuộc họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps Loài này được Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris (Kobayasi, 1982)

Cordyceps là chi đa dạng nhất trong họ Clavicipitaceae về số lượng loài

và phổ ký chủ Ước tính có hơn 400 loài trong chi này (Mains, 1958;

Kobayasi et al, 1982; Stensrud et al., 2005)

Nấm C militaris thuộc giới Nấm, họ Cordycipitaceae, chi Cordyceps

và loài C militaris Tên khoa học Cordyceps militaris (L.) Fr (1818)

(Kobayasi, 1982)

Nấm Đông trùng hạ thảo C militaris là loài nấm ký sinh trên sâu bướm,

quả thể có màu cam, chiều dài 8 - 10 cm Đầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng, quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỗng ở giữa Các nang bào tử dài từ 300 - 510 µm, bề rộng 4

µm Các bào tử nang hình sợi, không màu và phân đoạn, kích thước 3,5 - 6

1 – 1,5 µm Các bào tử nang này trong điều kiện ngh o dinh dưỡng s đứt ra

và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấp Nấm này có phân bố rộng, ở Bắc M , châu

Âu và châu Á (Paul et al, 2008)

Hình 1.1 Đông trùng hạ thảo C militaris ngoài tự nhiên

(Nguồn: Biological Resource Center, NITE – NBRC)

1.1.2 Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo

Nấm Đông trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy được vào mùa hè, ở vùng núi cao trên 4.000 m như cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam

Túc và Vân Nam, v.v Theo các nhà khoa học thì chi nấm Cordyceps có tới

400 loài khác nhau, tính riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông trùng hạ thảo Các loài nấm này phân bố rộng ở châu Á với trung tâm đa dạng

là vùng Đông Á và châu Úc Tuy nhiên, cho đến nay người ta mới chỉ nghiên

cứu nhiều 2 loài nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá trị

dược liệu tốt với con người

1.1.3 Vòng đời và cơ chế lây nhiễm của Đông trùng hạ thảo vào cơ thể côn trùng

Vào mùa đông, bào tử nấm ĐTHT có trong đất s dính vào bên ngoài sâu hay nhộng của các loài bướm khác nhau Sau đó bào tử nấm s nảy mầm thành ống có các thể bám Các ống này s tiết các enzyme kitanase, lipase, protease phá hủy vỏ ngoài ký chủ, xâm nhập vào mô bên trong cơ thể Trong

cơ thể ký chủ, hệ sợi nấm hút chất dinh dưỡng và phát triển mạnh m chiếm toàn bộ cơ thể, gây chết ký chủ, vỏ cứng lại để bảo vệ sợi nấm Đến mùa hè,

hệ sợi nấm s nảy chồi, s làm nứt vỏ kitin của sâu, rồi phát triển thành quả thể Quả thể sinh sản hình thành bào tử trong các túi bào tử Sau đó túi bào tử nứt ra, bào tử phóng thích ra môi trường Đến mùa đông, trứng côn trùng nở thành sâu, nhộng, ngẫu nhiên bị bào tử xâm nhập.Vòng đời cứ thế tiếp tục

(Kobayasi et al, 1982; Kamble et al, 2012)

Qủa thể nấm C militaris thường có màu vàng nhạt hoặc màu da cam (Zheng et al., 2011)

1.1.4 Sự lây nhiễm của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào cơ thể côn trùng

Theo Bách khoa toàn thư thì nấm Cordyceps lây nhiễm vào cơ thể sâu

đến nay vẫn chưa rõ nguyên nhân Những con sâu này có thể đã ăn phải bào

tử nấm hoặc chúng mắc bệnh nấm ký sinh từ các lỗ thở Đến khi sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô của vật chủ, sử dụng hoàn toàn các chất dinh dưỡng trong cơ thể sâu Đến một giai đoạn nhất định, nấm phát triển thành quả thể nấm (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử

Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính:

(1) Giai đoạn xâm nhập

Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh

mầm bệnh, nó giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ dày như

Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, Naxetylglucosaminidase, cenlulase Các enzyme này được tạo ra một cách

nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậm chí ngay trong một loài (Nguyễn Lân Dũng et al., 2006)

Enzym protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham

gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là

protein) Lipase, cenlulase và các enzyme khác cũng là những enzyme có vai

trò không kém phần quan trọng Nhưng quan trọng hơn nhất là enzym phân hủy protein (protease) và enzyme phân hủy kitin (chitinase) của côn trùng Hai enzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng

(2) Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết

Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợ nấm được hình thành trong cơ thể, nó phân tán khắp nơi theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâm nhập Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp Hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài Kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đến chết (Pramer D., 1965)

(3) Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết

Ở bên trong cơ thể côn trùng, sợi nấm sinh trưởng và nhân lên nhanh chóng Một số loài nấm tiếp tục sinh trưởng ở dạng sợi nấm Hệ thống miễn dịch của ký chủ côn trùng sử dụng cơ chế thực bào và tiết ra các hợp chất đối kháng

lai và tạo ra phản ứng miễn dịch Tuy nhiên, nấm ký sinh côn trùng phát triển rất nhanh thông qua việc tái sản xuất nhanh chóng sợi nấm làm áp đảo hệ thống miễn dịch của côn trùng Hơn thế nữa nấm còn tạo ra các dạng độc tố và một số công cụ tấn công khác để giết chết côn trùng, chính những độc tố và công cụ tấn công này

đã phá hủy cơ chế kháng của ký chủ Hầu hết các nấm bất toàn (inperfect fungi) thường tạo ra độc tố và giết chết côn trùng trong một thời gian ngắn hơn là nấm có giai đoạn sinh sản hữu tính Trong giai đoạn đầu độc ký chủ, một số loài nấm bất toàn giết chết ký chủ trước khi gây hại toàn bộ cơ thể côn trùng và trên cơ thể côn

trùng quan sát thấy rất ít sợi nấm (Trần Ngọc Lân, 2008)

