công nghệ sản xuất nước mắm lên men từ đậu nành

Hạt đ ậu nành có chứa hàm lượng chất béo cao hơn các loại đậu khác nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng.. Bảng 1.13 Thành phần hóa học của bột mì 1.2.1 Yêu cầu chung về v

Mục lục

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về nguyên liệu 3

1.1.1 Nguyên liệu đậu nành 3

1.1.1.1 Nguồn gốc cây đ ậu nành và c ấu tạo của hạt đ ậu nành 3

1.1.1.2 Tình hình s ản xuất đậu nành trên thế giới và Việt Nam 4

1.1.1.3 Kỹ thuật canh tác cây đậu nành 6

1.1.1.4 Phương pháp thu hoạch và bảo quản hạt đậu nành 8

1.1.1.5 Các hiện tượng hư hỏng của hạt đậu nành và các yếu tố ảnh hưởng đến thời gian bảo quản 9

1.1.1.6 Giá trị kinh tế của cây đậu nành 11

1.1.1.7 Giá trị dinh dưỡng của hạt đậu nành 12

1.1.2 Nguyên liệu bột mì 20

1.2 Tổng quan về sinh vật 21

1.2.1 Yêu c ầu chung về vi sinh vật trong sản xuất nước mắm 21

1.2.2 Vi sinh vật sử dụng trong sản xuất nước mắm lên men từ đậu nành 22

1.2.2.2 Đặc điểm 22

1.2.2.3 Sự phân bố trong tự nhiên 23

1.2.2.4 Tác hại 23

1.2.2.5 Lợi ích 23

1.3 Các thành phần khác trong s ản xuất nước mắm lên men từ đậu nành 24

1.3.1 Giới thiệu về nguyên liệu muối 24

1.3.2 Nước dùng để sản xuất 25

1.3.3 Phụ gia 26

1.4.3 Thời gian lên men 29

1.4.4 Ảnh hưởng của pH 29

CHƯƠNG 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Các phương pháp xác định hình thái vi khuẩn 31

2.1.1 Nhuộm Gram 31

2.1.2 Nhuộm bào tử 31

2.1.3 Nhuộm vỏ nhày 32

2.2 Các phản ứng sinh hóa xác định vi sinh vật 32

2.2.1 Thử nghiệm Catalase 32

2.2.2 Thử nghiệm khả năng sinh Indol 33

2.2.3 Thử nghiệm Metyl Red 33

2.2.4 Thử nghiệm Voges-Proskauer 34

2.2.5 Thử nghiệm Citrate 35

2.2.6 Thử nghiệm trên môi trường KIA/TSI 36

2.2.7 Thử nghiệm tính di động trên môi trường thạch mềm 37

2.2.8 Thử nghiệm Urease 37

2.3 Phương pháp phân lập giống Bacillus subtilis và xác định hoạt tính enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis 38

2.3.1 Phân lập giống 38

2.3.2 Xác định hoạt tính enzyme protease 38

2.3.3 Xác định hoạt tính enzyme amylase 40

2.4 Nhân giống 42

2.5 Giữ giống 42

2.3.1 Phương pháp cấy chuyền 43

2.3.2 Bảo quản lạnh 43

2.6 Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa sinh 43

2.6.1 Xác định độ ẩm 43

2.6.2 Phương pháp xác định đ ạm tổng số 44

2.6.5 Xác định muối NaCl 48

2.6.6 Xác định độ acid 48

2.7 Phương pháp phân tích vi sinh vật 49

2.7.1 Tổng vi sinh vật hiếu khí 49

2.7.2 Xác định tổng số Coliforms 50

2.7.3 Escherichia coli 51

2.7.4 Staphylococcus aureus 52

2.7.5 Xác định Salmonella 53

2.7.6 Shigella 54

CHƯƠNG 3 QUY TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC MẮM LÊN MEN TỪ ĐẬU NÀNH 56

3.1 Bản chất của quá trình lên men nước mắm từ đậu nành 57

3.1.1Cơ sở sinh hóa của quá trình lên men 57

3.1.2 Cơ chế của quá trình hình thành nước mắm khi lên men đậu nành 57

3.2 Các hệ enzyme tham gia vào quá trình thủy phân 58

3.3 Ưu và nhược điểm của quá trình lên men 58

3.4 Sơ đồ quy trình s ản xuất nước mắm lên men từ đ ậu nành 59

3.5 Thuyết minh quy trình 60

3.6 Các sự cố xảy ra trong quá trình lên men và phương pháp xử lý 63

3.7 Phương pháp thí nghiệm 65

3.7.1Mục đích thí nghiệm 65

3.7.2 Phương pháp thí nghiệm 65

3.8 Thiết bị dùng trong sản xuất 66

3.9 Đánh giá chất lượng sản phẩm nước mắm chay 67

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ 69

4.1 Kết quả nhuộm Gram của Bacillus subtilis 70

4.2 Kết quả nhuộm bào tử của Bacillus subtilis 70

4.3 Xác định hoạt tính enzyme protease của vi khuẩn bacillus subtilis 71

4.4 Xác định hoạt tính amylase của vi khuẩn bacillus subtilis 71

4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến ho ạt động enzyme của vi khuẩn bacillus subtilis 72

4.6 Hàm lượng acid amin (g/l) trong t ừng mẫu thí nghiệm 73

4.7 Hàm lượng ammoniac (g/l) trong từng mẫu thí nghiệm 74

4.8 Hàm lượng muối có trong nước mắm 73

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 76

LỜI MỞ ĐẦU

Nước mắm có vai trò khá quan trọng trong nền văn hóa ẩm thực của Việt Nam Nước mắm hấp dẫn mọi người nhờ hương vị thơm ngon đặc biệt của nó và có giá trị dinh dưỡng cao Thông thường người ta quan niệm nước mắm là một gia vị tạo cho bữa ăn hàng ngày được thơm ngon hơn, ngoài nó còn là một thực phẩm có chứa đ ầy

đủ các acid amin không thay thế cần thiết cho cơ thể

Đậu nành là một loại thực phẩm tự nhiên có giá trị dinh dưỡng cao Đậu nành chứa hầu hết các chất dinh dưỡng c ần thiết cho cơ thể như là: protein, glucid, một số chất khoáng và vitamin cần thiết cho cơ thể So với các loại thuộc họ đậu khác, đ ậu nành là loại có chứa hàm lượng protein cao nhất, hàm lượng protein trong một hạt đ ậu chiếm tới 38% trọng lượng của hạt đậu Các nhà khoa học đã nghiên cứu và cho biết rằng protein của đậu nành có tác dụng ngăn ngừa bệnh ung thư, bệnh tim mạch và phòng tránh được bệnh loãng xương Các nghiên cứu khoa học cũng chứng minh rằng các sản phẩm lên men từ đậu nành ta còn có rất nhiều vitamin B12 mà vitamin này có khả năng tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể, hạn chế được bệnh thiếu máu Từ đậu nành ta có thể làm ra nhiều sản phẩm bổ dưỡng như: sữa đậu nành, chao, tương, đ ậu phụng, nước tương …

