(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người

(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NCS Lê Thị Thơm

NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA 3 - 6 TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG

THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2021

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NCS Lê Thị Thơm

Đề tài: “NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA 3 - 6 TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG VIỆT NAM

Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM THỰC PHẨM BẢO VỆ

SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI”

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 9 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS TS Đặng Diễm Hồng

Hà Nội – 2021

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS TS Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng Phòng Công nghệ Tảo - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định hướng, chỉ bảo tận tình những kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ về tinh thần, vật chất, động viên tôi vượt qua nhiều trở ngại và khó khăn để hoàn thành luận án trong suốt những năm qua

Tôi trân trọng cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phòng đào tạo của học Viện Khoa học và Công nghệ cùng các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp đã và đang công tác tại phòng Công nghệ Tảo: TS Hoàng Thị Minh Hiền, TS Ngô Thị Hoài Thu, TS Hoàng Thị Lan Anh, TS Lưu Thị Tâm, TS Nguyễn Cẩm Hà, ThS Đinh Thị Ngọc Mai

… đã cho tôi những lời khuyên chân thành, đã đóng góp ý kiến và giúp đỡ tôi hoàn chỉnh số liệu trong luận án này

Tôi xin cảm ơn Khoa Dược lý – Học viện Quân Y đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm, TS Đoàn Lan Phương – Viện Hóa học Các hợp chất Thiên nhiên - phân tích hàm lượng các axít béo, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng - kiểm tra chất lượng của dầu, Công ty Cổ phần Dược phẩm Novaco - bao viên, đóng gói và hoàn thiện sản phẩm

Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ Công Thương “Nghiên cứu quy trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo omega-3 và omega-6 (EPA, DHA, DPA) từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng” năm 2013 - 2015 thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 do PGS TS Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình

Hà Nội, ngày tháng năm 20

Nghiên cứu sinh

Lê Thị Thơm

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Lê Thị Thơm

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU…… ……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU………… ……… 4

1.1 Giới thiệu chung về axit béo, vai trò, nguồn gốc và con đường sinh tổng hợp axít béo……… ……… 4

1.1.1 Giới thiệu chung về axit béo …… ……… ……… ……… 4

1.1.2 Vai trò và ứng dụng của PUFAs……….……… 6

1.1.3 Nguồn cung cấp PUFAs 9

1.1.4 Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở vi tảo ……… 14

1.2 Vi tảo biển dị dưỡng, công nghệ nhân nuôi sinh khối và các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nhân nuôi sinh khối ……… 18

1.2.1 Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Schizochytrium ……… 18

1.2.2 Công nghệ nhân nuôi sinh khối vi tảo biển dị dưỡng trên thế giới………… 20

1.2.3 Công nghệ nhân nuôi sinh khối chi Schizochytrium trên các quy mô khác nhau và sản xuất thương mại DHA……… 22

1.2.4 Một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sản xuất DHA ở thraustochytrid, đặc biệt là chi Schizochytrium 24

1.3 Các phương pháp tách chiết, tinh sạch PUFAs, bảo quản dầu………… 26

1.3.1 Các phương pháp tách chiết dầu thô có chứa PUFAs……….……… 26

1.3.2 Các phương pháp thủy phân dầu từ dầu thô ……….……… 29

1.3.3 Các phương pháp tinh sạch PUFAs, DHA, EPA, DPA ……… 30

1.3.4 Bảo quản axit béo……… ……….……… ………… 33

1.4 Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của dầu tách chiết từ Schizochutrium đối với người và động vật … 35 1.5 Tình hình sản xuất và tách chiết PUFAs từ VTBDD ở Việt Nam …… 36

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 38

2.1 Vật liệu……… 38

2.1.1 Chủng tảo và điều kiện nhân nuôi sinh khối ……… 38

2.1.2 Động vật thí nghiệm 38

2.1.3 Sinh khối tảo và cặp mồi đặc hiệu 38

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 39

2.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng……… 39

2.2.1 Hóa chất……… 39

2.2.2 Các dụng cụ và thiết bị sử dụng……… 39

2.3 Môi trường……… 40

2.4 Phương pháp nghiên cứu ……… 41

2.4.1 Sàng lọc và nhân nuôi sinh khối chủng tiềm năng trong các hệ thống lên men khác nhau cho tích lũy các axit béo ω 3 - 6 cao ……… 41

2.4.2 Phương pháp tách chiết lipit và làm giàu hỗn hợp axít béo giàu ω 3 - 6 44

2.4.3 Xác định các chỉ tiêu chất lượng của dầu……… 47

2.4.4 Tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên Algal oil omega 3 (AOO-3-6) 50

2.5 Bố trí thí nghiệm 51

2.5.1 Sàng lọc nhanh chủng/loài tiềm năng cho sản xuất sinh khối giàu axit béo ω 3 - 6……… 51

2.5.2 Thí nghiệm nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng tiềm năng… 52 2.5.3 Nhân nuôi sinh khối chủng S mangrovei TB17 trong các hệ thống lên men khác nhau (1, 5, 10, 30 và 150 Lít)……… 52

2.5.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện đến quá trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 54

2.5.5 Nghiên cứu khả năng bảo quản của các chất chống oxy hóa lên chất lượng dầu sinh học omega-3 và omega-6 57

2.5.6 Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên AOO-3-6 57

2.6 Xử lý số liệu 58

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 59

3.1 Sàng lọc chủng/loài tiềm năng và lựa chọn điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp ở các quy mô khác nhau ……… 59

