BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA GENE KHÁNG KHÁNG SINH Ở VI KHUẨN VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH.ThS NGUYỄN THỊ ĐẤU

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH HỘI ĐỒNG KHOA HỌC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA GENE KHÁNG KHÁNG SINH Ở VI KHUẨN VIBRIO CHOLERAE PH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH

HỘI ĐỒNG KHOA HỌC

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA GENE

KHÁNG KHÁNG SINH Ở VI KHUẨN

VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH

Chủ nhiệm đề tài : ThS NGUYỄN THỊ ĐẤU

Chức vụ : Trưởng Bộ môn

Đơn vị : Bộ môn Chăn nuôi Thú y

Khoa Nông nghiệp – Thuỷ sản

Trà Vinh, ngày tháng năm 2015

ISO 9001 : 2008

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH

HỘI ĐỒNG KHOA HỌC

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA GENE

KHÁNG KHÁNG SINH Ở VI KHUẨN

VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH

Xác nhận của cơ quan chủ quản

(Ký, đóng dấu, ghi rõ họ tên)

i

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Giám hiệu Trường Đại học Trà Vinh, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Phòng Đào tạo, Phòng Quản lý Khoa học, Phòng Quản

lý Sau Đại học thuộc Trường và Viện đã tạo điều kiện tốt cho tôi thực hiện nghiên cứu khoa học và các học phần của nghiên cứu sinh;

Xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hồ Thị Việt Thu, PGS.TS Trần Nhân Dũng đã tạo mọi điều kiện, rất tận tình giúp đỡ, tìm hướng đi phù hợp với nghiên cứu trong thực tế để tôi có thể hoàn thành luận án này;

Chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Trà Vinh, Phòng Khoa học Công nghệ và Đào tạo Sau đại học, Khoa Nông nghiệp Thuỷ sản Trường Đại học Trà Vinh và các em sinh viên lớp DA09BTY đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành nghiên cứu đề tài này;

Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Trà Vinh đã tạo điều kiện cho chúng tôi tham gia lấy mẫu tại các cơ sở giết mổ trong địa bàn Tỉnh;

Chân thành cảm ơn các anh chị em Bộ môn Vi sinh Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ; Trường Đại học Y Dược Cần Thơ; Khoa xét nghiệm bệnh viện Đa khoa Trung ương Cần Thơ;

Chân thành cảm ơn gia đình và đồng nghiệp đã tạo điều kiện và động viên tôi hoàn thành nghiên cứu này

Xin chân thành cảm ơn!

NGUYỄN THỊ ĐẤU

ii

TÓM TẮT

Nghiên cứu từ tháng 4 năm 2012 đến tháng 4 năm 2014, có 25 chủng vi khuẩn

thuộc Vibrio spp phân lập được từ 500 mẫu gồm nghêu, tôm, nước ở sông, nước biển,

nước ao nuôi tôm, huyết heo ở các huyện trong tỉnh và phân của bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy tại bệnh viện đa khoa tỉnh Trà Vinh Kết quả cho thấy có 6 chủng thuộc loài

Vibrio cholerae (24%), 8 chủng thuộc loài Vibrio paraheamolyticus (32%), 4 chủng

thuộc loài Vibrio vulnificus (16%), 5 chủng thuộc loài Vibrio fluvialis (20%) và 2 chủng thuộc loài Vibrio alginolyticus (8%).

Sáu chủng Vibrio cholerae được xác định tính nhạy cảm và kháng kháng sinh đối với 8 loại kháng sinh, bằng phương pháp Kirby-Bauer (CLSI, 2010), kết

quả các chủng kháng kháng sinh bao gồm: streptomycin 50%, tetracycline 33%, trimethoprim-sulfamethoxazole 33% và vancomycin 67% Kết quả PCR cho thấy

có 2 chủng Vibrio cholerae trong tổng số 6 chủng kiểm tra chứa gene kháng kháng sinh tetA, gen mã hóa cho tetracycline, riêng các nhóm gene kháng kháng sinh blaSHV, aac(3)-IV và dhfrI mã hoá cho nhóm kháng sinh β-Lactam,

Aminoglycosid, Trimethoprim chưa được phát hiện trong nghiên cứu này

So sánh tỉ lệ tương đồng về trình tự nucleotide của 2 chủng Vibrio cholerae

(T1, T3) mang gene kháng kháng sinh trong nghiên cứu này với các chủng ở Thái

10 chủng; 96% với 01 chủng và 94% với 02 chủng Trình tự thuộc chủng V cholerae

T1 và T3 có hiện tượng thêm hoặc mất từ 1- 3 nucleotide trên nhiều vị trí codon, dẫn

đến sự thay đổi vị trí các acid amin và thay đổi cấu trúc protein Chủng V cholerae T1

và T3 có codon kết thúc lần lượt ở 10 và 6 vị trí, đây là loại đột biến vô nghĩa, sẽ làm ngừng tổng hợp chuỗi polypeptid của vi khuẩn

Kết quả thử nghiệm trên thỏ chứng minh chỉ số bám dính V cholerae T1 và T3

vào niêm mạc ruột đối với thỏ không uống vaccine phòng bệnh tả tại thời điểm 9 giờ

là 55,7±13,9 và 59,3±4,2 và đối với thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả là 12,4±0,6 và 7,41±1,9 Tại thời điểm 16 giờ không có hiện tượng bám dính vi khuẩn vào niêm mạc ruột trên tất cả thỏ được thí nghiệm

Từ khoá: Vibrio choleae; gene kháng kháng sinh; vaccine

iii

MỤC LỤC

Trang

TT TÓM TẮT ……… ii

ABSTRACT ……… v

MỞ ĐẦU ……… 1

Tính cấp thiết của đề tài ……… 1

Giới hạn đề tài nghiên cứu ……… 2

Mục tiêu của đề tài ……… 2

Nội dung thực hiện ……… 3

Phương pháp nghiên cứu ……… 3

NỘI DUNG Chương 1: Tổng quan tài liệu ……… 4

1.1 Lịch sử bệnh do vi khuẩn tả ……… 4

1.2 Phân loại - Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae ……… 5

1.2.1 Phân loại vi khuẩn Vibrio cholerae ……… 5

1.2.2 Đặc điểm hình dạng của Vibrio cholerae ……… 6

1.2.3 Độc tố……… 6

1.3 Cơ chế kháng kháng sinh của Vibrio cholerae ……… 7

1.3.1 Cơ chế bơm kháng sinh ……… 7

1.3.2 Đột biến tự phát……… 8

1.3.3 Yếu tố SXT và integrons ……… 9

1.3.4 Đề kháng kháng sinh do Plasmid……… 9

1.4 Đặc điểm di truyền và sự kháng kháng sinh của Vibrio cholerae ở một số nước……… 10

1.5 1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4 1.5.5 1.5.6 Tình hình dịch tễ và kháng kháng sinh của Vibrio cholerae ở Việt Nam ………

Tình hình dịch tễ bệnh do Vibrio cholerae ở Việt Nam ………

Sự kháng kháng sinh của V cholerae ………

Nguyên nhân kháng kháng sinh của Vibrio cholerae ………

Các yếu tố về độc lực và đa dạng di truyền ………

Triệu chứng bệnh do vi khuẩn Vibrio cholerae ………

Phòng và điều trị bệnh ………

12

12

14

15

16

18

18

iv

2.1

Chương 2: Phân lập vi khuẩn V cholerae kháng kháng sinh

tại tỉnh Trà Vinh………

Mục đích nghiên cứu ………

20 20 2.2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ……… 20

2.2.1 Xác định V cholerae bằng phản ứng sinh hóa……… 21

2.2.2 Xác định V cholerae bằng máy định danh tự động……… 22

2.2.3 Xác định vi khuẩn Vibrio spp bằng kỹ thuật PCR ……… 23

2.3 Kết quả nghiên cứu ……… 25

2.3.1 Kết quả định danh Vibrio spp.bằng phản ứng sinh hóa ……… 25

2.3.2 2.3.3 Kết quả định danh Vibrio spp bằng máy định danh tự động …

Kết quả định danh Vibrio spp bằng kỹ thuật PCR ………

27 28 2.3.4 Tỉ lệ phát hiện Vibrio spp.trên các loại mẫu phân lập ………… 29

Chương 3: Xác định đặc tính di truyền của gene kháng kháng sinh ở vi khuẩn V cholerae được tuyển chọn……… 33

3.1 Mục đích nghiên cứu ……… 33

3.2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ……… 33

3.3 Kết quả nghiên cứu ……… 36

3.3.1 Kết quả sự kháng kháng sinh của V cholerae bằng phương pháp Kirby Bauer ……… 36

3.3.2 Kết quả sự kháng kháng sinh của V cholerae bằng PCR……… 39

3.3.3 3.3.4 3.3.5 Kết quả giải trình tự các đoạn gen kháng kháng sinh………

So sánh trình tự nucleotide của chủng V cholerae T1, T3 với chủng V cholerae hoang dại N16961 tìm các dạng đột biến … Mối liên hệ qua cây phát sinh loài ………

40 42 45 Chương 4: Thử nghiệm chủng V cholerae được tuyển chọn trên thỏ nhằm đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch đối với vaccine hiện hành ……… 50