Ngoài ra, từ đậu nành ta cũng có thể tạo ra sản phẩm nước mắm chứa đ ầy đủ các chất dinh dưỡng và thơm ngon Nước mắm lên men từ đậu nành là một sản phẩm rất tốt cho người tiêu dùng, đ ặt biệt phù hợp với người ăn chay, nhất là khi xu hướng

ăn chay trong cộng đồng người Việt chúng ta hiện nay ngày càng tăng

Chúng tôi chọn đề tài này với mong muốn mở rộng thêm vốn kiến thức của

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về nguyên liệu

1.1.1 Nguyên liệu đậu nành

1.1.1.1 Nguồn gốc cây đậu nành và cấu tạo của hạt đậu nành

Cây đ ậu nành có tên khoa học là Glycine Max Merril Tên tiếng Anh là soyabeans

Tên tiếng Việt là đ ậu nành (miền Nam), đậu tương (miền Bắc)

Đậu nành có nguồn gốc từ Trung Quốc (miền đông bắc) khoảng hơn ngàn năm trước công nguyên Ngày nay, đậu nành đã trở thành một loại thực phẩm thiết yếu cho các dân tộc Châu Á và trên thế giới Cây đậu nành ở Việt Nam cũng như các nước khác ở Đông Nam Á và Nam Á đều có nguồn gốc từ Đông Bắc Á, cây đ ậu nành được trồng ở Việt Nam vào kho ảng thế kỉ thứ VI

Hạt đậu nành có nhiều hình dạng khác nhau: Hình tròn, bầu dục, tròn dẹt Hạt đ ậu nành có nhiều màu sắc khác nhau, trong đó đậu nành màu vàng là loại tốt nhất, được trồng và sử dụng nhiều, giá trị thương phẩm cao

- Phôi chiếm 2% trọng lượng hạt, chứa hai lá mầm và có chức năng như cơ cấu

dự trữ thức ăn Ngoài ra, phôi còn có ba bộ phận khác: Rể mầm, trụ dưới lá mầm và trụ trên lá mầm

- Tử diệp chiếm 90% trọng lượng hạt, chứa lượng protein và dầu cao nhất trong toàn hạt

Hình 1.3 Cấu trúc của hạt đậu nành Tùy theo kích thước của hạt, ta có thề chia làm 3 loại: to (1000 hạt nặng từ 300g), trung bình (loại 1000 hạt nặng từ 150g-300g), nhỏ (1000 hạt nặng dưới 150g)

1.1.1.2 Tình hình sản xuất đậu nành trên thế giới và Việt Nam

- Tình hình sản xuất đậu nành trên thế giới

Do hạt đậu nành có giá trị dinh dưỡng cao và thời gian trồng ngắn, nên đ ậu nành trở thành cây trồng kinh tế quan trọng trên thế giới Hạt đậu nành cũng có khả năng dễ thích nghi nên nó đã được trồng ở khắp năm châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ (trên 70%), tiếp đến là châu Á

Bảng 1.1 Tình hình s ản xuất đậu nành trên thế giới từ năm 2001 đến 2005

Năm Diện tích (triệu ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (triệu tấn)

Nguồn: FAOSTAT Database, 2006

Bảng 1.2 Tình hình s ản xuất đậu nành của 4 nước đứng đầu trên thế giới trong những năm gần đây

Diện tích (triệu

ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Diện tích (triệu ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Diện tích (triệu ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

Mỹ 29,33 22,77 66,77 29,93 28,6 85,740 28,84 28,72 82,82 Braxin 18,52 28,08 52,02 21,52 23,14 49,793 22,89 21,92 50,1 Achentina 12,4 28,0 34,88 14,3 22,0 31,500 14,03 27,28 33,30 Trung 9,32 16,53 15,39 9,07 18,14 17,600 9,500 17,79 16,90 Nguồn: FAOSTAT Database, 2006

- Tình hình sản xuất đậu nành trong nước

Hiện nay, cả nước đã hình thành 6 vùng sản xuất đ ậu nành: vùng Đông Nam Bộ có diện tích lớn nhất (26,2% diện tích trồng đậu nành cả nước), miền núi Bắc Bộ 24,7%,

Diện tích trồng đậu nành ở nước ta trong năm 2005 tăng 24,16%, sản lượng tăng 19,1% so với năm 2001 nhưng đáng chú ý nhất là năng suất đậu nành tăng không đáng kể do nhiều nguyên nhân: Hạn chế về giống, điều kiện canh tác, sự xuất hiện của những lo ại bệnh gây ảnh hưởng đến tình hình s ản xuất

Bảng 1.3 Tình hình s ản xuất đậu nành ở Việt Nam từ năm 2001-2005

Nguồn: FAOSTAT Database, 2006

1.1.1.3 Kỹ thuật canh tác cây đậu nành

- Thời vụ trồng

Đậu nành được trồng quanh năm nhưng với mỗi thời vụ canh tác khác nhau sẽ ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng của cây trồng, tình hình sâu bệnh, năng suất, phẩm chất hạt, chi phí s ản xuất Với đặc tính dễ thích nghi, là cây trồng ngắn ngày (thời gian sinh trưởng từ 72 đến 90 ngày cho một vụ trồng), nên thích hợp cho việc bố trí vào các mô hình luân canh để nâng giá trị kinh tế, đồng thời hạn chế sâu bệnh Được trồng bốn vụ trong năm: Vụ Đông xuân, Xuân hè, Hè thu, Thu đông

- Mô hình canh tác

Có 2 mô hình canh tác cây đ ậu nành: Mô hình chuyên canh và mô hình luân canh

Mô hình chuyên canh: Chúng ta cày đất lúc có độ ẩm vừa phải, tránh cày đất lúc

đủ độ ẩm thích hợp Tránh làm đất quá tơi, khi gặp trời mưa đất dễ bị đóng vón, cản trở sự hút nước và chất dinh dưỡng của cây, cây sinh trưởng yếu, các nốt sần ít và nhỏ

Mô hình luân canh: Trên chân đất ruộng, tiến hành gieo hạt đậu nành sau khi thu hoạch lúa, khi đất còn độ ẩm thích hợp (có thể kết hợp phủ rơm để giữ ẩm)