3.1.1 Sàng lọc nhanh chủng/loài tiềm năng cho sản xuất sinh khối giàu axit béo omega 3 - 6……… 59

3.1.2 Lựa chọn điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp chủng TB17 ở quy mô bình tam giác lên sinh trưởng và tích lũy axit béo……… 62

3.1.3 Nhân nuôi sinh khối ở các hệ thống lên men 5 và 10 Lít ……… 68

3.1.4 Nhân nuôi sinh khối ở hệ thống lên men 30 Lít ……… 70

3.1.5 Nhân nuôi sinh khối ở các hệ thống lên men 150 Lít ……… 72

3.1.6 Các phương pháp nhân nuôi khác nhau để cung cấp sinh khối giàu axít béo ω 3 – 6……… 74

3.1.7 Thu hoạch sinh khối chủng S mangrovei TB17 ……… 80

3.2 Tách chiết dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 từ SKK chủng TB17 …… 82

3.2.1 Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 dạng FFA …… 82

3.2.2 Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 dạng methyl este … 94 3.2.3 So sánh 2 phương pháp tách chiết dầu (dạng FFA và dạng methyl ester) từ

sinh khối tươi và SKK……… 100

3.2.4 Sản xuất và đánh giá chất lượng dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 ở quy mô 100g SKK/mẻ ……… 103

3.3 Các điều kiện bảo quản dầu, sản xuất viên nang mềm và đánh giá tính an toàn, tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên nang mềm AOO-3-6……… 108

3.3.1 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa đến quá trình bảo quản dầu giàu các axit béo ω 3 - 6……… 108

3.3.2 Nghiên cứu sản xuất viên nang mềm algal oil omega 3 - 6 từ dầu sinh học giàu axit béo ω 3 – 6 …… 113

3.3.3 Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên dầu tảo AOO-3-6……… 116

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 124

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ………… 126

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 127

PHỤ LỤC………

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ALA

AOO-3-6

α-linolenic acid Axit α-linolenic

Algal oil omega-3-6 ARA Arachidonic acid Axit Arachidonic

BHA Butylated Hydroxyanisole Butylated Hydroxyanisole

BHT Butylated Hydroxytoluene Butylated Hydroxytoluene

DHA Docosahexaenoic acid Axit Docosahexaenoic

DPA Docosapentaenoic acid Axit Docosapentaenoic

DGLA dihomo-gamma-linoleic acid Axit dihomo-gamma-linoleic

EPA Eicosapentaenoic acid Axit Eicosapentaenoic

FDA Food and Drug Administration Cục Quản lý Thực phẩm và Dược

phẩm Hoa kỳ GRAS Generally Recognized as Safe Chứng nhận là an toàn

GLA Gama linoleic acid Axit Gama linoleic

MUFA Monounsaturated fatty acid Axit béo không bão hòa một nối đôi

PUFA Polyunsaturated fatty acid Axit béo không bão hòa đa nối đôi PKS Polyketide synthase Sinh tổng hợp kỵ khí

SFA Saturated fatty acid Axit béo bão hòa

microscopy

Kính hiển vi điện tử truyền qua

TFA Total fatty acid Axit béo tổng số

TBHQ Tertiary Butyl Hydroquinone Tertiary Butyl Hydroquinone

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng các axít béo ω 3 - 6 có trong một số loại dầu thực vật 9 Bảng 1.2 Hàm lượng DHA và EPA của một số loại cá và động vật 10 Bảng 1.3 Một số sản phẩm thương mại có chứa EPA và DHA có nguồn gốc từ vi tảo… 24 Bảng 1.4 Một số phương pháp tách chiết dầu và khả năng thu hồi của chúng……… 29 Bảng 2.1 Danh sách các chủng VTBDD Schizochytrium spp.……… 38 Bảng 3.1 Sự thay đổi MĐTB, SKK và hàm lượng lipit của các chủng được nhân

nuôi sinh khối trong bình tam giác 250 mL sau 144 giờ ……… 60 Bảng 3.2 Thành phần axit béo của các chủng TG11(6), TB17 và PQ6 61 Bảng 3.3 Thành phần axit béo trong sinh khối tươi của chủng TB17 nhân nuôi sinh

khối trong bình tam giác 1 Lit……… 67 Bảng 3.4 Thành phần axít béo của sinh khối tươi chủng TB17 khi nhân nuôi sinh

khối trong hệ thống lên men 5 và 10 Lít 69 Bảng 3.5 Thay đổi MĐTB, SKK, hàm lượng lipit của chủng TB17 khi nhân nuôi

sinh khối trong hệ thống lên men 30 Lít sử dụng CNMTK và CNMCN 70 Bảng 3.6 Thành phần và hàm lượng axít béo của chủng TB17 khi nhân nuôi sinh

khối trong hệ thống lên men 30 Lít sử dụng CNMTK và CNMCN 71 Bảng 3.7 Thay đổi mật độ tế bào, sinh khối khô và lipit của chủng TB17 khi nhân

nuôi sinh khối trong hệ thống lên men 150 Lít……… 72 Bảng 3.8 Thành phần và hàm lượng axít béo của sinh khối tảo S mangrovei TB17

sau 120 giờ nhân nuôi sinh khối trong hệ thống lên men 150 Lít………… 73 Bảng 3.9 Sinh trưởng, hàm lượng lipit và glucose dư trong môi trường của chủng

