kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vi sinh vật trên sản phẩm thủy sản

Đồng thời Bộ Thủy Sản và các địa phương có nhiều chương trình thực hiện phát triển các sản phẩm thủy sản ngày một phong phú hơn, chất lượng hoàn hảo hơn và đặc biệt quan tâm đến an toàn

MỞ ĐẦU

PHẦN MỘTGIỚI THIỆU VỀ TRUNG TÂM KỸ THUẬT 3

II CƠ CẤU TỔ CHỨC VÀ “QUẦN Lì LÝ PHÒNG G THỰC PI PHẨM trang 1

3 Trách nhiệm và quyển hạn kiểm nghiệm viên nhóm vi sinh trang 3

II BỐ TRÍ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH "1 `

PHAN HAITONG QUAN

A VI SINH VAT THUY SAN 0oocosocossvssisisusvininininonnnvnnmnuenerinsnnnndtang 6

I HỆ VI SINH VẬT CỦA CÁ - 2-1 E,12211Z74.1z2xicrrrvcere EPâNE Ố,

1 Vị sinh vật ngoài da cá

2 Vị sinh vật trong mang cá

3 Vị sinh vật trong ruột cá

4 Vi sinh vật xâm nhập vào cá bằng các con đường sau

II CÁC NGUỒN NHIỄM VI SINH HVAT’ TRONG CHE BIEN VA BAO QUAN

1 Giai đoạn tiết nhớt

2 Giai đoạn chết cứngGồm 3 qúa trình

2.1 Qua trinh Glyco — gidi ( glycolysis) 2.2 Qua trinh phan giải ATP và Creatinphotphat

2.3 Qúa trình tách phức chất actomyozin

3 Giai đoạn tự tiêu hay phân giải

4 Giai đoạn ươn thối

B VI SINH VẬT GAY HAI CHU YEU TRONG THUC PHAM dưang 10

I CLOSTRIDIUM PERERINGENS ceiii TARB TÔ,

1 Hình thái sinh học

2 Tác nhân gây hại gây bệnh

3 Phát hiện Clostridium Perfringens

II STAPHYLOCOCCUS AUREUS 02.2 verrerrreo

3.2 Giai đoạn tăng sinh ( tăng sinh chọn lọc) 3.3 Môi trường phân lập

3.4 Thử các test sinh hóa

PHẦN BANỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP THỬ

A THOT GIAN - ĐỊA ĐIỂM SEnneeenessse

B MẪU- DỤNG CỤ HÓA CHẤT ccccsssrsssee

1 Lấy mẫu

2 Chuẩn bị mẫu kiểm nghiệm

3 Chuẩn bị mẫu huyền phù gốc và các dịch pha loãng từ mẫu thử 3.1 Huyền phù gốc (dung địch pha loãng đầu tiên)

3.2.Dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo

SINHVẬT TRÊN SẢN PHẨM THỦY SẢN trang 18

1 Mô tả KH ve "% ÔỎ trang 18

2 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong sản phẩm thủy sản _phương pháp đổ

2.1 Nguyên tắc

2.2 Môi trườn 2.3 Tiến hành

2.3.1 Chuẩn bị mẫu 2.3.2 Cấy mẫu 2.3.3 Tính kết quả

Il KIEM NGHIEM COLIFORM mm 111

1 Mô tả Hee H110 1 1 niesnsrrser trang 20

2.1 Pương pháp đi đổ đĩa theo TCVN N(5; 5287 — 94 4) 2.1.1 Nguyên tắc

2.1.2 Môi trường 2.1.3 Tiến hành

2.1.3.1 Chuẩn bị mẫu

2.1.3.2 Cấy mẫu

2.1.3.3 Tính kết quả 2.2 Phuong phdp MPN (Most Probable Number)

2.2.1 Nguyén tac

2.2.2 Môi trường 2.2.3 Tiến hành

2.2.4 Cấy và ủ mẫu 2.2.5 Thử khẳng định

II KIỂM NGHIỆM ESCHERICHIA COLI 22 trang 25,

2 Xác định E coli li bằng phương pháp đi định tính theo TCVN N (5287 - -94), trang 25 2.1 Nguyên tắc

2.2 Môi trường hoá chất 2.3 Tiến hành

2.3.1 Tăng sinh 2.3.2 Phân lập

2.3.3 Nhận dạng E coli 2.3.4 Thử các phản ứng sinh hóa(nghiệm pháp IMViC)

3 Cơ sở phản ứng sinh hóa - -ss5sssrerererererrrexosre.e EFATE 2Ó,

3.1 Phản ứng Indol 3.2 Phản ứng MRVP( Methyl red)

3.3 Phan ting MRVP (Voges - Proskauer) 3.4 Phan ting Citrate simmons

Iv XAC DINH STAPHYLOCOCCUS AUREUS trang 32

3 Cơ sở sinh hóa staphylococcus aureus e-« -«.«.-esfFATIE 34,

V KIỂM NGHIỆM SALMONELLA eoeieie.EARĐ 35,

2.3.2 Tăng sinh

2.3.3 Phân lập 2.3.4 Thử phản ứng sinh hóa 2.3.5 Đọc kết quả

3 cơ sở sinh hóa SALMONELLA -eceeerereesrero EATĐ 37, 3.1 Phản ứng trên môi trường KIA

3.2 Phản ứng trên môi trường MIU:

VI KIỂM NGHIỆM PHÁT HIỆN SHIGELLA 2 „2222 t2 1g 4 1

1 Mô tẢ ciiiiiiiiiiiirrrarri TATE 41,

2 Xác định SHIGELLA theo (TCVN 5287 - 94) trang 41 2.1 Nguyên tắc

2.3.4 Thử phản ứng sinh hoá 2.3.5 Đọc kết quả

VII KIEM NGHIEM BACILLUS CEREUS 0 cccccccccsssssssssssssssssssscussssssssssusees

I0 ma .ÝỶÝ Ả

2 Xác định BACILLUS CEREUS theo (TCVN 4991 —89)

2.1 Nguyên tắc 2.2 Môi trường thuốc thử

2.3 Tiến hành

2.3.1 Chuẩn bị mẫu 2.3.2 Cấy mẫu 2.3.3 Xác nhận và thử các phản ứng sinh hóa:

2.3.4 Tính kết quả

3 Các test phản ứng sinh hoá 2 scrtrrrrg ch thgthgveirtirrrevs 3.1 Phản ứng mối trường thạch glucoza

3.2 Phần ứng VP 3.3 Phản ting nitrate thanh nitrite

VII KIEM NGHIỆM CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

8.6 Sa

2 Tiến hành theo (TCVN 4991 ~ 89)

2.1 Nguyên tắc : 2.2 Môi trường thuốc thử 2.3 Tiến hành

2.3.1 Tăng sinh

2.3.2 Phân lập 2.3.3 Thử phản ứng sinh hoá _ 2.3.4 Đọc kết qủa (định tính) 2.3.5 Đánh giá kết quả

3 Tiến hành theo tiêu chuẩn cuả Bộ Y Tế (TCVN 4584 - 88)

3.1 Nguyên tắc 3.2 Môi trường 3.3 Tiến hành 3.3.1 Chuẩn bị mẫu

.trang 42 .trang 42

trang 44

trang 46 trang 46 trang 47

trang 48

3.3.2 Cấy mẫu 3.3.3 Đọc kết quả 3.3.4 Kiểm tra tính đông sữa

số 0

2 Xác định

2.1 Nguyên tắc 2.2 Môi trường nuôi cấy 2.3 Tiến hành

2.3.1 Chuẩn bị mẫu 2.3.2 Cấy mẫu 2.3.3 Đọc kết quả

2.3.4 Thử các test sinh hóa 2.3.5 Kết luận

3 Cơ sở sinh hóa

X KIỂM NGHIỆM TỔNG SỐ NẤM MEN, MOC

1 Mô tả “ HH

2 Phương pháp | kiểm m nghiệm

2.1 Nguyên tắc 2.2 Môi trường

2.3 Tiến hành 2.3.1 Chuẩn bị mẫu 2.3.2 Cấy mẫu 2.3.3 Tính kết quả

PHẦN BỐN KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

II THẢO LUẬN 3 TH EtHỦ 112812 1-0010 E1 EEEennsee

1 Thảo luận về: tổng số vi khuẩn hiếu khí + 222 Z72.222 2tr

1.1 Phương pháp thử 1.2 kết quả

2 Thảo luận về: kiểm nghiém coliform

2.1 Tiến hành theo phương pháp đổ đĩa la (TCVN 5 5287 - 1994)

2.2 Kết quả

rang 50 trang 50 trang 50

„trang 53 trang 56 trang 56 trang 56

trang 57 trang 58 trang 58

trang 58.