- Mật độ trồng

Lượng giống sử dụng 70-80 kg/ha nếu là áp dụng tỉa Nếu sạ, lượng giống

100-120 kg/ha Mật độ trồng: Tỉa theo khoảng cách 40-10cm hay 30-20cm Mỗi lỗ 3 cây (50 cây/m2), sau đó chừa lại 2 cây/lỗ Khi gieo hạt thì gieo ở độ sâu 2,5cm Tùy thuộc vào giống, thời vụ trồng, đất canh tác, trình độ thâm canh mà có mật độ gieo trồng khác nhau

- Phương pháp gieo hạt

Trước khi gieo hạt, phơi lại hạt giống một nắng nhẹ trên nong, nia, cót, không được phơi trên nền xi măng, sân gạch khi nắng gắt Gieo hạt khi đất đủ ẩm, trước khi gieo phải bón phân, gieo hạt xong phải lấp một lớp đất tơi xốp dày 2-3cm Đối với đậu nành trên đất 2 vụ lúa: trước khi gieo hạt phải cho nước vào để đất đủ độ ẩm, sau trút sạch nước mặt, vạch thành hàng cách nhau 25-30cm để gieo, trên cùng một hàng gieo cách nhau 7-8cm/hạt, lấp hạt bằng đ ất trộn NPK hoặc là phân chuồ ng ho ại mục

- Vấn đề bón phân cho đậu nành

Cùng thuộc nhóm cây họ đậu, đậu nành có khả năng cố định đạm, khả năng này là

nhờ vi khuẩn Rhizobium jabonicum (còn gọi là vi khuẩn cố định đạm) Vi khuẩn này

sống trong điều kiện đất không bị ngập và đất phải thoáng khí, giúp tạo nốt sần trong

rễ cây họ đậu Nhờ hút chất đạm từ không khí, khi nốt sần trưởng thành nó sẽ cung

- Chăm sóc cây

Khi cây được 1-2 lá thật, tiến hành tỉa dặm để đảm bảo mật độ cây trồng trên ruộng Kết hợp với các lần bón phân, làm cỏ và vun gốc đ ậu Có thể làm cỏ bằng tay, hoặc nếu sử dụng thuốc diệt cỏ thì phải xử lý trước khi gieo đậu 1-2 ngày

Đậu nành là cây trồng cạn nhưng kém chịu hạn Nhu cầu nước của cây đậu nành lớn nhất vào thời kỳ ra hoa kết quả, nên thời kỳ này cần tưới đủ ẩm cho cây Nếu thời

kỳ này mà bị thiếu nước sẽ giảm năng suất Đậu nành khi gieo cần độ ẩm 50% mới mọc được tốt Cần tránh đất bị ngập ngúng và đóng vón

1.1.1.4 Phương pháp thu hoạch và bảo quản hạt đậu nành

- Phương pháp thu hoạch hạt đậu nành

Cần xác định độ chín trước khi thu hoạch Thời kỳ chín sinh lý là 50% số lá trên cây đã chuyển sang màu vàng Thời điểm thích hợp nhất để thu hoạch hạt đậu nành là khi cây đạt đến thời kỳ chín hoàn toàn, là khi hầu hết tất cả các lá trên cây đã chuyển sang màu vàng, rụng, kho ảng 95% số trái trên cây chuyển sang màu nâu xám Khi thu hoạch, chúng ta c ắt ngang cây về phơi khô đ ập lấy hạt Nên thu hoạch vào lúc nắng ráo, phơi khô và đập ngay, hoặc đập sau khi ủ 1-2 ngày; sàng sẩy loại bỏ rác, tạp chất, hạt xanh non, hạt nhỏ, phơi hạt đến khi khô giòn Tuyệt đối không được phơi hạt trên sân gạch, không được phơi quá nắng

Chọn ngày nắng ráo, cây thu hoạch về cắt bỏ rễ, lá rồi đem phơi 1 nắng, buổi chiều xếp dựng đứng trong nhà, không được xếp đống, gây hấp hơi bốc nóng, gây mốc hỏng hạt giống Tiến hành ủ 2-3 ngày đêm để cho quả chin đều, hạt vàng không nứt Khi gặp nắng gắt cần tranh thủ phơi ngay, bỏ qua giai đoạn ủ để tránh khi trời mưa, không khí ẩm sẽ làm mốc hạt Đem phơi thêm 1 nắng, đập lấy hạt đợt 1, phơi khô, chọn lọc làm hạt giống Số quả còn trên cây, đem ủ đống thêm 1-2 ngày cho hạt chín tiếp, sau đó đem phơi 1 nắng và thu ho ạch đợt cuối cùng dùng làm đ ậu thương

Hạt sau khi đ ược tách ra khỏi vỏ, sau đó cần tiến hành phơi khô Phơi khô: Sấy bằng hệ thống làm khô với độ ẩm không khí tự nhiên và nhiệt độ 35- 400C Trong quá trình sấy luôn kiểm tra độ ẩm và nhiệt độ hàng giờ Khi hạt đậu nành đ ạt tới độ

ẩm 10% thì dừng lại và đưa hạt vào làm sạch cơ bản Hệ thống làm sạch cơ bản gồm

3 bộ phận cơ bản: Sàng những hạt tốt lọt qua sàng, những vật to ở trên sàng được loại bỏ Phân loại hạt, những hạt to đầu, đẹp ở trên sàng, những hạt nhỏ lọt qua lỗ được loại bỏ Sau khi làm sạch cơ bản, hạt giống được đưa vào đóng gói theo quy định của cấp giống và cho vào kho bảo quản

- Phương pháp bảo quản hạt đậu nành

Hạt đậu nành dễ bị mất sức nảy mầm so với lúa, bắp… Hạt bị mất sức nảy mầm,

vỏ hạt và tử diệp chuyển sang màu sậm Độ bóng của vỏ hạt giảm, hạt dễ bị mốc Thời hạn cho phép bảo quản phụ thuộc vào đặc tính giống, công nghệ trước thu hoạch, nhiệt độ và độ ẩm không khí lúc bảo quản Trong đó, nhiệt độ và độ ẩm không khí là yếu tố quan trong nhất

Giảm càng thấp độ ẩm, càng tăng thêm thời gian bảo quản Phơi càng khô, bảo quản càng lâu hơn Độ ẩm của hạt khi đưa vào bảo quản là khoảng 12% Hạt đậu nành không những phải phơi thật khô mà còn phải được bảo quản trong điều kiện thật khô ráo, có độ ẩm không khí càng thấp càng tốt

