BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN CAO SƠN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN CAO SƠN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI, NĂM 2015
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN CAO SƠN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 62 72 04 10
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu
TS Lê Thị Hồng Hảo
HÀ NỘI, NĂM 2015
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu và TS Lê Thị Hồng Hảo Các
số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập và nghiên cứu thực hiện luận án dưới sự hướng dẫn của PGS TS Thái Nguyễn Hùng Thu và TS Lê Thị Hồng Hảo,
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
PGS TS Thái Nguyễn Hùng Thu, Phó hiệu trưởng Trường Đại học Dược Hà
Nội, Trưởng bộ môn Hóa Phân tích - Độc chất và TS Lê Thị Hồng Hảo, Phó
Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, là hai người thầy, cô đã tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ và cho tôi những kiến thức quý báu để tôi hoàn thành luận án
Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi tham gia học tập và hoàn thành luận án đúng thời gian quy định
Các thầy, cô Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất và Phòng Sau đại học, Trường
Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường
PGS Phạm Gia Huệ nguyên Trưởng Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất,
Trường Đại học Dược Hà Nội là người thầy đã đóng góp ý kiến, chỉ dẫn tôi hoàn thành luận án
Các anh chị em tại Khoa Độc học dị nguyên và các đồng nghiệp ở Viện Kiểm
nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã động viên, giúp đỡ và chia sẽ với những khó khăn trong công việc
Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án
Trần Cao Sơn
Trang 5MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU viii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ x
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1 TỔNG QUAN 3
1.1 HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT 3
1.1.1 Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật 3
1.1.2 Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật 3
1.1.3 Một số nhóm hóa chất bảo vệ thực vật chính 5
1.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT 13
1.2.1 Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trên thế giới 13
1.2.2 Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật ở Việt Nam 14
1.2.3 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật an toàn và hiệu quả 15
1.3 DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 16
1.3.1 Khái niệm về dư lượng và mức dư lượng tối đa 16
1.3.2 Quy định về mức dư lượng tối đa 17
1.3.3 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc và bảo quản dược liệu 19 1.3.4 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm dược liệu 22
1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT 23
1.4.1 Các phương pháp xử lý mẫu 23
1.4.2 Một số kỹ thuật dùng trong phân tích hóa chất bảo vệ thực vật 39
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 49
2.1.1 Hoá chất bảo vệ thực vật 49
2.1.2 Đối tượng phân tích 53
2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 54
2.2.1 Hoá chất, thuốc thử 54
2.2.2 Chất chuẩn 54
Trang 62.2.3 Thiết bị, dụng cụ 56
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 57
2.3.1 Phương pháp khảo sát thực địa và lấy mẫu 57
2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu 58
2.3.3 Phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ 58
2.3.4 Phương pháp thẩm định 59
2.3.5 Phân tích mẫu thực 62
2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 62
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 63
