49_ NHNUyen et al-Dap ung mien dich ca tra edwardsiella ictaluri

ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus GÂY RA BỞI VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri THE IMMUNE RESPONSE OF STRIPED CATFISHES Pangasianodon hypophthalmus INDUCED BY Edwar

ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

GÂY RA BỞI VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri

THE IMMUNE RESPONSE OF STRIPED CATFISHES (Pangasianodon hypophthalmus)

INDUCED BY Edwardsiella ictaluri Nguyễn Hoàng Nhật Uyên * , Huỳnh Kim Nguyên, Đặng Thị Hoàng Oanh và Jung Tae Sung

Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

Email: nhnuyen@ctu.edu.vn

ABSTRACT

This study was conducted to evaluate the immune response of striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) to attenuated Edwardsiella ictaluri bacteria Agglutination test was used to

quantify the level of specific antibody from striped catfish every week after soaking with

different concentrations ( 2x104-8 CFU/ml) of the attenuated bacteria and control group The

challenge test by injecting virulent E.ictaluri (1.5x105 CFU/fish) were done at 2 weeks post

exposure The results showed that specific antibody against E.ictaluri of all experimented

fishes were detected at 2nd week after soaking Antibody titers increased quickly at the 3rd week, following by a gradual rise In 6th week, the highest titer from treatments was found in treatment 1x108 with level 9.0 which was significant different (P<0, 05) from the control group (2.0) In addition, group soaking with 1x108 CFU/ml of the attenuated bacteria had significant lower mortality (25%) (P<0, 05) compared to control group (70%) These results

demonstrated using attenuated E.ictaluri at concentration 1x108 CFU/ml can stimulate striped

striped catfish generate specific antibody against E.ictaluri infection in experimental

condition

Keywords: Pangasianodon hypophthalmus, immune response, Edwardsiella ictaluri,

attenuated vaccine

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đồng Bằng Sông Cửu Long lâu nay vẫn được biết đến như một trong những vùng nuôi và xuất khẩu cá tra trọng điểm của Việt Nam Song hành với diện tích và sản lượng nuôi ngày càng tăng thì người nuôi phải đối mặt với vấn đề dịch bệnh ngày càng nhiều Một trong những

bệnh gây thiệt hại nặng nề cho nghề nuôi cá tra là bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra Trong trường hợp này người nuôi thường sử dụng kháng sinh để điều trị Tuy

nhiên việc sử dụng kháng sinh hiện nay đã không còn hiệu quả như mong muốn vì tình trạng

vi khuẩn kháng thuốc ngày càng nhiều Theo nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv hơn 70% các chủng E.ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra đã kháng với trimethoprim,

oxytetracycline và streptomycin Nhóm quinolon như fumequin, oxolinic acid và

enrofoxacin cũng đã giảm tác dụng (Dung et al., 2008, 2010) Để khắc phục tình trạng trên

cũng như khắc phục các nhược điểm của phương pháp dùng kháng sinh (ô nhiễm môi trường, tồn dư kháng sinh,…), hiện nay trên thế giới đã có nhiều loại vaccine thủy sản được nghiên cứu và sử dụng Tuy nhiên ở nước ta vẫn chưa có 1 loại vaccine nào được đưa vào ứng dụng rộng rãi mặc dù đã có một số nghiên cứu bước đầu thử nghiệm trên các đối tượng nuôi thủy sản Vaccine có nhiều loại với những ưu, nhược điểm khác nhau Trong đó, vaccine từ vi

khuẩn E.ictaluri nhược độc có nhiều ưu điểm là kích thích sinh miễn dịch nhanh và kéo dài,

dễ sản xuất, chi phí thấp,… Do đó nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá khả năng

gây miễn dịch của vi khuẩn E.ictaluri nhược độc trên cá tra trong điều kiện phòng thí nghiệm

nhằm cung cấp thêm thông tin về miễn dịch cũng như vaccine trên cá tạo tiền đề cho sự sản xuất vaccine sau này

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

− Cá tra giống khỏe, sạch bệnh có trọng lượng từ 20-25g

− Chủng vi khuẩn E.ictaluri HL3 được phân lập và định danh từ mẫu cá bệnh thu tại ao

− Chủng vi khuẩn E.ictaluri nhược độc DeltaE3 được thực hiện theo sơ đồ hình 1

Hình 1 Sơ đồ tạo chủng E ictaluri nhược độc bằng phương pháp đột biến gen

Bố trí thí nghiệm

Cá tra được bố trí thành 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 2 bể lặp lại, mỗi bể 20 con