4.1 Mục đích nghiên cứu ……… 50

4.2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu……… 50

4.3 Kết quả nghiên cứu ……… 52

4.3.1 Kết quả đánh giá chủng đột biến của V cholerae đối với thỏ không uống vaccine phòng bệnh tả ……… 52

4.3.2 Kết quả đánh giá tính đáp ứng miễn dịch trên thỏ đã uống vaccine phòng bệnh tả ……… 55

v

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ……… 50

Kết luận ……… 59

Đề nghị ……… 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……… 60

PHỤ LỤC………

1 Thành phần môi trường, hóa chất dùng trong thí nghiệm ……… 68

2 Bộ môi trường và thuốc thử dùng định danh vi khuẩn Gram âm 72 3 Vaccine tả dùng trong thí nghiệm ……… 72

4 Kết quả các phản ứng sinh hoá ……… 73

5 Tổng hợp KQ thử kháng sinh đồ đối với V cholerae………… 78

6 Chủng V cholerae kháng thuốc chủ yếu từ năm 2003 – 2009 ở một số nước trên thế giới ……… 79

7 8 9 10 11 Sắc phổ chuỗi trình tự chủng T1 gen kháng KS TetA ……

Các acid amin chủng T1 ………

Các acid amin chủng T3 ………

Các acid amin chủng hoang dại………

Kết quả xử lý thống kê ………

82

83

84

85

86

vi

1.1

2.1

Tình hình dịch tễ bệnh do V cholerae ở Việt Nam ………

Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR dựa trên

Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp theo loài ………

Sự nhạy cảm và kháng kháng sinh của V cholerae ……

Sự đa kháng kháng sinh của V cholerae ………

So sánh vị trí các acid amin của chủng V cholerae hoang dại

3.8 Mức độ tương đồng đoạn gen đề kháng kháng sinh của V

cholerae (T1 và T3) ……… 47

vii

DANH SÁCH HÌNH

1.1

1.2

Phân loại type huyết thanh V cholerae ………

Cấu tạo vi khuẩn V cholerae ………

5 6 1.3 1.4 1.5 1.6 Sự hình thành chủng V cholerae có độc tố ………

Cơ chế tác động của kháng sinh ………

Cơ chế ĐK kháng sinh của VK ………

Sự di truyền Plasmid từ vi khuẩn sang vi khuẩn ………

7 8 8 12 1.7 2.1 2.2 2.3 Vi khuẩn đột biến roi ………

Quy trình phân lập và định danh Vibrio spp ………

Khuẩn lạc trên môi trường TCBS………

Test sinh hoá………

16 24 26 26 2.4 2.5 Nồng độ muối từ 0% - 10%

Chủng vi khuẩn O3.2 (T3) dưới kính hiển vi điện tử …………

27 27 2.6 3.1 3.2 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen 16S-27F và 1492R ………

Kết quả thực hiện kháng sinh đồ ………

Tỷ lệ nhạy cảm và đề kháng kháng sinh đối với V cholerae……

28 37 37 3.3 3.4 3.5 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen tetAF và testAR ………

So sánh các vị trí nucleotide được chèn vào và mất đi …………

Cây phát sinh loài của V cholerae về kháng kháng sinh…………

39 42 48 4.1 4.2 Thỏ thí nghiệm ………

Thỏ được gây mê ………

50 51 4.3 4.4 Dịch thu từ niêm mạc ruột non thỏ………

Pha loãng mẫu theo dãy thập phân ………

51 52 4.5 4.6 Biểu đồ FA sau khi tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ ………

Biểu đồ CFU V cholerae bám dính trong niêm mạc ruột thỏ ……

53 54 4.7 4.8 Biểu đồ FA sau khi tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ………

Biểu đồ CFU sau khi tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ ………

55

56

viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt Chữ viết đầy đủ Nghĩa tiếng Việt

mang gen có độc tố tả

Standard Institute

Viện tiêu chuẩn lâm sàng và phòng thí nghiệm

truyền

- 1 -

MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Vibrio cholerae là vi khuẩn Gram âm, tác nhân của bệnh dịch tả trên người,

gây tiêu chảy cấp tính và mất nước, dịch bệnh xảy ra với các hình thức dịch địa phương và đại dịch Thế giới đã trải qua 7 đại dịch dịch tả, từ năm 1816 đến năm 1923

đã có 6 vụ đại dịch xảy ra, những đại dịch này đều bắt đầu từ Ấn Ðộ và đều do Vibrio

cholera O1 type sinh học cổ điển gây ra Đại dịch thứ 7 khác với 6 đại dịch trước, đại

dịch này do Vibrio cholerae type sinh học El Tor gây ra và có nguồn gốc từ đảo

Celebes của Indonesia năm 1961 Đại dịch này kéo dài nhất và có phạm vi rộng hơn 6 đại dịch trước đó, đến nay còn nhiều nước thông báo những đợt bùng phát dịch tả cũng

do nguyên nhân này gây ra (Nguyễn Văn Lượng, 2009)

Trong những năm gần đây Việt Nam đã xảy ra 3 đợt dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm ở 18 tỉnh, thành thuộc cả 3 miền Bắc, Trung, Nam Năm 2009 - 2010, dịch tả lại

xuất hiện tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam, một chủng vi khuẩn Vibrio cholera O139 được phân lập từ 7 mẫu nước và được đặt tên là Vibrio cholera O139, nhưng ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh tả do O139 gây ra (Dong Tu Nguyen et

al., 2012)

Đồng bằng sông Cửu Long, tính đến 19/8/2010 đã có 4 địa phương gồm: Bến Tre, Tiền Giang, thành phố Cần Thơ và An Giang xuất hiện bệnh nhân mắc bệnh

tiêu chảy do vi khuẩn Vibrio choleraee (vovnews.vn, 2010) Tỉnh Trà Vinh có vị trí

địa lý với nhiều nguy cơ tiềm ẩn bệnh dịch tả vì có bờ biển kéo dài khoảng 65 km

và trên địa bàn Trà Vinh có hệ thống sông chính với tổng chiều dài 578 km, trong

đó có các sông lớn là sông Hậu, sông Cổ Chiên và sông Măng Thít, vì thế rất dễ cho việc lưu hành vi khuẩn tả từ sông Cổ Chiên giáp với tỉnh Bến Tre, nơi đã từng xảy

ra dịch bệnh vào năm 2010

Biển Duyên Hải và Cầu Ngang thuộc tỉnh Trà Vinh là vùng chuyên nuôi trồng thủy sản, trong đó phổ biến nhất là nghêu và tôm Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh thức ăn hải sản là nguồn lưu trữ vi khuẩn gây bệnh tả được xác định là

Vibrio cholerae Vi khuẩn này có cấu trúc gene của chủng thuộc type sinh học El tor,

nhưng lại mang gene độc lực của type cổ điển, khiến nó tăng độc lực và gây bệnh với triệu chứng lâm sàng nặng hơn, người khỏe mang trùng và thời gian mang trùng dài

hơn, khả năng tồn tại lâu hơn trong môi trường (Boyd et al., 2008)

Có nhiều loại kháng sinh sử dụng điều trị bệnh tả đang đề kháng với vi

khuẩn này, trong đó có V cholerae, đây là vấn đề phức tạp trong điều trị bệnh và là

mối quan tâm đối với sức khỏe cộng đồng Nhiễm sắc thể được chứng minh là yếu

- 2 -

tố di truyền về gene kháng kháng sinh của vi khuẩn Việc thu nhận và lây truyền của các gene kháng kháng sinh là do các yếu tố di truyền như plasmid, integrons và

transposons (Ghosh et al., 2011) Một trong những yếu tố di truyền được tích hợp

và sao chép trên nhiễm sắc thể và được truyền gene kháng kháng sinh giữa các vi

khuẩn cùng loài trong môi trường (Burrus et al., 2004) Thực phẩm và nước ô

nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh là một mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng, càng quan tâm hơn nữa là thuốc kháng sinh được dùng làm thức ăn cho động

vật đã góp phần vào việc kháng kháng sinh khi điều trị bệnh trên người (Smith et al,

1999) Nhiều nghiên cứu về V cholerae được phân lập từ các nguồn nước sông và

nước biển, trên các loại mẫu thức ăn hải sản đều cho thấy vi khuẩn này có khả năng kháng lại hầu hết các kháng sinh thường được sử dụng, điều này có thể khẳng định trong thực tế việc kháng kháng sinh đang gia tăng cả trong lĩnh vực chăn nuôi trang trại và y tế công cộng, đây cũng là vấn đề toàn cầu trong những thập kỷ gần đây do

sử dụng bừa bãi và lạm dụng kháng sinh trong các trang trại chăn nuôi và thực phẩm làm thức ăn gia súc, gia cầm (Teuber, 2001; Bywater, 2004)

Với mục tiêu xác định mối liên quan về đặc điểm di truyền gene kháng

kháng sinh của V cholerae phân lập trên môi trường nước và trên các loại mẫu có

nguồn gốc từ hải sản Nghiên cứu đã tiến hành với nội dung: “Xác đinh đặc điểm di

truyền của gene kháng kháng sinh ở vi khuẩn Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà

Vinh”, từ đó giúp cơ sở y tế có chiến lược sử dụng kháng sinh đúng nhằm làm giảm

tỷ lệ tử vong, giảm chi phí trong điều trị bệnh, phù hợp với điều kiện kinh tế trong

khu vực

Giới hạn đề tài nghiên cứu

Kế tiếp kết quả đề tài đã kết thúc giai đoạn trước: “Tỉ lệ nhiễm và sự nhạy

cảm kháng sinh của vi khuẩn Vibrio cholerae trên huyết heo, nghêu và trên người

tiêu chảy tại tỉnh Trà Vinh”

Các kết quả đã nghiên cứu: Tỉ lệ phát hiện V cholerae phân lập trên mẫu

nghêu, huyết heo và mẫu nước (sông, biển, ao nuôi tôm)

Trong phần nghiên cứu tiếp theo được thực hiện với mục tiêu và các nội dung như sau:

Mục tiêu của đề tài

Xác định đặc điểm di truyền của đoạn gene kháng kháng sinh ở V cholerae

tại tỉnh Trà Vinh nhằm định hướng hiệu quả hơn cho việc phòng và điều tri bệnh

tiêu chảy do vi khuẩn này gây ra tại địa phương

- 3 -

Nội dung thực hiện

(1) Phân lập vi khuẩn V cholerae kháng kháng sinh tại tỉnh Trà Vinh

(2) Giải trình tự đoạn gene kháng kháng sinh của vi khuẩn V cholerae được

tuyển chọn (gene kháng kháng sinh: nhóm β-lactam; nhóm Aminoglycosid; nhóm Tetracycline; nhóm Trimethoprim)

(3) Thử nghiệm chủng V cholerae được tuyển chọn trên thỏ nhằm đánh giá

khả năng đáp ứng miễn dịch đối với vaccine hiện hành

Phương pháp nghiên cứu

- Nuôi cấy xác định với các phương pháp: phản ứng sinh hoá; máy định danh

tự động, kỹ thuật PCR

- Trích DNA - Giải trình tự đoạn gene kháng kháng sinh

- Thực hiện thí nghiệm trên thỏ (uống vaccine)