1.1.1.5 Các hiện tượng hư hỏng của hạt đậu nành và các yếu tố ả nh hưởng đến thời gian bảo quản

Nguyên nhân gây hư hỏng và làm giảm chất lượng đậu nành

- Trong quá trình thu hoạch có sử dụng cơ giới hóa làm cho hạt đậu bị xây xát

vỏ, vỡ nát làm giảm trọng lượng hạt

- Do nấm mốc, vi sinh vật gây hại làm cho hạt bị biến chất, giảm sút chất lượng

- Đậu nành lại là nguồn thức ăn rất tốt cho vi sinh vật và côn trùng phá hoại mạnh, rất dễ bị mốc, oxy hoá, lượng axit béo tăng lên, phẩm chất c ủa đậu nành giảm

xuống

- Nếu thuỷ phần của hạt 15 - 16% và bảo quản trong điều kiện nhiệt độ cao sẽ rất

dễ dẫn đến hiện tượng tự bốc nóng

- Nếu trong khối hạt lẫn nhiều tạp chất ho ặc sâu hại nước nghiêm trọng thì khả

năng biến chất của hạt tương đối lớn

- Khối lượng chất khô có thể bị tiêu hao do quá trình hô hấp của hạt hay do các

vi sinh vật ăn mất, thủy phần phần lớn bị giảm do quá trình thoát hơi nước tự nhiên

- Trong quá trình bảo quản nếu xảy ra các biến đổi sinh hóa bất lợi sẽ làm thay

đổi thành phần dinh dưỡng và một số sinh vật gây hại sinh ra độc tố

Các yếu tố ảnh hưởng đến thời gian bảo quản đậu nành

- Hạt đ ậu nành dễ bị mất sức nẩy mầm so với lúa, bắp, cao lương,…Hạt bị mất sức nẩy mầm, vỏ hạt và tử diệp chuyển sang màu s ậm Độ bóng của vỏ hạt giảm, hạt

dễ bị mốc

- Thời hạn cho phép bảo quản phụ thuộc vào đặc tính giống, công nghệ trước thu hoạch, nhiệt độ và ẩm độ không khí lúc bảo quản Trong đó, nhiệt độ và ẩm độ không khí là yếu tố quan trọng

- Giảm càng thấp ẩm độ, càng tăng thêm thời gian bảo quản Phơi càng khô, bảo quản càng được lâu hơn

- Hạt đã được phơi thật khô, nhưng nếu bảo quản trong điều kiện ẩm (ẩm độ trong không khí cao), hạt đậu nành sẽ hút ẩm trở lại Trong trường hợp này, hạt sẽ bị mất sức nẩy mầm nhanh chóng Do đó hạt đậu nành, không những phải phơi thật khô,

mà còn phải được bảo quản trong điều kiện thật khô ráo, có ẩm độ không khí càng thấp càng tốt

- Giảm càng thấp ẩm độ, càng tăng thêm thời gian bảo quản

- Phương pháp bảo quản: phương pháp cổ truyền (bảo quản được từ 3 – 7

- Kho ảng nhiệt độ: Cứ gia tăng 50C nhiệt độ của môi trường, sẽ giảm phân nửa thời gian bảo quản

- Kho ảng ẩm độ: Cứ gia tăng 1% ẩm độ, sẽ giảm phân nửa thời gian bảo quản

1.1.1.6 Giá trị kinh tế của cây đậu nành

Cây đậu nành được mệnh danh là “Ông Hoàng trong các loại cây họ đậu”, khó có thể tìm thấy một cây trồng nào có giá trị kinh tế cao như cây đậu nành

- Giá trị về mặt thực phẩm:

Hạt đậu nành có thành phần dinh dưỡng cao Protein của đậu nành có phẩm chất tốt nhất trong số các lo ại protein có nguồn gốc từ thực vật Hạt đ ậu nành có chứa hàm lượng chất béo cao hơn các loại đậu khác nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng Dùng dầu đậu nành thay cho mỡ động vật có thể tránh được xơ mỡ động mạch Đậu nành còn là vị thuốc để chữa bệnh, đ ặt biệt đậu nành đen có tác dụng tốt cho tim, gan, thận, dạ dày và ruột Đậu nành là thức ăn rất tốt cho người bệnh tiểu đường, thấp khớp, thần kinh suy nhược và suy dinh dưỡng

- Giá trị về mặt công nghiệp

Đậu nành là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu Hiện nay trên thế giới cây đ ậu nành là cây đứng đ ầu về cung nguyên liệu cho ngành ép dầu, dầu đậu nành chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật Đặc điểm của dầu đậu nành là khô chậm, chỉ số iot cao (120-127), ngưng tụ ở nhiệt độ -15 đến -180C Từ dầu đ ậu nành người ta có thể chế ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp khác như: làm nến, xà phòng v.v…

quả, hạt) có hàm lượng khá cao nên các s ản phẩm phụ như thân lá tươi có thể làm thức ăn gia súc, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp cho gia súc Các sản phẩm phụ như khô dầu có thành phần dinh dưỡng NPK khá cao vì thế làm thức ăn gia súc rất tốt Cải tạo đất: Đậu nành là cây trồng luân canh cải tạo đ ất rất tốt do cây đậu nành có khả năng cố định đ ạm 1ha trồng đ ậu nành nếu sinh trưởng tốt, để lại trong đất từ 30-

60 kg N Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đ ậu nành vào cơ cấu cây trồng hợp

lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí bón N Thân, lá của cây đậu nành dùng để bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N chiếm khoảng 19%

1.1.1.7 Giá trị dinh dưỡng của hạt đậu nành

So với thịt động vật, đậu nành có nhiều chất dinh dưỡng hơn Trong 100g đ ậu nành: 450Kcal, 34g đạm, 18g béo, 165mg calcium, 11mg s ắt Trong khi đó thịt bò loại ngon chỉ có: 165 Kcal, 21g đạm, 9g béo, 10mg calcium, 3mg sắt Đạm đ ậu nành

có thể thay thế cho đạm động vật vì không có cholesterol Đậu nành cũng có nhiều calcium hơn sữa bò, nhiều lecithin hơn trứng Các amino acid cần thiết cho cơ thể thì đều có trong đậu nành Với trè em, chất đạm của đậu nành là món ăn quý giá giúp các

em bổ sung chất dinh dưỡng đầy đủ, nhất là đối với trẻ em dị ứng sữa bò

Đậu nành là thức ăn đầy đủ chất dinh dưỡng, lại dễ tiêu hóa, có giá trị dinh dưỡng như sữa bò, giúp phát triển và tái tạo màng tế bào kể cả tế bào thần kinh, chống loãng xương, là thức ăn tốt nhất cho trẻ em bị còi xương và suy dinh dưỡng

