GIÁO TRÌNH KÝ SINH TRÙNG THỰC HÀNH (DÙNG CHO ðÀO TẠO CỬ NHÂN XÉT NGHIỆM)

VỤ KHOA HỌC VÀ ðÀO TẠO – BỘ Y TẾ LỜI NĨI ðẦU Giáo trình Ký sinh trùng thực hành được biên soạn cho sinh viên khoa Kỹ thuật Y học cĩ mục đích hướng dẫn cho những sinh viên học mơn

BỘ Y TẾ

GIÁO TRÌNH

KÝ SINH TRÙNG

THỰC HÀNH (DÙNG CHO ðÀO TẠO CỬ NHÂN XÉT NGHIỆM)

MÃ SỐ: ðK.01.Z.15

NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC

HÀ NỘI – 2008

Chỉ ñạo biên soạn:

VỤ KHOA HỌC VÀ ðÀO TẠO – BỘ Y TẾ

Chủ biên:

PGS TS LÊ THỊ XUÂN

Những người biên soạn:

CN Vạ THỊ MỸ DUNG

CN NGUYỄN THỊ HIỆN

CN TRỊNH TUYẾT HUỆ

CN NGUYỄN HỒ PHƯƠNG LIÊN PGS.TS LÊ THỊ XUÂN

Tham gia tổ chức bản thảo:

ThS PHÍ VĂN THÂM

TS NGUYỄN MẠNH PHA

LỜI GIỚI THIỆU

Thực hiện một số ựiều của Luật Giáo dục, Bộ Giáo dục & đào tạo và Bộ Y tế ựã ban hành chương trình

khung ựào tạo Cử nhân xét nghiệm Bộ Y tế tổ chức biên soạn tài liệu dạy Ờ học các môn cơ sở và chuyên

môn theo chương trình trên nhằm từng bước xây dựng bộ sách ựạt chuẩn chuyên môn trong công tác ựào tạo nhân lực y tế

Giáo trình KÝ SINH TRÙNG THỰC HÀNH ựược biên soạn dựa vào chương trình giáo dục của Trường đại học Y Dược TP Hồ Chắ Minh trên cơ sở chương trình khung ựã ựược phê duyệt Giáo trình ựược PGS.TS Lê Thị Xuân (Chủ biên), CN Võ Thị Mỹ Dung, CN Nguyễn Thị Hiện, CN Trịnh Tuyết Huệ, CN Nguyễn Hồ Phương Liên biên soạn theo phương châm: kiến thức cơ bản, hệ thống; nội dung chắnh xác, khoa học; cập nhật các tiến bộ khoa học, kỹ thuật hiện ựại và thực tiễn Việt Nam

Giáo trình KÝ SINH TRÙNG THỰC HÀNH đã được Hội đồng chuyên mơn thẩm định sách và tài liệu dạy – học chuyên ngành Cử nhân xét nghiệm của Bộ Y tế thẩm định năm 2008 Bộ Y tế quyết định ban hành tài liệu dạy – học đạt chuẩn chuyên mơn của ngành trong giai đoạn hiện nay Trong thời gian từ 3 đến 5 năm, sách phải được chỉnh lý, bổ sung và cập nhật

Bộ Y tế chân thành cảm ơn các tác giả và Hội đồng chuyên mơn thẩm định đã giúp hồn thành cuốn sách; cảm ơn PGS.TS Vũ ðức Chính, PGS.TS Hồng Tân Dần đã đọc và phản biện để cuốn sách sớm hồn thành, kịp thời phục vụ cho cơng tác đào tạo nhân lực y tế

Lần đầu xuất bản, chúng tơi mong nhận được ý kiến đĩng gĩp của đồng nghiệp, các bạn sinh viên và các độc giả để lần xuất bản sau sách được hồn thiện hơn