TB17 dưới điều kiện nhân nuôi sinh khối theo mẻ……… 75 Bảng 3.10 Sinh trưởng, hàm lượng lipit và glucose dư trong môi trường của chủng

TB17 dưới điều kiện nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-batch……… 75 Bảng 3.11 Thành phần axit béo trong sinh khối của chủng TB17 ở các phương pháp

nhân nuôi sinh khối khác nhau trong môi trường P1……… 77 Bảng 3.12 Tổng hợp thành phần và hàm lượng các axit béo chủ yếu trong quá trình

nhân nuôi sinh khối ở các quy mô khác nhau 79 Bảng 3.13 Thành phần axít béo trong lipit của chủng TB17 khi nhân nuôi sinh khối

theo mẻ ở hệ thống lên men 30 Lít……… 86

Bảng 3.14 Một số tính chất của dầu tảo sau phản ứng xà phòng hóa ……… 88

Bảng 3.15 Thành phần axít béo trong hỗn hợp dầu sau phản ứng xà phòng hóa lipit 89 Bảng 3.16 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm dầu sinh học giàu

axit béo ω 3 - 6 thu được sau quá trình làm giàu……… 92

Bảng 3.17 Thành phần axít béo trong pha rắn và pha lỏng sau quá trình tạo phức với

urea 93 Bảng 3.18 Thành phần axít béo của TFA thu được từ SKK chủng TB17 96 Bảng 3.19 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm dầu sinh học giàu

axit béo ω 3 - 6 (dạng methyl ester) thu được sau quá trình làm giàu……… 98 Bảng 3.20 Thành phần axít béo trong pha rắn và pha lỏng sau quá trình tạo phức với

urea 99 Bảng 3.21 Ảnh hưởng của các phương pháp tách chiết dầu khác nhau và các nguồn

sinh khối khác nhau đến hiệu suất tách chiết dầu giàu axít béo ω 3 - 6 100 Bảng 3.22 Thành phần axit béo của hỗn hợp PUFAs thu được ở dạng FFA và methyl

giàu axít béo  3 - 6 114 Bảng 3.31 Các chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại nặng của của viên nang mềm thực

phẩm chức năng giàu axít béo  3 - 6 115 Bảng 3.32 Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của viên nang dầu tảo AOO-3-6……… 116 Bảng 3.33 Ảnh hưởng của viên nang AOO-3-6 đối với trọng lượng cơ thể chuột (n =

Bảng 3.34 Ảnh hưởng của viên nang AOO-3-6 lên một số chỉ tiêu huyết học của

chuột (n = 08, ± SD)……… 118 Bảng 3.35 Ảnh hưởng của viên nang AOO-3-6 lên nồng độ creatinin huyết thanh

Bảng 3.36 Tốc độ hình thành phản xạ có điều kiện, tốc độ dập tắt phản xạ có điều

kiện tìm thức ăn trong mê lộ của các lô chuột nghiên cứu (n = 8)………… 123

x

x

x

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của DHA……… 5

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của EPA………… 6

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của ω-6 DPA (A) và ω-3 DPA (B)……… 6

Hình 1.4 Sản xuất axit béo omega - 3 từ các nguồn khác nhau ……… 12

Hình 1.5 Sơ đồ tách chiết PUFAs từ vi tảo và lợi ích của nó đối với con người… 12 Hình 1.6 Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở thực vật, động vật và con người… 15 Hình 1.7 Mối quan hệ giữa sinh tổng hợp terpenoid và docosahexaenoic acid (DHA) ở Thraustochytrids……… 15

Hình 1.8 Sinh tổng hợp DHA theo con đường hiếu khí ở Thraustochytriidae… 16

Hình 1.9 Sinh tổng hợp DHA theo con đường PKS ở Thraustochytriidae…… 17

Hình 1.10 Vòng đời và sơ đồ tóm tắt các dạng tế bào trong chu kỳ sống của thraustochytrid và labyrinthulid……… 19

Hình 1.11 Vị trí phân loại của chi Schizochytrium 20

Hình 1.12 Sơ đồ tổng quát của nhân nuôi sinh khối theo mẻ, theo kiểu fed-batch, liên tục và động học tăng trưởng của các quá trình nhân nuôi sinh khối tương ứng……… 21

Hình 1.13 Sơ đồ tổng quát hoạt động của các chất chống oxy hóa……… 34

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu dầu sinh học giàu ω 3 - 6 từ Schizochytrium mangrovei TB17 58 Hình 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của chủng TB17………… 62

Hình 3.2 Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của chủng TB17……… 62

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh trưởng của chủng TB17…… 64

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng của chủng TB17… 64

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của chủng TB17………… 65

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng của chủng TB17 65 Hình 3.7 Ảnh hưởng của pH môi trường môi trường lên sinh trưởng của chủng TB17……… 66

Hình 3.8 Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh trưởng của chủng TB17 66 Hình 3.9 MĐTB, SKK và hàm lượng lipit của chủng TB17 trong bình tam giác 1 Lit……… 67

Hình 3.10 Ảnh hình thái tế bào chủng TB17 nhân nuôi sinh khối trong bình tam giác 1 Lit……… 68

Hình 3.11 MĐTB và SKK của chủng TB17 trong hệ thống lên men 5 và 10 Lit… 68 Hình 3.12 Hàm lượng glucose còn dư trong môi trường nuôi và lipit của chủng TB17 trong hệ thống lên men 5 và 10 Lit… ……… 68