Trong số các loại đ ậu, đậu nành là loại đ ặc biệt có khả năng ngăn ngừa và phát triển bệnh ung thư Để trao đổi và kết thúc những khám phá mới về đ ậu nành trong lĩnh vực y khoa phòng ngừa và chữa trị bệnh ung thư, National Cancer Institute ở Washington DC đã tổ chức hội nghị khoa học vào ngày 27 tháng 6 năm 1990, quy tụ hầu hết các nhà khoa học cùa các viện nghiên cứu và các giáo sư c ủa các trường đại

ung thƣ, họ đã xác định đƣợc năm chất có đặc tính chống lại mầm ung thƣ có trong đậu nành: protease inhibitors, phytate, phytosterols, saponins, isoflavones Đ ặc biệt trong đó là hợp chất isoflavones có công thức hóa học gần giống nhƣ kích thích tố nữ estrogen, vì thế nó đƣợc mệnh danh là estrogen thảo mộc (phytoestrogen) và đƣợc nghiên cứu về công dụng đối với cơ thể

Đậu nành còn có một số tác dụng dƣợc lý khác nhƣ: bảo vệ gan, làm giảm cholesterol trong máu (FDA đã cho phép ghi trên nhãn các sản phẩm đậu nành là: có lợi cho sức khỏe & giảm nguy cơ bệnh vành tim.), chống oxy hóa

Bảng 1.4 Thành phần dinh dƣỡng trong 100g đậu nành của các loại hạt khác nhau

Loại hạt Kcal Protein(g) Lipid(g) Glucoside(g) Xơ(g)

Protein (%) lipid(%) Cacbohydrat (%) Tro (% )

Thành phần hóa học của hạt đậu nành:

- Protein và thành phần acid amin

Protein là chất quan trọng nhất trong thành phần hóa học của hạt đ ậu nành Protein đậu nành chứa đầy đủ các amino acid cần thiết cho cơ thể Hàm lượng protein trong đậu nành rất cao, dao động từ 29,6-50,5%, trung bình là từ 36-40% Trong khi đó hàm lượng protein của gạo chỉ có 6,2-12%, ngô: 9,8-13,2%, thịt bò: 21%, cá: 17-20%, thịt gà: 20%, thịt heo: 19%, trứng: 13-15%

Protein đậu nành là loại dễ tiêu hóa, phần lớn các thức ăn từ đậu nành rất dễ tiêu hóa Protein đậu nành bổ dưỡng tương đương thịt nhưng có ưu điểm là không sinh độc tố cho cơ thể Thịt động vật chứa nuleo-abuminnoid, chất này có chứa bazơ xanthic có nhân puric t ạo ra những chất độc, trong khi đậu nành chứa para-nuleo-abuminnoid không có chứa bazo xanthic nên không gây độc

Trong protein đậu nành có thành phần lysine và globulin cao, trong khi các loại nông sản khác thì lại thiếu Globulin chiếm đến 85-95% còn lysine chiếm 16%, hơn hẳn gạo (3%), cá (<2%), mà lysine là một amino acid quan trọng cần thiết cho quá trình phát triển của trẻ em

Thành phần acid amin trong protein của đ ậu nành còn có methyonine và tryptophane, ngoài ra còn có các acid amin khác với số lượng khá cao tương đương lượng amino acid có trong thịt

Trong chế độ ăn hàng ngày, nếu dùng 6g đậu nành thì không cần bổ sung thêm methionin, lượng methionin có trong đ ậu nành là 500mg/kg

Bảng 1.6 Thành phần acid amin trong hạt đậu nành

Bảng 1.7 So sánh hàm lƣợng acid amin (%) của đậu nành với các protein khác nhau

- Lipid

Đậu nành chứa hàm lƣợng lipid cao hơn các loại đậu khác (16-20% trọng lƣợng khô của hạt) nên đƣợc xem là loại cây cung cấp dầu thảo mộc Lipid của đậu nành có khoảng 85% là acid béo không no, trong đó 8-9% acid linoleic, acid này là 1 loại acid béo có 3 nối đôi, acid này đƣợc xem là một acid béo có lợi không những về mặt tiêu hóa nhƣ các acid béo không no khác mà nó còn có trách nhiệm chuyển hóa cholesterol làm gi ảm nguy cơ bệnh tim mạch Lipid của đ ậu nành có mùi vị thơm ngon, chúng ta nên sử dụng dầu đ ậu nành thay cho mỡ động vật sẽ tốt cho sức khỏe Bảng 1.8 Thành phần acid béo trong đ ậu nành

Bảng 1.9 Thành phần carbohydrate trong đ ậu nành

Bảng 1.10 Thành phần khoáng trong đậu nành

Lưu ý: Ngoài những thành phần dinh dưỡng kể trên, trong đậu nành còn chứa chất

kháng enzyme tiêu hóa trypsin, chất sinh bướu giáp, chất ngưng kết hồ ng huyết cầu, chất kháng vitamin Các chất này dễ bị phân hủy bởi nhiệt, nên cần đun sôi trước khi làm thức ăn

Bảng 1.11 Thành phần vitamin trong đậu nành

Bảng 1.12 Bảng so sánh thành phần dinh dưỡng trong đ ậu nành với sữa bò và sữa mẹ Thành phần trong

Trong bột mì, glucid chiếm tỷ lệ cao nhất và là thành phần chủ yếu cấu tạo nên lớp

vỏ hạt, nội nhũ Trong tinh c ủa gạo mì có một lượng glucose (0,1-0,37%) và các loại đường khác (1-3,7%), các loại đường này rất quan trọng đối với quá trình lên men Lipid của bột mì có 2 loại no và không no Thành lipid là nguyên nhân làm cho bột mì bị ôi chua khi gặp nhiệt độ và độ ẩm cao

Ngoài ra, trong bột mì còn có một số enzyme như: amylase, protease, lipase, men oxi hóa khử và một số vitamin như: B1, B2, PP, Ca và một lượng nhỏ vitamin A và E Bảng 1.13 Thành phần hóa học của bột mì

1.2.1 Yêu cầu chung về vi sinh vật trong s ản xuất nước mắm

Muốn đưa nước mắm vào sản xuất công nghiệp, trước tiên ta phải có giống thuần khiết vì nó quyết định đến hương vị, hiệu suất sử dụng nguyên liệu và phẩm chất sản phẩm và là điều kiện cơ bản để ổn định sản xuất, không gây hư hỏng trong s ản xuất Giống đưa vào s ản xuất phải có điều kiện sau:

- Hoạt lực của protease cao

- Sức phát triển mạnh và chống tạp khuẩn tốt

- Không sinh độc tố

- Ảnh hưởng tốt đối với hương thơm

- Có khả năng sử dụng được nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm như các phụ phẩm…

