Tài liệu Chương 2: CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (tiếp theo) doc

www.themegallery.com Ngân hàng cDNA  Bộ gen Eukaryotae 1,7% gen người-mã hoá protein;  Tập hợp cDNA được tổng hợp nhờ kỹ thuật phiên mã ngược mRNA tương ứng cDNA=complementary DNA;

Trang 1

LOGO

Chương 2: CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI

(tiếp theo)

Nguyen Thi Viet Anh

Trang 2

www.themegallery.com

Nội dung

1 Các kỹ thuật chính dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp

1.2 Các enzym dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp 1.3 Các vector nhân dòng dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp

1.1 Khái niệm

1.4 Nhân dòng gen (gene cloning)

2 Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA

2.1 Kỹ thuật chiết tách DNA và RNA 2.2 Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA 2.3 Phương pháp PCR

2.4 Kỹ thuật xác định trình tự DNA 2.5 Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA) 2.6 Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR (AFLP, SSR) 1.5 Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gen

2.7 Genomic và proteomic

Trang 3

 Ngân hàng bộ gen:

 Thư viện DNA từ bộ gen (lắc cơ học, RE);

 Khái niệm ngân hàng bộ gen (Bank of genomic DNA):

• Đoạn DNA được tách dòng (khác nhau do tế bào, bộ gen, RE,…);

• Bao gồm exon và intron;

• VD: ngân hàng bộ gen của vi khuẩn;

• tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gen và đã được tách dòng trong tế bào chủ;

• Đầu tiên DNA 300.000-400.000 bp gắn vào YAC hoặc BAC, cắt đoạn nhỏ trung bình 30.000-40.000 bp gắn vào cosmid, cuối cùng

là các đoạn trung bình 4.000 bp gắn vào plasmid để giải kí tự chuỗi.

2 Các kỹ thuật chính sử

dụng trong phân tích DNA

Trang 4

2 Các kỹ thuật chính sử

dụng trong phân tích DNA

Bước 1: Dùng enzyme cắt giới hạn

Bước 2: DNA bị cắt thành nhiều

đoạn khác nhau

Bước 3: đoạn DNA

được đưa vào vector

Trang 5

Ngân hàng cDNA

 Bộ gen Eukaryotae (1,7% gen người-mã hoá protein);

 Tập hợp cDNA được tổng hợp nhờ kỹ thuật phiên mã ngược

mRNA tương ứng (cDNA=complementary DNA);

 Exon;

 Enzyme reverse transcriptase, DNA polymerase;…

 cDNA từ những đoạn gen đã được phiên mã ra mRNA (khác

biệt tuỳ vào tế bào của mô đã được biệt hoá và giai đoạn biệt

hoá) tổng hợp các ngân hàng cDNA trong từng loại tế bào,

từng loại mô của các cơ quan sẽ hình thành nên ngân hàng

cDNA của một cơ quan nào đó

 VD: rễ lúa

Trang 6

Trang 8

nucleotide tự do, DNA

polymerase…

 mRNA tổng hợp nên cDNA;

 Enzyme RNase H để phân huỷ sợi khuôn RNA;

 Tổng hợp sợi đơn cDNA thứ 2

Trang 9

 Phiên mã ngược bằng phân huỷ hoàn toàn sợi khuôn mRNA

(cDNA có cấu trúc kẹp tóc-hairpin loop, S1 nuclease cắt bỏ);

 Phiên mã ngược tạo cDNA theo kỹ thuật RACE (rapid

amplification of cDNA ends): kỹ thuật nhân nhanh đầu cuối

cDNA

 Video cDNA libraries

Trang 10

 Ưu điểm sử dụng ngân hàng cDNA:

 Các dòng c-DNA chứa trình tự mã hoá liên tục của

một gen;

 Những tế bào chuyên hoá sẽ tạo ra số lượng lớn của 1 loại protein;

 Dễ chiết tách; giảm nhẹ việc xác định đúng dòng

mong muốn từ ngân hàng gen

Kỹ thuật tạo

ngân hàng cDNA

Trang 11

Phương pháp PCR

 PCR = Polymerase chain reaction: phản

ứng polymerase dây chuyền:

 Khuếch đại một lượng lớn đoạn DNA trong điều

kiện in-vitro;

 Trong ống nghiệm plastic nhỏ (ependoff);

 Khác hẳn với sự tạo dòng các đoạn DNA bằng tế bào vi khuẩn hay nấm men;

Trang 13

Trang 14

 Phản ứng PCR:

 Khuôn mẫu (DNA cần khuếch đại);

 Các đoạn mồi (primer ~18-25 Nucleotide);

 DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase);

 Các nucleotide tự do (dNTP);

 Dung dịch đệm thích hợp;

 Video phản ứng PCR

Trang 15

 Lợi ích:

 Khuếch đại các trình tự nucleotide đặc hiệu

 Thời gian thực hiện cực nhanh;

 Đơn giản và ít tốn kém;

 Độ tinh sạch của mẫu không cần cao

Giới hạn:

 Cần phải biết trình tự nucleotide (hoặc ít nhất là một

phần của đoạn cần khuếch đại)

Trang 16

 Các dạng PCR mở rộng:

 RT-PCR (reverse transcripstase PCR): mRNA làm

khuôn mẫu chuyển thành cDNA cho sự khuếch đại PCR;

 Real-Time PCR: PCR định lượng, có thể biết được số lượng DNA khuếch đại trong quá trình khuếch đại;

 PCR-ELISA: kết hợp với miễn dịch trong chuẩn đoán

Trang 17

Kỹ thuật xác định trình

tự DNA

 DNA: một chuỗi xoắn kép:

 4 loại Nucleotide: A (Adenine), C

(Cytosine), G (Guanine), T (Thymine);

 Xác định trình tự của DNA

(sequencing) là biết được trình tự sắp xếp của 4 loại Nu trên chuỗi DNA

Trang 18

 Phương pháp hoá học xác định trình tự

DNA của Maxam và Gilbert:

1 Đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’ của DNA;

2 Xử lí với hoá học làm biến đổi 1 hay 2 base

(dimethylsulphate làm biến đổi Guanine, hydrazine và NaCl làm biến đổi Cytosine…);

3 Các Nucleotide biến đổi sẽ bị lấy ra khỏi chuỗi DNA;

4 4 loại Nucleotide4 nhóm với 4 bản điện di  Tổng

hợp đầy đủ 4 bản điện di sẽ phản ánh đầy đủ trình tự các nucleotide của đoạn DNA

tự DNA

Trang 21

 Hạn chế của phương pháp hoá học

xác định trình tự DNA của Maxam và

Gilbert:

 Khó thực hiện;

 Cần nhiều thông số tối ưu từ thí nghiệm;

 Xác định nồng độ giới hạn của các chất hoá học;

tự DNA

Trang 23

Trang 24

4 loại dNTP

tự DNA

Trang 26

 Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA):

 RFLP=Restriction fragment length polymorphism;

 Dựa trên đặc điểm của các loại enzyme cắt giới hạn;

 Các đoạn cắt = các “dấu vân tay” (fingerprinting) đặt trưng cho từng loại phân tử;

 Bản đồ di truyền các kết quả của RFLP: xác định

nguồn gốc hoặc kiểm tra mức độ tiến hoá của các loài sinh vật

Kỹ thuật RFLP

Trang 27

 Bao gồm các bước:

 Tách chiết và tinh sạch DNA;

 Xử lí bằng enzyme cắt giới hạn;

 Điện di đoạn cắt trên gel agarose;

 Southern blotting (lai DNA/DNA)

Trang 28

 Southern blotting:

 Phương pháp lai giữa

các đoạn DNA mạch

đơn của mẫu cần nghiên

cứu với các mẫu dị

Cắt ADN bằng men giới hạn

Điện di trên gel Biến tính ADN (NaOH & NaCl) Chuyển ADN sang màng (transfer) Lai với mẫu dò được đánh dấu bằng