3.1 KHẢO SÁT TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG TRỒNG CÂY THUỐC 63
3.1.1 Nguồn cung hóa chất bảo vệ thực vật 63
3.1.2 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc tại Hà Nội và một số vùng lân cận 70
3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU 75
3.2.1 Xây dựng các điều kiện sắc ký khối phổ 75
3.2.2 Xây dựng quy trình chiết hóa chất bảo vệ thực vật từ một số dược liệu và sản phẩm dược liệu 85
3.2.3 Thẩm định các phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong một số dược liệu và sản phẩm dược liệu 100
3.3 DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 115
3.3.1 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu tươi 116
3.3.2 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu khô 117
3.3.3 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong thực phẩm chức năng có thành phần thảo dược 118
3.3.3 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong trà xanh 120
Chương 4 BÀN LUẬN 122
4.1 VỀ VIỆC SỬ DỤNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG TRỒNG CÂY THUỐC VÀ CHẾ BIẾN DƯỢC LIỆU 122
4.1.1 Về loại hoá chất bảo vệ thực vật được kinh doanh 122
4.1.2 Về loại HCBVTV được sử dụng trong trồng cây thuốc 123
Trang 74.2 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC
VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM DƯỢC LIỆU 124
4.2.1 Lựa chọn đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu 124
4.2.1.2 Lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu 126
4.2.2 Về phương pháp xử lý mẫu 127
4.2.3 Về phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ 132
4.2.4 Về kết quả thẩm định phương pháp 138
4.3 VỀ DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 141
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 144
KẾT LUẬN 144
KIẾN NGHỊ 145
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 146
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 8DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
TT Chữ viết tắt Giải thích
ionization)
ionization)
spectrometry)
Trang 9TT Chữ viết tắt Giải thích
Trang 10DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1.1 Phân loại HCBVTV theo mối nguy 4
Bảng 1.2 Số lượng hoạt chất HCBVTV được phép sử dụng, hạn chế sử dụng và cấm sử dụng ở Việt Nam 14
Bảng 1.3 Quy định của Dược điển Việt Nam IV về giới hạn HCBVTV 17
Bảng 1.4 Giá trị MRL mặc định của một số nước 19
Bảng 1.5 Một số ứng dụng của phương pháp QuEChERS để phân tích HCBVTV trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu 38
Bảng 1.6 Một số ứng dụng phân tích đồng thời HCBVTV bằng GC-MS 44
Bảng 1.7 Một số ứng dụng phân tích đồng thời HCBVTV bằng LC-MS 48
Bảng 2.1 Một số HCBVTV được nghiên cứu trong khóa luận [17][124] 49
Bảng 2.2 Thông tin về các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu 54
Bảng 2.3 Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỷ lệ ion 60
Bảng 3.1 Các HCBVTV được tiêu thụ phổ biến tại các địa phương khảo sát 65
Bảng 3.2 Sự phổ biến của các HCBVTV theo nhóm phân loại 69
Bảng 3.3 Danh mục cây thuốc và dược liệu ở các địa phương khảo sát 71
Bảng 3.4 Danh mục HCBVTV sử dụng trong trồng cây thuốc 73
Bảng 3.5 Các điều kiện MS trong LC-MS/MS để phân tích HCBVTV 76
Bảng 3.6: Các thông số hoạt động đã tối ưu của nguồn ion hoá 77
Bảng 3.7 Khảo sát gradient pha động (A = acid acetic 0,1%; B = methanol) 79
Bảng 3.8 Điều kiện gradient để tách hỗn hợp HCBVTV 80
Bảng 3.9 Độ lặp lại của hệ thống LC-MS/MS 81
Bảng 3.10 Điều kiện MS trong GC-MS/MS được sử dụng trong nghiên cứu 83
Bảng 3.11 Độ lặp lại của hệ thống GC-MS/MS 84
Bảng 3.12 So sánh các phương pháp chiết và pH dịch chiết đo được 90