Hình 3.13 Sinh trưởng của chủng TB17 trong các môi trường nhân nuôi sinh khối

khác nhau……… 74 Hình 3.14 Sự thay đổi thể lipit trong quá trình nhân nuôi sinh khối theo mẻ…… 78 Hình 3.15 Sự thay đổi thể lipit trong quá trình nhân nuôi sinh khối kiểu fed-batch 78 Hình 3.16 Ảnh hưởng của các phương pháp thu hoạch sinh khối đến sinh khối

tươi (A) và MĐTB tảo trong môi trường sau thu hoạch (B)……… 80 Hình 3.17 MĐTB tảo trong môi trường nuôi sau thu hoạch bằng chitosan ở các

Hình 3.18 Ảnh minh họa quá trình thu sinh khối bằng chitosan ở các nồng độ

Hình 3.19 Ảnh hưởng của phương pháp tách chiết lên hiệu suất tách chiết lipit từ

sinh khối khô của chủng TB17……… 83 Hình 3.20 Ảnh hưởng của các loại dung môi lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh

khối khô của chủng TB17……… … 83 Hình 3.21 Ảnh hưởng của phương pháp sấy sinh khối lên hiệu suất tách chiết lipit

từ sinh khối khô của chủng TB17……… 84 Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh

khối khô của chủng TB17……… 84 Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh

khối khô của chủng TB17……… 85 Hình 3.24 Ảnh hưởng của chế độ khuấy lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối

khô của chủng TB17……… 85 Hình 3.25 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH (A), thời gian phản ứng (B) và nhiệt độ

phản ứng (C) lên hiệu suất xà phòng hóa dầu tảo……… 87 Hình 3.26 Ảnh hưởng của tỉ lệ FFA: urea (A), tỉ lệ Urea: ethanol (B) và nhiệt độ

kết tinh (C) lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs của hỗn

Hình 3.27 Ảnh hưởng của chất xúc tác lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối

khô của chủng TB17……… 95 Hình 3.28 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/ sinh khối lên hiệu suất tách chiết TFA

từ sinh khối khô của chủng TB17……… 95 Hình 3.29 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh

khối khô của chủng TB17……… 96 Hình 3.30 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh

khối khô của chủng TB17……… 96 Hình 3.31 Ảnh hưởng của tỷ lệ TFA: urea lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách

Hình 3.32 Ảnh hưởng của tỷ lệ Urea: methanol lên hiệu suất tạo phức và hiệu

thu được……… 104 Hình 3.36 Quy trình tách chiết dầu giàu axít béo ω 3 - 6 PUFAs dạng methyl este

từ SKK chủng S mangrovei TB17 theo phương pháp tạo phức urea… 105 Hình 3.37 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa BHA lên chỉ số peroxide của

dầu sinh học ω 3 - 6……… 109 Hình 3.38 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa BHT lên chỉ số peroxide của

dầu sinh học ω 3 - 6……… 109 Hình 3.39 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa TBHQ lên chỉ số peroxide của

dầu sinh học ω 3 - 6……… 110 Hình 3.40 Ảnh hưởng của hỗn hợp 3 chất bảo quản theo tỷ lệ 1:1:1 (B) lên chỉ số

peroxide của dầu sinh học ω 3 - 6……… 110 Hình 3.41 Ảnh hưởng của vitamin E nồng độ 0,0075% lên chỉ số peroxyt của dầu

sinh học ω 3 - 6 112 Hình 3.42 Ảnh hưởng của viên AOO-3-6 đối với hoạt độ AST (A) và ALT (B),

hàm lượng Albumin huyết tương (C) và Chlesterol toàn phần (D)…… 120 Hình 3.43 Hình ảnh đại thể gan, thận, lách chuột lô đối chứng (A), lô TN1 (B) và

Hình 3.44 Hình ảnh mô bện học vi thể gan, thận, lách chuột sau 90 ngày uống

thuốc lô đối chứng (A, D, H), lô TN1 (B, E, D) và lô TN2 (C, G, K),

MỞ ĐẦU

Hiện nay, khi nhu cầu cuộc sống cũng như những đòi hỏi cao hơn về giá trị dinh dưỡng thì con người không chỉ sử dụng các loại dầu ăn thông dụng mà còn cả các loại dầu đặc sản có giá trị cao (dầu salad, dầu chức năng) để phục vụ cho món

ăn cao cấp, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người, dược phẩm Các loại dầu từ thực vật chỉ chứa các axít béo không bão hòa có mạch cacbon ≤ 18 Trong đó các loại dầu thực vật như dầu lanh, canola và đậu tương chứa các axit béo không bão hòa đa nối đôi dạng omega-3 (polyunsaturated fatty acid omega 3; PUFAs ω-3) chủ yếu là axít α-linolenic (ALA) và các loại dầu khác như dầu bắp, dầu hạt bông vải, dầu nho…lại chứa chủ yếu là PUFAs ω - 6 Đối với các loại axít béo ω-3 có số cacbon lớn hơn 20 và 22 chủ yếu lại có nguồn gốc từ cá biển Nguồn cung cấp chính các axít béo docosahexaenoic (DHA; C22:6) và eicosapentaenoic (EPA; C20:5) là các loài cá nhiều mỡ như cá trích, cá thu và cá hồi Tuy nhiên, chất lượng của dầu cá biển tự nhiên lại phụ thuộc vào loài cá, mùa