VỤ KHOA HỌC VÀ ðÀO TẠO – BỘ Y TẾ

LỜI NĨI ðẦU

Giáo trình Ký sinh trùng thực hành được biên soạn cho sinh viên khoa Kỹ thuật Y học cĩ mục đích

hướng dẫn cho những sinh viên học mơn Ký sinh trùng nhằm hồn thiện khả năng chẩn đốn dựa trên một số thơng tin lâm sàng cơ bản và xét nghiệm bệnh phẩm bằng cách xem kính hiển vi, cấy Một số kỹ thuật miễn dịch cũng được đề cập đến

Giáo trình gồm cĩ ba phần:

Phần một: Phần kỹ thuật trình bày những kỹ thuật xét nghiệm cơ bản bao gồm phương pháp thu thập,

bảo quản, xử lý bệnh phẩm

Phần hai: ðịnh danh, gồm các hình ảnh các ký sinh trùng và vi nấm gây bệnh thường gặp ở nước ta

Ngồi việc các sinh viên phải nắm vững các kỹ thuật được giới thiệu, điều chúng tơi quan tâm hơn nữa

là sinh viên phải biết được ưu, nhược điểm của các phương pháp được chọn, phải hiểu ích lợi và hạn chế của

nĩ Sinh viên cần phải biết lựa chọn các phương pháp chẩn đốn phù hợp với từng loại ký sinh trùng và từng loại bệnh phẩm

Nội dung các kỹ thuật trình bày trong giáo trình này cĩ thể khơng được đầy đủ, nhưng nĩ cũng chứa đựng các phương pháp phổ biến nhất và đủ dùng cho các phịng xét nghiệm lâm sàng ở nước ta

Trong cuốn giáo trình này, chúng tơi đã cố gắng trình bày những điểm đặc trưng về hình thể để phân biệt ký sinh trùng và giải thích làm thế nào để xác định chúng

Phần ba: Phụ lục, giới thiệu các hĩa chất thường dùng trong xét nghiệm ký sinh trùng đường ruột; các

hĩa chất, thuốc nhuộm và mơi trường trong xét nghiệm nấm

Những hình ảnh minh họa, mặc dù khơng hồn chỉnh nhưng cũng khá đầy đủ về số lượng và chất lượng, cung cấp một cách khái quát về hình thái của ký sinh trùng và vi nấm cũng như các kỹ thuật phát hiện chúng Các tác giả là những người làm việc ở phịng thí nghiệm trong nhiều năm qua và cĩ kinh nghiệm giảng dạy về mơn Ký sinh trùng, hy vọng rằng cuốn sách này sẽ cung cấp những thơng tin cĩ giá trị cho sinh viên nhằm giúp họ cĩ kiến thức về thực tiễn chẩn đốn ký sinh trùng, giúp cho việc phịng, chữa bệnh đạt hiệu quả

Do trình độ và thời gian cĩ hạn, chúng tơi khơng tránh khỏi những thiếu sĩt về chuyên mơn cũng như in

ấn, rất mong nhận được sự gĩp ý của các sinh viên và đồng nghiệp để lần xuất bản sau giáo trình được hồn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn

CÁC TÁC GIẢ

PHẦN MỘT

KỸ THUẬT

Bài 1 CÁCH SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI

ða số ký sinh trùng (KST) không thể nhận thấy bằng mắt thường mà cần có những dụng cụ quang học

ñể phóng ñại chúng lên như kính lúp, kính hiển vi Tùy theo yêu cầu của kỹ thuật, kính hiển vi còn cần có những phụ tùng ñể ño kích thước KST, tụ quang nền ñen,…

1 NHẮC LẠI CẤU TRÚC CỦA KÍNH HIỂN VI

Kính hiển vi là một công cụ thường dùng và quan trọng nhất của một phòng xét nghiệm KST Kính hiển

vi có thể có những hình dạng khác nhau tùy theo mẫu sản xuất, nhưng cấu tạo cơ bản giống nhau, gồm có những bộ phận:

Thị kính là một thấu kính nằm ở phía trên ñể mắt nhìn ảnh qua vật kính Có 3 loại thị kính x5, x10, x15; loại x10 thường ñược dùng nhiều nhất