1.1.5 Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo

Bảng 1.1 Phân loại nấm Đông trùng hạ thảo

Cordyceps sinensis Cordyceps militaris

Giới Nấm Nấm

Ngành Ascomycota Ascomycota

Lớp Ascomycestes Sordariomycetes

Bộ Hypocreales Hypocreales

Chi Cordyceps Cordyceps

Loài Sinensis militaris

Tên khoa học Cordyceps sinensis Cordyceps militaris

Hai loài nấm C sinensis và C militaris hiện nay đang được nghiên cứu

rất nhiều về nuôi trồng, lên men, chiết xuất và sản xuất các thực phẩm chức

năng do có giá tri dược liệu và giá tri kinh tế cao (Liu et al., 2001; Li et al., 2006) Nấm đông trùng hạ thảo Ophiocordyceps sinensis (hay còn gọi là C

sinensis) là một loại nấm dược liệu có phân bố rất hạn chế trong tự nhiên và

được nuôi dưỡng trong điều kiện hoang dã, loài nấm này hiện tại vẫn chưa được nuôi trồng thành công trong môi trường nhân tạo, do đó sản lượng nấm

thu được không đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường (Li et al., 2006; Stone

2008; Zhang et al., 2012) Loài đông trùng hạ thảo C militaris (thường được gọi nấm cam sâu bướm), chứa các hợp chất hóa học tương tự như của C

sinensis, nhưng có thể dễ dàng nuôi trồng trong môi trường nhân tạo (Li et al., 1995; Dong et al., 2012) Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về quy trình

nuôi trồng nấm C.militaris nhằm thay thế cho loài C sinensis và có nhiều

nghiên cứu quan trọng về gen, nhu cầu dinh dưỡng, môi trường nuôi cấy, các

đặc tính sinh hóa và dược lý của nấm C militaris Gần đây, bộ gen hoàn chỉnh của C militaris cũng được giải trình tự làm cơ sở cho nhiều nghiên cứu sâu hơn về loại nấm này (Zheng et al., 2011)

Có hơn 400 phân loài Cordyceps đã tìm thấy và mô tả, tuy nhiên chỉ có khoảng 36 loài được nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo để sản xuất quả thể

(Wang, 1995; Sung, 1996; Li et al., 2006) Duy nhất loài C militaris đã được

trồng ở quy mô lớn do nó có dược tính rất tốt và có thời gian sản xuất ngắn

(Li et al., 2006)

1.1.6 Thành phần hóa học trong nấm Đông trùng hạ thảo

Theo số liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của thể quả nấm C

militaris cho thấy loài nấm này chứa các thành phần như protein chiếm

40,69%; các loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu

(29,15 ppm); hợp chất hóa học chất quan trọng (Shih et al., 2007).

Acid amin

Kết quả nghiên cứu của Hyun (2008) cho thấy trong quả thể nấm C

militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm

(69,32 mg/g trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm) Khối lượng acid amin mỗi loại trong quả thể và sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao động từ 1,15 - 15,06 mg/g (đối với quả thể) và 0,36 - 2,99 mg/g (đối với sinh khối) Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả thể bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g),

arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g) Số liệu phân tích của Chang và ctv

(2001) cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g) (Chang, 2001)

cid b o

Theo kết quả nghiên của Hur (2008) thì quả thể nấm C militaris chứa

nhiều acid béo không no, chiếm 70% tổng số acid béo, trong đó lượng acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả thể và 21,5% trong sinh khối Lượng acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối

denosine và cordycepin

Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dược tính cao của nấm C

militaris Adenosine trong quả thể chiếm 0,18% và trong sinh khối nấm

chiếm 0,06% Hợp chất cordycepin trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần

so với sinh khối (Huang et al., 2006)

Polysaccharide

Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 được tách chiết nấm Cordyceps

militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường

monosaccharide: mannose và galactose Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loại polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất Một số monosaccharid có trong nấm đông trùng hạ thảo như rhamnose, ribose, arabinose, glucose,

mannitol, fructose… (Yan et al., 2008)

- Các nucleotid:

Nucleotid là một trong những thành phần có hoạt tính trong nấm đông trùng hạ thảo, trong đó các hoạt chất adenosin, cordycepin được sử dụng là các hoạt chất để đánh giá chất lượng của đông trùng hạ thảo Ngoài ra trong đông trùng hạ thảo còn nhiều loại nucleotid khác như uridin, 2’-3’ – dideoxyadenosin (cấu trúc này được đưa vào các hợp chất có hoạt tính

antiretrovirus điều trị cho bệnh nhân đã bị nhiễm HIV nhƣ didanosin, hydroxyethyladenosin, guanidin, deoxyguanidin…, những hoạt chất này chƣa tìm thấy đƣợc ở trong các dƣợc liệu khác trong tự nhiên

Công thức hóa học Cordycepin Công thức hóa học Adenosin

Công thức hóa học Guanosin công thức hóa học Cytidin

Công thức hóa học Thymidin Công thức hóa học Uridin

Hình 1.2 Công thức của một số nucleotid trong Đông trùng hạ thảo

Đông trùng hạ thảo có chứa các loại acid amin thiết yếu như acid glutamic, acid aspartic, arginin…và các hợp chất kiểu polyamin là cadaverin, spermidin, spermin…, các cyclodipeptid như cordycedipeptid A Các hợp chất này có hoạt tính chống viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus

do trong C militaris Các axit béo không bão hòa (68,87%) chiếm ưu thế hơn

các axit béo bão hòa (23,40%) và δ-tocopherol là dạng duy nhất của vitamin E được phát hiện (55,86 μg / 100 g) Các axit hữu cơ được tìm thấy trong nấm này là axit oxalic, citric và fumaric (lần lượt là 0,33, 7,97 và 0,13 g / 100 g) Chiết xuất methanol của C militaris đã ức chế lipid peroxidation, làm giảm

sự phát triển của các gốc tự do Chiết xuất này cũng cho thấy tính kháng

khuẩn và chống nấm mạnh Cuối cùng, chất chiết xuất từ C militaris có thể

ức chế sự gia tăng các tế bào ung thư biểu mô tế bào ung thư người (MCF-7, ung thư vú), NCI-H460 (non-small lung), HCT-15 (đại tràng) và heLa (cổ tử cung)