vụ và vị trí đánh bắt Việc sử dụng dầu PUFAs có nguồn gốc từ cá trong khẩu phần thức ăn, kể cả cho trẻ nhỏ cũng như dược phẩm có thể gặp một số bất lợi bởi sự có mặt tạp nhiễm của polychlorinated biphenyls (PCBs) hoặc dioxin, kim loại nặng… cũng như mùi vị đặc trưng của cá gây ra Hơn nữa, dầu cá biển thực tế là một hỗn hợp phức tạp các axít béo có chiều dài mạch cacbon và mức độ chưa bão hoà rất khác nhau Do vậy, việc tinh sạch chúng rất khó khăn và đòi hỏi chi phí tốn kém trước khi có thể sử dụng chúng vào các mục đích khác nhau cũng như nâng cao giá trị sử dụng các sản phẩm tạo ra so với giá trị ban đầu Dầu sinh học giàu PUFAs ω 3

- 6 được sản xuất từ một số loài vi tảo đang thu hút được sự quan tâm nghiên cứu và dần có một vị trí đáng kể, không ngừng được mở rộng và phát triển mạnh mẽ trong thị trường thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người, dược phẩm trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng

Vi tảo biển (VTB) được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: khai thác các chất có hoạt tính sinh học, để xử lý môi trường, làm phân bón, nhiên liệu sinh học và được ứng dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản (NTTS) với một số loài VTB quang tự dưỡng truyền thống Tuy nhiên, việc nuôi trồng VTB quang tự dưỡng có chi phí cao làm cho giá thành sản xuất các sản phẩm đi từ sinh khối tảo có giá thành đắt, gây hạn chế cho việc thương mại hóa trên quy mô lớn Để khắc phục những nhược điểm nêu trên, việc tìm kiếm, khai thác và ứng dụng các loài vi tảo

biển dị dưỡng (VTBDD) trong đó có chi Schizochytrium đang thu hút nhiều sự quan

tâm nghiên cứu của các nhà khoa học cả trong và ngoài nước nhưng vẫn còn rất mới

mẻ ở Việt Nam và hứa hẹn sẽ mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống con người

Các loài VTBDD thuộc chi Schizochytrium có khả năng tích lũy hàm lượng

lipit cao, có thể lên tới 70% sinh khối khô (SKK) và hàm lượng -3 PUFAs như EPA, DHA chiếm 30-50% so với axít béo tổng số (Total fatty acid - TFA) Vai trò của -3 PUFAs nêu trên đã được chứng minh ở nhiều khía cạnh như sự phát triển trí não của trẻ nhỏ, sức khỏe đối với hệ tim mạch, hệ thần kinh và trong nhiều liệu pháp điều trị các bệnh ung thư, mất trí nhớ, trầm cảm

Hiện nay, chi VTBDD Schizochytrium được coi là một trong các ứng cử viên

tiềm năng thay thế nguồn sản xuất -3 PUFAs truyền thống từ dầu cá Ở Việt Nam, những nghiên cứu về nhân nuôi sinh khối, tách chiết và ứng dụng của các axít béo trên từ VTBDD còn rất mới mẻ và có nhiều tiềm năng ứng dụng Chính vì vậy,

chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 - 6

từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người”

Mục tiêu nghiên cứu của luận án

1 Sàng lọc chủng/loài VTBDD và tối ưu điều kiện nhân nuôi sinh khối để thu được sinh khối giàu axít béo ω 3 - 6;

2 Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh sạch và bảo quản dầu sinh học giàu axit béo ω 3

- 6 từ loài vi tảo biển dị dưỡng lựa chọn được;

3 Sản xuất viên nang dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 có tính an toàn cao và đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ, khả năng học tập của viên nang trên động vật thực nghiệm

Một số nội dung nghiên cứu chính của luận án

1 Sàng lọc chủng tiềm năng giàu axít béo ω 3 - 6 từ các loài VTBDD Việt Nam; tối

ưu các điều kiện nhân nuôi thu sinh khối chủng tiềm năng ở quy mô bình tam giác, ở các hệ thống khác nhau (5, 10, 30 và 150 Lít);

2 Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh sạch và bảo quản dầu sinh học giàu axít béo ω 3

- 6 nhằm cung cấp nguyên liệu đảm bảo chất lượng ứng dụng làm thực phẩm bảo

vệ sức khỏe cho con người;

3 Sản xuất viên nang Algae oil omega 3 - 6 (AOO-3-6) từ dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 đảm bảo chất lượng, có tính an toàn cao và đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ, khả năng học tập của viên AOO-3-6 trên mô hình động vật thực nghiệm

Những đóng góp mới của luận án

- Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách bài bản, có

hệ thống về: sàng lọc, nhân nuôi sinh khối chủng vi tảo biển dị dưỡng tiềm năng

Schizochytrium mangrovei TB17 được phân lập ở tỉnh Thái Bình, Việt Nam có hàm

lượng PUFAs ω 3 - 6 cao, trong đó DHA chiếm 42,68 ±1,76% so với TFA và axit docosapentaenoic (DPA) chiếm 11,02 ± 1,14% so với TFA; lựa chọn được các điều

giờ nhân nuôi sinh khối có sử dụng glucose ban đầu 30 g/L và nitơ 0,22 g/L Khi

đó, năng suất axít béo không bão hòa 3,6 g/L, DHA và DPA đạt 2,54 và 0,8 g/L, tương ứng [101]