1.2.2 Vi sinh vật sử dụng trong sản xuất nước mắm lên men từ đậu nành

Vi sinh vật sử dụng trong s ản xuất nước mắm lên men từ đậu nành là vi khuẩn

Khi gặp điều kiện không thuận lợi của môi trường sống, tế bào sẽ hình bào tử Kích thước của tế bào không lớn hơn kích thước tế bào nên vi khuẩn giữ nguyên hình dạng khi hình thành bào tử Bào tử khó nhuộm màu hơn, bền hơn đối với nhiệt và các yếu tố phá hủy khác Bào tử có chứa acid dipicolinic (5-10% so với chất khô), được bao bọc bởi vỏ trong c ấu tạo từ glycan peptid và vỏ ngoài

Bào tử, khuẩn lạc có màu kem hoặc nâu, có nhiều nếp nhăn, khi phát triển trên môi trường lỏng thì dính liền nhau như một lớp màng mỏng

Bacillus subtilis thường là không sinh độc tính, nhưng có khả năng sản sinh ra chất

kháng sinh để tiêu diệt những vi khuẩn khác

1.2.2.3 Sự phân b ố trong tự nhiên

Bacillus subtilis có mặt khắp nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm và cỏ

khô nên còn có tên gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, chúng còn phân bố rộng rãi trên bề

mặt các loại hạt và các sản phẩm chế biến từ hạt Trong bột mì, Bacillus subtilis

chiếm khoảng 75-95% số vi khuẩn tạo bào tử

Bacillus subtilis cũng hiện diện trong rễ cây, nơi tiếp xúc giữa rễ và môi trường

đất xung quanh Những rễ cây và sự liên kết sinh học có thể làm ảnh hưởng lớn đến hóa học của đất và tạo ra môi trường độc cho đất

Người ta nhận thấy rằng nhóm vi khuẩn Bacillus subtilis có mặt ở khắp nơi và

dường như có thể đóng vai trò đáng kể (có lợi cũng như có hại) trong quá trình biến đổi sinh học từ các nguyên liệu dùng để sản xuất như bột mì, bột gạo, … đến các sản phẩm thực phẩm truyền thống như tương, chao, cơm mẻ …

1.2.2.4 Tác hại

Do bào tử Bacillus subtilis có thể phát triển ở những nhiệt độ, pH và nồng độ muối

cao nên có thể gây hư hỏng thực phẩm

Đồ hộp nếu bị nhiễm Bacillus subtilis sẽ có mùi vị thối chua rất khó chịu, không

tạo gas hoặc có thể tạo gas trong môi trường có đường

Năm 1885, Laurent phát hiện Bacillus subtilis phát triển trên khoai tây và bánh mì,

làm cho sản phẩm bị chảy nhớt Chúng cũng là thủ phạm gây hư hỏng các sản phẩm sữa, bánh ngọt, kẹo có nhân nhất là khi bảo quản các sản phẩm ở nhiệt độ nóng

1.2.2.5 Lợi ích

- Tạo kháng sinh

Bacillus subtilis có thể sản sinh ra nhiều loại kháng sinh có ích đối với nhiều loại

- Sinh tổng hợp enzyme

Amylase: amylase là hệ enzyme phổ biến trong giới vi sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân xúc tác sự thủy phân các lien kết nội phân tử trong

polysaccharit với sự tham gia c ủa nước Bacillus subtilis có khả năng tạo một lượng

lớn α-amylase ngoại bào, phân giải tinh bột nhanh gấp 2,5 lần so với α-amylase c ủa

nấm mốc α-amylase của Bacillus subtilis tác dụng lên amilose tạo ra các dextrin có

mạch dài khoảng 6-8 gốc gluose, s ản phẩm cuối cùng của sự thủy phân bởi amylase là glucose và mantose đến 70-75% pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường

hóa c ủa enzyme α-amylase Bacillus subtilis là 5,6-6,2

Protease: Các enzyme protease xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid

hoặc protein Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp protease ngoại bào phân giải

protein và các cơ chất cao phân tử khác có rong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật có thể dễ dàng hấp thụ

Cellulase: Được tổng hợp từ nhiều chủng vi sinh vật khác nhau Người ta đã nhận thấy khả năng phân giải xellulose của một số động vật ăn cỏ là do trong da dày chúng

có chứa một số loại vi khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase Ngoài nhóm vi khuẩn trong da dày của động vật ăn cỏ, còn có nhiều loài vi sinh vật trong đ ất, nước,

không khí, cây cỏ, thực vât chết, phân động vật Trong nhóm vi khuẩn thì có Bacillus subtilis, Acetobacter xylinum,…

1.3 Các thành phần khác trong sản xuất nước mắm lên men từ đậu nành

1.3.1 Giới thiệu về nguyên liệu muối

Muối trong tự nhiên gồm có mỏ, muối giếng, muối ở đáy hồ nước mặn và muối biển Tùy theo phẩm chất và công dụng của mỗi loại muối người ta chia ra: muối ăn – muối công nghiệp – muối làm phân Muối dùng để sản xuất nước mắm là muối ăn Muối là nguyên liệu không thể thiếu trong quá trình sản xuất nước chấm, thiếu

là NaCl, ngo ài ra còn có các t ạp chất như canxi, magie…, tỷ lệ của muối NaCl và các tạp chất tùy thuộc vào từng loại muối mà người ta muốn sản xuất Muối sử dụng trong sản xuất nước chấm có chất lượng càng tốt sẽ giúp cho nước chấm càng thơm ngon Yêu c ầu của muối trong sản xuất nước chấm phải là muối ăn ( NaCl ), có độ tinh khiết cao Tốt nhất là muối kết tinh hạt nhỏ, có độ rắn cao, màu tr ắng óng ánh, không đóng thành cục, không có vị đắng chát

Nồng độ muối thấp có tác dụng thúc đẩy quá trình thủy phân prontein nhanh hơn

và tạo thành acid amin nhiều hơn Nồng độ muối có tác dụng ức chế, làm mất hoạt tính c ủa enzyme, quá trình thủy phân bị chậm lại, thời gian thủy phân kéo dài Nồng

độ muối ảnh hưởng mạnh mẽ đến vi sinh vật Nồng độ muối cao sẽ ức chế vi sinh vật phát triển Còn nồng độ muối thấp thì mốc dễ dàng phát triển cùng với một số vi khuẩn gây thối phát triển và làm hư hỏng sản phẩm Thường lượng muối cho vào quá trình lên men kho ảng 20 – 25% so với lượng nước

Bảng 1.14 Thành phần hóa học của muối

Loại muối % NaCl % Nước % Chất không

không được quá 500 – 600 mg/l Lượng vi sinh vật không được quá 20 – 100 con/ml nước Đặt biệt không có vi sinh vật gây bệnh