(Hình 2A) Các nghiệm thức được ngâm (Hình 2B) trong vi khuẩn E.ictaluri nhược độc ở các

nồng độ từ 104 đến 108 CFU/ml trong 3 giờ có sục khí (Bảng 1)

Cá tra được tiêm cảm nhiễm chủng vi khuẩn E.ictaluri có độc lực HL3 ở tuần thứ 2 sau khi

ngâm vi khuẩn với nồng độ 1.5 x 105 CFU/ml (0.1 ml/cá) Cá được thu mẫu máu trước khi ngâm và định kỳ mỗi tuần sau ngâm (Hình 3), thu 3 con/nghiệm thức lặp lại 2 lần, số cá chết trong đợt cảm nhiễm được ghi nhận và tính tỉ lệ bảo hộ của vaccine theo công thức của Amend (1981): Tỉ lệ bảo hộ RSP= (1 – (% cá chết có vaccine/ % cá chết nhóm đối

chứng)*100

Bảng 1 Bố trí thí nghiệm ngâm vi khuẩn E.ictaluri nhược độc

Nghiệm thức 2x10

4

CFU/ml

1.5x10 5 CFU/ml

2x10 6 CFU/ml

2x10 7 CFU/ml

1x10 8 CFU/ml

Đối chứng

Chất ngâm E.ictaluri

nhược độc

E.ictaluri

nhược độc

E.ictaluri

nhược độc

E.ictaluri

nhược độc

E.ictaluri

nhược độc

NaCl 0.85%

Cảm nhiễm E.ictaluri E.ictaluri E.ictaluri E.ictaluri E.ictaluri E.ictaluri

Liều tiêm 1.5 x 105 1.5 x 105 1.5 x 105 1.5 x 105 1.5 x 105 1.5 x 105

Hình 2 A) Hệ thống bể thí nghiệm; B) Cá tra được ngâm vi khuẩn E.ictaluri nhược độc;

(C) Cá tra được gây nhiễm bằng phương pháp tiêm

Hình 3 Lịch bố trí thí nghiệm Phương pháp thu mẫu

Thu mẫu máu: Sử dụng benzocain (Merck) nồng độ 100 ppm để gây mê cá trong 1 – 2 phút

Vệ sinh vùng gần cuống đuôi của cá Dùng kim tiêm 1ml châm nhẹ vào phần cuống đuôi cho

để lấy máu từ động mạch chủ ở cột sống (Houston,1990) (Hình 4A) Cho máu vào ống eppendorf 1,5ml và để yên 2 – 3 giờ trong ngăn mát tủ lạnh, sau đó ly tâm 6.000 vòng/phút trong 5 phút Lấy phần huyết thanh phía trên cho vào ống eppendorf khác và đem xác định hàm lượng kháng thể hoặc trữ lạnh (Hình 4B và 4C)

Kiểm tra vi khuẩn: Cá sau khi thu mẫu máu được trữ lại mẫu thận trong ethanol (Merck) để

kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn bằng phương pháp PCR (Hình 5A)

Phương pháp bất hoạt vi khuẩn bằng formaline: Vi khuẩn E.ictaluri chủng HL3 sau khi

được nuôi tăng sinh được bất hoạt bằng formaline (37%) Xác vi khuẩn được rửa sạch formaline bằng nước muối sinh lý và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh hoặc ở -20ºC (Hình 5B)

VI

V

Tiêm cảm nhiễm Ngâm vi

khuẩn

B

A

Hình 4 A) Phương pháp lấy máu cá tra; B) Máu sau khi ly tâm; C) Huyết thanh

Hình 5 (A) mẫu thận trữ trong ethanol; (B) Chuẩn bị vi khuẩn làm kháng nguyên Phản ứng ngưng kết kháng nguyên-kháng thể

Phản ứng được thực hiện trên các đĩa nhựa (microplate) 96 giếng theo phương pháp vi ngưng kết kháng nguyên- kháng thể của Roberson (1990) Cho 25μl huyết thanh vào giếng số 1 và 2