II Một số trao đổi khác . «-eerrrrre ARE Ô2,

PHẦN NĂM: NHẬN XÉT ~ ĐỀ XUẤT - KẾT LUẬN

E.coli trên môi trường Endo Agar (2 hình)

Phản ứng sinh hóa E.coli (2 hình)

E.coli trên môi trường EMB

E.coli trên môi trường LT - BGBL 20%

3 HÌNH 4: STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Staphylococcus aureus cầu khuẩn gram (+)

Staphylococcus aureus trên môi trường thạch Baird parker

4 HÌNH 5: SALMONELLA

Salmonella trên môi trường XLD

Salmonella trên môi trường Bismuth Sulphite Agar

Salmonella điđộng nhờ có lông

Phản ứng sinh hóa Salmonella

5 HÌNH 6: BACILLUS CEREUS :

Bacillus cereus vi khuẩn hình que

Bacillus cereus

6 HINH 7; CLOSTRDIUM PERFRINGENS

Clostrdium perfringens môi trường thạch Wilsion — Blair Clostrdium perfringens

Clostrdium perfringens trực lhuẩn gram (+)

7 HINH 8: VIBRIO CHOLERAE

Vibrio cholerae phay khudn gram (-) (2 hình)

Vibrio cholerae trén môi trường TCBS

ae

—

CC Cod

Trong năm 2000 vừa qua sản lượng thủy sản xuất khẩu đáng kể qua các thị

trường Châu Âu, EU, Khu vực các nước lân cận Với kim ngạch hơn 1,2 tỷ USD cho

ngân sách nhà nước Đồng thời Bộ Thủy Sản và các địa phương có nhiều chương trình thực hiện phát triển các sản phẩm thủy sản ngày một phong phú hơn, chất lượng hoàn hảo hơn và đặc biệt quan tâm đến an toàn vệ sinh thực phẩm theo tiêu chuẩn Việt Nam ( TVCN), tiêu chuẩn quốc tế ngày một hội nhập thị trường quốc tế

Thủy sản là nguồn cung cấp protein giàu dinh dưỡng, bên cạnh đó chúng còn cung cấp cho con người một số vitamin và chất khoáng cần thiết cho cơ thể con người

mà không có sản phẩm thực phẩm nào khác có thể thay thế được Tuy vậy các sản phẩm thủy sản cũng có khả năng gây bệnh cho cơ thể con người nếu không bảo quản tốt chúng

rất dễ bị hư hỏng, biến chất vì bản thân các sản phẩm thủy sản chứa các hệ vi sinh vật thông thường từ môi trường sống cùng với sự nhiễm khuẩn xảy ra trong quá trình xử lý

và chế biến Khi gặp điều kiện thuận lợi các vi sinh vật sẽ phát triển làm hư hỏng biến chất sản phẩm và cuối cùng có thể gây nguy hiểm cho người tiêu dùng

Do đó việc kiểm tra chất lượng sản phẩm thủy sản, và nhất là công tác kiểm nghiệm vi sinh luôn cần thiết và được quan tâm đặc biệt

Thấy được tầm quan trọng của việc vệ sinh và an toàn thực phẩm nhà nước đã đưa ra các tiêu chuẩn về vi sinh trên thực phẩm thủy sản, thúc đẩy phát triển kinh doanh bảo đảm an toàn, vệ sinh, bảo vệ môi trường, đảm bảo về quyền và lợi ích người tiêu dùng, góp phần mở rộng thương mại và hợp tác thị trường quốc tế

An toàn thực phẩm hiện là mối quan tâm lớn của xã hơi Người tiêu dùng ngày nay hiểu biết về các nguyên nhân chính gây những cơn đại dịch đo thực phẩm và đòi hỏi những nguồn cung cấp thực phẩm an toàn Phát hiện để góp phần, ngăn ngừa và kiểm soát các vi sinh vật có trong thực phẩm thủy sản

Được khoa Công Nghệ May - Dinh Dưỡng Trường ĐHDL Kỹ Thuật Công Nghệ

và Giảng Viên hướng dẫn phân công thực hiện dé tai:" KIEM NGHIỆM MỘT số CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TREN SAN PHAM THUY SAN" va thực hành công việc kiểm nghiệm vi sinh vật tại phòng thí nghiệm thực phẩm Trung Tâm Kỹ Thuật 3 trong

S2

ae

CC fei

K3

=

oe

= 2s

C3 C -

>2

a

ax

ca PE)

PE)

C3

Co)

= c<

I KHAI QUAT:

Trung tâm kỹ thuật 3, một đơn vị sự nghiệp khoa hoc tiến hành các dịch vụ kỹ

thuật về tiêu chuẩn đo lường chất lượng nhằm phục vụ cho công tác quản lý nhà nước và các yêu cầu khác Trung tâm phối hợp chặt chẽ với các đơn vị trong và ngoài Tổng Cục

để hoàn thành nhiệm vụ thanh tra nhà nước về tiêu chuẩn đo lường và kỹ thuật nhà nước chất lượng hàng hóa xuất nhập khẩu là nhiệm vụ hàng đầu Trung tâm đã từng bước xây dựng và đưa vào áp dụng hệ thống chất lượng trên cơ sở các nội dung đã được qui định

trong TCVN ISO 9002 : 1996

Cơ cấu tổ chức hệ thống trung tâm gồm nhiều ngành nghề Xin được giới thiệu

về cơ cấu tổ chức và quản lý phòng thực phẩm

II CƠ CẤU TỔ CHỨC VÀ QUẦN LÝ PHÒNG THỰC PHẨM

1 Giới thiệu:

Phòng thực phẩm của Trung Tâm Kỹ Thuật 3 được tổ chức theo cách thức để

phòng có thể hoạt động độc lập, không bị sức ép về tài chính, thương mại hay ảnh hưởng của các đơn vị khác

Trưởng phòng (TP), cán bộ kỹ thuật TO (Technical Operator),và cán bộ chất lượng QO (Quality control Operator), có nhiệm vụ giải thích, hướng dẫn và đôn đốc để

tất cả các nhân viên của phòng thực hiện đúng trách nhiệm, quyền hạn đã qui định nhằm góp phần đảm bảo hệ thống chất lượng hoạt động theo đúng mục tiêu chất lượng

đã đề ra

Mẫu thử nghiệm nhận thông qua bộ phận giao dịch với khách hàng Nhân viên

phòng không được tiếp xúc trực tiếp với khách hàng để đảm bảo kết qủa thử nghiệm có

NGUYEN THỊ THANH TUYỂN Kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vsv trên thực phẩm thủy sản Trang 1