1.1.7 Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris

Các hợp chất dược liệu của nấm Cordyceps militaris ứng dụng trong

điều tri bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó loài nấm này có giá tri

kinh tế cao Nấm Cordyceps militaris rất khan hiếm trong tự nhiên Vì vậy,

việc sản xuất ở quy mô lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều

tri bệnh từ Cordyceps militaris hiện đang là một vấn đề cấp thiết

- C c h p chất chống ung thư: Hợp chất cordycepin

(3′-deoxyadenosine) từ nấm cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung

thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch (Shonkor et al., 2010)

- Hoạt tính kh ng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hợp chất

CM-hs-CPS2 chứa trong dịch chiết nấm C.militaris có tính kháng DPPH, hoạt tính khử và tạo phức ở nồng đô (8 mg/ml) là 89%, 1,188 và 85% (Fengyao et al.,

2011)

- Tăng số lư ng tinh trùng: Nghiên cứu trên lợn cho thấy khi dùng

chế phẩm từ Cordycepsmilitaris, số lượng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh

trùng di động và hình dạng bình thường tăng Hiệu quả này được duy tr thậm

ch sau 2 tuần ngưng sử dụng chế phẩm Lượng cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian sử dụng chế phẩm nên có khả năng chất này làm tăng lượng

tinh dịch và chất lượng tinh trùng ở lợn (Lin et al., 2007)

- Hạn chế virus c m: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm

Cordyceps militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng

trong điều tri cúm A Chất này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của

các đại thực bào (Yuko et al., 2007)

- Kh ng khu n kh ng nấm và kh ng ung thư: C.militaris protein

(CMP) tách chiết từ nấm có kích thước 12kDa, pI 5,1 và có hoạt tính trong

khoảng pH 7- 9 Protein này ức chế nấm Fusariumoxysporum và gây độc đối với tế bào ung thư bàng quan (Byung-Tae et al., 2009)

Hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn

Clostridium Các hợp chất dẫn xuất từ nấm được mong đợi ứng dụng trong

việc điều tri các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh tiểu đường thông qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, do đó được hy vọng s ứng dụng được như một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều tri các bệnh về

miễn dịch (Seulmee et al., 2009).

- Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps

militaris có hoạt tính gắn fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin

Enzyme này có khả năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy mô lớn s làm một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang được sử dụng

cho bệnh tim lão hóa ở người (Jae-Sung et al., 2006)

- Tính kháng viêm: Để xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch

chiết từ quả thể nấm Cordyceps militaris (CMWE) được thử nghiệm về tác

dụng kiểm soát lipopolysaccharide (LPS) (chịu trách nhiệm kích thích việc sản xuất nitric oxide), việc phóng thích yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) của tế bào RAW 264,7 Các đại thực bào được xử lý với nồng độ khác nhau của CMWE làm giảm đáng kể LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết Những kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây

viêm của tế bào (Wol-Soon et al., 2010)

- C c ứng dụng trên lâm sàng của nấm Cordyceps militaris: Mặc dù

nấm Cordyceps sinensis được sử dụng rộng rãi hơn Cordyceps militaris, tuy

nhiên các ứng dụng lâm sàng của chúng cũng khá tương tự nhau Các chiết

xuất từ nấm Cordyceps militaris có thể được sử dụng trong các trường hợp suy giảm chức năng phổi, ho có đờm, chóng mặt (Das et al., 2010; Mizuno,

1999)

1.1.8 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo

1.1.8.1 Trên thế giới

Có rất nhiều nghiên cứu về Đông trùng hạ thảo (C militaris) đã được

nghiên cứu và đăng trên nhiều tạp chí uy tín Tuy nhiên, điểm giống nhau là hầu hết các nhà khoa học đều cho rằng phần dược tính của nấm đông trùng hạ

thảo (C militaris) chủ yếu có trong quả thể nấm và có rất ít hoặc không có

trong cơ thể ký chủ

So với C siensis, C militaris dễ để nuôi cấy trong cả môi trường lỏng

và môi trường đặc với nhiều nguồn carbon và nitơ khác nhau Những nghiên

cứu gần đây đã chứng minh rằng C militaris chứa nhiều thành phần hoạt tính

có tiềm năng dược liệu như cordycepin, ergosterol, mannitol và nhiều loại polysaccharide có tác động đến nhiều hệ cơ quan trong cơ thể và phòng chống nhiều bệnh nên đã được sử dụng với nhiều mục đích chữa trị khác nhau (Das

et al., 2010; Gu et al., 2007; Reis et al., 2013)

Bên cạnh đó, những nghiên cứu về đa dạng di truyền bằng việc giải

trình tự vùng ITS giữa các dòng C militaris được phân lập từ các vùng địa lý

khác nhau được sử dụng để nuôi trồng tạo quả thể ở quy mô công nghiệp, cho thấy sự đa dạng di truyền giữa các dòng được phân lập từ Anh, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Na Uy là rất nhỏ và không tương quan với điều kiện