Từ giếng số 2 trở đi pha loãng huyết thanh bằng nước muối sinh lý với nồng độ pha loãng bằng ½ Cuối cùng cho 25μl huyền dịch xác vi khuẩn vào các giếng rồi trộn đều Để yên 4 – 5 giờ ở nhiệt độ phòng rồi đọc kết quả Mổi đĩa 96 giếng có sử dụng 1 đối chứng dương (mẫu huyết thanh thu được có hiệu giá kháng thể cao nhất) và 1 đối chứng âm (nước muối sinh lý) (Hình 6A và 5B) Đọc kết quả: Dương tính (+): Đáy giếng tạo thành một lớp ngưng kết trải rộng Âm tính (-): Ở đáy giếng chỉ có một chấm tròn nhỏ màu trắng (Hình 6A)

Hình 6 A) Đọc kết quả phản ứng, B) Thao tác thực hiện KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể đặc hiệu

Mẫu máu của cá trước khi ngâm vi khuẩn đều có hiệu giá kháng thể bằng 0 Hiệu giá kháng thể trung bình (HGKTTB) của cá ở tất cả các nghiệm thức đều tăng sau mỗi tuần, đặc biệt tăng nhanh từ tuần thứ 2 sau ngâm vi khuẩn và đạt mức cao nhất ở cuối giai đoạn khảo sát (Hình 7

và bảng 2) Tuy nhiên, hàm lượng kháng thể có sự khác nhau ở mỗi nghiệm thức Ở tuần thứ nhất, cá bắt đầu có đáp ứng miễn dịch nhưng chưa có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng kháng thể của cá tra giữa các nghiệm thức (HGKTTB từ mức 0.0 đến 0.5) Đặc biệt ở nhóm đối chứng hầu như không có sự đáp ứng miễn dịch nào cho đến tuần thứ 4 xuất hiện kháng thể trong máu với HGKTTB là 1.7 do những con cá còn sống qua đợt cảm nhiễm bắt đầu có sự

đáp ứng miễn dịch khi được tiêm vi khuẩn E.ictaluri Tuy nhiên sự tăng lên này không thể

quan sát được ở các tuần tiếp theo vì nhóm này có tỉ lệ chết cao nhất (trên 70%) nên số cá thí nghiệm không còn để thu mẫu máu

Sự khác biệt về hàm lượng kháng thể giữa nhóm đối chứng và các nghiệm thức ngâm vi khuẩn được thể hiện rõ từ tuần thứ 3: trong khi đối chứng vẫn ở mức 0.0 thì HGKTTB ở các nghiệm thức còn lại đều tăng vọt có y nghĩa (P<0.05), và đạt mức cao nhất là 6.3 ở nghiệm thức 108 và không khác biệt nhiều với mức 5.8 của nghiệm thức 107 Ngược lại, nghiệm thức

104 có sự đáp ứng kháng thể thấp nhất (mức 3.5) trong số các nghiệm thức được ngâm vi khuẩn Ngoài ra kháng thể đặc hiệu tăng nhanh nhất vào giai đoạn này do cá sau khi ngâm

(tiếp xúc với E.ictaluri lần thứ nhất) đã hình thành kháng thể nguyên phát; sau 2 tuần lại được

gây cảm nhiễm (tiếp xúc lần 2) hình thành kháng thể thứ phát

Theo những thí nghiệm của Phạm Công Thành (2010) trên cá tra khi tiêm nhắc với vi khuẩn

E.ictaluri bất hoạt thì nhận thấy lượng kháng thể tăng lên đáng kể so với khi tiêm lần đầu Kết

quả này cũng tương đồng với các thí nghiệm trên cá nheo Mỹ và 1 số loài cá xương khác:

kháng thể gia tăng khi được kích thích lần 2 (Hanson et al., 1999).

Bên cạnh đó, nghiên cứu thăm dò đặc tính gây đáp ứng miễn dịch của tác nhân gây bệnh đốm

trắng mủ trên cá tra của Nguyễn Thị Mộng Hoàng và ctv (2009) cũng chỉ ra rằng việc tiêm

nhắc vào ngày thứ 14 kích thích đáp ứng miễn dịch thứ phát nên kháng thể hình thành sớm, cao hơn và duy trì lâu hơn so kháng thể nguyên phát Do đó HGKTTB của cá ở các nghiệm thức tiếp tục tăng cao ở các tuần tiếp theo và đạt mức cao nhất vào cuối giai đoạn khảo sát (tuần thứ 6) Nghiệm thức 108 vẫn là nghiệm thức có đáp ứng miễn dịch mạnh nhất, HGKTTB

là 8.7 và vẫn không khác biệt nhiều so với nghiệm thức 107 (mức 8.0) nhưng khác biệt có nghĩa so với nghiệm thức 106 (mức 7.0) Điều cần chú y ở đây là không có kết quả HGKTTB

của nghiệm thức 104, 105 và Đối chứng vì cá ở các nghiệm thức này có tỉ lệ chết cao nên không còn mẫu thu Tuy nhiên, có thể thấy rõ rằng sự đáp ứng kháng thể của cá tra ở tất cả nghiệm thức vẫn còn diễn ra và tăng nhanh ít nhất là đến cuối giai đoạn khảo sát