- 4 -

NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lịch sử bệnh do vi khuẩn tả

“làn sóng bệnh tả” lan khắp thế giới Tiếp đó, đến những năm 60 phạm vi lây lan của vi khuẩn tả đã được khoanh vùng và cho đến những năm gần đây bệnh chủ yếu xuất hiện ở Đông Nam Á Năm 1961 type sinh học El Tor gây dịch tại Philippin và tạo làn sóng thứ bảy Từ đó trở đi type vi khuẩn này tiếp tục gây ra dịch bệnh tại châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi và một phần Châu Âu (Colwell, 2004)

Từ năm 1991, tỷ lệ mắc bệnh tả do vi khuẩn Vibrio cholerae O1 đã xảy ra ở Châu Mỹ La tinh (Levine, 1991; Ries et al., 1992), đến năm 1992 bệnh lại xuất hiện

và lây lan nhanh chóng bởi Vibrio cholerae O139 trong khu vực Đông Nam Châu Á (Shimada et al., 1993) và gần đây bệnh lại bùng phát ở châu Phi, do type huyết thanh non-O1, non-O139, đây cũng là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy (Sharma et al., 1998) Các nghiên cứu về sự tiến hóa phân tử chủng Vibrio cholerae O1 ở Peru từ năm 1991-1995, Ấn Độ, và ở Thái Lan cho thấy rằng Vibrio cholerae O1 đã trải qua những thay đổi về di truyền ở mức tương đối cao (Dalsgaard et al., 1999)

Ở Việt Nam bệnh tả là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra tiêu chảy hơn một thế kỷ nay, với 2.000.000 trường hợp được báo cáo trong năm 1850 Năm 1885, một đợt bùng phát dịch tả với tỷ lệ tử vong lên đến 50% và đến năm 1910-

1930 có 5.000 đến 30.000 trường hợp bệnh tả đã được báo cáo hàng năm (Nguyen,

1962) Đến năm 1964 Vibrio cholerae O1 type sinh học El Tor lại gây bệnh ở miền

Nam Việt Nam với tổng số 20.009 trường hợp mắc bệnh và 821 trường hợp tử vong Trong lịch sử, phần lớn các đợt dịch bệnh tả đều xuất hiện ở các khu vực ven biển miền

Trung và Nam Việt Nam Vibrio cholerae O1 type sinh học El Tor hiếm khi xuất hiện

ở Bắc Việt Nam Đến năm 1976, bệnh có xảy ra tại thành phố Hải Phòng và tỉnh

Quảng Ninh (Dalsgaard et al., 1999) Từ năm 2007 đến năm 2008, có 20 tỉnh và

thành phố của Việt Nam đã bị ảnh hưởng, đa số những người bị nhiễm bệnh chủ

yếu là tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm Năm 2010, một chủng vi khuẩn Vibrio

cholera O139 được phân lập từ 7 mẫu nước và được đặt tên là V cholerae O139

Tuy có sự lây lan nhanh chóng của O139 trong khu vực Đông Nam Á nhưng ở Việt Nam, có rất ít thông tin về bệnh tả do O139 gây ra (Dong Tu Nguyen, 2012)

- 5 -

1.2 Phân loại - Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae

1.2.1 Phân loại vi khuẩn V cholerae

V cholerae là vi khuẩn Gram âm gây bệnh tả ở người, thuộc chi Vibrios lớp

gamma của ngành Proteobacteria V cholerae có hai type sinh học chính, đó là type sinh học cổ điển và type sinh học El Tor, và một số nhóm type huyết thanh khác V

cholerae được phân loại căn cứ trên kháng nguyên O ở phần thân và các nhóm

huyết thanh, đến nay người ta đã biết có ít nhất 200 serogroups (Kaper et al., 1995)

Trước năm 1992, nhóm O1 là nhóm huyết thanh duy nhất gây ra dịch, từ năm 1992

về sau một nhóm huyết thanh khác là O139 gây ra các đại dịch bùng phát tại Ấn Độ

và Bangladesh Hiện nay, 2 nhóm huyết thanh này là nguyên nhân gây bệnh tả lưu

hành và phát thành dịch; những nhóm huyết thanh V cholerae khác không gây thành dịch được gom chung lại thành nhóm V cholerae non-O1 và non-O139 Sự

phân loại được biểu diễn theo sơ đồ sau:

Hình 1.1: Phân loại type huyết thanh V cholerae (Võ Văn Lượng, 2009)

Việc phân loại nhóm huyết thanh được thực hiện bằng cách cho kháng huyết thanh (antisera) hấp phụ hoặc cho các kháng thể đơn dòng hấp phụ thành phần kháng nguyên “O” của lớp lipopolysaccharide trên màng tế bào vi khuẩn

Ngoài ra, V cholerae O1 còn được phân ra thành 3 type huyết thanh, Ogawa,

Inaba và Hikojima; type thứ 3 này ít gặp và cũng chưa được mô tả đầy đủ Các type huyết thanh này được chia thành 3 loại kháng nguyên (KN): A, B và C KN A cấu tạo từ 3- deoxy-L-glycerotetronic acid, còn KN B và C chưa rõ Chủng O139 Bengal và những chủng gây bộc phát thuộc serogroup O1 của cả 2 type sinh học là

- 6 -

cổ điển và El Tor có nhiều điểm tương đồng, nhưng cũng có nhiều điểm khác biệt đáng kể Chủng O139 có vỏ bọc, đó là điểm khác với các chủng O1 và còn nhiều điểm khác biệt trong thành phần KN “O” ở phần lipopolysaccharide ở màng

tế bào vi khuẩn (Kaper et al., 1995; Faruque, 1998)

1.2.2 Đặc điểm hình dạng của Vibrio cholerae

Vi khuẩn V cholerae còn gọi là vi khuẩn tả hay phẩy khuẩn tả, có chiều dài

từ 1μm đến 3 μm và chiều ngang từ 0,5 μm đến 0,8 μm (1mm = 1.000 μm) Chúng

có 1 sợi lông dài (flagellum) ở một đầu giúp chúng di chuyển rất nhanh theo hình xoắn ốc loạng choạng Quan sát dưới kính hiển vi, nhiều người dùng danh từ “sao xẹt” để mô tả sự di chuyển nhanh chóng của chúng Vi khuẩn tả có 2 loại kháng nguyên chính: kháng nguyên H (từ cái đuôi: flagellar H antigen) và kháng nguyên

O từ thân vi khuẩn (somatic O antigen) Người ta dùng hệ thống của Sakasaki và Shimada dựa vào kháng nguyên O để phân loại Vì loại O1 gây hầu hết các trận dịch và đại dịch, nên người ta phân ra 2 nhóm: O1 và không phải O1 (non-O1) Theo sự phản ứng của huyết thanh mà người ta tìm thấy 206 nhóm O và đánh theo

số thứ tự: O1, O2, O3,… O206 nhưng chỉ có nhóm vi khuẩn tả O1 và O139 có thể

gây thể bệnh lý tả và có thể gây ra đại dịch (Kaper et al., 1995)

Hình 1.2: Cấu tạo vi khuẩn V cholerae Korinfo, 2000

1.2.3 Độc tố

lý Trước hết, các chủng V cholerae tiếp nhận phage TCP và biến thành V

cholerae TCP + Sau khi trở thành TCP+, tức là vi khuẩn có tua, tua sẽ đóng vai trò

thụ thể cho phage CTXΦ để cho phage chui vào vi khuẩn, và gắn DNA của nó vào

chromosome của V cholerae theo cơ chế phage tiềm tan (lysogenic )

Bản chất của các gene CTX và TCP đều là bacteriophage từ bên ngoài được

gắn vào trong chromosome của V cholerae Có người cho rằng V cholerae vốn là

vi khuẩn “hiền” nhưng khi bị các bacteriophage gây nhiễm chúng mới trở thành

chủng sinh độc tố và gây bệnh lý V cholerae trở thành chủng sinh độc tố

- 7 -

(toxicogenic V cholerae) và gây bệnh khi nào chúng có tiêm mao giúp vi khuẩn

bám vào niêm mạc ruột non

Hình 1.3: Sự hình thành chủng V.cholerae có độc tố (Võ Văn Lượng, 2009)

Giữa các bacteriophage CTX và TCP có một sự cộng tác như sau: phage

CTX Φ chui vào tế bào V cholerae thông qua các tua (pili) vốn do 1 phage khác là

TCP Φ mã hóa Khi DNA của CTX Φ gắn vào chromosome thành 1 gene, gene này chịu sự kiểm soát của 1 gene khác là ToxR, vốn là gene cũng mã hóa gene TCP, để sản xuất ra độc tố tả CT

1.3 Cơ chế kháng kháng sinh của Vibrio cholerae

1.3.1 Cơ chế bơm kháng sinh

V cholerae kháng kháng sinh bằng cơ chế bơm kháng sinh ra ngoài, hoặc đột

biến nhiễm sắc thể thông qua gene di truyền như việc trao đổi (tiếp hợp) plasmid, transposon (gene nhảy), integrons và các yếu tố SXT Sự đề kháng kháng sinh của

V cholerae từ năm 2003 đến năm 2009 được thể hiện qua Phụ lục số 1 (Maya et al.,

2011) V cholerae sử dụng cơ chế bơm ra khỏi màng tế bào một loạt các loại thuốc kháng sinh, hoặc các chất tẩy có cấu trúc hóa học không liên quan (Paulsen et al., 1996) Hai yếu tố chính cho cơ chế bơm của V cholerae là các nguồn năng lượng

(Putman et al., 2000) V cholerae sử dụng một loạt các hệ thống gene

(MATE-family efflux systems) bao gồm VcmB, VcmD, VcmH, VcmN, VcmA và VcrM

(Begum et al., 2005) Gần đây chủng V cholerae O395 type cổ điển mang gene

EmrD-3 đề kháng đối với linezolid, rifampicin, erythromycin và chloramphenicol

(Smith et al., 2009) Gen EmrD-3 cũng hiện diện trong bộ gene của chủng N16961

El Tor và non- O1/non- O139

E coli, tạo điều kiện cho khả năng kháng thuốc kháng sinh như alafosfalin

(Atherton et al., 1979) Tuy nhiên, đột biến nhiễm sắc thể dẫn đến việc đề kháng này vẫn còn chưa biết (Towner et al., 1980) Năm 2002, Baranwal et al (2002)

cũng phát hiện ra đột biến nhiễm sắc thể trong các gene gyrA và Parc, trong đó mã hóa tiểu đơn vị của gyrase DNA và topoisomerase IV, tương ứng Những đột biến