Bổ án tất nghiệp GVHD: Thac sj HUYNH TRIET DUNG

2.1 Trưởng phòng:

-Thực hiện các trách nhiệm theo qui định trong sổ tay chất lượng

-Quản lý và chịu trách nhiệm trước Phó Giám Đốc kỹ thuật toàn bộ các hoạt động thử nghiệm của phòng

-Quản lý tài sản, vật tư, thiết bị và nhân sự của phòng

-Báo cáo các hoạt động liên quan của phòng lên Phó Giám Đốc kỹ thuật

-Thiết lập, thực hiện và duy trì hệ thống chất lượng của phòng phù hợp với các chuẩn mức qui định

-Thiết lập và duy trì dẫn xuất chuẩn, tình trạng hiệu chuẩn, theo dõi việc bảo trì sửa chữa các thiết bị thử nghiệm và phụ trợ

-Hỗ trợ QO trong việc phân tích, khảo sát, đánh giá, xem xét và giải quyết sự không phù hợp của phòng

-Ký phiếu kết qủa, phê duyệt và ban hành hướng dẫn công việc của phòng -Ký bản chấm công, cung ứng vật tư, hóa chất và tài chính của phòng trước khi

trình lãnh đạo trung tâm duyỆt

-Kiểm tra các báo cáo thử nghiệm

-Theo dõi kiểm tra việc tiếp nhận và thử nghiệm mẫu mỗi ngày

-Giao việc cho từng nhân viên có liên quan

2.2 Cán bộ chất lượng (QO)

-Thực hiện các trách nhiệm trong số tay chất lượng

-Chịu trách nhiệm trước trưởng phòng về chất lượng các hoạt động thử nghiệm của phòng, quản lý và xây dựng các công việc phù hợp với các yêu cầu đã để ra và kiểm soát việc thực hiện

-Lập kế hoạch và tổ chức hiệu chuẩn, bảo trì các thiết bị của phòng, theo dõi điều

kiện môi trường và nguồn phụ trợ thích hợp cho công việc thí nghiệm

-Tham gia theo dõi việc phân tích nguyên nhân để xuất kiểm tra việc thực hiện các biện pháp xử lý sản phẩm không phù hợp, tham gia giải quyết các khiếu nại của khách hàng và biện pháp khắc phục phòng ngừa

-Lưu giữ hồ sơ chất lượng của đơn vị

-Báo cáo với trưởng phòng TQM (Total quality manager) cdc hoạt động có liên

quan đến chất lượng

-Dán nhãn cho hoặc không cho phép sử dụng thiết bị, chất chuẩn trong đơn vị

-Kiểm tra việc sử dụng các thiết bị, vật tư, chất chuẩn, phương pháp thử, hướng dẫn công việc và nhân lực cho công việc thử nghiệm Có quyền đình chỉ tạm thời các vấn để trên thấy có dấu hiệu vi phạm nghiêm trọng hay cần thiết đồng thời báo cho trưởng phòng biết

-Thay thế cán bộ kỹ thuật (TO) giải quyết các công việc có liên quan khi vắng mặt

Bổ án tất nghiên GVHD: Thac sj HUYNH TRIET DUNG

2.3 Can bộ kỹ thuật (TO)

-Thực hiện các trách nhiệm theo qui định trong sổ tay chất lượng

-Chịu trách nhiệm về mặt kỹ thuật của phòng

-Lập kế hoạch và tổ chức thực hiện các để tài nghiên cứu khoa học của phòng, kiểm tra theo đõi và thực hiện các phương pháp thử

-Phân công thử nghiệm mẫu trực tiếp cho các kiểm nghiệm viên nhóm vi sinh, ky kiểm tra các báo cáo thử nghiệm vi sinh, chịu trách nhiệm trước trưởng phòng về tiến

độ và thử nghiệm vi sinh

-Phối hợp và hỗ trợ QO trong các hoạt động liên quan đến chất lượng của đơn vị

-Báo cáo trưởng phòng, TMT các vấn để có liên quan đến hoạt động kỹ thuật

-Thay thế trưởng phòng hoặc QO giải quyết các công việc có liên quan khi trưởng phòng hoặc QO vắng mặt

-Thực hiện các công tác đột xuất khác theo sự điều động của Ban Giám Đốc và sự phân công của trưởng phòng

3 Trách nhiệm và quyền hạn kiểm nghiệm viên nhóm vi sinh

-Rửa, lau chùi đụng cụ, thiết bị, lọ đựng dung dịch thuốc thử mỗi ngày để đảm bảo

các vật trên luôn sạch

-Thực hiện các công tác đột xuất khác theo sự điểu động của ban Giám Đốc và sự phân công của trưởng phòng

-Phân tích các chỉ tiêu vi sinh theo năng lực thử nghiệm qui định

-Chủ động tham gia các hoạt động đảm bảo chất lượng như trắc nghiệm kỹ năng, soát xét và cập nhật phương pháp thử vi sinh, để xuất với trưởng phòng, TO hoặc QO các ý kiến cải tiến công việc hoặc han ché sai sót

-Kiểm tra thiết bị chất chuẩn đúng hạn theo sự phân công

STT | Thiét bi Công việc cần thực hiện Phân công thực hiện

01 | Đèn cực tím Khả năng tiệt trùng Kiểm nghiệm viên

02 | Tủ cấy, tủ ấm, các bề mặt | Độ vô trùng

05 |Môi trường nuôi cấy vi | Kiểm tra chất lượng khi | Kiểm nghiệm viên

sinh vật, hóa chất mới nhận vào, theo dõi

việc chuẩn bị mỗi ngày

06 | Các nhiệt kế trong tủ ấm Kiểm tra điểm 0, kiểm tra

điểm thường sử dụng bằng nhiệt kế chuẩn

07 | Các chủng vi sinh vật Kiểm tra chất lượng bằng

môi trường đặc trưng

Đổ án tốt nghiện GVHD: Thac sj HUYNH TRIẾT DONG

08 | Các tủ ấm, bếp cách thủy, | Theo dõi nhiệt độ, độ ẩm, | Kiểm nghiệm viên

II BỐ TRÍ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH:

Phòng thí nghiệm vi sinh gồm có hai phần:

4 Nồi thanh trùng môi trường pha chế (Autoclave)

5 Nồi chưng cách thủy

GVHD: Thac sy HUYNH TRIET DUNG

Nhận mẫu Cấy mẫu ——> Ủ mẫu SS Doc két qua —> TỬa -

Phong lam viéc

Vòi nước

NGUYEN THI THANH TUYEN Kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vsv trên thực phẩm thủy sản

A 2 2

A: VI SINH VAT THUY SAN ( visinh vat cá)

Cá bán ngoài thị trường: Có cá sống, cá tươi (cá mới chết) cá ướp đá, cá

khô Thành phần dinh dưỡng của cá tuỳ thuộc theo loại cá, mùa đánh bắt và thức ăn của

cá Cá bị biến chất nguyên nhân đo qúa trình từ đánh bắt, vận chuyển đến xử lý Phần quan trọng là cấu trúc của cá không chặt chẽ, do đó mà cá dễ ươn thối Vi sinh vật xâm

nhập vào các con đường sau:

Pharf cén lại là muối khoáng và enzym

Ở cá có đủ thành phần dinh dưỡng và là điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát

triển, đặc biệt là hệ vi sinh vật gây thối Tất cả các vi sinh vật gây thối ưa lạnh, gây thối của cá dễ thích ứng với nhiệt độ thấp của cá trong bảo quản