 Ống kính là một ống mà ánh sáng phải ñi qua từ vật kính ñến thị kính và có chức năng giữ thị kính và vật kính nằm cách nhau một khoảng nhất ñịnh

 ðĩa mang vật kính là một bộ phận có 4 lỗ ñể gắn vật kính, khi xoay sẽ ñưa vật kính cần sử dụng vào ống kính

 Vật kính: ánh sáng ñi qua vật quan sát rồi ñến thấu kính này Có 4 loại vật kính, nhưng thường dùng 3 loại:

– Vật kính x10: có thị trường lớn nhất, sau khi ñiều chỉnh ñể thấy rõ mẫu vật, vật kính này thường cách kính mang vật khoảng 16mm

– Vật kính x 40: có ñộ phóng ñại trung bình, sau khi ñiều chỉnh ñể thấy rõ mẫu vật, vật kính này thường cách kính mang vật khoảng 4mm

– Vật kính x100: có ñộ phóng ñại lớn nhất, sau khi ñiều chỉnh ñể thấy rõ mẫu vật, vật kính này thường cách kính mang vật khoảng 1mm Sử dụng vật kính với dầu soi kính và dùng ốc vi cấp ñể ñiều chỉnh

 Kính tụ quang: tập trung ánh sáng

 Màng chắn ánh sáng: ñể cho ánh sáng qua nhiều hay ít ñể vào vật kính

 Gương tròn dùng ñể lấy ánh sáng, thường có 2 mặt:

– Mặt lõm: khi sử dụng vật kính x10, x40

– Mặt phẳng: khi sử dụng vật kính x100

Những loại kính dùng ánh sáng của bóng ñèn gắn trong thân máy không có gương

 Tiểu xa: dùng ñể giữ tiêu bản ñược gắn với một trục có một ốc dùng ñể di chuyển sang trái, sang phải

và một ốc dùng ñể di chuyển phía trước, về sau

Thân kính mang ống kính, bàn mang mẫu vật, kính tụ quang, ốc vi cấp, ốc thứ cấp và gương

Cấu tạo kính hiển vi quang học

2 CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI

ðặt tiêu bản lên bàn mang tiêu bản

 ðiều chỉnh ánh sáng với gương tròn, kính tụ quang và màn chắn sáng

 Xoay trục mang vật kính x10 vào ñúng vị trí

 Vặn ốc thứ cấp ñể thấy rõ vật

 Nếu cần quan sát với ñộ phóng ñại lớn thì ñổi qua vật kính lớn hơn x40, dùng ốc vi cấp ñể ñiều chỉnh ñến khi thấy rõ vật Khi sử dụng vật kính x100, ta phải dùng dầu soi kính Nhỏ 1 giọt dầu lên tiêu bản rồi ñổi qua vật kính x100

3 CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI

ðặt kính hiển vi ñúng chỗ, xa hơi nóng và chỗ ẩm ướt

 Cầm kính hiển vi bằng thân kính, tay kia ñỡ chân của kính Phải ñể ñứng kính hiển vi, không ñược ñể kính nghiêng

 Cẩn thận không làm rơi chất ăn mòn hay bất cứ một dung dịch nào lên bàn kính

 Không ñược ñể tay ướt hay bẩn lên kính hiển vi

 Lau thị kính và vật kính bằng giấy lau kính trước và sau khi dùng Khi soi với vật kính dầu, thấm giấy lau kính với một giọt xylen ñể lau vật kính Sau khi lau với xylen, phải lau khô ngay bằng giấy lau kính, nếu không xylen có thể làm bong những thấu kính gắn trong vật kính

 Trước khi cất kính hiển vi, ñể vật kính nhỏ ở vị trí quan sát và hạ thấp ống kính bằng ốc lớn Vặn nhẹ nhàng, ñừng ấn mạnh ống kính Nếu cẩn thận hơn, hạ tụ quang kính xuống Nếu tụ quang kính bẩn, lau bằng giấy lau kính khô

 ðể gương nghiêng, mặt phẳng ra phía ngoài ñể tránh bụi

 Che kính hiển vi bằng bao của kính Cất kính vào ñúng chỗ của kính, ñể lui vào phía trong, ñừng ñể mấp mé phía ngoài

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Trình bày cách sử dụng kính hiển vi ñể quan sát một mẫu phân tươi

2 Khi sử dụng kính hiển vi ñể soi lam máu, anh (chị) cần chú ý ñến yếu tố nào ñể có thể nhìn thấy rõ KST

sốt rét (KST SR) trên phết máu nhuộm?