- 9 -

làm thay đổi mối quan hệ của gyrase DNA và topoisomerase IV đối với kháng sinh,

và do đó bảo vệ V cholerae không bị tác động bởi nhóm kháng sinh thuộc quinolone Năm 2010, Kim et al (2010) đã tiến hành một nghiên cứu hồi cứu để

xác định cơ chế kháng quinolone ngày càng tăng ở bệnh viện Dhaka của Bangladesh trong 6 năm giai đoạn từ năm 2002 đến năm 2008 Tương tự như các

nghiên cứu của Baranwal et al., (2002), họ phát hiện ra rằng V cholerae đã tích lũy

đột biến nhiễm sắc thể trong các gene gyrA và Parc, làm tăng sức đề kháng với

kháng sinh nhóm quinolone (Kim et al., 2010) Cần lưu ý rằng các chủng thu thập

trong 6 năm trước đó chứa một đột biến duy nhất trong gyrA và qua thời gian, các chủng này tăng đột biến thêm ở Parc, mức độ đề kháng của vi khuẩn đối với quinolone ngày càng cao

Kháng sinh thuộc nhóm quinolone đã được sử dụng nhiều trong quá trình

điều trị bệnh tả do V cholerae gây ra, do đó cũng làm tăng tỉ lệ đề kháng của nhiều

vi khuẩn kháng kháng sinh khác Nhiều nghiên cứu của Abera et al (2010); Karki

et al (2010); Ranjbar et al (2010) đã ghi nhận sự đề kháng của V cholerae đối với

nhiều loại kháng sinh thường được sử dụng để điều trị bệnh tả (ví dụ như tetracycline, erythromycin, chloramphenicol, quinolone); tuy nhiên, những nghiên

cứu này chỉ đánh giá sự đề kháng kháng sinh của các chủng V cholerae, nhưng

chưa làm sáng tỏ cơ chế kháng thuốc

1.3.3 Yếu tố SXT và integrons

Sự lây lan gene kháng kháng sinh của V cholerae là sự chuyển gene ngang

giữa các tế bào vi khuẩn khác loài hoặc qua sự tự lây truyền nhờ yếu tố di động, bao

gồm cả các yếu tố SXT Yếu tố SXT đầu tiên được mô tả với V cholerae nhóm

huyết thanh O139 có chứa gene kháng sulfamethoxazole, trimethoprim và

streptomycin (Waldor et al., 1996) Ngày nay, nhiều chủng nhóm huyết thanh O1 và

O139 được phân lập trên toàn thế giới đã có các yếu tố SXT qua lây lan tự nhiên

(Burrus et al., 2006)

1.3.4 Đề kháng kháng sinh do Plasmid

Tetracycline là kháng sinh được dùng bằng đường uống để điều trị cho bệnh

nhân do đó có rất nhiều chủng V cholerae đề kháng với các loại thuốc này V

cholerae là một trong những loài kháng tetracycline đầu tiên được báo cáo, tiếp đó

là streptomycin và chloramphenicol (Greenough et al., 1964) Gene kháng kháng sinh đã được truyền gene ngang cho vi khuẩn E coli K12, và một plasmid duy nhất (Hedges et al., 1975) Tương tự, một đợt dịch tả bùng phát ở Matlab, Bangladesh

năm 1979 là do một chủng vi khuẩn mang plasmid đa kháng thuốc được truyền

ngang thông qua sự tiếp hợp với các vi khuẩn khác, bao gồm cả E coli (Glass et al.,

- 10 -

1983) Plasmid này truyền gene kháng một số loại kháng sinh như tetracycline, ngoài ra còn có cả ampicillin, kanamycin, streptomycin, gentamicin và trimethoprim Tuy nhiên, nhiều chủng đa kháng kháng sinh cũng đã biến mất trong

vòng một thập kỷ qua (Faruque et al., 1998)

Một số cơ chế tiến hóa của vi khuẩn là nhận gene kháng kháng sinh giữa các chủng trong cùng một loài Những cơ chế này có thể thay đổi tính chất hóa học của kháng sinh, hoặc thay đổi vị trí tác động bởi các kháng sinh Phương thức phổ biến nhất là làm bất hoạt enzyme của kháng sinh, một enzyme của tế bào được sửa đổi

để phản ứng với kháng sinh mà không ảnh hưởng đến vi sinh vật

1.4 Đặc điểm di truyền và sự kháng kháng sinh của Vibrio cholerae ở

một số nước

Năm 1979, một đợt bùng phát dịch tả do đa kháng thuốc của V cholerae xảy

ra ở Matlab thuộc Bangladesh cho thấy có 16,7% các chủng kháng với các kháng sinh như tetracycline, ampicillin, kanamycin, streptomycin, và trimethoprim-sulfamethoxazole và 10% các chủng khác kháng với bốn loại trong số những kháng sinh bao gồm cả tetracycline Một plasmid kháng kháng sinh cũng được xác định

trong các mẫu phân lập và đã được kết hợp với Escherichia coli K-12 do sự di truyền gene Một nghiên cứu về dịch tễ cũng chứng minh rằng các chủng V

cholerae kháng nhiều loại thuốc, trong đó đặc biệt là tetracycline (Glass et al.,

1980) Đến năm 1986, vi khuẩn kháng kháng sinh đã có sự thay đổi, và các chủng

V cholerae phân lập từ bệnh nhân mắc bệnh tả năm 1986 tại Dhaka không còn

kháng với tetracycline, streptomycin, chloramphenicol, amoxicillin, hoặc acid

nalidixic (Nakasone et al., 1987) Tuy nhiên, trong năm 1988 và năm 1989, gần như tất cả các chủng V cholerae type sinh học cổ điển ở Bangladesh đều kháng với

tetracycline trong khi các chủng thuộc type sinh học El Tor là nhạy cảm với

tetracycline (Siddique et al., 1989) Đến năm 1991, chủng V cholerae type sinh học

El Tor tái xuất hiện kháng với tetracycline trong các đại dịch ở Bangladesh

(Siddique et al., 1992)

Nhiều dữ liệu chứng minh những chủng V cholerae phân lập ở Thái Lan có

trimethoprim/sulfamethoxazole và ampicillin, xảy ra giữa các chủng phân lập trong

năm 2007 Phần lớn những chủng V cholerae phân lập trước hoặc sau năm 2007

đều nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh, hai chủng phân lập từ năm 2010 nhạy cảm

với tất cả sáu loại thuốc kháng sinh được thử nghiệm Nhìn chung, 54% của V

cholerae phân lập từ năm 2003 đến năm 2011 kháng với hai hay nhiều thuốc kháng

sinh (Chariya et al., 2013)

- 11 -

Trong một nghiên cứu khác, những chủng V cholerae phân lập giữa năm 2003

đến 2010 phía Đông Bắc Thái Lan cho thấy có sự thay đổi theo thời gian đối với từng loại kháng sinh khác nhau Mặc dù tất cả các chủng phân lập vào năm 2007, hai chủng trong năm 2010 và một chủng được phân lập trong năm 2011 đều đa đề kháng (MDR), nhưng những chủng phân lập trước và sau năm 2007 rất nhạy cảm

trimethoprim/sulfamethoxazole và ampicillin (Supawat et al., 2009)

Sự gia tăng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn với nhiều loại kháng sinh trong những năm gần đây là do sự hiện diện của gene kháng kháng sinh trên vi khuẩn có chứa plasmid, đã tạo thuận lợi trong việc di truyền và lây lan nhanh chóng

sự đề kháng trong việc điều trị bệnh do vi khuẩn (Zulkifi et al., 2009) Vi khuẩn

truyền gene kháng kháng sinh thông qua trung gian plasmid, đây là yếu tố quyết định cho sự lây truyền gene kháng kháng sinh, được gọi là R-plasmid, đặc biệt trong các khu vực nước bị ô nhiễm hoặc vùng nước ven biển (Manjusha, 2011) Vi khuẩn kháng kháng sinh thường được thu nhận qua trung gian plasmid nằm trên nhiễm sắc thể và được truyền sang thế hệ tiếp theo (chuyển gene theo chiều dọc) và cũng có thể trao đổi giữa các quần thể vi khuẩn khác nhau (chuyển gene theo chiều ngang), nếu sử dụng rộng rãi các loại thuốc kháng sinh không đúng cách sẽ dẫn đến

sự gia tăng về sự kháng thuốc của vi khuẩn và phổ biến nhất là plasmid đa đề kháng

kháng sinh (R-plasmid) (Sơn et al., 1997)

Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy những kết quả tương tự như những

báo cáo trước đây về sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Vibrio spp từ các mẫu phân lập từ lâm sàng (Abraham et al., 1997), nước ở ao nuôi tôm (Eleonor et al., 2001) và mẫu tôm (Liu et al., 1999) Tỷ lệ đề kháng cao nhất với kháng sinh:

amoxicillin, ampicillin, carbenicillin, cefuroxime, streptomycin, rifampicin Như vậy, vi khuẩn hiện diện trong các loại mẫu có mang gene chứa plasmid kháng kháng sinh sẽ góp phần vào sự phổ biến gene kháng kháng sinh trong môi trường

biển (Chandrasekaran et al., 1998) Hơn nữa, sự hiện diện của plasmid trong Vibrios

có thể gây nguy hiểm cho sức khỏe cộng đồng vì plasmid từ động vật có thể được truyền lây trực tiếp hoặc gián tiếp qua các tác nhân gây bệnh cho con người như

Vibrio spp hoặc vi khuẩn E coli (Manjusha, 2011)

- 12 -

Hình 1.6: Sự di truyền Plasmid từ vi khuẩn sang vi khuẩn (Bonnie, 2011)