1.Vi sinh vat ngoài da cá

Ngoài da cá có một lớp nhớt, lớp nhớt này rất giàu protein và là môi trường dinh dưỡng thích hợp cho vi sinh vật phát triển Thường gặp các loài trực khuẩn như: Proteus

vulgarus, Micrococcus roseus, Escherichia coli

2 Vi sinh vat trong mang ca:

Trong mang cá có đặc biệt nhiều vi sinh vật, vì trong đời sống của cá mang làm chức

năng như một bộ máy hô hấp, sự hiếu khí tích cực Hàm lượng các chất hữu cơ cao và

có phần ứng kiêm nhẹ Bởi vậy, mang nhiễm nhiều vi sinh vật của nước, bùn, thức ăn

Khi cá chết, ta thấy vi sinh vật phát triển khá mạnh ở mang cá, đặc biệt vi sinh vật ưa khí

3 Vi sinh vật trong ruột cá:

Vi sinh vật trong ruột cá khá phong phú, những nguồn nhiễm vào là nước, bùn, thức ăn.Vì thế có đủ mặt các vi sinh vật của bùn nước và cả vi sinh vật ky khí sinh bào tử

Trong ruột cá thường thấy vi khuẩn: CI Sporogenes, E.coli, đặc biệt là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Salmonella và Clostridium Số lượng và thành phần hệ vi sinh vật tự nhiên của cá phụ thuộc vào điều kiện sống và số lượng, thành phần hệ vi sinh vật cư trú

ở độ sâu khác nhau

Cá sống thường ít nhiễm bẩn vi khuẩn Vì trong các tế bào của cá sống thường có

khả năng bảo vệ và miễn dịch Vì vậy cá@ vi sinh vật gây thối khó phát triển được

Nhưng khi cá chết khả năng để kháng bị mất và vi sinh vật sẽ phát triển làm thay đổi chất lượng của cá, sự thay đổi này đặt biệt xảy ra nhanh nếu như khi cá chết không kịp

thời lấy ruột ra vì trong ruột cá chứa rất nhiều vi sinh vật

NGUYEN TH) THANH TUYỂN Kiếm nghiệm mật số chỉ tiêu vsv trên thự: phẩm thủy sản Trang 6

4 Vi sinh vật xâm nhập vào cá bằng các con đường sau:

- Xâm nhập từ niêm dịch biểu bì vào: tuyến da của cá có tiết ra niêm dịch, đấy là

môi trường tốt cho vi sinh vật phát triển và từ đó vi sinh vật xâm nhập vào thịt cá

- Xâm nhập từ mang cá: khi cá chết mang cá thường bị ứ máu lại là môi trường

tốt cho vi sinh vật phát triển

- Xâm nhập từ đường ruột: men phân giải chất đạm trong ruột cá có tác dụng với thành ruột tạo điều kiện cho vi sinh vật trong ruột cá từ trong ruột cá lan ra ngoài

- Xâm nhập từ vết thương: vết thương do đánh cá, chuyên chở cũng là đường cho

vi sinh vật xâm nhập vào

Cá sau khi chết sẽ dần dẫn thay đối trạng thái liên quan đến các qúa trình tự phân và

vi sinh vật học Những quá trình tự phân là qúa trình hóa sinh của các enzym phân hủy protein cũng như glucid Các vi sinh vật phát triển đặc biệt là những giống giàu hoạt tính Proteaza sẽ phân hủy sâu sắc các chất protein trong thịt cá gây ra sự thối

rữa Sự thối rữa thường bắt nguồn từ ngoài vào rồi lan truyền bên trong pH của thịt

cá nhanh chóng chuyển sang kiểm Màu sắc cá thay đổi, mùi khó chịu do sản phẩm của qúa trình phân hủy protein, (NH:, HS, Mercaptan, Indol, Scartol) Các vi sinh vật gây thối cá là vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn Qúa trình phân hủy protein có thể xây ra đồng thời hiếu khí và ky khí Các vi sinh vật hiếu khí phát triển mạnh tạo điểu kiện cho vi sinh vật ky khí phát triển và hoạt động Để ngăn chặn quá trình thối rữa trong bảo quần cá có thể dùng các tác nhân của môi trường bên ngoài ức chế sự phát triển của vi sinh vật như: Làm lạnh, lạnh đông, sấy khô, ướp muối, đóng hộp,

Surimi, làm mắm, chượp, hun khói

I.CÁC NGUỒN NHIỄM VI SINH VAT TRONG CHE BIEN VA BAO QUAN CA:

Cá sau khi đánh bắt còn sống thêm một thời gian nữa rồi mới chết nhưng vẫn còn

tươi Thời gian này cá được chứa đựng trong các hòm, rổ, thùng, toa xe Chuyên chở tới

các nơi phân phối và sử dụng chế biến

Hệ vi sinh vật tự nhiên của cá ở thời kỳ này thường không phát triển, nhưng có

thể bị lây nhiễm vào cá đo vi sinh vật ở các đụng cụ chứa dựng, chuyên chở, nước rửa,

không khí nơi để cá Những vi sinh vật lây nhiễm thường là tạp khuẩn, nhưng cũng có

khi có cả vi sinh vật lây bệnh

- Nước dùng để rửa và chế biến cá phải sạch, đặc biệt số lượng E.coli <= 3 + 4 tế

bào/lít Không được dùng lại nước rửa cá nhiễu lần, như vậy sẽ làm tăng lên lượng

nhiễm khuẩn cho cá

- Đồ dùng, chứa đựng, chế biến cá phải sạch

- Các nguyên liệu phụ trong quá trình chế biến cá cũng là nguồn nhiễm quan trọng (dầu, muối, đường ) Muối thường có khoảng (100 — 200.000) té bao vi sinh vat khác nhau Trong muối cá đạng vi sinh vật gây thối cá muối Đôi khi có loài phát triển

trong dung dịch muối cao nhưng ngừng phát triển trong dung dịch muối bão hoà

NGUYEN THỊ THANH TUYỂN Kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vsv trên thực phẩm thủy sản Trang 7

- Cá trước khi đem bảo quản và chế biến cần phải rửa sạch và moi ruột, đó là

biện pháp sơ chế cần thiết nhằm làm giảm lượng vi sinh vật nhiễm ở cá, làm tăng thời gian bảo quản và chỉ tiêu vi sinh vật cho cá

Đối với cá đem ướp chượp làm nuớc mắm chỉ cần rửa sạch bùn bẩn, không cần moi ruột, cá ướp chượp cần tăng cường qúa trình phân hủy protein của cá làm cho cá chóng ngấu để rút ngắn thời gian ướp chượp cũng như tổng thời gian làm nước mắm

III QÚA TRÌNH PHÂN HỦY VI SINH VẬT CÁ SAU KHI CHẾT:

Tiết nhớt > chết cứng —> tự tiêu > ươn thối

1 Giai đoạn tiết nhớt:

Khi cá gần chết lượng nhớt tiết ra rất nhiều Thành phan cấu tạo của nhớt chủ yếu là

glucoprotein (muxin) Nhớt ban đầu trong suốt không mùi, sau biến đục có mùi chua và tanh Giai đoạn này là môi trường tốt cho vi sinh vật phát triển và xâm nhập vào đa thịt

cá Lúc này lớp nhớt bị phân hủy còn thịt cá vẫn tươi tốt

2 Giai đoạn chết cứng: Gồm 3 qúa trình

2.1 Qúa trình Glyco — giải ( glycolysis)

Glycogen bị phân giải ra acid lactic với sự tham gia của ATP

2.2 Qúa trình phân giải ATP và Creatinphotphat:

ATP (Acid adenozintriphotphoric) phân hủy dưới ảnh hưởng enzym

adenozintriphotphataza cia miozin thanh acid adenozindiphotphoric (ADP) va photphat

vô cơ tự do phần năng lượng giải phóng

Acid lacic © ——————» pH=5,5

Glyco nail

Miozin

Creatin photphat 2.3 Qúa trình tách phức chất actomyozin:

It ATP Giai đoạn này cá săn cứng, vẫn tươi chưa nhiễm vi sinh vật

NGUYEN TH] THANH TUYEN Kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vsv trôn thực phẩm thủy sản Trang 8

3 Giai đoạn tự tiêu hay phân giải: ;

Thịt cá bắt đầu mềm lại do phân giải chất men, có trong mô liên kết biến đổi

protein từ dạng phức tạp thành đơn giản :

Protid — —— > Polipeptid ————> Peptid ———~> Acid amin

Katepxin

4 Giai đoạn ươn thối:

Qúa trình phân giải protein thành acid amin Vi sinh vật phát triển và phân giải acid amin thành tri metil amin, đimetil amin làm cho cá phân phối

Sự ươn thối diễn biến theo 2 điều kiện:

- Khi trimetil amin oxit ( TMAO ) trong thịt cá thành trimetil amin ( TMA ) có mùi tanh

- Khi số vi trùng gia tăng , protein bị phân giải tới mức hoàn toàn ươn thối

Các vi sinh vật gây ươn thối:

- - Loại có men hỗn hợp như: Streptococcus, Staphylococcus phân hủy protid, lipid, glucid

- Loại có men đơn phân hủy protid, polipeptid và acid amin thuộc nhóm Bacillus Trong giai đoạn đầu của quá trình phân phối, các vi sinh có men hỗn hợp hoạt động trước phân hủy glucid thành các acid hữu cơ bay hơi có mùi khó chịu rồi đến các vi sinh vật có men đơn phá hủy đạm thành các chất đơn giản, độc hại

Sự lên men glucid hình thành các acid hữu cơ làm môi trường trở nên acid: Acid lactic, acid acetic, acid butyric, acid glycoric CO;, hydrocacbua còn gọi là giai đoạn lên men chua

Sau đó men mốc tiêu thụ các acid môi trường trở nên trung tính và vi sinh vật lên

men thối bắt đâu phát triển, chuyển hóa protid thành pepton, polipetit, acid amin và cuối cùng là các chất đơn giản, độc hại và hôi thối như ammonia, hydrosunfua, indol, scatol, phenol

Ban đầu cơ thể cá đầy đủ các loại vi sinh vật, sau đó Streptococus và Staphylococus phá hủy glucid làm môi trường hóa chua Coli hình thành amonia trung hòa acid trong

môi trường Thịt cá nhợt nhạt và nâu dần do hiện tượng hóa pepton, môi trường kiểm và

có mùi Sau đó Bacillus perfringens làm tăng lượng amonia và hydrosunfua Thịt cá bốc

mùi hôi thối và chuyển từ nâu bầm sang xanh lục, mễm nát, phẩn ứng kiểm mạnh

Bacillus putrificus Proteus vulgar làm phát sinh các chất độc phenol, indol, scatol cu6i

cùng hàm lượng quá cao làm vi khuẩn ky khí chuyển thành nha bào, giai đoạn này thịt

cá nhão và hư thối dần Cá ở giai đoạn này khi người dùng chế biến không kỹ rất dễ bị

nhiễm bệnh do ăn phải lượng lớn các vi sinh vật gây bệnh còn sống và sau đó bị bệnh

NGUYEN TH! THANH TUYEN Kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vsv trên thực phẩm thủy sản Trang 9

B.VI SINH VAT TAC NHAN GAY BENH CHU YEU TRONG THUC

PHAM THUY SAN

Một số loài trực khuẩn gram (+) sinh bào tử có khả năng gây ngộ độc thực phẩm nhu Clostridium botulinum, Clostridium perfringens va Bacillus Cereus Cac dạng ngộ

độc do mỗi loài này gây ra thường liên quan đến thực phẩm nhất định tuy khả năng gây ngộ độc là độc tố chung của chúng

Các cơn dịch bệnh Botulism được ghi nhận đầu tiên ở Đức vào năm 1793 có liên quan đến việc ăn xuc xích (Botulus) nhổi huyết, sau đó nhiều vụ tương tự đã được ghi nhận ở khắp nơi Và gần đây có rất nhiều vụ ngộ độc xảy ra như bò điên, gia cầm, cá nóc đã làn nhiều người bị tử vong

I CLOSTRIDIUM PERERINGENS (trước gọi là CI Welchii)

Thuộc họ: Bacillaceae Giống : Clostridium

Loài : Clostridium perfringens

1 Hình thái sinh học:

Clostriđium perfringens là trực khuẩn hình que, gram (+), kích thước l x 3 x 9

um, sinh bao ttf, nha bào hình bầu dục, tốc độ sinh trưởng nhanh nhất trong các loài vi

sinh vật mà con người biết đến Bào tử của chúng có mặt khắp nơi trong thiên nhiên và rất dễ nhiễm vào thực phẩm Nhờ bào tử nên chúng có khả năng cạnh tranh rất cao so với vi sinh vật khác Khi các tế bào sinh dưỡng đưới tác dụng của bào tử chết đi, còn bào tử vẫn còn sống sót

Clostridium chiu được nhiệt 75°C trong thời gian 10 phút Clostridium

perfringens sống tối ưu ở (43 + 47)°C thường ở nhiệt độ (12 + 50)”C pH = (6,0 + 7,5)

2.Tác nhân gây hại gây bệnh:

- Trong thực phẩm có chứa hơn 1000.000 tế bào/g thực phẩm

3.Phát hiện Clostridium Perfringens

- Nuôi cấy ky khí trên môi trường tăng sinh thạch Tryptose — Sunfit -Cycloserin

(TSC) ở (35 + 37)°C /20h khuẩn lạc có màu đen

Bồ án tốt nghiện GVHD: Thac sj HUYNH TRIẾT DUNG

Il STAPHYLOCOCCUS AUREUS

độ thích hợp tạo màu là(20 + 25)°C, nhiệt độ phát triển la 37°C Không di động

không tạo bào tử, nhưng có khả năng sống nông độ muối Na CI (9% + 10%), một số chủng có thể phát triển ở nỗng độ NaCIl 20% Có khả năng kháng thuốc ( trong tế

bào có B - Lactanase kháng penicillin và cephalosporin) Tạo ra độc tố Enteroxon

độc tố này chịu nhiệt

2 Khả năng gây bệnh

Staphylococcus thường có mặt phổ biến mọi nơi, thông thường thấy trên da, khoang mũi, tóc, quần áo Ở người (đây là nguồn nhiễm quan trọng nhất vào thực phẩm) khi phát triển trong thực phẩm S.aureus có khả năng sinh một loại độc tố protein phân tử lượng thấp gọi là độc tố đường ruột của Staphylococcus (A, B, C¡,

C, , C3, D và F) Các độc tố này gây nôn, mửa, đau thắt bụng, tiêu chảy, kiệt sức xảy ra sau (1 + 8)h đối với người bệnh

Có khả năng gây độc do độc tố: Enzym coagulase và các độc tố gây ra

- Tổn thương tế bào

- Tạo mụn nhọt

- Làm đông sợi huyết, máu

- Gây viêm phổi

- Viêm màng não

- Viêm cơ tim viêm thận

- Viêm tủy xương

3 Phat hién Staphylococcus aureus

S.aureus được xác định thử trên phản ứng đông huyết tương từ những khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập Baird Parker (BP), khuẩn lạc có màu đen

nhánh, sáng ,(ròn, lỗi đường kính từ I đến 1,5 mm được bao quanh bởi một vùng

sáng (các khuẩn lạc không đặc trưng có kích thước và màu sắc tương tự nhưng không

có quang sang)

- Méi tru@ng phan lap: Tellurite Glycine Agar (TGA) hoac Baird Parker (BP)

- Môi trường phục hồi: Brain Heart I nfusion (BHI)