3 Sau khi soi lam máu tìm KST SR, anh (chị) bảo quản kính hiển vi như thế nào trước khi cất vào tủ kính?

Bài 2 CÁCH CHUẨN ðỘ KÍNH HIỂN VI

Xác ñịnh loài KST cần dựa vào nhiều tiêu chuẩn, trong ñó có tiêu chuẩn kích thước của KST Ta có thể ước lượng kích thước KST bằng cách so sánh với một vật ñã biết kích thước trước như hồng cầu, nhưng cách này không cho ta kết quả chính xác ðể ño ñược chính xác kích thước KST, ta dùng thước trắc vi ñặt trong thị kính

1 DỤNG CỤ

– Kính hiển vi 2 mắt với các vật kính x 10, x 40, x 100

– Dầu

– Giấy lau kính

– Thước trắc vi thị kính (chia thành 50 ñơn vị)

– Thước trắc vi nền với 2 ñộ chia 0,1 và 0,01mm

– Thị kính (nên sử dụng thị kính x10):

+ Thước trắc vi nền có kích thước bằng lam kính bình thường và ở giữa có những gạch cách nhau 0,1 và 0,01mm

+ Thước trắc vi ñặt ở thị kính là một ñường thẳng ñược chia thành 50 vạch Tùy theo ñộ phóng ñại của vật kính, các vạch này có các số ño khác nhau

2 QUY TRÌNH KỸ THUẬT

Tháo thị kính ra và ñặt thước trắc vi thị kính vào (mặt khắc vạch hướng xuống dưới) ðặt thị kính trở lại vị trí cũ

 ðặt thước trắc vi nền lên bàn kính hiển vi

 Di chuyển bàn kính sao cho 2 thước nằm chồng lên nhau, vạch 0 trên thước trắc vi thị kính trùng với vạch 0 trên thước trắc vi nền

 Nhìn phía bên phải vạch 0 của thước trắc vi nền ñể tìm ñiểm mà 1 vạch của thước trắc vi thị kính trùng với 1 vạch của thước trắc vi nền, ñiểm trùng này gọi là ñiểm Y Khoảng cách sẽ thay ñổi tùy theo các vật kính sử dụng (x10, x40, x100)

 ðếm số vạch chia trên thước trắc vi thị kính, từ số 0 ñến vạch trùng lắp (Y) ðếm số vạch chia (0,1mm) trên thước trắc vi nền từ vạch 0 ñến vạch trùng lắp (Y), Tính ñoạn ñếm ñược trên thước trắc vi thị kính theo công thức sau:

N = Số vạch ñếm ñược trên thước trắc vi nền (mm)

n = Số vạch ñếm ñược trên thước trắc vi thị kính (mm)

Ví dụ: ðo chiều dài của trứng giun kim

ðặt tiêu bản lên bàn kính, quan sát trứng với vật kính ×10, chiều dài của trứng giun kim tương ứng với 8 khoảng chia của thước trắc vi thị kính

Ta ñã có ñơn vị thị kính ở vật kính x10 là 7,5mm, chiều dài của trứng giun kim sẽ là 7,5mm x 8 = 60mm

Lưu ý:

– Mỗi ñộ phóng ñại của vật kính (x10, x40 và x100) có ñơn vị thị kính khác nhau, vì mỗi vạch của thước trắc vi nền sẽ thay ñổi kích thước trong khi vạch của thước trắc vi thị kính vẫn duy trì kích thước cũ

Vì vậy, cần phải chuẩn ñộ cho từng loại vật kính và ghi lại các ñơn vị này lên kính hoặc tờ giấy dán gần kính