Ở Thái Lan tất cả các chủng V cholerae O1 phân lập đều dương tính type

huyết thanh đặc hiệu Inaba hoặc Ogawa Đối với những chủng V cholerae phân lập

từ môi trường và lâm sàng giữa năm 2003 và năm 2004 đều là type huyết thanh

Inaba Tất cả các chủng V cholerae O1 phân lập từ lâm sàng vào năm 2007 và 2011

và một phần lớn của các chủng phân lập lâm sàng trong năm 2010 là Ogawa Hai

chủng phân lập từ các nguồn trên bề mặt nước trong năm 2010 là Inaba (Chariya et

al., 2013)

Một nghiên cứu khác đã chứng minh những đặc điểm di truyền của V

cholerae O1 phân lập ở Thái Lan đã tương tự như những chủng lưu hành trong đợt

dịch gần nhất là năm 2010 Các nghiên cứu này cũng cung cấp dữ liệu về sự đề

kháng kháng sinh do những thay đổi về di truyền của V cholerae đối với những chủng phân lập từ các nguồn nước trên bề mặt ở Khon Kaen, Thái Lan (Okada et

al., 2012) Sự thay đổi này cũng được khảo sát bởi Hoshino et al., (1998) bằng

phương pháp PCR multiplex về ctxA (tiểu đơn vị A mã hóa CTX), nhận thấy V

cholerae phân lập từ môi trường nước không sinh độc tố ctxA

1.5 Tình hình dịch tễ và tính kháng kháng sinh của Vibrio cholerae ở

Việt Nam

1.5.1 Tình hình dịch tễ bệnh do Vibrio cholerae ở Việt Nam

Bệnh tả lần đầu tiên xuất hiện ở Việt Nam năm 1850 với 2 triệu trường hợp bệnh được thông báo Bệnh tả do type sinh học El Tor lần đầu tiên xuất hiện ở miền Nam Việt Nam năm 1964 với 20.000 người mắc bệnh, trong đó có 821 người tử vong Từ đó đến năm 1975, ở miền Trung và miền Nam, bệnh xảy ra dưới dạng dịch lưu hành Sau năm 1975, do việc thông thương giữa 2 miền Nam Bắc bệnh tả

đã lây ra miền Bắc và gây ra những vụ dịch rải rác ở Hải Phòng, đến năm 1993 –

2004, bệnh xảy ra cả 3 miền Bắc, Trung, Nam với vài ngàn ca được báo cáo hàng năm, tuy nhiên, bệnh không phát thành dịch lớn, có rất ít trường hợp tử vong (WHO, 2008)

- 13 -

Trong tháng 10 năm 2007, sự gia tăng các trường hợp tiêu chảy cấp được

báo cáo tại Hà Nội, gây ra bởi biến đổi gene vi khuẩn V cholerae O1, Ogawa type sinh học El Tor và cổ điển Từ năm 2007 đến năm 2008, V cholerae O1 type

Ogawa được ghi nhận ở tất cả các trường hợp mắc bệnh đến từ Hà Nội, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (NIHE) yêu cầu Viện Vaccine Quốc tế (IVI) hỗ trợ việc

điều tra dịch tễ, đặc biệt xem xét vai trò của vaccine để kiểm soát (Nguyen et al.,

2009)

Cuối năm 2008, có 20 tỉnh và thành phố của Việt Nam đã bị ảnh hưởng, đa

số những người bị nhiễm bệnh là những cư dân Hà Nội, con đường lây nhiễm chủ yếu là tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm Vi khuẩn tả đã được phát hiện trong nước uống tại Hà Nội hoặc trong các khu vực bị ô nhiễm đó là nguồn nước trên bề mặt Ở

Nam Định, miền Bắc Việt Nam, năm 2010, một chủng vi khuẩn Vibrio cholera O139 được phân lập từ 7 mẫu nước và được đặt tên là V cholerae O139, chủng

ND1 Tuy có sự lây lan nhanh chóng của O139 trong khu vực Đông Nam Á nhưng

ở Việt Nam, có rất ít thông tin về bệnh tả do O139 gây ra Vì vậy, một nhóm nghiên

cứu đã tiến hành một cuộc khảo sát về bệnh tả do V cholerae O139 giữa năm 2006

và 2010 tại Việt Nam để làm sáng tỏ về tình hình hiện tại của V cholerae O139 tồn

tại trong môi trường thủy sản tại Việt Nam Trong quá trình khảo sát tại Nam Định

vào năm 2010, đã phân lập một chủng V cholerae O139 từ môi trường nước (Dong

Tu Nguyen, 2012)

Bảng 1.1: Tình hình dịch tễ bệnh do V cholerae ở Việt Nam

1 1850 Không xác định

2 1910-1963 Không xác định

3 1964 V cholerae O1, El Tor

4 1975 V cholerae O1, El Tor

5 1993- 2004 V cholerae O1 Inaba

6 2007 V cholerae O1, Ogawa

7 2008 V cholerae O1, Ogawa

8 2010 V cholerae O139, Ogawa

(WHO, 2008)

Dịch tả năm 2007- 2008 ở phía Bắc Việt Nam có một số đặc điểm khác như: Dịch xảy ra tản phát, dồn dập trong một thời gian ngắn, rải rác trên nhiều vùng địa dư, không có liên quan với nhau, hầu như không có ca bệnh thứ phát, hầu hết bệnh nhân đều có liên quan đến thực phẩm

- 14 -

Một nghiên cứu của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cho thấy các yếu tố nguy cơ cao mắc bệnh tả là ăn thịt chó, mắm tôm, rau sống, tiết canh Bệnh xảy ra chủ yếu ở người lớn, trên 15 tuổi, nam nhiều hơn nữ; tỉ lệ người lành mang vi khuẩn khoảng 15%, những nhóm người có nguy cơ cao với tả là những người tiếp xúc gần (cùng ăn, uống, sinh hoạt) với bệnh nhân tả; dân cư tại vùng không sử dụng hố xí (đổ thẳng ra cống, mương, kênh, sông); sử dụng nước bề mặt (ao, hồ, kênh, mương, sông ) bị ô nhiễm; có tập quán ăn uống không hợp vệ sinh, ăn rau sống, ăn hải sản chưa chín, dùng phân tươi trong trồng trọt; khu vực dân cư ven biển; vùng bị ngập

lụt và sau ngập lụt V cholerae O1 được phân lập từ các tỉnh cao nguyên, là các

tỉnh nghèo nhất của Việt Nam, người dân không có các dịch vụ y tế và nguồn cung cấp nước uống an toàn

Đến năm 2010 chủng V cholerae O139 xuất hiện ở miền Bắc Việt Nam, tuy nhiên cho đến nay V cholerae O139 vẫn chưa được nghiên cứu nhiều tại Việt Nam,

trái ngược với các nước láng giềng, các type huyết thanh O139 vẫn tiếp tục được

xác định bằng phương pháp ngưng kết kháng huyết thanh của V cholerae O139 Sự xuất hiện của V cholerae O139 ở Ấn Độ và Bangladesh trong năm 1992 và sự lây

lan ở các nước Đông Nam Á là một nguyên nhân cho rằng O139 có thể lây lan vào

Việt Nam Serogroup O1 không có miễn dịch chéo đối với serogroup O139, V

cholerae O139, chủng 4260B bắt đầu thử nghiệm ở miền Trung Việt Nam vào năm

1997 (Chongsa-nguan, 1993)

Sự xuất hiện và biến mất của serogroup O139 ở Samut Sakorn có liên quan

tới sự xuất hiện của một chủng V cholerae O1, cho thấy Ribotype R1 giống với V

cholerae O1 phân lập ở Việt Nam sau năm 1990 (WHO, 2008)

1.5.2 Sự kháng kháng sinh của V cholerae ở Việt Nam

Những chủng V cholerae phân lập ở Việt Nam trong năm 2000 tương tự như

chủng phân lập ở Ấn Độ sau năm 1993 (là O139), vì chúng chứa yếu tố SXT, cho thấy khả năng kháng sulphamethoxazole-trimethoprim, chloramphenicol và

streptomycin (Amita et al., 2003) Tuy nhiên, chủng phân lập tại Việt Nam năm

2000 có khả năng kháng tetracycline trái ngược với chủng phân lập ở Ấn Độ là

nhạy cảm với kháng sinh này (Nguyen, et al., 2002, Amita et al., 2003)

Một nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng các chủng V cholerae phân lập

ở Việt Nam có liên quan với các chủng gây bệnh ở đại dịch tả thứ bảy (Choi et al., 2010) và có liên quan chặt chẽ với các chủng V cholerae type sinh học El Tor đã biến thể và hiện đang lưu hành ở Bangladesh (Nair et al., 2002), Ấn Độ (Goel et al., 2010) và Thái Lan (Okada et al., 2010) Hầu hết các chủng V cholerae từ Việt

Nam đều đa kháng thuốc với nalidixic acid, co-trimoxazole và tetracycline Tất cả

- 15 -

các mẫu phân lập đều mẫn cảm với doxycycline Tetracycline là loại kháng sinh sử dụng rất phổ biến trong điều trị bệnh tả, cả hai tetracycline và doxycycline thuộc nhóm kháng sinh tetracycline và kháng chéo giữa các loại thuốc trong nhóm (Fluit

et al., 2005)

Phần lớn những chủng V cholerae phân lập ở Việt Nam vẫn còn nhạy với

kháng sinh azithromycin (95%) và kháng sinh này vẫn có thể được sử dụng để điều

trị bệnh do V cholerae ở Việt Nam Azithromycin được sử dụng để điều trị các

bệnh tiêu chảy trên toàn thế giới (de Saussure, 2009) và đã có hiệu quả trong việc

điều trị bệnh tả ở trẻ em và người lớn (Saha et al., 2006) Nhìn chung, những chủng

V cholerae phân lập ở Việt Nam đều đề kháng kháng sinh tương tự như những

chủng V cholerae type sinh học El Tor phân lập ở Ấn Độ và Thái Lan và chủng

biến đổi mang alen ctxB cổ điển; một biến thể mới của V cholerae O1 (Jain et al.,

2011)