1.3.3 Phụ gia

- Nước màu

Nước màu có tác dụng làm cho nước mắm được dịu ngọt, màu vàng đẹp Cách làm nước màu: nấu đường đến độ ngả màu cánh gián, thử vào nước lã thấy vón cục là được, dùng vải lọc để lọc lấy nước màu và phối chế vào nước mắm

- Quả thơm

Dùng quả thơm chín cho vào quá trình ủ nước mắm để cho nước mắm sau này có hương thơm

Bảng 1.15 Chỉ tiêu c ủa nước sử dụng trong thực phẩm

Các chỉ tiêu Tiêu chuẩn

Các chỉ tiêu lý và hóa học

Hàm lượng thuốc trừ sâu phân hữu cơ 0,01 mg/l

Chỉ tiêu vi sinh vật

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

Lên men là dùng enzyme của vi khuẩn để thủy phân protein trong đậu nành và tinh bột trong gạo nếp thành nước mắm Điều khác biệt giữa sự lên men và thối rữa là sau khi lên men xong không sinh ra mùi thối Lên men cũng là một giai đoạn quan trọng, nếu xử lý nguyên liệu tốt, nuôi vi khuẩn đúng kỹ thuật mà lên men không đảm bảo thì nước mắm vẫn không đạt yêu cầu, hiệu suất không cao Ba yếu tố ảnh hưởng quan

1.4.1 Lượng nước cho vào trong quá trình lên men

Lượng nước cho vào trong quá trình thủy phân phải phù hợp thì quá trình thủy phân sẽ xảy ra nhanh hơn Theo kinh nghiệm của các xí nghiệp sản xuất nước chấm cho thấy lượng nước cho vào quá trình thủy phân tốt nhất là 30 – 40 % so với nguyên liệu, khi cho nước vào nên cho 5 – 10 % muối NaCl và duy trì ở nhiệt độ thủy phân thích hợp trong suốt thời gian lên men Để tính lượng nước cần thiết cho quá trình thủy phân, ta s ử dụng công thức sau:

W = (A*B) – C Trong đó:

W: Lượng nước cần cho vào A: Khối lượng vi khuẩn không nước B: % khối lượng nước trộn vào C: Hàm lượng nước của vi khuẩn Ảnh hưởng của nước đến tốc độ của các quá trình thủy phân trong sản phẩm nước mắm được quyết định bởi các yếu tố sau:

- Sự phân bố của các chất tham gia phản ứng ở trong sản phẩm

- Độ linh động của cơ chất do trạng thái tập hợp và cấu trúc sản phẩm quyết định

- Hoạt độ nước

1.4.2 Nhiệt độ khi lên men

Nhiệt độ lên men hết sức quan trọng vì nó tạo điều kiện cho enzyme của vi khuẩn xúc tác cho các quá trình thủy phân protein và tinh bột thành đường, các amino acid, Nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật Mỗi loại vi sinh vật thích ứng với một nhiệt độ nhất định Do đó ta cần tạo một điều kiện tối ưu cho vi

Trong quá trình chế biến, khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng của các enzyme

sẽ tăng Nếu nhiệt độ tăng cao quá thì sẽ ức chế sự ho ạt động của enzyme và quá trình thủy phân sẽ giảm, đồng thời làm cho s ản phẩm có mùi khét, đ ắng Nếu nhiệt độ thấp

sẽ kéo dài thời gian lên men, s ản phẩm có màu nhạt và năng suất sản phẩm không cao Nhiệt độ thích hợp cho các enzyme của vi khuẩn hoạt động là khoảng từ 37-500C

1.4.3 Thời gian lên men

Tùy theo lượng nước trộn vào và điều kiện nhiệt độ khi lên men mà thời gian lên men dài hay ngắn Chúng ta cũng có thể căn cứ vào sự tăng giảm của N formol để quyết thời gian lên men

Sau khi thủy phân xong, căn cứ vào hàm lượng nước trong dịch thủy phân để tính hàm lượng muối và nước muối bổ sung vào cho đạt nồng độ quy định và số lượng nước chấm cần thiết lấy ra

1.4.4 Ảnh hưởng của pH

Mỗi hệ enzyme có pH tối thiểu khác nhau Vì vậy phải xem loại enzyme nào nhiều nhất và đóng vai trò chủ yếu nhất trong quá trình s ản xuất nước chấm, ta phải tạo độ

pH thích hợp cho enzyme đó ho ạt động

Qua thực nghiệm cho thấy, pH = 4 – 5 thích hợp cho quá trình lên men Đồng thời,

ở pH này còn có tác dụng ức chế vi khuẩn gây thối phát triển

CHƯƠNG 2

CÁC PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Các phương pháp xác định hình thái vi khuẩn

Cách tiến hành :

- Làm tiêu bản : Dùng que cấy lấy nước cất vô trùng làm vết bôi lên phiến kính (lấy một ít khuẩn lạc làm vết bôi) Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định trên ngọn lửa đèn cồn

- Nhuộm tiêu bản : Nhuộm tím kết tinh lên vết bôi để yên trong 1 phút Sau

đó rửa nước và thấm khô  nhuộm lugol trong 1 phút Sau đó rửa nước và thấm khô

 rửa vết bôi bằng cồn 96 trong 30 giây, rửa nước thấm khô  nhuộm với Fucshin trong 30 giây, rửa nước thấm khô vết bôi  quan sát dưới kính hiển vi ổ vật kính 100x

Đọc kết quả : Tế bào bắt màu hồng (Gram âm) Tế bào bắt mảu tím (Gram dương)

2.1.2 Nhuộm bào tử

Sự hình thành bào tử là một hình thức đổi mới tế bào khi gặp những điều kiện bất lợi trong chu trình sống (nhiệt độ, áp suất, pH…).Nguyên tắc nhuộm dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipid) Trước hết xử lý

Phương pháp nhuộm như sau: Làm vết bôi và cố định vết bôi tương tự như phương pháp nhuộm Gram đã trình bày ở trên Sau đó nhuộm vết bôi bằng malachite trong vòng 10 phút, r ửa nước và thấm khô  nhuộm vết bôi bằng Fucshin trong 30 giây, rửa nước thấm khô  quan sát dưới kính hiển vi

Đọc kết quả : Tế bào bắt màu hồng còn bào tử bắt màu xanh lục

2.1.3 Nhuộm vỏ nhày

Các bước tiến hành như sau :