ñể dễ tra cứu

– Khi muốn có số ño của KST thì chỉ cần nhân số vạch ño ñược với ñơn vị thị kính ñể có kích thước thật

– Sau khi mỗi vật kính ñã ñược chuẩn ñộ, ta không trao ñổi thị kính chứa thước trắc vi và những vật kính của kính hiển vi này với thị kính hoặc vật kính của kính hiển vi khác Phải sử dụng vật kính và thị kính

ñã ñược chuẩn ñộ

– Nên chuẩn ñộ ñịnh kỳ ñể bảo ñảm tính chính xác

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Tạo sao cần phải biết kích thước của KST?

2 Trình bày cách tính ñơn vị thị kính

3 Làm thế nào ñể ño kích thước của trứng giun ñũa?

Bài 3 THU THẬP VÀ BẢO QUẢN PHÂN

ðỂ XÉT NGHIỆM TÌM KÝ SINH TRÙNG

1 THU THẬP BỆNH PHẨM

Có nhiều phương pháp lấy bệnh phẩm, việc quyết ñịnh chọn phương pháp nào dựa vào giá trị và giới hạn của mỗi phương pháp Nếu bệnh phẩm không ñược lấy và xử lý ñúng yêu cầu kỹ thuật, chúng ta có thể không phát hiện ñược mầm bệnh

1.1 Chuẩn bị bệnh nhân trước khi lấy phân

Nhiều kết quả xét nghiệm phân là âm giả tạo do bệnh nhân không ñược hướng dẫn ñầy ñủ hay hướng dẫn không ñúng cách Phải hướng dẫn bệnh nhân một cách cẩn thận; tốt nhất là phòng thí nghiệm ñưa cho bác sĩ ñiều trị những bản in sẵn những chi tiết cần thiết ñể phát cho bệnh nhân ñược chỉ ñịnh xét nghiệm phân

Dặn bệnh nhân trong 3 ngày trước khi lấy bệnh phẩm, tránh dùng những loại thuốc và thực phẩm có thể làm cho việc nhận dạng KST khó khăn như:

– Thuốc: Bismuth, Magnesium, Kaolin, Baryte, thuốc ñặt vào hậu môn có dầu, mỡ

– Thực phẩm nhiều cặn bã: ngũ cốc, bắp cải, salad, quả có nhiều hạt nhỏ, nhiều chất béo, dầu, mỡ Bệnh nhân nên ăn chế ñộ ít chất bã như: bánh, ñồ ăn loãng, trứng, sữa, gan,…

1.2 Lấy bệnh phẩm

1.2.1 Tại phòng xét nghiệm

Tốt nhất nên lấy phân tại phòng xét nghiệm

– Lọ ñựng phân:

+ Cần phải khô và sạch, bằng nhựa trong hoặc giấy carton không thấm nước hoặc thủy tinh

+ Có miệng rộng, nắp vặn chặt

+ Có dán nhãn ñể ghi họ, tên, tuổi, ñịa chỉ của bệnh nhân và ghi ngày, giờ lấy bệnh phẩm

– Cách lấy phân:

+ Có thể lấy bất cứ chỗ nào của khuôn phân ñể tìm trứng giun, sán Nhưng ñể phát hiện ñơn bào, nên lấy phân ở chỗ bất thường như máu, nhày, lỏng, bọt hoặc lấy phân ngay trong trực tràng

+ Không ñược lấy phân lẫn với nước tiểu, dầu, các chất muối Mg, Al, Ba, Bi, Fe vì các chất ñó làm biến dạng ñơn bào

+ Nếu cho bệnh nhân uống thuốc xổ, chỉ nên cho uống sulfat natri và sẽ lấy phân khi bệnh nhân ñi ngoài lần thứ hai hay thứ ba sau khi uống thuốc

– Lượng phân cần lấy:

+ Thay ñổi tùy theo mục ñích và kỹ thuật xét nghiệm, thường chỉ cần khoảng 5 – 10 gam phân (khoảng bằng hạt lạc) ñể có thể ñủ làm nhiều phương pháp