Những chủng V cholerae kháng tetracycline tại Việt Nam vào năm 2000 là

do gene TetA, vị trí gene TetA tìm thấy ở trong cụm gene chứa yếu tố SXT, tuy nhiên, gene kháng trimethoprim chưa tìm thấy trong những năm này Iwanaga M, (2000) đã nghiên cứu và nhận thấy rằng thành phần di truyền của tác nhân gây bệnh dịch tả tại Lào có trình tự nucleotid tương đồng với những chủng phân lập ở Việt Nam năm 2000, điều đó chứng tỏ những nước láng giềng có đường biên giới chung khi có dịch bệnh xảy ra sẽ dễ dàng lây lan và mang những đặc điểm gây bệnh như nhau, hoặc chúng có thể biến đổi thành những chủng gây bệnh có nhiều độc tính hơn so với chủng ban đầu

Các đợt bùng phát dịch tả ở ba giai đoạn từ năm 1995, 2000 và 2002 là do

những chủng V cholerae mang gene khác nhau Một câu hỏi đặt ra là “Làm thế nào

các loại gene này xuất hiện và biến mất?” một số khả năng xảy ra là: thứ nhất, tất cả

những chủng này luôn hiện diện trong hệ vi khuẩn trong môi trường ở Việt Nam và

sinh sản nhanh tại một thời điểm Thứ hai, những chủng này đến từ các nước khác

và tạo sự bùng phát dịch bệnh Thứ ba, trong cùng một chủng loài các sinh vật sẽ xuất hiện sự đột biến gene đó là chèn và xóa các gene kháng thuốc, từ đó xuất hiện một loạt các thế hệ mới (Dalsgaard, 1999)

1.5.3 Nguyên nhân kháng kháng sinh của Vibrio cholerae

Việc sử dụng kháng sinh trong những thập kỷ vừa qua đã dẫn đến sự xuất hiện rất nhiều chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh và tạo nên một mối nguy cơ toàn cầu trầm trọng đe dọa nền y học hiện đại Cả vi khuẩn Gram dương và Gram

âm đều có khả năng đề kháng lại nhiều loại kháng sinh Các chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh (một số lớn trong đó có khả năng đa đề kháng) xuất hiện gầy đây

- 16 -

và là nguyên nhân của những mối lo ngại gồm các tác nhân gây bệnh tiêu chảy như

Shigella, Salmonella, E coli và Enterococcus faecium; các tác nhân gây bệnh đường

hô hấp như Klebsiella pneumoniae và P aeruginosa; gây bệnh đường tiết niệu như E

coli, M tuberculosis Theo Viện các bệnh truyền nhiễm và nhiệt đới quốc gia ngày

23/4 đưa ra cảnh báo, đã có hai trong số bốn loại kháng sinh cũ trước đây thường dùng đặc trị vi khuẩn tả bị kháng thuốc tại Việt Nam như tetracyclline Có ba cơ chế thường gặp của hiện tượng đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn: Thay đổi vị trí đích tác động, thay đổi sự thu nhận kháng sinh và bất hoạt kháng sinh

1.5.4 Các yếu tố về độc lực và đa dạng di truyền

V cholerae sử dụng hai yếu tố độc lực, độc lực từ tiêm mao (TCP) và độc tố

dịch tả CTX TCP, mã hóa cho các yếu tố gây bệnh thuộc lớp I (VPI I), là một tiêm

mao loại IV cho phép cơ thể tổng hợp tạo thành (Kirn et al, 2000) TCP cũng rất cần thiết cho sự hình thành khuẩn lạc của V cholerae định vị trong ruột non của chuột

sơ sinh (Taylor et al., 1987) và con người (Herrington et al., 1988) Khi sự hình thành khuẩn lạc trong ruột non thành công, V cholerae sẽ tiết ra độc tố gây bệnh tả

Các độc tố kích thích các tế bào biểu mô ruột non tiết ra dịch lỏng trong lòng ruột non, từ đó có hiện tượng tiêu chảy mất nước

Sự đột biến ở roi của một số chủng V cholerae sẽ ảnh hưởng đến yếu tố độc

lực TCP, Hình sau biểu hiện sự biến đổi về roi

a Roi của chủng hoang dại; b Roi do đột biến gen; c Roi do đột biến gen

Hình 1.7: Vi khuẩn đột biến roi (Ewen, 2008) Nếu vi khuẩn mang gene đột biến sẽ dẫn đến khiếm khuyết trong việc lắp ráp roi (flagellar) Qua Hình trên, đối với loài hoang dại (Hình a) không mang gene đột biến nên chiều dài roi dễ dàng nhìn thấy qua hiển vi điện tử; Hình (b) vi khuẩn

a Roi dài b Không có roi c Roi ngắn

- 17 -

mang gene flgT đột biến nên không hình thành roi; Hình (c) vi khuẩn có roi ngắn hơn cũng do hiện diện gene đột biến roi fliA

Nhiều nghiên cứu trước đó đã cho thấy sự bùng phát dịch tả ở miền Bắc Việt

Nam trong năm 2007 và đầu năm 2008 là do chủng V cholerae O1 type sinh học El

Tor đã biến thể từ type sinh học Cổ điển mang gene có độc tố CTXB Chủng thuộc type sinh học El Tor này được du nhập vào miền Bắc Việt Nam trong năm 2007 và thường xuyên thay thế các chủng mang gene CTX của type cổ điển trên nhiễm sắc thể nhỏ, tương tự như phiên bản của các chủng phân lập ở Mozambique, và có liên quan đến sự bùng phát dịch tả tại Việt Nam năm 2007 Dữ liệu cho thấy kiểu gene

của các chủng V cholerae gây bùng phát dịch tả ở miền Bắc Việt Nam từ năm 2007

và năm 2010 gây ra bởi một dòng duy nhất là type sinh học El Tor đã biến thể và đang chiếm ưu thế thay cho các type sinh học El Tor truyền thống trước đây

(Nguyễn et al., 2009)

Trong một nghiên cứu của Trần et al (2012) cho thấy chủng V cholerae

type sinh học El Tor có liên quan đến những chủng gây dịch tả tái phát tại Việt Nam năm 2007-2010, đây là một biến thể của type El Tor có mang gene độc lực CTX cổ điển và mang gene RST type sinh học El Tor có liên quan đến dịch tả tại Khon Kaen, Thái Lan Theo thời gian, vi khuẩn có một quá trình chuyển đổi di truyền từ

type El Tor biến thể gây bệnh ở Mozambique đã lan sang các nước châu Á, vì V

cholerae có ngoài môi trường tự nhiên, từ đó vi khuẩn phát triển tại Khon Kaen và

sau đó xuất hiện ở khắp nước Thái Lan (Okada et al., 2012)

Trong lịch sử, bệnh tả đã được lưu hành trong nhiều thế kỷ trong khu vực sông Hằng, đồng bằng thuộc Vịnh Bengal Bệnh dịch tả xảy ra ở Châu Phi và Châu

Mỹ La Tinh và sau đó lan sang các nước châu Á (Blake, 1994) Năm 1991 V

cholerae O1 type sinh học El Tor lần đầu tiên gây bệnh bệnh dịch tả ở Châu Mỹ

Latinh (Blake, 1994), và các chủng khác nhau được phát hiện sau đó vào năm 2009

( Beltra'n et al., 1999; Popovic et al., 1993; Nusrin et al., 2009)

Tại Thái Lan, phần lớn các chủng V cholerae O1 type sinh học El Tor có

liên quan đến việc tái phát dịch tả từ năm 2003 đến 2011, những mẫu phân lập chủ yếu có nguồn gốc từ nước ngoài môi trường, điều đó phản ánh sự đa dạng di truyền

trong quần thể V cholerae (Alam et al., 2007), sau đó xuất hiện ở các nước Châu Á, Châu Phi (Ansaruzzaman et al., 2004) và các nước Châu Mỹ (Alam et al., 2010)

Những bằng chứng có liên quan đến các chủng thuộc type sinh học El Tor đã biến thể và gây dịch bệnh ở Thái Lan, Việt Nam và Bangladesh thể hiện qua cây phát sinh loài, mặc dù những chủng này phát triển độc lập trong các hệ sinh thái khác nhau Những hình ảnh sau cho thấy các phương thức lây truyền bệnh rất đa dạng

- 18 -

trong cộng đồng dân cư và những nước lân cận với Việt Nam như Lào, Campuchia

và Thái Lan

1.5.5 Triệu chứng bệnh do vi khuẩn Vibrio cholerae

Các triệu chứng của bệnh dịch tả bắt đầu sau 24 – 48 giờ ủ bệnh Bệnh nhân trải qua triệu chứng khởi phát đột ngột như tiêu chảy mất nhiều nước thường nôn mửa và kèm theo đau bụng Tiêu chảy có một đặc trưng như “nước cơm” xuất hiện Bệnh rất nghiêm trọng có thể mất nước trên 250 ml/ kg trong 24 giờ đầu tiên Người lớn thường sốt, trong khi trẻ em có thể bị sốt, dấu hiệu lâm sàng khác là mất nước,

từ 3-5% trọng lượng cơ thể, bệnh nhân có biểu hiện khát nước Nếu mất 5-8% nước bệnh nhân sẽ bị hạ huyết áp, nhịp tim nhanh, suy nhược, mệt mỏi Lượng nước tiểu của bệnh nhân giảm đáng kể, mắt xuất hiện thủy tinh và chìm, trẻ sơ sinh yếu ớt, da xuất hiện nếp nhăn, bệnh nhân có thể rơi vào tình trạng hôn mê (Lencer, 2001)

1.5.6 Phòng và điều trị bệnh

Phòng ngừa

Chỉ uống nước đã được nấu chín, tránh uống các các loại nước giải khát chưa được kiểm tra xuất xứ và vệ sinh Chỉ ăn thức ăn đã được nấu chín và tốt nhất là ăn nóng; tránh ăn các loại rau sống trong vùng đang có dịch hoặc nghi có dịch Các nước phát triển khuyến cáo công dân của họ không dùng “đồ ăn uống vỉa hè” trong thời gian nghi ngờ có dịch hay đang có dịch tại các nơi họ đến du lịch hay làm việc

và hạn chế “mang đồ ăn về làm quà tặng”