- Nhưng cần lưu ý là có những loài Staphylococcus không làm đông huyết tương (coagulase ) song vẫn có khả năng sinh độc tố

NGUYEN TH) THANH TUYEN Kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vsv trên thực phẩm thủy sản Trang 11

2 Khả năng gây bệnh:

Có 3 dạng bệnh do Salmonella

- Sốt thương hàn do Salmonella Typhosa

- Nhiễm trùng máu do S.Cholerasuis

- Rối loạn tiêu hóa do S Typhimurium va S E nteritidis

Các triệu chứng do Salmonella như nôn, mửa, đau đầu ớn lạnh, tiêu chảy, sốt xuất

hiện (12 + 24)h sau khi ăn phải thức ăn chứa (1 + 10) triệu Salmonella/gam

3 Phát hiện Salmonella:

Việc tìm kiếm Salmonella trong mẫu thực phẩm bao gồm các bước

- Tiền tăng sinh

- Tăng sinh (chọn lọc)

- Phân lập

- Các test sinh hóa

3.1 Giai đoạn tiền tăng sinh:

Là giai đoạn tăng sinh không chọn lọc Dùng môi trường nước pepton đệm Loại môi trường này giàu dinh đưỡng và không chứa những chất đặc hiệu, tạo điều kiện cho

sự phục hổi sức sống và tăng trưởng đồng thời của Salmonella đã ít nhiều bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thực pẩm

3.2 Giai đoạn tăng sinh ( tăng sinh chọn lọc):

Từ giai đoạn tiền tăng sinh cấy chuyển sang môi trường tăng sinh là canh Selenite

Broth hoặc canh Muller ~ Kauffmamn (tetrathionate brilliant green) Cả hai môi trường này có khả năng ức chế hoặc ngăn chặn sự sinh trưởng của nhóm vi sinh vật khác đồng

thời cho phép sự phát triển của Salmonella trong hỗn hợp được nuôi cấy

3.3 Môi trường phân lập:

Là môi trường chọn lọc dạng đặc chứa một số hợp phần tạo thuận lợi cho sự phát hiện giống hoặc loài vi sinh vật.Trên môi trường thạch Salmonella - Shigella Agar (SS), -

NGUYEN TH! THANK TUYEN Kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vsv trên thực phẩm thủy sản Trang 12

Bổ án tốt nghiện GVHD: Thac sv HUYNH TRIET DUNG

Bismuth Sulfite Agar (BS) va Mac Conkey Agar (MC) khuẩn lac Salmonella tron, hoi

lồi trong, bờ đều, đôi khi có tâm đen, đường kính từ (2 + 4)mm

Đặc biệt môi trường phân lập XLD Salmonella khuẩn lạc điển hình trong hơi nhuốm đỏ, do sự thay đổi của chất chỉ thị trong môi trường đôi khi có tâm đen 3.4 Thử các test sinh hóa:

* Cấy đâm sâu rồi cấy ria thạch nghiêng môi trường TSI (Triple sugar Iron Agar) hoặc

KIA (Kligler’s Iron Agar) 0 37°C /24h cho két qua

- Phần cấy đâm sâu (đáy) đổi màu từ đỏ sang vàng : Dextroza hoặc Glucoza (+), tạo bọt khí trong nền thạch, sinh hơi HạS (+), thạch nứt nổi lên

- Phần nghiêng khuẩn lạc Salmonella có màu đen, giữ nguyên màu đỏ của phần nghiêng Lactoza (-), Saccharoza (-)

* Môi trường MIU ( Motility Indol Urea medium)

- Trên môi trường MIU cấy đâm sâu ủ 37°C/24h Salmonella mọc lan khỏi đường

cấy thẳng, có tính đi động, không làm biến màu môi trường từ vàng sang đỏ, urease (-)

- _ Cho lên bể mặt môi trường MIU 0,5mL thuốc thử kovacs, Salmonella không làm đỏ thuốc thử (-)

IV SHIGELLA

1 Hinh thai sinh hoc

Shigella là giống thuộc họ tộc Salmonella Shigella là một dạng trực khuẩn gram

(-) ky khí tương đối, không sinh bào tử thường bị nhầm lẫn với Salmonella trong quá trình kiểm tra vi sinh, có khuẩn lạc nhỏ hơn Salmonella Shigella là những vi khuẩn đường ruột hoàn toàn thích ghi với con người, Shigella được chia làm 4 nhóm:

+ S dysenteriae

+ S.Flexneri

+ S.boydii

+ S.sonnei

Nhìn chung Shigella là nhân tố quan trọng trong các bệnh lây lan theo đường

nước, đặc biệt là vùng nhiệt đới nơi điểu kiện vệ sinh còn yếu Vi sinh vật này lan

truyén theo nước, thực phẩm, người và động vật Tỷ lệ gây tử vong của các bệnh do Shigella cao hơn so với Salmonella

Shigella không di động, không tạo bào tử, ky khí tùy nghi, kháng nguyên Ô và K không có kháng nguyên H Oxydase (-) không tạo HS, nhiệt độ phát triển từ (10 + 48)”

C, pH phát triển (6 + 8)

2 khả năng gây độc tố và gây bệnh

Nội độc tố Liposaccharit có ở thành tế bào gây kích thích thành ruột

Ngoại độc tố được thoát ra ngoài tác động lên ruột, hệ thần kinh trung ương, gây tiêu

chảy, ức chế hấp thụ đường, acid amin ở ruột non Shigella chủ yếu qua đường tiêu hóa,

chỉ cần (10 + 100) tế bào cũng đủ gây bệnh, nếu ruột già bị tổn thương sẽ gây đau bụng mạnh, làm ung loét và xuất huyết, tiêu chảy nhiều lần, phân nhầy nhớt và có máu

NGUYEN TRỊ TRANH TUYỂN Kiém nghiệm một số chỉ tiêu vsv trên thực phẩm thủy sản Trang 13

3 Phat hién Shigella:

Giống như Salmonella nhưng ở môi trường phân lập Shigella khuẩn lạc tròn, hơi lồi, trong ,bóng mờ, không có tâm đen

- Phản ứng sinh hóa Shigella không tạo khuẩn lạc đen trên môi trường TSI hoặc

KIA Dihydrosunfua (-), không sinh hơi, Lactosa và Saccharosa (-), Gluco (+)

- _ Môi trường MIU khuẩn lạc không di động: indol (-) và urease (-)

Vibrio là những trực trùng gram (-), hơi cong, hình dấu phẩy trong canh trùng non, đi

động bằng một lông roi, không sinh bào tử, có khả năng phát triển tốt ở pH > 9, nổng độ muối NaCl 3%, tạo axeton và lên men đường, chuyển động rất linh hoạt bằng một lông

roi, chúng gây bệnh qua tiếp xúc, sữa thực phẩm và côn trùng

2 Khả năng gây bệnh :

Tạo ra độc tố ruột màng ngoài: Preprotoxin, Cytotoxin và Hemolyzin

Vibrio Cholerae gây bệnh tả như sau:

Vibrio cholerac —> đường tiêu hóa —> qua hàng rao dich vi trong da day > mang

nhày mô ruột —> vào máu và gây bệnh

Triệu chứng bệnh tả là: thời gian ủ bệnh (1 + 4) ngày, gây tiêu chẩy rất nhiều, buồn nôn gây co thắt cơ bụng, cơ thể mất nước nhanh chóng

3 Phát hiện Vibrio cholerae

NGUYEN TH THANH TUYỂN Kiểm nghiệm một số chỉ tiêu ysv trên thiƒc phẩm thủy sản Trang 14

E.coli là đạng Coliform có nguồn gốc từ phân trực khuẩn gram (-), ky khí tương

đối không sinh bào tử, có mặt phổ biến trong tự nhiên cũng như trong đường tiêu hóa của người và động vật, chúng lây lan qua đường thực phẩm rất nghiêm trọng