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

tuần

10^4 10^5 10^6 10^7 10^8

ĐC

Hình 7 Đáp ứng miễn dịch của cá tra qua từng giai đoạn khảo sát

Bảng 2 Hiệu giá kháng thể trung bình của cá tra trong giai đoạn khảo sát

Nghiệm

10 4 0.0a 0.3 ± 0.5a 3.5 ± 1.1b 3.7 ± 1.0a 4.5 ± 0.7a -

10 5 0.0a 1.7 ± 0.8b 4.2 ± 1.5bc 5.8 ± 1.3c 6.4 ± 1.1a -

10 6 0.2 ± 0.4a 2.0 ± 1.4b 4.2 ± 1.8bc 6.2 ± 1.8c 6.0 ± 2.0a 7.0 ± 0.0a

10 7 0.3 ± 0.8a 2.3 ± 2.3b 5.8 ± 1.5cd 6.2 ± 1.2c 6.6 ± 0.9a 8.0 ± 0.0ab

10 8 0.5 ± 0.6a 3.5 ± 0.8bc 6.3 ± 2.6d 6.7 ± 1.2d 7.3 ± 1.2b 8.7 ± 2.1b

Các giá trị trong bảng thể hiện giá trị trung bình và độ lệch chuẩn

Các giá trị trong cùng cột mang chữ cái mũ khác nhau thì khác nhau có y nghĩa thống kê (P<0.05)

Kết quả cảm nhiễm

Cá bệnh sau khi gây nhiễm có các dấu hiệu giống với cá bệnh ngoài tự nhiên: cá bệnh trong những ngày đầu và chết vào ngày thứ 4 đến ngày thứ 10 sau cảm nhiễm Cá bệnh có dấu hiệu

bỏ ăn, bơi xoay vòng đảo lên xuống nhiều lần sau đó lờ đờ rồi Bên trong tất cả cá chết đều có dấu hiệu đốm trắng ở gan, thận và tỳ tạng (Hình 8A)

Kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR cho thấy các mẫu thận thu được từ cá

chết đều dương tính (+) với E.ictaluri (Hình 8B) Như vậy có thể nói cá chết trong đợt gây nhiễm này nguyên nhân chính là do vi khuẩn E.ictaluri gây ra

Kết quả trình bày ở hình 9 và bảng 3 cho thấy có sự khác biệt đáng kể về tỉ lệ chết ở các nghiệm thức: nghiệm thức Đối chứng có tỉ lệ chết cao nhất (trên 70%) cũng là nghiệm thức có HGKTTB thấp nhất Trong số các nghiệm thức được ngâm vi khuẩn nhược độc có số cá chết giảm theo liều tiêm, tương ứng với tỉ lệ bảo hộ tăng dần và với nồng độ ngâm 1x108 CFU/ml đạt tỉ lệ bảo hộ cao nhất (65%) Nghiệm thức 105 và 106 có tỉ lệ bảo hộ bằng nhau (45%) và thấp nhất ở nghiệm thức 104 (30%) Có sự liên quan giữa hàm lượng kháng thể trong máu và

Gây cảm nhiễm

Cá nhiễm bệnh

Ngâm E.ictaluri

nhược độc

Hình 8 (A) Cá tra bị đốm trắng nội quan (B) Kết quả điện di sản phẩm PCR

50

28.6

25

71.4

0 10 20 30 40 50 60 70 80

nghiệm thức

10^4 10^5 10^6 10^7 10^8 ĐC

Hình 9 Biểu đồ tỉ lệ chết của cá tra ở các nghiệm thức thí nghiệm

Bảng 3 Tỉ lệ chết của cá tra ở các nghiệm thức

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Kết luận

Cá tra có đáp ứng miễn dịch đặc hiệu đối với vi khuẩn E.ictaluri nhược độc Đáp ứng miễn dịch mạnh nhất khi được ngâm vi khuẩn E.ictaluri nhược độc ở nồng độ 1x108 CFU/ml và gây nhiễm ở liều 1.5x105 CFU/ml (HGKTTB là 8.7, tỉ lệ bảo hộ 65%) Cá tra không được

ngâm vi khuẩn thì không đáp ứng kháng thể đối với E.ictaluri Việc tiêm cảm nhiễm ở tuần

thứ 2 còn có vai trò như mũi tiêm nhắc giúp kích thích quá trình sinh kháng thể diễn ra nhanh, mạnh hơn và mức HGKTTB ở tất cả các nghiệm thức vẫn tiếp tục tăng nhanh từ tuần thứ 3 đến cuối giai đoạn khảo sát