1.2.3.2 Thay đổi nhiệt độ trong quá trình nhân nuôi

Zeng và cộng sự (2011) [97] đã thu được hàm lượng DHA cao nhất 51,98%

so với TFA và sản lượng DHA 6,05% SKK khi nuôi lắc Schizochytrium HX - 308,

sử dụng nhiệt độ nhân nuôi sinh khối trong 32 giờ đầu 30°C và 12 giờ tiếp theo 20°C Điều này thể hiện tính mềm dẻo của màng tế bào thích nghi với nhiệt độ thấp [102]

1.2.3.3 Thay đổi tốc độ sục khí

Trong quá trình nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-batch trong hệ thống lên

men 1.500 Lít đối với Schizochytrium sp đã cho thấy tốc độ sục khí được kiểm soát

ở 0,4 L/L/phút trong 24 giờ đầu, sau đó chuyển sang 0,6 L/L/phút cho đến 96 giờ tiếp theo và sau đó chuyển về 0,4 L/L/phút cho đến khi kết thúc quá trình Sinh khối tươi (SKT), năng suất lipit và DHA đạt 71 g/L; 35,75 g/L và 119 mg/L/h, tương ứng, cao hơn 11,21% so với không thay đổi tốc độ sục khí [98] Trong điều kiện

tương tự, sinh khối chủng S limacinum OUC88 đạt 81,84 g/L, năng suất lipit tổng

số (43,13 g/L) và DHA (19,2 g/L), hàm lượng DHA chiếm 44,54% so với TFA [103]

1.2.3.4 Thay đổi phương pháp nhân nuôi sinh khối

Chủng Schizochytrium sp sau 120 giờ nhân nuôi sinh khối theo mẻ có SKK,

lipit và năng suất DHA đạt 55,32 g/L, 22,5 g/L và 8,34 g/L, tương ứng Trong khi

đó, nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-bacth ở chủng này sau 96 giờ nhân nuôi sinh khối và có tiến hành bổ sung glucose thì SKK, lipit và năng suất DHA cao hơn đạt 60,16 g/L, 30,44 g/L và 10,77 g/L, tương ứng [104] Vì vậy, phương pháp này có triển vọng phát triển trên quy mô công nghiệp cho việc sản xuất DHA từ vi tảo

1.2.3.5 Thay đổi hỗn hợp các điều kiện

Quá trình nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-batch sản xuất nhiều DHA ở

Schizochytrium sp FJU-512 được thực hiện trong hệ thống lên men 15 Lít Các điều

kiện nhân nuôi sinh khối như nhiệt độ, pH, oxy hòa tan và tốc độ khuấy được điều khiển tự động Sau đó, 10 g/L nitơ hữu cơ, 20 g/L muối biển và glucose được thêm liên tục khi glucose còn lại dưới 2% sau 24 giờ Nhiệt độ được duy trì 28°C ở pha log, sau đó, hạ xuống dưới 25°C để tăng cường sự tích lũy chất béo Tốc độ sục khí

1 L/L/phút, oxy hòa tan khoảng 5% pH được duy trì ở mức 5,7 ± 0,1 bằng cách tự động bổ sung thêm amoniac công nghiệp 28% Kết quả năng suất DHA tăng lên từ 1,09 ± 0,05 g/L (sau 36 giờ) lên 16,04 ± 0,80 g/L (sau 120 giờ) [105]

Các hướng nghiên cứu nêu trên đã được mở rộng đáng kể trong những năm gần đây với các sản phẩm rất đa dạng, đặc biệt là các sản phẩm từ dầu tảo có hàm lượng EPA và DHA cao được thể hiện ở Bảng 1.3

Bảng 1.3 Một số sản phẩm thương mại có chứa EPA và DHA có nguồn gốc từ vi

tảo [43]

Tên sản phẩm

EPA+DHA (%

dầu thương mại)

Quang tự dưỡng, bể hở DSM-NP life’s

DHA™

40% - 45%

DHA

Crypthecodinium cohnii Javornicky

Nhân nuôi sinh khối dị dưỡng DSM-NP life’s DHA

plus EPA™

22,5% DHA

Goldstein and Belsky

Nhân nuôi sinh khối dị dưỡng

DHA

Ulkenia sp Gaertner Nhân nuôi sinh

khối dị dưỡng Source-Omega

Source Oil™ 35% DHA - 40%

Schizochytrium sp

Goldstein and Belsky

Nhân nuôi sinh khối dị dưỡng GCI Nutrients DHA

1.2.4.1 Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ

Taoka và cộng sự (2009) [106] đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự

tăng trưởng và cấu trúc axít béo của Aurantiochytrium sp mh0186 Kết quả nhiệt độ

từ 15°C đến 30°C không làm thay đổi hàm lượng DHA và năng suất sinh khối Tuy nhiên, nhiệt độ có thể làm thay đổi cấu hình axít béo ở ngoài vùng nhiệt độ từ 10°C

đến 35°C Ở giá trị nhiệt độ 5°C và 40°C thì Aurantiochytrium sp không sinh trưởng Kết quả tương tự cũng được xác định ở chủng A limacinum OUC88, với nhiệt độ tối ưu trong khoảng từ 16°C đến 23°C [107], Schizochytrium sp KF-1, A

mangrovei KF-2, KF-7, KF-12, Thraustochytrium striatum KF-9 và Ulkenia sp

KF-13 với nhiệt độ tối ưu từ 15°C đến 30°C [108]