2 Khả năng gây bệnh

- Phần lớn E.coli phân lập từ môi trường và gây bệnh E.coli gây bệnh đường ruột

EPEC (Enteropathogenic E.coli — diarrheagenic E.coli ), thuộc nhóm huyết thanh, nội độc tố, không chịu nhiệt

- E.coli gây bệnh khác là EIEC (Enteroinvasive E.coli) rất giống Shigella bởi khả năng gây bệnh xâm nhiễm và chứng tiêu chẩy ở người

- E coli gây bệnh nữa là ETEC (Enterotoxigenic E.coli) có khả năng sinh độc tố đường ruột không chịu nhiệt có tính kháng nguyên Việc phát hiện E.coli tiến hành thei phương pháp thông thường khi phân lập Coliform phân ở (44 - 45)” C Tuy nhiên cũng

có dang E.coli mới phát hiện gần đây là E.coli 0,57 :H17 không phát triển được ở (44 +

45)C

3 Phát hiện E.coli

- Môi trường tăng sinh: làm đục và sinh hơi canh BGBL (Brilliant Green Bile Lactose 2%) hoac canh Lauryl Sulphate Tryptose (LT)

— ~ Môi trường phân lập: EMB (Eosine Methylene Blue Agar): E coli có màu tím

ánh kim, tròn ,bờ đều, đường kính khoảng 0,5mm hoặc môi trường Endo E.coli có màu

-_ Thử phản ứng sinh hóa: IMViC E.coli typel: ++ - - và E coli type ÏÏ: - + - -

NRUYÊN THỊ TRANH TUYỂN Kiểm nghiệm một số chỉ tiéw vsv trén thực phẩm thủy sản Trang 15

ae

RE 2s

A THỜI GIAN - ĐỊA ĐIỂM

Thời gian: ngày 09 tháng 05 đến ngày 15 tháng 06 năm 2001

Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh thực phẩm TRUNG TÂM KỸ THUẬT 3

B MẪU - DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM

I MAU VA CHUAN BI MAU

Các loại thực phẩm thủy sản đông lạnh, khô, đổ hộp,nước mắm

1 Lấy mẫu: Các mẫu sản phẩm được kiểm tra vi sinh vật phải đảm bảo, phải phản ánh đúng tình trạng vi sinh trong mẫu tránh mọi việc tạp nhiễm từ ngoài vào

- Đối với loại sản phẩm có bao gói độc lập ( hộp, chai, túi, giấy, chất dẻo ) thì lấy cả đơn vị mẫu nguyên theo tỷ lệ qui định trong các tiêu chuẩn riêng cho từng sản

phẩm

- Đối với các loại mẫu phải lấy ra từ khối lượng lớn như: lạnh đông, khô, nước mắm thì lấy theo nguyên tắc sau:

Sát trùng vị trí sẽ mở lấy mẫu ( vòi rót, nắp thùng) bằng bông tẩm cồn, đốt

Dụng cụ mở cắt đã được khử trùng ( lau cồn, đốt) mở bao bì hoặc cắt bể mặt sản phẩm

Lấy mẫu sản phẩm bằng dụng cụ lấy mẫu vô trùng ( tỷ lệ mẫu lấy theo dạng này có thể qui định trong các tiêu chuẩn cho sản phẩm) Đối với mẫu đặc không lấy ít hơn

200g, mẫu lồng không lấy ít hơn 300mL

Cho mẫu vào các lọ, bình ( vô trùng) có nút kín

Ghi nhãn đây đủ thông số cần thiết: Nơi lấy mẫu, lô sản xuất, số lượng, trạng thái mẫu (nếu cần), ngày lấy mẫu, ký hiệu

Vận chuyển mẫu an toàn, nhanh chóng (lưu ý đến nhiệt độ đối với sản phẩm đông lạnh) về phòng kiểm nghiệm

_ Ghi sổ nhận mẫu các chỉ tiết cần thiết

2 Chuẩn bị mẫu kiểm nghiệm

Mẫu thử sau khi đem đến phòng thí nghiệm, cần làm tan giá đối với sản phẩm đông

lạnh trước khi thí nghiệm, còn sản phẩm khác đưa vào thí nghiệm ngay hoặc lưu trữ

3 Chuẩn bị mẫu huyền phù gốc và các dịch pha loãng từ mẫu thử

3.1 Huyền phù gốc (dung dịch phha loãng đầu tiên)

- _ Là dung dịch hay nhũ tương thu được sau khi một khối lượng m của sản phẩm kiểm

tra đã được cân hay đong (trước đó mẫu đã được lắc kỹ, hoặc trộn , dập mẫu ) ÐĐem

NGUYEN THI TRANH TUYỂN Kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vsv trôn thực phẩm thủy sản Trang 16

trộn một cách cẩn thận với một lượng gấp 9 lần nước pha loãng, sao cho cuối cùng

có được sự phân bố đồng đều của vi sinh vật trong hỗn hợp dung dịch

- _ Lượng cân hay đong của mẫu này có thể được thay đổi tuỳ loại sản phẩm hoặc theo chỉ tiêu kiểm tra, nhưng thông thường không ít hơn 10g

Vd: cân 10g mẫu fillet hải sản đông lạnh, dập mẫu trộn với 90mL dung dịch pha

loãng là nước muối sinh lý hoặc nước pepton

3.2 Dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo:

Từ mẫu thử lỏng hoặc huyền phù gốc ta có thể pha loãng dung dịch thích hợp cho mục đích phân tích theo tỷ lệ 1:9

Việc pha loãng này nhằm cho số lượng các vi sinh vật có trong mỗi đơn vị giảm tới mức có thể quan sát dễ dàng hoặc đếm được (phân tích định lượng ) sau khi nuôi cấy trong ống nghiệm hoặc các đĩa thạch

Kỹ thuật pha loãng: Dùng pipet vô trùng hút 1mL dung dich mẫu lỏng hoặc huyền phù cho vào ống nghiệm có chứa 9mL dung dịch phaloãng Cẩn thận trộn đều phân mẫu thử này.Với nuớc pha loãng bằng cách lắc nhẹ Lặp lại thao tác này cho dãy

ống pha loãng khác Mỗi độ pha loãng ding mot pipet

NGUYEN THI THANH TUYEN Kidm nghiém một số chỉ tiêu vsv trên thực phẩm thủy sản Trang 17

II DỤNG CỤ HOA CHAT

Qua quá trình thực tập” thí nghiệm tại Trung Tâm, đã dùng các thiết bị (nêu ở

phần D và dụng cụ (đa số bằng thủy tỉnh) sau:

Đĩa petri đường kính 40mm, 60mm, 100mm

Ống nghiệm các cỡ

Pipet các loại: ImL, 10mL, 20mL (pipet thủy tinh và tự động)

Que cấy các loại (que cấy ria, que cấy sâu, que cấy trang)

lệ số vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm

2 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong sản phẩm thủy sản phương pháp đổ đĩa

theo (TCVN 5287 — 94)

2.1 Nguyên tắc:

Sử dụng phương pháp đổ đĩa trên cơ sở mẫu xác định Đếm số khuẩn lạc mọc trên

môi trường thạch dinh dưỡng từ các nông độ pha loãng sau khi nuôi cấy ở 30°C/72h, trên môi trường thach Tryptone Glucose Agar, hoặc 370C/48h trên môi trường Nutrient Agar

2.2 Môi trường:

- Thach dinh duGng Tryptone Glucose Agar

- Pepton hoac tryptone

- Nuéc muéi sinh ly 0,85% (Sodium chloride)