địa lý (Wang et al., 2008) Nghiên cứu của Zheng et al (2011) cho thấy rằng

bộ gen của C militaris không chứa các gen mã hóa ra các chất độc tương tự

các nấm gây độc cho con người

Do tính chuyên biệt cao đối với ký chủ và bị ảnh hưởng lớn bởi môi

trường tăng trưởng nên loài C militaris rất khó tìm thấy trong tự nhiên Do đó

việc nuôi cấy loài này nhằm thu sinh khối và các thành phần có hoạt tính sinh học thu hút nhiều nhà khoa học Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các

thành phần có hoạt tính sinh học thu được giữa các dòng C militaris ngoài tự nhiên và được nuôi trồng là tương tự nhau (Tong et al., 1997; Jiang và Sun, 1999., Wang et al., 2012) Ba phương pháp phổ biến trong nuôi cấy nấm C

militaris hiện nay là nuôi cấy trong môi trường rắn, môi trường lỏng và nuôi

quả thể sau 12- 15 ngày sau khi chuyển vào điều kiện này Bên cạnh đó nghiên cứu của ông cũng chỉ ra rằng thành phần môi trường tối ưu cho sự hình thành quả thể là môi trường gạo lức được bổ sung 40 g/l glucose, 5 g/l peptone, 1,5g/l MgSO4.7H2O, 1,5 g/l K2HPO4 và 1,0 mg/l NAA và môi trường tối ưu tạo ra Cordycepin là gạo lức bổ sung 10 g/l glucose, 10 g/l peptone, 1,0 g/l MgSO4.7H2O, 1,0 g/l K2HPO4 và 1,0 mg/l NAA Trong khi nghiên cứu của Lim et al., (2012) và Dong et al., (2012) cho thấy đậu nành và lúa mì được bổ sung dinh dưỡng là cơ chất tốt nhất cho sự tạo - 7 - thành adenosin, cordycepin

và D-mannitol của C militaris khi được nuôi trên môi trường đặc

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng gạo: nước (tỷ lệ 1:1; 1:1.35 hoặc cao hơn

chút ít) là tối hảo cho sự hình thành quả thể nấm C militaris (Sung et al

1999, 2002; Lin et al., 2006; Zhang et al., 2008; Yue, 2008) Tỷ lệ này phụ

thuộc vào loại lúa được sử dụng và hàm lượng amylopectin chứa trong gạo

Nghiên cứu của Kim et al., (2010) chỉ ra rằng trong 8 loại ngũ cốc sử dụng nuôi tạo quả thể C cardinalis, gạo lức là loại cơ chất tốt nhất và hàm lượng

gạo lức cũng như hàm lượng nước trong môi trường nuôi cũng ảnh hưởng đến chiều cao quả thể và trọng lượng tươi nấm/chai nuôi

Bên cạnh đó, việc bổ sung nhộng tằm vào môi trường gạo lứt nhằm tạo

quả thể C militaris đã được chứng minh là tốt hơn so với các loại cơ chất khác được sử dụng (Shrestha et al., 2004a, b, 2005a, b; Sung et al., 2006a, b; Zhao et al., 2006a; Jin et al., 2009) Tuy nhiên, hầu hết các dòng C militaris

yêu cầu hàm lượng đạm tương đối thấp, ở nồng độ đạm cao có thể ức chế sự

hình thành quả thể (Gao et al 2000) nên năng suất nấm nuôi trên côn trùng

thường thấp hơn trên ngũ cốc

Kết quả nghiên cứu của Hong et al (2010) cho thấy dịch nuôi C

militaris được tiêm vào nhộng tằm ở phần ngực hoặc phần bụng với thể tích

từ 75-100 µl ở độ tuổi từ 9 - 11 ngày tuổi, điều kiện nuôi ở điều kiện nhiệt độ

20OC, ánh sáng có cường độ 500 lux thì tất cả nhộng tằm được tiêm bị nhiễm nấm và tạo quả thể

Nuôi trồng thể quả nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris được

tiến hành ở nhiều nước trên thế giới: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và

M Tại Trung Quốc có các trang trại lớn chuyên nuôi trồng loài nấm này ở các tỉnh: Thượng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy, Giang Tô Chỉ tính một trang trại nuôi trồng loài nấm này tại Kaiping, Quảng Châu, sản lượng một năm thu được 100.000 kg sản phẩm Sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo từ nuôi trồng nhân tạo đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới kể cả các nước phương Tây và mang lại lợi nhuận cao cho các doanh nghiệp và người

nuôi trồng nấm (Li Cui et al., 2008)

Jae Sung Kim et al., (2006), tại Hàn Quốc, đã sử dụng nhộng tằm để

nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps militaris Nhộng tằm được đựng trong các

lọ nuôi cấy, khử trùng ở 121OC trong thời gian 90 phút, để nguội, cấy giống nấm, 20 ngày sợi nấm ăn kín toàn bộ giá thể, trong điều kiện nhiệt độ 20 –

25OC, cường độ ánh sáng 500-700 lux đã hình thành mầm thể quả Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi cũng được các tác giả tiến hành trên môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau: 40 g/lít đường glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0,5 g/lít KH2PO4, 0,5 g/lít K2HPO4.3H2O, và 0,5 g/lít MgSO4.7H2O Hai

loài Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc và Cordyceps militaris (L ex Fr.) Link

được tập trung nghiên cứu nuôi trồng thể quả và nuôi cấy sinh khối hệ sợi nhiều nhất (Russell R., Paterson M., 2008)