1.2.4.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nhiều nguồn cacbon khác nhau đã được sử dụng cho sinh trưởng của Thraustochytrids, phổ biến nhất là glucose và glycerol Nồng độ của nguồn cacbon cũng là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và hiệu suất

DHA của một số Thraustochytrids Ví dụ, Chủng Aurantiochytrium sp TC 20 thay

đổi hàm lượng lipit từ 33 đến 52% dưới các điều kiện nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-batch với thành phần môi trường và nguồn cacbon khác nhau [109] Sahin và

cộng sự (2018) [110] đã cho thấy chủng Schizochytrium sp S31 có khả năng sử dụng

nguồn cacbon là glucose và glycerol Chủng này có năng suất sinh khối và DHA đạt 5,15 g/L và 0,33 g/L khi nồng độ glucose là 40 g/L hoặc nồng độ glycerol là 40 g/L

Tương tự, Thraustochytrium sp ONC-T18, khi được nhân nuôi sinh khối ở nồng độ glucose 100 g/L thì năng suất DHA đạt 4 g/L [111], trong khi Schizochytrium sp sử

dụng gycerol trong lên men fed-bacth, sinh khối khô đạt 103,44 ± 1,50 g/L, lipit đạt 47,22 ± 0,54 % SKK và DHA 61,76 ± 3,77 g/L [112]

1.2.4.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nitơ cũng là một tham số quan trọng cho sự sinh trưởng của thraustochytrid Một số tác giả đã sử dụng peptone và cao nấm men [113], hoặc cao nấm men (10 g/L) và mì chính (10 g/L) thì sinh khối, hàm lượng lipit và DHA đạt 55,83 g/L, 34,97% SKK và 35,68% TFA, tương ứng sau 96 giờ nhân nuôi sinh khối [55] Yokochi và cộng sự (1998) [114] đã nghiên cứu các nguồn nitơ khác nhau với mục

tiêu làm tăng năng suất sinh khối và hiệu suất DHA trong A limacinum SR21 Khi

sử dụng cao ngô hay cao nấm men thì sinh khối thu được đạt 15 g/L nhưng năng suất DHA ở cao ngô tăng gấp 3 lần (1,5 g/L)

Tỷ lệ C/N cao đã được chứng minh là cải thiện quá trình tổng hợp lipit và tích lũy DHA trong quá trình nhân nuôi sinh khối với thraustochytrid chủng G13 [115]

Jakobsen và cộng sự (2008) [116] đã cho thấy hàm lượng TFA của Aurantiochytrium

sp T66 tăng trong điều kiện đói nitơ - tức là giảm hàm lượng nitơ dẫn đến tích lũy lipit Huang và cộng sự (2012) [113] đã nghiên cứu trong quá trình nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-batch với các tỷ lệ C/N khác nhau là 0,5; 1,25 và 1,875 với chủng

A limacinum SR21 Kết quả thu được hàm lượng DHA tăng từ 50% đến 67% so với

TFA, năng suất sinh khối đạt 62 g/L và DHA đạt 20 g/L

1.2.4.4 Ảnh hưởng của độ mặn

Chi Schizochytrium được phân lập từ các vùng rừng ngập mặn nên độ mặn là

yêu cầu bắt buộc cho sinh trưởng của các chi này Các chủng có độ mặn dao động lớn thì sẽ có khả năng chịu đựng độ mặn rộng (thậm chí tới 0%) [45] Chi

Schizochytrium sinh trưởng tốt trong khoảng 15 - 30‰ cũng đã quan sát được ở rất

nhiều chủng thuộc loài S mangrovei, S limacinum [108, 114], độ mặn tối ưu dao động trong khoảng 15 - 22,5‰ ở một số chủng thuộc chi Schizochytrium and

Thraustochytrium [117] Một số chủng có thể phát triển tốt trên một phạm vi độ

mặn rộng từ 0 đến 12‰, đồng thời hàm lượng DHA của chúng dao động trong khoảng 0,08 - 0,10 g/g SKK [118]

1.2.4.5 Ảnh hưởng của oxy hòa tan

Thraustochytrids là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc [74], nghĩa là oxy cần thiết cho sự phát triển của chúng Tuy nhiên, sự dư thừa oxi có thể dẫn đến quá trình oxy hóa các axít béo chưa bão hòa do sự hình thành các phản ứng oxy hóa Tuy nhiên, dưới các điều kiện giới hạn oxy, hàm lượng DHA cao cũng đã được ghi nhận (51%

so với TFA) và SKK đạt 26 g/L Do đó, để có được năng suất sinh khối cao và hàm lượng lipit cao, Huang và cộng sự (2012) [113] đã cung cấp oxy liên tục trong quá

trình nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-batch A limacinum SR21, mức oxy hòa tan

là 50%, tỷ lệ C/N là 1,25, nồng độ glycerol 100 g/L, cao nấm men 40 g/L, peptone

40 g/L thì sinh khối tươi đạt 62 g/L, hàm lượng DHA là 73% so với TFA, năng suất DHA đạt 20 g/L Do đó, mặc dù vẫn chưa rõ liệu mức oxy liên tục hay không liên tục có lợi cho sản xuất DHA cao, nhưng nó đã được chứng minh qua các nghiên cứu rằng oxy là một tham số quan trọng đối với sự tăng trưởng của Thraustochytrids [119]