+ Trong một số trường hợp như tìm giun, ñốt sán, các bệnh về bộ tiêu hoá phải lấy toàn bộ số lượng phân ñược thải ra ñể có thể thấy ñược KST và màng nhày hay mô bì bị tróc ra cùng với phân

1.2.2 Ngoài phòng xét nghiệm

Lấy phân ở ngoài phòng xét nghiệm là ñiều bất ñắc dĩ, cần tôn trọng những nguyên tắc sau:

– Phải gửi ñến phòng xét nghiệm trong thời gian ngắn nhất, ñặc biệt là ñơn bào, phân phải luôn ñược giữ

ấm

– Không ñược giữ ở nhiệt ñộ lạnh quá

– Nếu ở xa: giữ hộp phân trong nước ấm 37oC và ñồng thời lấy một chút phân cho vào một trong những dung dịch cố ñịnh:

+ MIF: Merthiolate Iod Formol

PVA: Polyvinyl Alcohol

F2AM: Formol + Phenol + Alcool + Xanh Methylene

1.3 Thời gian xét nghiệm phân

Sau khi thu hồi bệnh phẩm cần xét nghiệm ngay, càng sớm càng tốt Thời gian từ khi lấy mẫu ñến khi khảo sát:

– Phân bình thường cần xét nghiệm trong vòng 12 – 24 giờ hoặc có thể ñể 1 – 2 ngày trong tủ lạnh – Phân mềm, nhão, lỏng hay có màng nhày và máu cần phải xem ngay trong vòng 30 phút sau khi lấy Trong trường hợp sau khi lấy phân mà chưa xét nghiệm ngay hoặc lấy phân tại nhà ở xa, nên bảo quản phân bằng cách ñể phân trong các dung dịch ñịnh hình (fixative) ñể trứng giun, sán không phát triển, ñơn bào không bị thoái hóa

2 HÓA CHẤT BẢO QUẢN PHÂN

– ðể bảo quản hình thể và ngăn sự phát triển tiếp tục của trứng và ấu trùng giun, sán, phân ñược ñựng trong chất bảo quản ngay lập tức sau khi lấy (bệnh nhân lấy) hoặc khi phòng xét nghiệm nhận bệnh phẩm – Một số chất cố ñịnh ñược ưa dùng là: formol, sodium acetat–acetic acid–formol (SAF), dung dịch Schaudinn, polyvinyl alcohol (PVA)

– Khi chọn phương pháp cố ñịnh, phải ñảm bảo chất cố ñịnh ñược chọn phù hợp với kỹ thuật xét nghiệm

sẽ làm Vì mỗi chất cố ñịnh có tính chất riêng, không thể dùng cho tất cả các loại kỹ thuật xét nghiệm

2.1 Formol

Formol ñặc biệt thích hợp ñể cố ñịnh ấu trùng giun, sán và bào nang ñơn bào Hai nồng ñộ thường dùng

là 5% cho bào nang ñơn bào và 10% cho trứng và ấu trùng giun, sán

ðể giữ hình dạng ñơn bào ñược tốt, nên pha loãng formol với dung dịch ñệm phosphat, tạo thành formol trung hòa

Ghi chú: Formaldehyd bán thị trường thường chỉ 37 – 40% HCHO, tuy nhiên vẫn ñược xem là 100%

Bào nang ñơn bào, trứng nang của trùng bào tử, trứng giun, sán và ấu trùng ñược bảo quản lâu dài trong formol 10% Formol nóng (60OC) có thể dùng ñối với bệnh phẩm có trứng giun, sán (vì trong formol lạnh, một vài loại trứng dày sẽ tiếp tục phát triển, gây nhiễm và sống trong một thời gian dài)

Lấy vài gram phân trộn kỹ trong dung dịch formol 5 – 10%

Ưu ñiểm:

– Cố ñịnh toàn bộ phân

– Pha chế dễ, bảo quản lâu

– Cặn lắng có thể làm thử nghiệm miễn dịch