đồng vị phóng xạ Rửa màng lai Phát hiện phân tử lai nhờ phóng xạ tự

ghi (autoradiography)

Trang 29

Trang 30

 Ứng dụng:

 Chọn lọc các cá thể; chọn giống động thực vật;

 Phát hiện các cặp gen nghiên cứu là đồng hợp hay

dị hợp tử hay có liên kết gen…;

 Kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo quy luật Mendel;

 So sánh sự tiến hoá của các loài;

 So sánh sự khác nhau giữa các cá thể trong loài

Trang 31

Các kỹ thuật xác định tính đa

hình DNA dựa trên PCR

 Kỹ thuật AFLP:

 AFLP = Amplified fragment length polymorphism

(các đoạn DNA đa hình được khuếch đại chọn lọc);

 Các cặp mồi (primer) đặc hiệu khuếch đại đoạn DNA cần nghiên cứu;

 Thực hiện PCR lần thứ 2 với các mồi được nối thêm

1 hoặc 2 nucleotide ở đầu 3’ (hoặc 5’) của mồiđể

nhân các đoạn DNA có tính đặc hiệu cao;

 Cho phép phân biệt mức độ giống nhau khác nhau

của các đơn vị dưới loài (quan hệ di truyền gần nhau)

Trang 32

Kỹ thuật

AFLP

Trang 33

Kỹ thuật AFLP

Trang 34

Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR

Trang 35

microsatellite (vi vệ tinh);

 Phổ biến trong hệ gen

Trang 36

Kỹ thuật SSR

 Ưu điểm:

 Khả năng phát hiện tính đa hình cao;

 Phát hiện được kiểu gen đồng hợp hay dị hợp

 Tiết kiệm thời gian và hoá chất

 Nhược điểm:

 Thiết kế mồi đặc hiệu cho từng locus;

 Khó xác định mối quan hệ giữa các allele với những trình tự lặp lại SSR này

Trang 37

Ý nghĩa của các kỹ thuật

Gene Đặc tính Nguồn Nhiễm

sắc thể

Liên kết marker

Khoảng cách

Bph-10(t) Rầy nâu O.australi

Trang 38

Bản đồ di truyền nhiễm sắc

thể số 12 của cà chua

Trang 40

 Giải kí tự chuỗi DNA của hàng loạt mô hình:

 Vi khuẩn E.coli (kích thước 4,6 Mb; năm 1997; số lượng

Trang 41

Genomics

Trang 42

 Genome = bộ gen;

 Sự giải kí tự chuỗi thành công ở bộ gen người và

hàng trăm sinh vật khác đã tạo nên khoa học về bộ gen gọi là Genomics hay bộ gen học;

 Cho phép hiểu chi tiết về cơ chế phân tử của sự

sống, xác định được trình tự DNA nhanh chóng và các chức năng;

 Phát hiện, bảo tồn và sử dụng sự đa dạng sinh học

Genomics

Trang 43

protein, gồm vị trí, chức năng, các biến đổi và

tương tác;

 Ứng dụng trong sản xuất ra hormon và vaccin có

hiệu quả với số lượng lớn;

 Mạng lưới các gen điều hoà;

 Chữa trị một số bệnh do thiếu biến đổi sau dịch mã;

 Mạng lưới biểu hiện gen giữa các loài

Proteomics

Trang 44

Trang 45

 Nhập môn CNSH – Phạm Thành Hổ;

 Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thuỳ Dương;

 Biện pháp sinh học trong Bảo vệ thực vật – Nguyễn Văn Đĩnh;

 Bài giảng về công nghệ sinh học trong bệnh cây-Hà Viết Cường;

 System biology – Pierre Hilson;

 Molecular breeding and biodiversity of plants- Isabel Roldan

Trang 46

LOGO

Tiêu đề	Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (tiếp theo)
Tác giả	Nguyen Thi Viet Anh
Trường học	Trường Đại học Công nghệ TP.HCM
Chuyên ngành	Công nghệ sinh học
Thể loại	Chương
Thành phố	TP.HCM

Định dạng
Số trang	46
Dung lượng	1,1 MB