Tại thành phố Hayward, bang California, M , Công ty công nghệ sinh

học BIOKEN đã nuôi trồng quy mô công nghiệp loài nấm Cordyceps

militaris Sản phẩm được tiêu thụ trong nước và thị trường quốc tế

1.1.8.2 Tại Việt Nam

Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tiến hành thu mẫu Đông trùng

loài nấm Đông trùng hạ thảo được giám định, các loài nấm Đông trùng hạ thảo đều thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocriales, lớp Sordariomycetes,

ngành phụ nấm túi Ascomycota Các loài nấm được xác định là: Aschersonia

badia Patouillard, Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill., Beauveria brongniartii (Saccardo) Petch, Cordyceps annullata Kobayasi & Shimizu, Cordyceps cardinalis G.H Sung & Spatafora, Cordyceps crinalis Ellis ex

Lloyd, Cordyceps formicarum Kobayasi, Cordyceps formosana Kobayasi & Shimizu, Cordyceps gunnii Berk, Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link.,

Cordyceps myrmecophilla Cesati, Cordyceps nutans Pat., Cordyceps oxycephala Penz &Sacc.,Cordyceps pseudomilitaris Hywel-Jones &

Sivichai, Cordyceps sphecocephala (Klotzsch ex Berk.) Berk.& M.A Curtis,

Cordyceps stylophora Berk.& Br., Cordyceps takaomontana Yakush.&

Kumaz, Cordyceps tuberculata (Lebert) Maire, Isaria cateniannulatus (Z.Q Liang) Samson & Hywel-Jones, Isaria farinosa (Holmsk.)Fr., Isaria japonica Yasuda, Isaria takamizusanensis Kobayasi, Isaria ternuipes Peck và

Metarrhizium anisopliae (Metch.) Sorokin

Năm 2009, Viện Khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam và trường Đại học

Lâm nghiệp đã tiến hành điều tra thu mẫu nấm ĐTHT (Cordyceps nutans) tại

khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang Tác giả Phạm Quang Thu

đã thông báo phát hiện được loài nấm Đông trùng hạ thảo và được giám định

là loài Cordyceps nutans Đây là loài nấm đầu tiên được mô tả và ghi nhận có

phân bố tại Việt Nam (Phạm Quang Thu, 2009)

Tại vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc Phạm Quang Thu đã phát hiện

nấm ĐTHTCordycepsGunnii (Phạm Quang Thu, 2009)

Tại vườn Quốc gia Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai đã phát hiện nấm ĐTHT

Cordyceps militari (Nấm nhộng trùng thảo) (Phạm Quang Thu, 2009)

Năm 2009, Phạm Thị Thùy đã thu thập ở vườn Quốc gia Cúc Phương,

tỉnh Ninh Bình nguồn nấm Cordyceps

Nhóm tác giả Trương Bình Nguyên, Đinh Minh Hiệp, Lê Huyền Ái Thúy và ctv, (2010) tập trung vào các nghiên cứu phát hiện các chủng nấm Cordyceps bản địa tại vùng cao nguyên Langbian, Lâm Đồng và khảo sát một

số hoạt tính sinh học của các loài nấm này Sau 4 năm nghiên cứu, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông lâm nghiệp Lâm Đồng đã hoàn thiện quy trình nghiên cứu, sản xuất loại nấm đông trùng hạ thảo C takaomontana trên dâu tằm và hiện đang sản xuất thử nghiệm một số sản phẩm từ đông trùng hạ thảo như: viên nhộng và viên nén đông trùng hạ thảo Viện Bảo vệ thực vật cho biết đã nhân nuôi thành công loài đông trùng hạ thảo (C militaris) trên môi trường gạo lức và môi trường gạo lức có bổ sung nhộng dâu tằm

Năm 2012-2014, Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học – môi trường, trường Đại Học Nông Lâm thực hiện đề tài NCKH cấp Bộ về xây dựng quy trình nuôi cấy đông trùng hạ thảo quy mô phòng thí nghiệm

Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Viện Nghiên cứu công nghệ sinh học

và môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM (Lê Thị Diệu Trang, Lê Phước Thọ, Trần Công Sơn và Nguyễn Thị Ngọc Anh) báo cáo công trình nghiên cứu “Sản xuất đông trùng hạ thảo Cordyceps sp quy mô phòng thí nghiệm” trong cuộc thi Eureka 2013 của Thành Đoàn TP.HCM

Nhóm tác giả Lê Thị Diệu Trang, Trần Công Sơn, Lê Phước Thọ, Nguyễn Thị Ngọc Anh (2013) đã công bố các kết quả xây dựng quy trình nuôi cấy C sinensis, đánh giá tính kháng oxy hóa và hàm lượng adenosin trên tạp chí khoa học k thuật Nông Lâm nghiệp của Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM

Trong Hội nghị nấm học tổ chức tại Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM (11/2014), một số công trình của các nhóm tác giả Vũ Xuân Tạo và ctv, Phạm Nguyễn Duy Bình và Phan Kim Ngọc đã công bố kết quả nghiên cứu về các yếu tố môi trường tác động đến sự sinh trưởng của C militaris; Võ

Thị Xuyến và ctv nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy C pseudomilitaris

Trong chương trình nghiên cứu nghị định thư giữa Việt Nam và Trung

Quốc cấp nhà nước về nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps

militarris PGS.TS Phạm Thị Thuỳ, Viện Bảo vệ thực vật đã chủ trì đề tài phát

triển nấm Đông trùng hạ thảo làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người Kết quả đã nghiên cứu và xác định được 3 loài nấm Đông trùng hạ thảo đó là:

- Cordyceps nutans ở Cúc Phương, Ninh Bình và Tam Đảo, Vĩnh Phúc

- Cordyceps militaris ở Vũ Quang, Hà Tĩnh

- Cordycep sp1 ở Sơn Động, Bắc Giang

Tác giả cũng đã xác định được một số giá trị dược liệu của nấm Đông

trùng hạ thảo Cordyceps militaris gồm chất Cordycepin, HEAA, một số

vitamin và một số nguyên tố vi lượng Trên đây là một số kết quả bước đầu về

việc nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps ở Việt Nam Vì vậy việc

nghiên cứu nấm này cần thiết được tiếp tục để đi sâu và phát triển những nấm

Cordyceps để làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người

Do giá tri dược liệu, giá trị kinh tế cao và tính khả thi của việc nuôi

nấm Cordyceps militaris ở quy mô lớn, việc phát triển các nghiên cứu về nuôi trồng nấm Cordyceps militaris nhằm tăng quy mô sản xuất, đáp ứng nhu cầu

của thi trường trong nước và chuyển giao công nghê cho các đơn vi sản xuất

để đem lại lợi ích kinh tế cho địa phương là hết sức cần thiết

Tác giả Nguyễn Ngọc Trai bước đầu nghiên cứu quy trình nuôi nấm

đông trùng hạ thảo (C militaris) có nguồn gốc từ nhật bản tại Trà Vinh Kết

quả nghiên cứu đạt được như sau : (1) Nhiệt độ 25oC và cường đô chiếu sáng

500 lux là phù hơp cho sự hinh thành và phát triển quả thể nấm C militaris ;

(2) Đối với môi trường nuôi là gạo lức huyết rồng bổ sung dinh dưỡng, 20 g gạo lức được bổ sung 30 ml dung dịch dinh dưỡng gồm 18,56 g/l glucose; 14,55 g/l peptone; 1,42 g/l KH2PO4; 1,5 g/l MgSO4 và 1,0 mg/l NAA, pH

5,6 100% keo nuôi có nấm C militaris hình thành quả thể với trong

lượng quả thể đạt 8,01 g/keo; (3) Trên môi trường gạo lức (50 g/hộp nuôi) bổ sung 50 ml nước cất và nhộng tằm 5 g/hộp nuôi, sau 60 ngày chủng giống số lượng quả thể/hộp nuôi là 20,11 quả thể và trọng lượng quả thể đạt 10,14 g, hàm lượng Cordycepin và Adenosine phân tích được trong quả thể lần lượt là 10,08 mg/g và 0,57 mg/l và trong với cơ chất nuôi (gạo lức có chứa tơ nấm)

đạt lần lượt 3,44 mg/g và 0,09 mg/g ; (4) Nấm C militaris được nuôi tạo quả

thể thành công trên nhộng tằm 9 ngày tuổi với số quả thể đạt trung bình 1,69 quả thể/nhộng

Nhóm tác giả Nguyễn Thị Hồng, Lê Minh Sắt, Nguyễn Thị Hồng Gấm, (2019) đã Xác định được môi trường và k thuật phân lập giống gốc nấm

Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) thu thập tại Vườn quốc gia Hoàng

Liên Sơn (Lào Cai) đã phân lập được 24 chủng giống gốc và tiến hành nhân giống cấp 1 và 2 các chủng giống trong môi trường nhân tạo Kết quả cho thấy, công thức khử trùng quả thể nấm cho tỷ lệ mẫu sạch cao nhất (92,86%)

là dùng cồn 70% trong 1 phút và cefotaxim 0,4 mg/ml trong 1 phút Môi trường nhân giống cấp 1 hiệu quả là: agar 10 g/l + dịch chiết khoai tây (1 g khoai tây/1 ml dịch chiết) 200 ml/l + đường sucrose 20 g/l + KH2 PO4 0,5 g/l + K2 HPO4 0,5 g/l + KNO3 1 g/l + Pepton 5 g/l + cao nấm men 5 g/l Môi trường gồm đường glucose 10 g/l + nhộng tằm 100 g/l + KH2 PO4 0,5 g/l + K2 HPO4 0,5 g/l + KNO3 1 g/l + CaCl2 2H2 O 0,1 g/l + Pepton 5 g/l + cao nấm men 10 g/l + vitamin B1 0,2 g/l + vitamin B8 0,2 g/l phù hợp để nhân giống cấp 2 nấm Đông trùng hạ thảo Kết quả là cơ sở khoa học quan trọng, tạo tiền đề cho sản xuất giống nấm Đông trùng hạ thảo phục vụ nhu cầu về giống nấm chất lượng cao ngày một lớn hiện nay

Nhóm tác giả Nguyễn Thị Liên Thương, Trinh Diệp Phương Danh và Nguyên Văn Hiệp, 2016 đã đánh giá vai trò của nấm đông trùng hạ

thảo Cordyceps militaris trong y học hiện đại trên cơ sở tổng hợp nhiều kết

quả nghiên cứu khoa học, đồng thời đánh giá các đặc điểm sinh học và ảnh

hưởng của các điều kiện nuôi trồng lên loại nấm Cordyceps militaris nhằm

phục vụ cho phát triển các quy trình nuôi trồng ở nước ta, đem lại những lợi ích kinh tế thiết thực cho các nhà sản xuất ở các địa phương Kết quả nghiên

cứu từ các công bố khoa học cho thấy nấm C.militaris được nhiều nghiên cứu

khẳng định tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh, đồng thời cũng được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp dược phẩm hiện nay, ví dụ như trong điều trị ung thư, điều hòa miễn dịch, suy giảm chức năng gan, thận.v.v

(Seulmee et al., 2009; Shonkor, 2010) Đối với việc sản xuất nấm C.militaris ở trong điều kiện nhân tạo, việc kiểm soát chặt ch các yếu tố

điều kiện môi trường nuôi trồng nấm như giống, nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, và dinh dưỡng là hết sức cần thiết để duy trì sản lượng và chất lượng

nấm Cordyceps militaris

1.1.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi trồng nấm Cordyceps militaris