Cần xử lý hoặc khử trùng các chất thải lây nhiễm, vệ sinh thực phẩm và các loại thực phẩm với nhiệt độ đủ cao giúp giảm bớt dịch bệnh Nhiễm serogroup O1

sẽ có khả năng miễn dịch với cùng một chủng vi khuẩn, tuy nhiên điều này không đúng cho serogroup O139 Vaccine có thể giúp hạn chế dịch bệnh trong vùng vệ sinh kém Tuy nhiên ngừa bằng đường uống có hiệu quả nhất

Vaccine phòng bệnh do V cholerae

Cách phòng bệnh bằng vaccine đã làm thay đổi mô hình nhiều loại dịch bệnh trên toàn cầu nhiều năm qua và việc tìm ra nhiều loại vaccine mới vẫn đang là thách thức của y học Tại Việt Nam, sự ra đời của vaccine tả công thức mới với hiệu lực bảo vệ cao và được các chuyên gia quốc tế đánh giá là loại vaccine tả tốt nhất thế giới hiện nay và sẽ là một giải pháp phòng bệnh trước sự bùng phát của dịch tiêu chảy cấp do vi khuẩn tả Theo các chuyên gia dịch tễ thuộc Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, hiệu quả của vaccine tả chỉ đạt khoảng 66 -70% và chỉ có tác dụng trong thời gian ngắn Do đó, uống vaccine không phải là biện pháp tối ưu trong phòng chống dịch mà chỉ là một biện pháp hỗ trợ Người dân cần tiếp tục thực hiện

- 19 -

nghiêm túc các biện pháp phòng bệnh như ăn chín uống sôi, rửa tay sạch, giữ gìn vệ sinh môi trường

Thuốc chủng ngừa WC/RBS bao gồm toàn bộ tế bào V cholerae được giết

chết và các tiểu đơn vị B có khả năng tạo độc tố bệnh tả Vaccine này bảo vệ chống lại type sinh học El Tor, điều chế từ vi khuẩn bệnh tả được làm giảm độc lực Cho đến nay, vaccine này dung nạp và miễn dịch tốt, vaccine mới đang được thử nghiệm chống lại type sinh học El Tor và O139 (Mandell, 2000)

Điều trị bệnh do V cholerae

Điều trị bệnh tả khá đơn giản: bệnh nhân phải được cấp nước để tránh giảm đường huyết, quá trình này phải thực hiện với hai phương pháp chính: bù nước bằng đường uống (Oresol), hoặc bệnh nhân mất nước nghiêm trọng có thể truyền nước Ringer Lactated hoặc nước muối Để đạt được tình trạng cân bằng lượng nước bình thường phải mất hơn bốn giờ, bệnh nhân mất nước nghiêm trọng cần 50-100 ml/ kg/giờ Sau khi đạt được tình trạng bình thường, bệnh nhân phải tiếp tục cấp nước bằng đường uống hoặc chất lỏng để điều trị cho đến khi tiêu chảy giảm đi

Kháng sinh dùng trong điều trị nhiễm trùng, không phải là biện pháp điều bệnh Tetracycline, ciprofloxacin và erythromycin có thể rút ngắn thời gian và khối lượng mất nước Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn đã trở thành một mối quan tâm trong khu vực có dịch tả lưu hành Kết hợp điều trị với các dịch truyền thích hợp sẽ tiết kiệm chi phí, không điều trị với các trường hợp điển hình có thể tử vong 25-50% Bệnh tả đòi hỏi phải nhiễm một liều lượng cao vi khuẩn là 103 đến 106 Liều này đủ để vi khuẩn nhạy cảm với nồng độ axit trong dạ dày Nguy cơ nhiễm bệnh tả tăng ở những người sử dụng thuốc kháng acid, các thuốc kháng histamine,

và các thuốc làm giảm acid dạ dày Nguy cơ tương tự đối với bệnh nhân viêm dạ

dày mãn tính do nhiễm H pylori , người đã có phẫu thuật dạ dày Người có nhóm

máu O cũng tăng nguy cơ nhiễm trùng, và tính nhạy cảm này vẫn chưa hiểu rõ (Lencer, 2001) Điều trị bệnh tả quan trọng nhất là công tác phòng chống, duy trì một nguồn cung cấp nước uống là rất quan trọng trong quá trình xảy ra dịch bệnh Nước được khử trùng với chlor và uống nước đun sôi có thể giúp tiêu diệt vi khuẩn trong nguồn nước

- 20 -

CHƯƠNG 2: PHÂN LẬP VI KHUẨN V CHOLERAE KHÁNG KHÁNG

SINH TẠI TỈNH TRÀ VINH

2.1 Mục đích nghiên cứu

Phân lập các loại mẫu từ nguồn nước (nước sông, nước ao nuôi tôm), các

loại thức ăn có nguồn gốc hải sản (nghêu, tôm) tìm vi khuẩn V cholerae kháng

kháng sinh tại Trà Vinh

2.2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng

Các loại mẫu từ nguồn nước (nước sông, nước ao nuôi tôm), các loại thức ăn có nguồn gốc hải sản (nghêu, tôm)

Mẫu tôm: rửa sạch chất bẩn bên ngoài, lấy phần thịt cắt nhuyễn (1g) tăng

sinh trong 9 ml môi trường ASPW

Mẫu nước: lấy 25 ml mẫu nước trên bề mặt tại các địa điểm nuôi tôm, nước

sông, nước biển Sau đó lấy 1ml nước tăng sinh trong 9ml môi trường ASPW

Phương pháp nghiên cứu

Các loại mẫu đều được nuôi tích lũy 2 lần trong môi trường ASPW

giờ Sau đó lấy 1 ml từ môi trường trên cho vào 10 ml môi trường ASPW ủ lần 2 ở 41,50C từ 16-18 giờ nhằm ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn cạnh tranh khác

* Phân lập trên môi trường chuyên biệt TCBS ở 370C trong 24 giờ: khuẩn lạc

có thể có màu vàng hoặc xanh tùy loài:

- Khuẩn lạc V cholerae lớn, đường kính khoảng 2-3 mm, láng, có màu vàng,

hơi phẳng, tâm đục và xung quanh có quầng trắng đục

- Khuẩn lạc V parahaemolyticus và V vulnificus lớn, đường kính khoảng

3-4 mm, có màu từ xanh đến xanh dương

- Khuẩn lạc V mimicus lớn, đường kính 2-3 mm, phẳng và có màu xanh Còn đối với khuẩn lạc V fluvialis thì phẳng, màu vàng và đường kính từ 2-3 mm

- 21 -

2.2.1 Xác định V cholerae bằng phản ứng sinh hóa (quy trình ISO/TS

21872-1:2007)

Các thử nghiệm sinh hoá quan trọng để phát hiện hay phân biệt các loài

Vibrios được thực hiện theo quy trình ISO/TS 21872-1:2007 (E)

Chọn khuẩn lạc trên môi trường SNA để thử nghiệm các đặc tính: phản ứng với oxidase; kiểm tra tính lên men đường glucose/lactose; khả năng sinh hơi và sinh

H2S; thử phản ứng sinh Indole và sự di động Thử tính ưa mặn của Vibrio spp ở các nồng độ muối NaCl khác nhau (0%, 2%, 6%, 8% và 10%), V cholerae mọc tốt trên môi trường có muối từ 0 – 2%; V parahaemolyticus và V Aginolyticus từ 2 – 8 %,

V vulnificus và V fluvialis từ 2 – 6%

* Thử nghiệm oxidase: Nhỏ nước muối sinh lý lên lam sạch và đặt đĩa giấy tẩm oxidase, dùng que cấy đầu tròn lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ đĩa môi trường SNA lên đĩa giấy tẩm oxidase đã được làm ướt và quan sát, đọc kết quả trong vòng

10 giây đến 1 phút Nếu đĩa giấy chuyển màu xám, tím hoặc xanh tím là kết quả dương tính, không đổi màu là kết quả âm tính

* Môi trường TSI saline: Mục đích của việc cấy trên môi trường này là kiểm tra tính lên men đường glucose, lactose, tính sinh gas và tính sinh H2S của vi khuẩn

Môi trường TSI saline được pha chế có màu đỏ cam, hấp khử trùng sau khi

đổ vào ống nghiệm, môi trường đặt nghiêng, phần nghiêng cao tương đương phần đứng và chiều dài môi trường đạt không qua 2/3 chiều cao ống nghiệm, tuyệt đối không để thạch chạm nắp ống nghiệm

Cách cấy vi khuẩn

Trong điều kiện vô trùng, chọn lấy một khuẩn lạc Vibrios riêng rẻ trên môi

trường SNA cấy vào môi trường TSI saline Dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn

Vibrios nghi ngờ thẳng xuống phần thạch đứng, phần thạch nghiêng ria cấy ngang

đem ủ ở 37 0C trong 24 giờ Đọc kết quả dựa vào sự thay đổi của môi trường:

 Vi khuẩn sinh H2S giữa vùng thạch đứng và thạch nghiêng sẽ có màu đen

 Vi khuẩn sinh hơi sẽ xuất hiện bọt trên mặt thạch hoặc cột thạch có những đường nứt

 Vi khuẩn lên men đường glucose, không lên men đường lactose thì phần thạch nghiêng có màu đỏ hồng còn phần thạch đứng có màu vàng

Kết quả: Trên môi trường TSI, Vibrio cholerae làm phần thạch nghiêng có

màu đỏ và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S (Hình 2.3)

- 22 -

* Thử khả năng sinh indole

+ Nguyên tắc: là thử khả năng oxy hóa acid amine tryptophane của vi khuẩn thành những sản phẩm biến dưỡng có gốc indole gồm indole, sketole Việc phát hiện indole được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với thuốc thử Kovacs (para dimethylaminobenzaldehyde, p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone có màu đỏ

+ Phương pháp tiến hành: nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử Kovacs vào ống nghiệm

vi khuẩn có Trypton và DL-trytophan đã được ủ ở 37oC trong 24 giờ:

Phản ứng dương tính (+): nếu có vòng đỏ hồng xuất hiện sau 2 – 3 phút Phản ứng âm tính (-): khi không có vòng đỏ hồng trên mặt môi trường sau

khi nhỏ thuốc thử Do vi khuẩn Vibrios có khả năng sinh indole nên phản ứng

indole dương tính (+) và có một vòng đỏ trên môi trường ống nghiệm

* Thử tính ưa mặn

V cholerae phát triển tốt ở môi trường có nồng độ muối từ 2 – 3%, để xác

định sự hiện diện của vi khuẩn, do đó cần cấy vi khuẩn ở các nồng độ muối (NaCl) khác nhau (0%, 2%, 6%, 8% và 10%)

Dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn Vibrios nghi ngờ vào ống nghiệm có chứa

kết quả dựa vào sự thay đổi độ đục của môi trường: ống nghiệm đục cho kết quả dương tính, ống nghiệm trong suốt cho kết quả âm tính Vi khuẩn mọc tốt ở môi trường có nồng độ muối 2%

* Nhuộm Gram: vi khuẩn sau khi phân lập từ các khuẩn lạc điển hình sẽ tiến hành nhuộm Gram để xác định hình dạng và tính bắt màu và quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 40 – 100X, vi khuẩn sẽ bắt màu hồng nhạt và có hình que ngắn, sau đó chụp dưới kính hiển vi điện tử 10.000 X

2.2.2 Xác định Vibrios bằng máy định danh tự động (Vitex 2 compact-

Biomerieux - BVĐK Trung ương Cần Thơ)

Nguyên lý định danh vi sinh vật là dùng phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh hoá của vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu của các giếng môi trường có sẵn trong thẻ (card) Các thẻ định danh được phủ hoá chất tối đa 64 giếng, các giếng có hoá chất đặc biệt phù hợp với tính chất sinh hoá của vi sinh vật khác nhau

Máy sẽ tự động báo cáo kết quả khi xét nghiệm hoàn tất từ 5 – 7 giờ, bao

gồm tỉ lệ dương tính của từng loài Vibrios và kết quả chi tiết về sinh hoá thông qua

- 23 -

việc đo cường độ ánh sáng bị chặn lại (hay sự suy giảm cường độ ánh sáng) khi ánh sáng đi qua giếng với các bước sóng 660 nm, 568 nm, 428 nm

2.2.3 Xác định vi khuẩn Vibrio spp bằng kỹ thuật PCR

Quy trình ly trích DNA từ khuẩn lạc

Chọn 10 khuẩn lạc rời đã được cấy thuần trên môi trường thạch không chọn lọc (SNA: saline nutrient agar), cho vào tube 2,2 ml có viên bi sắt và lắc bằng máy vortex, sau đó cho 1 ml Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, lấy phần dung dịch (400 μl) chuyển sang tube mới Cho một lượng tương đương Ethanol 95%, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ phần nước trong phía trên Kết tủa được rửa bằng Ethanol 70% trong 500

μl, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút Sấy khô phần tủa (DNA) trong 10 phút ở

450C; sau đó hòa tan DNA thu được trong 100 μl TE 0.1X và trữ ở -200C

Các gốc vi khuẩn thuần được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR, dựa trên gene 16S rRNA Trình tự nucleotide của các cặp mồi được trình bày trong Bảng 3.1 Thành phần 01 phản ứng PCR bao gồm: DNA tổng số khoảng 25μl, 2,5 μl buffer 1X (Tris

10 mM, KCl 50 mM, pH 9.0, Triton X-100), 2 μl MgCl2, 4μl cho mỗi dNTP, 1μl mồi xuôi 27F, 1μl mồi ngược 1492R, 0.25μl Taq DNA polymerase Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR như sau: 950C trong 5 phút, sau đó lặp lại 30 chu kỳ với các bước như sau: Biến tính ở 950C trong 1 phút, gắn mồi ở 530C trong 30 giây, tổng hợp DNA ở 720C trong 60 giây Cuối cùng phản ứng được duy trì 720C trong 5 phút

Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1X ở 100V trong 90 phút và chụp bằng máy chụp hình gel Biorad UV 2000, thang chuẩn 100 bp (công ty Fermentas)

Bảng 2.1: Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR dựa trên gene 16S

rRNA

Xác định Mồi Trình tự nucleotide của mồi (5'→3') Mồi xuôi // Mồi ngược

Độ dài (bp)

Biến tính

Gắn mồi

Kéo dài

Kết thúc

- 24 -

Xử lý số liệu: Xử lý kết quả bằng chương trình Excel; phần mềm BioEdit

(phân tích kết quả giải trình tự; phần mềm MEGA (Treeview)

Quy trình phân lập Vibrio spp theo tiêu chuẩn ISO/TS 21872-2:2007 được tóm tắt

qua sơ đồ sau:

Hình 2.1: Quy trình phân lập và định danh Vibrio spp

O1

Thực hiện phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh

O139

OgawaInaba

Ủ ở 37oC/6h → 1ml vào ống chứa 10ml ASPW Ủ

Kiểm tra các đặc tính sinh hóa

[Xác định vi khuẩn Vibrio spp và cấy thuần lại trên NA

saline

Giữ giống Cho 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9m nước Peptone

kiềm (ASPW)

- 25 -

2.3 Kết quả nghiên cứu

2.3.1 Kết quả định danh Vibrio spp bằng phản ứng sinh hóa

Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hoá của các loài thuộc Vibrio spp được thể

hiện qua bảng sau:

Bảng 2.2: Kết quả thử sinh hoá các loài thuộc Vibrio spp

Quan sát đặc tính sinh hóa, nhận thấy một số vi khuẩn Vibrio spp có thể

phát triển trong môi trường thạch muối-sucrose thiosulfate citrate-mật (TCBS):

khuẩn lạc màu vàng/xanh, Vibrio spp có thể phân biệt bởi một số phản ứng

sinh hóa, hầu hết đều tạo sản phẩm oxidase và catalase, lên men đường và

không sinh hơi; V cholerae, V paraheamolyticus, V fluvialis và V

alginolyticus đều không lên men đường lactose, riêng V cholerae và V alginolyticus có khả năng oxy hóa tryptophan của vi khuẩn thành sản phẩm có

gốc indole Tất cả các loài đều âm tính với urease, riêng V parahaemolyticus

- 26 -

có phản ứng dương tính với urê, đây là phản ứng có giá trị kiểm tra đối với các

chủng có khả năng gây bệnh Vibrio spp phát triển ở nồng độ muối thích hợp:

0-2%, 2-6%, 2-8% và từ 2-10%, tỉ lệ dương tính phù hợp với các phản ứng sinh hoá của 5 loài từ 90 – 98% Kết quả sinh hóa trên thực hiện theo tiêu chuẩn quy trình ISO/TS 21872-1:2007 (E)

(a) Khuẩn lạc có màu vàng (b) Khuẩn lạc có màu xanh

Hình 2.2: Khuẩn lạc trên môi trường TCBS

Hình 2.3: Test sinh hoá

(a) Oxidase (+); (b) Các dãy giếng dùng thử nghiệm Indole(+) và ONPG (+)

(c) Lên men đường glucose; (d) LDC (+); (e) Di động (+)

- 27 -

a Nồng độ muối (+) từ 0% - 2% b Nồng độ muối (+) từ 2% - 8%

Hình 2.4: Nồng độ muối từ 0% - 10%

* Nhuộm Gram: Kết quả xác định hình dạng vi khuẩn V cholerae dưới kính

hiển điện tử với độ phóng đại 5.000 và 10.000 lần, vi khuẩn có hình hơi cong, có chiều dài từ 1 µm – 3 µm, có roi ngắn

Hình 2.5: Chủng vi khuẩn O3.2 (T3) dưới kính hiển vi điện tử, độ phóng đại 5.000

và 10.000 lần

2.3.2 Kết quả định danh Vibrios bằng máy định danh tự động (Vitex 2 compact-

Biomerieux - BVĐK Trung ương Cần Thơ)

Kết quả định danh hoàn tất từ 5 – 7 giờ, tỉ lệ dương tính và kết quả chi tiết

về sinh hoá của từng loài Vibrios thể hiện qua phụ lục 4 Tỉ lệ dương tính của từng loài Vibrios được tổng hợp như sau:

- 28 -

2.3.3 Kết quả định danh Vibrio spp bằng kỹ thuật PCR

Hình 2.6: Sản phẩm khuếch đại đoạn gene 16S-27F và 1492Rbp Kết quả điện di hình trên cho thấy các sản phẩm PCR dài 1500 bp tương

đương với đoạn gene 16S-27F và 1492R ở tất cả các chủng Vibrio spp

Trình tự gene 16S rRNA được nhiều tác giả sử dụng trong phương pháp phân tích PCR để xác định bất kỳ vi khuẩn bao gồm cả vi khuẩn thuộc nhóm

Vibrios (Gomez et al., 2004; Haldar et al., 2011b) Đoạn gene 16S rRNA dài 1.500

bp bao gồm các khu vực bảo tồn cao và có mặt ở hầu hết các vi khuẩn có phân nhánh nhưng có mối quan hệ gần, trong khi vùng biến đổi có thể phân biệt các loài trong cùng một giống Đây là một công cụ để các nhà nghiên cứu sử dụng đoạn

gene 16S rRNA xây dựng cây phát sinh loài trong ngành vi sinh vật (William et al.,

1991)

Đối chiếu các kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa với các sản phẩm từ PCR,

nghiên cứu ghi nhận những loài thuộc Vibrios lần lượt: V cholerae vạch từ 1-6; V

fluvialis từ 7-11; V paraheamolyticus từ 12-19; V vulnificus từ 20-23; V alginolyticus từ 24-25

Qua nghiên cứu chưa phát hiện chủng thuộc Vibrios mang gene O139rfb và chủng mang gene mã hoá độc tố CTXA trên những mẫu từ môi trường nước và thức

ăn có nguồn gốc thủy sản, chứng tỏ Vibrio O139 xuất hiện chưa phổ biến tại tỉnh Trà Vinh Ở miền Bắc Việt Nam từ năm 2006 – 2010 chỉ phân lập một chủng V

cholerae O139 từ môi trường nước (Dong Tu Nguyen, 2012) Nghiên cứu trên cũng

cho thấy V cholerae đại diện cho một số chủng thuộc Vibrios được phân lập ngoài

môi trường nước, trong đó chỉ có một vài chủng có đặc tính gây bệnh và môi trường nước trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản luôn tồn tại cả hai chủng không gây bệnh

và gây bệnh (O1/non – O1 và O139/non – O139) những chủng không gây bệnh dễ