Bảng 3.13 Tỷ lệ ion xác nhận và ion định lượng của các HCBVTV 103
Bảng 3.14 Các nồng độ HCBVTV được sử dụng để khảo sát khoảng tuyến tính và đường chuẩn 104
Bảng 3.15 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn của HCBVTV trên mẫu dây thìa canh 104
Bảng 3.16 LOD, LOQ của các HCBVTV trong các nền mẫu khác nhau phân tích bằng LC-MS/MS 107
Bảng 3.17 LOD, LOQ của các HCBVTV trong các nền mẫu khác nhau phân tích bằng GC-MS/MS 108
Trang 11Bảng 3.18 Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu mã đề tươi (n=6) 110
Bảng 3.19 Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu trà thảo dược (n=6) 111
Bảng 3.20 Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu dây thìa canh (n=6) 112
Bảng 3.21 Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu trà xanh (n=6) 113
Bảng 3.22 Độ thu hồi của các HCBVTV trên một số nền mẫu thực 115
Bảng 3.23 Kết quả phân tích HCBVTV trong dược liệu tươi 116
Bảng 3.24 Kết quả phân tích HCBVTV trong dược liệu khô 117
Bảng 3.25 Tần suất phát hiện HCBVTV trong các nhóm sản phẩm khác nhau 119
Bảng 3.26 Đánh giá hàm lượng HCBVTV trong TPCN theo nguồn gốc mẫu 120
Bảng 3.27 Kết quả phân tích HCBVTV trong trà xanh 120
Bảng 4.1 Danh mục HCBVTV được lựa chọn cho nghiên cứu phân tích 125
Bảng 4.2 Tóm tắt các bước chiết HCBVTV trong các nền mẫu khác nhau bằng phương pháp QuEChERS 128
Bảng 4.3 So sánh ảnh hưởng nền của phương pháp nghiên cứu với ảnh hưởng nền theo phương pháp của Raski 132
Bảng 4.4 Thời gian lưu và điều kiện MS của một số HCBVTV rửa giải gần nhau 134
Bảng 4.5 Đánh giá khả năng phân tích các HCBVTV bằng GC-MS/MS và LC-MS/MS 136
Bảng 4.6 So sánh độ lặp lại và độ thu hồi với các nghiên cứu khác 140
Trang 12DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Các trạng thái vật lý theo nhiệt độ vào áp suất 26
Hình 1.2 Bộ dụng cụ chiết siêu tới hạn 26
Hình 1.3 Dụng cụ chiết pha rắn thông thường (a) và tự động (b) 28
Hình 1.4 Các loại nhóm silanol 29
Hình 1.5 Nguyên tắc của vi chiết sợi rỗng 35
Hình 1.6 Tóm tắt các bước chiết của ba phiên bản phương pháp QuEChERS 37
Hình 2.1 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ và sắc ký khí khối phổ sử dụng trong nghiên cứu 57
Hình 3.1 Hiểu biết về HCBVTV của cán bộ kinh doanh 64
Hình 3.2 Hiểu biết của nhân viên kinh doanh về danh mục HCBVTV 64
Hình 3.3 Hình ảnh một số HCBVTV không có nguồn gốc 68
Hình 3.4 Một số loại cây thuốc được trồng phổ biến ở các địa phương 73
Hình 3.5 Một số vỏ HCBVTV sau sử dụng tại ruộng 73
Hình 3.6 Sắc đồ tổng ion của hỗn hợp chuẩn HCBVTV 0,1 mg/mL và sắc đồ của 2 mảnh ion sản phẩm của carboxin, 2 mảnh ion sản phẩm của carbaryl 78
Hình 3.7 Sắc ký đồ một số HCBVTV theo chế độ gradient 4 80
Hình 3.8 Khảo sát quy trình chiết HCBVTV từ mẫu dược liệu tươi 85
Hình 3.9 So sánh hiệu suất chiết HCBVTV trên mẫu mã đề tươi của 3 quy trình 86
Hình 3.10 Dịch chiết bồ công anh xử lý theo quy trình có GCB (trái) và không có GCB 87
Hình 3.11 Ảnh hưởng của GCB đến độ thu hồi HCBVTV trên nền mẫu mã đề 88
Hình 3.12 Ảnh hưởng của GCB đến độ thu hồi HCBVTV trên nền mẫu bồ công anh 88 Hình 3.13 Quy trình chiết HCBVTV từ mẫu dược liệu tươi 89
Hình 3.14 Ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu đến hiệu suất chiết một số HCBVTV 90
Hình 3.15: So sánh số lượng HCBVTV ở các khoảng độ thu hồi khác nhau (>80%; 70-80% và <70%) khi xử lý bằng 3 quy trình 91
Hình 3.16 So sánh số lượng HCBVTV có độ thu hồi ở các khoảng khác nhau (>80%; 70-80% và <70%) khi sử dụng các lượng NaCl khác nhau 92
Hình 3.17 Quy trình QuEChERS chiết HCBVTV trong mẫu dược liệu khô 92
Hình 3.18 So sánh hiệu suất chiết HCBVTV trên mẫu TPCN xử lý theo 3 quy trình 93