NGUYEN THI THANN TUYỂN Kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vsv trên thực phẩm thủy sắn Trang 18

- _ Pha loãng mẫu tuỳ mức độ khả nghỉ về sự nhiễm khuẩn

- _ Mỗi mẫu nuôi cấy (2 - 3) nông độ liên tiếp, mỗi nồng độ 2 dia petri

- _ Thời gian từ khi pha loãng đến khi cấy mẫu không quá 20 phút

n ;, số đĩa độ pha loãng thứ 2 (2 đĩa)

D: hệ số pha loãng thứ nhất

- Lam tron két qua: a.10"

a: số thập phân ứng từ 1 đến 9,9 n: số mũ thập phân

- _ Chọn đĩa có khuẩn lạc từ (15 - 300) để tính giá trị trung bình

- sự phân bố của các khuẩn lạc trên đỉa phải hợp lý, độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít

- _ Không đếm đĩa khuẩn lạc mọc loang quá 2⁄3

NGUYEN TH| THANH TUYỂN Kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vsv trên thực phẩm thủy sản Trang 19

Bổ án tất nghiện GVHD: Thac sy HUYNH TRIET DONG

Tién hanh theo tiéu chuẩn Bộ Y Tế

Tương tự như TCVN (5287- 94) nhưng mẫu sau khi cấy ủ ở 379C/(24 + 48)h Đọc kết quả sau 24h và đọc kết quả chính thức sau 48h

QUI TRINH THU NGHIEM TONG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

10 g mẫu 90mL dung dịch nước muối sinh lý

hoặc ky khí tùy nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên mem dung Lactose ở 37°C trong vòng 24h Vị khuẩn Coliform mang tính chỉ thị vệ sinh thực phẩm đánh giá mức an

Một số tính chất sinh héa dic trung cho cdc loai thudc nhém nay 1a cdc test IMViC

(indol, methyl red, Voger — Proskauer va simmons citrate) nhém Coliform cho két qua

Các chủng trong cùng một loài đôi khi cho kết quả trái nhau, thường ở hai test

MR va VP

- Coliform phan (Feacal coliform ) cé nguồn gốc từ phân người và đông vật máu nóng Là những Coliform có khả năng sinh acid, sinh hơi trong môi trường canh EC ở

- Coliform phat trién tốt trên nhiều loại môi trường, nhiễu loại thực phẩm, nhiệt độ từ (-2°C +50} pH từ (4,4 + 9)

- E.coli có thể phát triển tối thiểu chỉ chứa một nguồn cacbon hữu cơ duy nhất như glucose va nguén nitơ duy nhất (NH4); SOa Chúng phát triển tốt trên môi trường thạch thường cho những khuẩn lạc thấy được ở 37°C /(12 + 16)h

2 Xac dinh Coliform

2.1 Phương pháp đổ đĩa theo TCVN ( 5287 - 94 )

-_ 2.1.1 Nguyên tắc: Đếm số khuẩn lạc lên men Lactose sau khi ủ môi trường thạch ở 37°C/24h Kết quả được biểu thị bằng số Coliform trên một gam hay 1mL mẫu

2.1.2 Môi trường:

- Thach VRBL (Crystal Violet Neutral Red Bile Lactose Agar)

2.1.3 Tién hanh

2.1.3.1 Chuẩn bị mẫu:

Mẫu phải mang tính đại diện cao nhất cho sản phẩm cần kiểm và phải được

lấy theo những điều kiện vệ sinh, vô trùng phù hợp

- Cân 10g mẫu cho vào bình chứa 90mL nước muối sinh lý, đổ vào bao PE vô trùng cho vào máy dập mẫu Đồng nhất mẫu bằng máy (Stomacher), dung dịch thu được gọi là dung dịch mẫu

- _ Pha loãng mẫu tuỳ theo mức độ nghỉ ngờ vệ sinh nhiễm khuẩn mẫu

- _ Mỗi mẫu (2 + 3) nông độ liên tiếp, mỗi nồng độ cấy trên hai đĩa petri -_ Thời gian từ khi lấy mẫu đến khi cấy mẫu không quá 20 phút

Sơ đồ và thí dụ tính tương tự như tổng số vi khuẩn hiếu khí

2.2 Phương phdp MPN (Most Probable Number) Theo TCVN 4882 - 1989

2.2.1 Nguyên tắc

Dựa vào tính chất lên men đường lactose trong canh thang chỉ thị màu và mật bò

sinh hơi, sinh acid để nuôi cấy và xác định theo phương pháp nhiều ống MPN dựa vào bảng chỉ số MPN để tính kết qủa

2.2.2 Môi trường:

Lactose bile brilliant green broth 2% (BGBL)

Lauryl sulfate tryptoza (LT)

2.2.3 Tiến hành thử:

Pha loãng mẫu: tùy mức độ nghỉ ngờ về sự nhiễm khuẩn của mẫu, pha loãng các

mẫu thành các nồng độ pha loãng khác nhau

2.2.4 Cấy và ủ mẫu:

Sử dụng ba ống chứa môi trường LT đậm đặc (nồng độ kép) Dùng pipet vô trùng hút 10mL mẫu chuyển vào ống chứa môi trường Ủ ở30°C/24h

Sử dụng ba ống chứa môi trường LT loãng (nồng độ đơn) Dùng pipet vô trùng hút

1mL mẫu nồng độ đâu tiên vào ba ống trên

Sử dụng ba ống chứa môi trường LT loãng (nông độ đơn) Dùng pipet vô trùng hút

1mL mẫu nồng độ pha loãng kế tiếp cho vào ba ống trên

Ủ các ống ở nông độ pha loãng (nồng độ đơn) ở 30°C/(48 + 96)h

Vi du: trong 3 day Ong nghiém c6 s6 6ng duong tinh 1a: 3 - 2 - 0

Chỉ số MPN của mẫu là: 93/1mL hoặc 930/1g

Với mức tin cậy 95%, chỉ số MPN dao động:

Từ 15 đến 380/1mL hoặc từ 150 đến 3800/1g

SƠ ĐỒ PHƯƠNG PHÁP MPN

25g mẫu + 225mL nước pepton

II KIỂM NGHIỆM ESCHERICHIA COLI

E.coli được phát hiện đo tính khả năng lên men đường Lactose sinh hơi ở 44°C và có

kết quả nghiệm pháp IMVIC phù hợp:

- E.coli type I: ++

- E.coli typell: - + - -

2.2 Môi trường hoá chất:

- - Môi trường tăng sinh: BGBL (Brilliant Green Bile Lactose 2%) hoặc canh Lauryl Sulphate Tryptose (LT)

- Môi trường phân lập: EMB (Eosine Methylene Blue Agar) hoặc Endo, hoặc DA (Desoxycholate Agar)

- _ Môi trường thử phản ứng sinh hóa:

+ Indol (nước pepton) thuốc thử Kovacs

+ MRVP (Methyl Red Voger Proskauer):với MR thuốc thử Methyl red, MR (VP)

thuốc thử œ - naphtol dung địch 5% và kali hyđroxit dung dịch 40% (KOH 40%)

+ Cimmons citrate agar (cấy ria thạch nghiêng)

Thuốc nhuộm gram

2.3 Tiến hành:

2.3.1 Tăng sinh:

- _ Cân 10g mẫu cho vào bìng chứa 90mL nước muối sinh lý , dập mẫu

- Hút ImL mẫu (d = 10”) cho vào ống chứa 5mL môi trường BGBL2% hoặc LT ủ ở 44°C/24h

2.3.2 Phân lập:

- Sau khi ủ 44°C/24h chọn ống nghiệm có phản ứng dương (biến màu môi trường

BGBL 2% từ xanh sang vàng và sinh hơi), cấy ria sang môi trường EMB hoặc Endo