1.1.9.1 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình nuôi trồng nấm

Việc nuôi cấy các loại nấm trên môi trường rắn đã được nghiên cứu trong nhiều năm qua So sánh với các loại môi trường khác, môi trường rắn hiệu quả hơn về các mặt như diện tích nuôi trồng nhỏ, giảm lượng nước tiêu thụ so với nuôi cấy lỏng, đồng thời giảm chi phí xử lý nước thải và tiêu thụ

năng lượng trong quy trình nuôi nấm Trong tự nhiên nấm C militaris sinh

trưởng rất hạn chế ký sinh trên côn trùng Khi nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo nấm có thể phát triển trong điều kiện tối ưu như độ thoáng khí giúp cho việc phát triển tơ nấm và quả thể, nhất là chủ yếu quả thể chứa nhiều hợp chất

có hoạt tính sinh học hơn (Sung et al., 2006; Zhang et al., 2008) Quả thể đã được trồng thành công trên môi trường gạo lứt (Choi et al., 1999; Sung et al., 2002) hoặc ấu trùng côn trùng (Harada et al., 1995; Sato và Shimazu, 2002)

Các nghiên cứu khác cũng cho thấy việc sử dụng hạt kê có thể tạo ra nấm có hàm lượng adenosine cao Các nghiên cứu cũng cho thấy khi hạt đậu nành

được dùng làm môi trường rắn hàm lượng cordycepin tăng so với giá thể gạo

(Lim et al., 2012)

1.1.9.2 Ảnh hưởng của dinh dưỡng trong môi trường nuôi nấm

Nguồn dinh dưỡng từ côn trùng: Môi trường nuôi cấy nấm có thể dùng

các loại nhộng và sâu khác nhau, nhưng hầu hết sử dụng nhộng tằm Bombyx

mori (Hong et al., 2010) Các nghiên cứu cũng cho thấy có khả năng sử dụng

các loại côn trùng khác để nuôi nấm như ấu trùng bướm đêm Antherea

pernyi (Wang et al, 2002), Mamestra brassicae (Harada et al, 1995) v.v

Nguồn dinh dưỡng từ các hợp chất hữu cơ tự nhiên: Việc sử dụng côn

trùng trong nuôi cấy nấm ở quy mô lớn cho thấy nhiều hạn chế về mặt nguyên liệu sẵn có, sự tạp nhiễm trong quá trình nuôi cao hơn, do đó các hợp chất hữu cơ đã được sử dụng để thay thế côn trùng Xie và cộng sự cho thấy việc

bố sung gạo lứt, lúa mạch và đậu nành vào môi trường nuôi cấy thích hợp để

thay thế côn trùng (Xie et al., 2009b) Tuy nhiên, Yahagi cũng chỉ ra rằng môi

trường dinh dưỡng trên thạch không phù hợp cho việc sản xuất nấm

(Yahagi et al., 2004)

1.1.9.3 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy

Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng lớn đến việc tạo quả thể trong nuôi trồng nấm Các nghiên cứu cho thấy khoảng nhiệt độ 18–22 °C là tối ưu cho

sự sinh trưởng sinh khối nấm và năng suất quả thể Tuy nhiên quá trình này s giảm mạnh khi tăng nhiệt độ trên 25 oC (Sung et al., 1999, 2002; Gao et

al., 2000) Do đó cần lưu ý về yếu tố nhiệt độ môi trường khi trồng nấm và

phải đảm bảo điều kiện này khi tiến hành nuôi trồng nấm ở khu vực có nhiệt

độ môi trường không thích hợp, như sử dụng máy điều hòa

Cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tạo quả

thể nấm Trong điều kiện che tối, việc tạo quả thể bị ức chế (Gao et al, 2000;

Sato và Shimazu, 2002) Các nghiên cứu cho thấy cường độ ánh sáng tối ưu

1000 lux được xem là điều kiện thích hợp nhất (Sung et al, 1999; Gao et al,

2000) Cần thiết kế các chế độ chiếu sáng phù hợp trong phòng nuôi khi nuôi

trong điều kiện nhân tạo đối với nấm C militaris

Các nghiên cứu cho thấy việc sử dụng màng bao HFM (hydrophobic

fluoropore Membrane) cho kết quả tốt nhất về hiệu suất quả thể nấm C

militaris (Zhang et al, 2010) Khoảng ẩm độ thích hợp cho nấm dao động từ

70–90 %, tương đương với độ ẩm không khí trong tự nhiên s phù hợp cho việc tạo quả thể Khi độ ẩm thấp s làm môi trường khô nhanh hạn chế sự phát triển của tơ nấm cũng như quả thể Do đó trong phòng nấm cần bổ sung

ẩm bằng máy phun ẩm với nguồn nước sạch khuẩn

Ngoài độ thoáng khí và ẩm độ, dịch nuôi cấy C militaris cần được chú

ý duy trì pH trong khoảng 6.0–6.5, nhiệt độ 20–25 °C và bổ sung các nguồn

dinh dưỡng như carbohydrate, nitrogen và muối khoáng (Sung et al, 2006) 1.2 Giới thiệu về tằm dâu

Trung Quốc là nước có nghề trồng dâu nuôi tằm sớm nhất trên thế giới, sau đó dâu tằm mới được phát triển và lan rộng đến các vùng khác trên thế giới Cách đây 4-5 nghìn năm người Trung Quốc đã biết nuôi tằm và thuần hoá giống tằm, cuốn Biên niên sửđã đề cập tới dâu tằm vào triều vua Châu Vương (2200 trước Công nguyên)

Tằm dâu là một nguồn chất béo ăn với hàm lượng cao của axit không

no béo (UFAs) (70% tổng hàm lượng lipid) và đang trở thành một trọng tâm của dược phẩm và nghiên cứu chế độ ăn uống trong lĩnh vực dầu chức năng Hàm lượng chất béo 8,52% -15,67% Tỷ lệ axit amin thiết yếu Bombyx mori là 32,50 Bombyx mori rất giàu canxi và chứa Mg, Zn, Fe, Mn và Cu, v.v