Hình 3.19 Ảnh hưởng của lượng PSA sử dụng đến độ thu hồi 94
Hình 3.20 Ảnh hưởng của lượng GCB sử dụng đến độ thu hồi 95
Trang 13Hình 3.21 Quy trình chiết HCBVTV trên nền TPCN 95
Hình 3.22 So sánh độ thu hồi của các HCBVTV khác nhau khi sử dụng các lượng muối chì acetat khác nhau 96
Hình 3.23 Ảnh hưởng nền với mẫu dược liệu tươi (bồ công anh) 97
Hình 3.24 Ảnh hưởng nền với mẫu TPCN (trà mướp đắng) 98
Hình 3.25 So sánh ảnh hưởng nền của hai kỹ thuật định lượng: không sử dụng nội chuẩn và có sử dụng nội chuẩn (TPP) 98
Hình 3.26 Ảnh hưởng nền với mẫu chè (có sử dụng nội chuẩn) 99
Hình 3.27 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn của atrazin và dimethoat theo LC-MS/MS 101
Hình 3.28 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của cypermethrin (4 đồng phân) và permethrin (2 đồng phân) theo GC-MS/MS 102
Hình 3.29 Đường chuẩn phân tích HCBVTV trên một số nền mẫu 106
Hình 3.30 Một số sắc đồ xác định LOD, LOQ thông qua xác định S/N 109
Hình 4.1 Sự phân mảnh của carbendazim 133 Hình 4.2 Sắc ký đồ của hai chất có thời gian lưu gần nhau (trichlorfon và dimethoat)135
Trang 14ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nông nghiệp, có nhiều mối nguy làm ảnh hưởng xấu đến năng suất và chất lượng nông sản như sâu bệnh, cỏ dại, chuột, mối mọt, nấm… Dược liệu là một loại sản phẩm nông nghiệp đặc biệt, do đó cũng có nguy cơ mắc phải các dịch bệnh nói trên Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) đóng vai trò quan trọng để phòng và loại trừ các loại dịch bệnh cho các sản phẩm nông nghiệp nói chung và dược liệu nói riêng Hiện nay, khi trồng hầu hết các loại dược liệu cần phải sử dụng HCBVTV nhằm tăng năng suất và chất lượng dược liệu
Khi được sử dụng, HCBVTV có thể tồn dư trong sản phẩm Nếu HCBVTV được dùng đúng theo quy định, mức tồn dư này là an toàn cho người sử dụng Theo quy định, mỗi loại HCBVTV đều có giá trị giới hạn dư lượng tối đa (MRL) Tuy nhiên, việc lạm dụng hoặc sử dụng không đúng cách các loại HCBVTV dẫn đến tồn
dư HCBVTV trong sản phẩm tăng lên vượt quá MRL Khi đó, HCBVTV sẽ gây ra các tác dụng không mong muốn cho người sử dụng
Việc xác định mức dư lượng HCBVTV trong dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu có ý nghĩa quan trọng để sàng lọc, loại bỏ các sản phẩm không đáp ứng được
sự an toàn cho người sử dụng Hiện nay, có hàng nghìn HCBVTV được cho phép sử dụng trong nông nghiệp Để có thể phân tích hết các HCBVTV, cần phải áp dụng rất nhiều kỹ thuật chiết và phân tích khác nhau, dẫn đến rất mất thời gian và tốn kém kinh phí Do đó, việc xây dựng được các phương pháp có thể xác định đồng thời nhiều HCBVTV thuộc nhiều nhóm khác nhau là nhu cầu cần thiết Trên thế giới, các phương pháp xác định HCBVTV đã được phát triển từ rất lâu và đã trải qua nhiều thành tựu… Hầu hết các phương pháp cố gắng hướng đến một phương pháp phân tích đồng thời nhiều HCBVTV trong cùng một lần phân tích Các phương pháp này được gọi là phương pháp đa dư lượng (MMM) Cục Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ đã ban hành
và thay đổi khá nhiều phương pháp đa dư lượng Trước đây, chiết lỏng lỏng kết hợp với làm sạch bằng sắc ký cột là phương pháp kinh điển trong phân tích dư lượng HCBVTV
Năm 2003, Anastassiades và cộng sự lần đầu tiên giới thiệu một phương pháp chiết và làm sạch nhanh, dễ dàng mà sau này được gọi là QuEChERS (viết tắt của Quick, Easy, Cheap, Efficient, Rugged, Safe) kết hợp với sắc ký khí khối phổ và sắc
ký lỏng khối phổ để phân tích HCBVTV trên rau quả [32] Phương pháp QuEChERS
đã nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi và được nhiều nước chấp nhận làm phương