Đề xuất

Tiến hành thử nghiệm vaccine E.ictaluri nhược độc với số lượng cá tra lớn hơn, thời gian

khảo sát dài hơn nhằm tìm ra quy luật biến động của lượng kháng thể trong máu cá Đồng thời tiến hành thử nghiệm vaccine trong môi trường ao nuôi thực nghiệm

LỜI CẢM TẠ

Các nội dung nghiên cứu trong báo cáo này được thực hiện từ đề tài hợp tác giữa Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ và Phòng thí nghiệm Bệnh

Thủy sản, Khoa Thú y, Đại học Quốc gia Gyeongsang, Hàn Quốc về ”Vaccine nhược độc phòng bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)”

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Lê Hùng Dũng, Nguyễn Diễm Thư, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Thị Mộng Hoàng, Nguyễn Mạnh Thắng và Nguyễn Văn Hảo, 2007 Xác định tinh sinh miễn dịch và hiệu quả của các

loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý và thời

điểm khác nhau của Đồng Bằng Sông Cửu Long Tuyển tập nghề cá Sông Cửu Long 2007 Tr

375 – 388

Nguyễn Thị Mộng Hoàng, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Diễm Thư, Nguyễn Mạnh Thắng, 2009 Định danh và thăm dò đặc tính gây đáp ứng miễn dịch của tác nhân gây bệnh đốm trắng mủ

trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Tuyển tập

nghề cá Sông Cửu Long

Phạm Công Thành, 2010 Khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Luận văn cao học Khoa Thủy Sản –

Đại học Nông Lâm

Từ Thanh Dung, M Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thụy

Mai Thy, 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus)

Tạp chí khoa học, Đại học Cần Thơ 137 – 142

Từ Thanh Dung, 2011 Thử nghiệm vắcxin phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra nuôi thâm canh Tạp chí Thương mại thủy sản Số 139 – tháng 7/2011

Võ Thanh Tùng, 2010 Thí nghiệm thành công vắc-xin cho cá tra Tạp chí Thương mại Thủy sản Số 128 – tháng 8/2010

Amend, D.F, 1981 Potency testing of fish vaccines Dev Biol Standard., 49, 447-454

Bricknell ; L.R., J.A., Bowden, T.J anh Ellis, A.E, 1999 Duration of protective antibodies and correlation with protection in Atlantic salmon (salmon salar L.), following vaccination with

Aeromonas salmonicidae vaccine containing iron regulated membrane protein and secretory

polysaccharide Fish and shellfish Immunology, 9 :139-151

Craig A Shoemarker, Phillip H Klesius, Joseph M.Bricker, 1999 Efficacy of a modified live

Edwardsiella ictaluri vaccine in channel catfish as young as seven days post hatch

Aquaculture 176 (1999) 189-13

Crumlish M et al., 2002 Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish (Pagasianodon hypophthalmus) cultured in the Mekong Delta, Vietnam Journal of

fish Diseases, 733 – 736 pages

Hawke, J.P 1979 A bacterium associated with desease of pond cultured channel catfish,

Ictalus puncatus Journal of the Fisheries Research Board of Canada 36:1508-1512

Ronald L Thune, Lisa A Collins, Michael P Pena, 1997 A Comparision of Immersion/Oral Combination and Injection Methods for the Vaccination of Channel Catfish Ictalurus puncatus

Against Edwardsiella ictaluri Journal of the world aquaculture society, vol 28, No.2, June,

1997

Shoemaker, Phillip H Klesius, Joseph M Bricker 1999 Efficacy of a modified live

Edwardsiella ictaluri vaccine in channel catfish as young as seven days post hatch

Aquaculture, 176 pp

Vinitnantharat, S Anh J A Plumb, 1993 Protection of channel catfish Ictalurus puncatus following natural exposure to Edwardsiella ictaluri