Có bốn loại tơ tằm tự nhiên, loại sản xuất nhiều chiếm 95% sản lượng trên thế giới đó là tơ của tằm dâu và mục tiêu chính của tơ là tơ tằm dâu Ngoài ra còn có loại khác đó là tơ tằm thầu dầu lá sắn, tơ tằm tạc, tơ tằm sồi

Tằm dâu được con người khai thác trên 4.000 năm, tất cả các giống

được nuôi hiện nay thuộc loài Bombyx mori L, nó được phân ra từ gốc tằm Mandarina có tên khoa học Bombyx mandarina (Moore)

Tằm dâu sau này được phân chia và xác định giống có nguồn gốc: Nhật Bản, Trung Quốc, châu Âu, Ấn Độ trên cơ sở phân bố địa lý hoặc gọi theo tính hệ như: độc hệ, lưỡng hệ, đa hệ hoặc gọi giống thuần chủng, giống lai (lai đơn, lai kép)

Tằm thầu dầu lá sắn có 2 loài Philosamia niconi (Hutt) hoặc Philosamia cynthia (Drury) thuộc loại tằm nhỏ ăn lá thầu dầu và lá sắn

Nó tạo ra tơ thô, kén không thích hợp cho ươm tơ, do đó nó thường được dùng để nấu và kéo sợi [50]

Tằm tạc thuộc loại tằm dại có nhiều giống:

+ Tằm tạc Trung Quốc: Antheraea pernyi có sản lượng lớn trên thế giới + Tằm tạc Tasa: Antheraea mylitta (Dury)

+ Tằm tạc Nhật Bản: Antheraea yamamai (Querin) cho tơ xanh

+ Tằm tạc Ấn Độ: Antheraea assamensis, ăn lá cây tạc (Terminalia) và

một số cây tạc khác, giống tằm độc hệ hoặc lưỡng hệ kén có thể ươm tơ giống như tằm dâu Có tầm quan trọng thứ 2 thế giới

Tằm dâu (Bombyx mori-Linnaeus) là loài côn trùng biến thái hoàn toàn,

vòng đời trải qua 4 giai đoạn phát dục khác nhau: trứng, tằm, nhộng, ngài Mỗi giai đoạn phát dục đều có một vai trò quan trọng trong đời sống con tằm

+ Giai đoạn tằm: là giai đoạn ăn lá dâu để tích lu dinh dưỡng, cơ thể tằm trong giai đoạn này lớn lên rất nhanh, tằm sắp chín (đủ dinh dưỡng) lớn gấp 8.000-10.000 lần so với tằm mới nở

+ Giai đoạn ngài: là giai đoạn trưởng thành con đực và con cái tìm nhau

để giao phối và ngài cái đẻ trứng

+ Giai đoạn trứng: đối với trứng tằm đa hệ thì sau khi con cái đẻ trứng 8-10 ngày, ở 25 °C trứng s nở thành tằm con Đối với trứng tằm lưỡng hệ và

độc hệ thì sau khi đẻ trứng đi vào trạng thái ngủ nghỉ và bắt buộc trứng phải qua lạnh Vì đây là đặc tính di truyền của tằm lưỡng hệ và độc hệ được hình thành trong điều kiện giá lạnh của vùng ôn đới, sau 4-5 tháng lạnh của mùa đông thì trạng thái ngủ nghỉ (hay còn được gọi là hưu miên) bị phá vỡ và trứng được nở ra tằm con Người ta đã lợi dụng đặc tính này của trứng tằm để bảo trứng lâu dài Đi với nó là các phương pháp đánh thức ngủ nghỉ bằng các biện pháp nhân tạo

Tằm dâu đến giai đoạn 6-8 ngày ( tằm chín) s được chọn thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu

Đặc điểm trứng tằm: hình bầu dục, nhỏ, dẹt, bên ngoài có vỏ cứng, tuỳ theo giống mà trứng có hình dạng khác nhau, trứng tằm độc hệ lớn nhất, sau đến là trứng lưỡng hệ, trứng tằm đa hệ là bé nhất, trứng có màu trắng sữa hoặc hơi vàng, trên mặt trứng có nhiều lỗ khí

Hình 1.3 Vòng đời tằm dâu

Hiện nay, xu hướng sử dụng ĐTHT từ tằm hoặc nhộng nguyên con đang được người dân ưa chuộng Do đó, hoàn thiện phương pháp nuôi cấy

C.militaris trên nhộng, tằm dâu là khá cần thiết Mặt khác, Việt Nam đang

khuyến khích nuôi tằm dâu đã tăng thu nhập cho nông dân, do đó, nguồn tằm dâu cũng khá dồi dào

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu tổng quát

Xây dựng được quy trình k thuật nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo

(Cordyceps militaris) trên giá thể tằm dâu nguyên con.

- Xác định được k thuật nuôi phát triển quả thể nấm trên con tằm;

- Đánh giá được hàm lượng hoạt chất Adenosine và Cordycepin trong nấm Đông trùng hạ thảo trên con tằm

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm Cordyceps militaris NBRC9787

được cung cấp bởi Trung tâm tài Nguyên sinh học NITE (NBRC), Nhật Bản

Vật liệu nghiên cứu: Tằm dâu chín ở độ tuổi 5 cấp đông được cung cấp bởi các cơ sở sản xuất dâu tằm, tỉnh Thái Bình

2.2.2 Hoá chất và thiết bị

Hóa chất:

- Các loại muối khoáng đa lượng KH2PO4, Mg2SO4

- Các chất hữu cơ Pepton, Cao nấm men, glucose và Vitamin B1

Thiết bị:

Sử dụng trang thiết bị, máy móc tại Phòng thí nghiệm nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo của Công ty CP Dược liệu HATACO Việt Nam, địa chỉ