1.3 Các phương pháp tách chiết, tinh sạch PUFAs, bảo quản dầu

1.3.1 Các phương pháp tách chiết dầu thô có chứa PUFAs

Vi tảo là một nhóm các sinh vật không đồng nhất với một loạt các đặc điểm khác nhau như kích thước tế bào, màu sắc, môi trường sinh sống, phương thức sinh sống, có thể là cơ thể đơn bào hay đa bào Sự đa dạng này đã tạo cho vi tảo nhiều các sản phẩm khác nhau như bổ sung vào thực phẩm, thức ăn cho động vật, các ngành công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm và nhiên liệu [120] Chính vì vậy, các phương pháp tách chiết các sản phẩm dầu từ vi tảo cũng rất đa dạng

1.3.1.1 Phương pháp ép cơ học

Ép là phương pháp liên quan đến việc sử dụng tác động của lực nén cơ học

để phá vỡ thành tế bào và thu hồi dầu từ bên trong các tế bào Đây là phương pháp phổ biến để phá vỡ tế bào Tuy nhiên, hiệu suất ép dầu phụ thuộc vào các yếu tố chính như: loại thiết bị ép (ép thủ công, ép thủy lực hay máy ép vít liên tục), số lần ép: (ép kiệt 1 lần hay nhiều lần), đặc tính cơ học của nguyên liệu ép (kích thước hạt, nhiệt độ, độ ẩm, tính dẻo, tính đàn hồi) Phương pháp này có thể được sử dụng kết hợp với một số loại chiết dung môi như n-hexane để nâng cao hiệu quả tách chiết [121]

1.3.1.2 Phương pháp enzyme

Enzyme cũng có thể được sử dụng để thủy phân thành tế bào giải phóng dầu Việc sử dụng các enzyme đơn lẻ hoặc kết hợp với một phương pháp phá vỡ vật lý có thể làm tăng khả năng tách chiết và năng suất thu được cao hơn Một số enzyme thương mại thường được sử dụng như: alcalase, neutrase, flavourzyme, amylase, glucanase, protease,

pectinase Ví dụ khả năng thu hồi dầu cá đạt cao nhất 17,4% (sau 2 giờ) sử dụng alcalase

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý enzyme để tách dầu ra khỏi nguyên liệu như nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme/nguyên liệu, thời gian Tuy nhiên, phương pháp

này rất tốn kém nên triển khai quy mô lớn bị hạn chế [122]

1.3.1.3 Phương pháp hóa học

Phương pháp này sử dụng các dung môi hòa tan dầu để tách dầu ra khỏi

nguyên liệu Các dung môi như benzen, cyclohexan, n-hexane, acetone và chloroform đã cho thấy có hiệu quả khi được sử dụng trên vi tảo; chúng làm phá vỡ thành tế bào vi tảo và chiết xuất dầu vì dầu tảo có độ hòa tan cao trong dung môi này [123] Ngoài ra, một dung môi thích hợp thường không tan trong nước, có điểm sôi thấp để dễ dàng loại bỏ nó sau khi tách chiết, có thể tái sử dụng và tiết kiệm chi phí Vì vậy, n-hexane (một dung môi không phân cực) thường được sử dụng ở quy

mô lớn [124] Vấn đề lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình tách chiết dầu của một loại nguyên liệu nhất định là rất cần thiết Tính chất cơ bản và không thể thiếu được của dung môi tách chiết là tính chất hoà tan chọn lọc, nghĩa là dung môi phải hoà tan tốt chất cần tách mà không hoà tan hoặc hoà tan rất ít các chất khác không mong muốn [125]

1.3.1.4 Phương pháp sử dụng sóng siêu âm

Sóng siêu âm tạo ra bong bóng trong dung môi, bong bóng vỡ ra và ở gần thành tế bào của vi tảo, tạo ra sóng xung kích, làm cho các chất béo được giải phóng vào dung môi Phương pháp này cải thiện đáng kể việc tách chiết dầu vi tảo, hiệu quả cao hơn, giảm thời gian tách chiết, tăng năng suất, chi phí trung bình và ít độc

Ví dụ: Sóng siêu âm rất hiệu quả trong việc phá vỡ thành tế bào vi tảo

Crypthecodinium cohnii, tăng hiệu suất tách dầu từ 4,8% (bằng cách chiết bằng

soxhlet với n-hexane) lên 25,9% [122] Tuy nhiên, phương pháp này không thích hợp cho sự ổn định của các loại dầu giàu axít béo không bão hòa đa nối đôi và nó

khó có thể được thực hiện ở quy mô rộng

1.3.1.5 Phương pháp chuyển este hóa trực tiếp từ sinh khối

Phương pháp để chuyển hóa dầu, mỡ động thực vật thành axít béo este chủ yếu dựa trên phản ứng este hóa với xúc tác hóa học, xúc tác sinh học hoặc nhiệt phân (pyrolysis) Xúc tác hóa học trong phản ứng este hóa có thể là axít (HCl,

H2SO4) hoặc kiềm (KOH, NaOH) tùy theo trạng thái tự nhiên của nguyên liệu (lượng axít béo tự do trong nguyên liệu) [126] Hiệu suất của quá trình este hóa phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng nước có trong nguyên liệu thô (sẽ tạo thành xà phòng thay vì methyl este), lượng axít béo tự do trong nguyên liệu, nhiệt độ, áp suất