- Nhỏ vài giọt dung dịch tím kết tinh lên phiến kính

- Lấy một ít khuẩn lạc trộn đều tím kết tính đã có sẵn trên phiến kính, dàn đều vết bôi, nhuộm trong vòng 5 – 7 phút  rửa vết bôi bằng dung dịch CuSO4 20%, rửa nước thấm khô  quan sát dưới kính hiển vi

Đọc kết quả: Tế bào có màu sẫm còn vỏ nhày có màu nhạt ở xung quanh

2.2 Các phản ứng sinh hóa xác định vi sinh vật

Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí, thử nghiệm (-) là không có hiện tượng sủi bọt

2.2.2 Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Nguyên tắc: Phát hiện khả năng của vi khuẩn có thể tạo Indol trong môi trường trypton Các hợp chất trung gian trong quá trình thủy giải tryptophan là acid indolpyruvic, từ đó indol được hình thành thông qua quá trình khử amin, hình thành skatol (metyl indol) là quá trình khử carboxyl cùa acid indol acetic Enzyme tryptophan xúc tác phản ứng khử amin của tryptophan và tách nhân thơm ra khỏi phân

tử tryptophan hình thành indol Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng giữa phân từ này với thuốc thử chứa p-dimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB) Nhân pyrrol của indol chứa nhóm –CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của p-DMAB tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ

Cơ sở sinh hóa của thử nghiệm như sau: Tryptophan là một aminoacid có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase t ạo ra sản phẩm chứa gốc indol

Phương pháp tiến hành: Vi sinh vật thử nghiệm được nuôi trong môi trường canh trypton trong kho ảng 24 - 48 giờ, sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s hoặc thuốc thử Erhlich, quan sát màu vài phút

Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ cánh sen Thử nghiệm (-) khi trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng đỏ

2.2.3 Thử nghiệm Metyl Red

Nguyên tắc: Nhằm xác định khả năng c ủa vi sinh vật sản xuất và duy trì các s ản phẩm acid bên trong môi trường trong quá trình lên men glucose Cơ sở sinh hóa :thử nghiệm Metyl red dựa trên cơ sở sử dụng chất chỉ thị pH là metyl red để nhận biết

tạo acid trong môi trường khi chúng bắt đ ầu phát triển Đối với các vi sinh vật cho phản ứng Metyl red âm tính thì ngay ban đầu một lượng acid hình thành trong môi trường nhưng kéo dài thời gian nuôi cấy  chuyển hóa các sản phẩm acid này thành acetoin do đó làm pH môi trường trung tính

Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường MRPV, ủ trong khoảng 2 – 5 ngày, sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử metyl red được pha theo tỷ lệ 0.1g trong 300ml cồn và cho vào nước định mức 500ml

Đọc kết quả : thử nghiệm (+) khi môi trường chuyển sang màu đỏ Thử nghiệm (-) khi môi trường không đổi màu

Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường MRPV ủ ở nhiệt độ

370C trong 2 – 5 ngày, sau đó nhỏ 2 giọt KOH 40% và 6 giọt α-naphtol rồi quan sát

sự xuất hiện màu

Đọc kết quả : thử nghiệm (+) khi xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường Thử nghiệm (-) khi môi trường không đổi màu

2.2.5 Thử nghiệm Citrate

Nguyên tắc: Nhằm xác định vi si sinh vật sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất

Cơ sở sinh hóa: Năng lượng cung cấp cho vi sinh vật khi trong môi trường không

có nguồn nguyên liệu để sử dụng cho quá trình lên men hay tạo các sản phẩm lactic bằng cách sử dụng nguồn carbon duy nhất là citrate

Bước đầu tiên vi sinh vật tách citrate thành oxaloacetate và acetate, đây là hai s ản phẩm trung gian cho quá trình đồng hóa citrate, còn s ản phẩm nhận được của quá trình này phụ thuộc vào pH của môi trường Nếu pH kiềm thì trong môi trường sẽ nhận được nhiều acetate và fomate, nếu pH acid thì sản phẩm tạo ra là lactatte, acetoin Như vậy sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường Mặt khác các vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất thì có khả năng sử dụng muối amonium như là nguồn đạm duy nhất  sinh ra NH3 làm kiềm hóa môi trường

Trong môi trường thử nghiệm khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất có chứa đạm ở dạng muối amonium sẽ làm tăng pH của môi trường thể hiện qua

sự đổi màu c ủa chỉ thị pH trong môi trường

Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng trong thử nghiệm là Simmon citrate agar hay môi trường lỏng Koser Cấy vi sinh vật lên môi trường thạch nghiêng Simmon citrate agar và ủ ở 370C trong 24 giờ lấy ra quán sát

Đọc kết quả: Thử nghiệm (+) khi môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang

2.2.6 Thử nghiệm trên môi trường KIA/TSI

Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng các nguồn carbonhydrat có mặt trong môi trường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh gas

Cơ sở sinh hóa: Môi trường KIA là môi trường rắn chứa lactose 1%, glucose 1%, TSI tương tự nhưng chứa thêm sucrose 1% Có 3 trường hợp xảy ra khi nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường KIA :

- Chỉ lên men glucose, lên men c ả hai loại đường và không lên men cả hai

nguồn trên Nếu vi sinh vật chỉ sử dụng glucose sau 24 giờ nuôi cấy làm phần nghiêng

có pH kiềm vì sau khi sử dụng hết lượng glucose thì vi sinh vật sử dụng pepton trong môi trường làm giải phóng NH3 nên môi trường phần nghiêng có pH kiềm, ở phần sâu môi trường có sự lên men kỵ khí glucose các sản phẩm thu được là acid hữu cơ làm môi trường pH acid  do trong môi trường có chứa chất chỉ thị pH (thường là phenol red) thì phần nghiêng của môi trường sẽ có màu đỏ và phần sâu có màu vàng

- Nếu vi sinh vật sử dụng cà hai nguồn đường nên phần nghiêng và sâu đều

có tính acid nên cả môi trường màu vàng

- Trong trường hợp cả hai nguồn carbon không được sử dụng thì nguồn pepton được sử dụng và làm môi trường pH kiềm nên cả môi trường có màu đỏ Trong môi trường nếu có tạo thành H2S thì môi trường có màu đen , có sinh gas thì gas sẽ tích tụ làm vỡ thạch hoặc tạo thành các bọt khí bên trong

Đối với môi trường TSI thì các phản ứng xảy ra tương tự, tuy nhiên trong trường hợp cả phần nghiêng và phần sâu có hiện tượng acid là do một trong hai hoặc cả hai nguồn sucrose và lactose được sử dụng Trong trường hợp này c ần làm thêm các thử nghiệm trên môi trường lactose và sucrose

Phương pháp tiến hành: Cấy vi sinh vật trên môi trường thạch nghiêng TSI hoặc