(LUẬN văn THẠC sĩ) tách dòng và thiết kế vector biểu hiện đoạn gen mã hóa độc tố apx IA từ actinobacillus pleuropneumoniae​

Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae từ lâu đã được nghiên cứu nhiều và xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm màng phổi ở lợn.. pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ APXIA

TỪ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ APXIA

TỪ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE

NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

MÃ SỐ: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: 1 TS Nguyễn Thị Thu Ngà

2 PGS TS Dương Văn Cường

Thái Nguyên, 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Thu Ngà và PGS.TS Dương Văn Cường Các số liệu trích dẫn rõ ràng, các kết quả trong luận văn là trung thực

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những kết quả nghiên cứu trong luận văn này

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 6 năm 2018

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Huyền Trang

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Nguyễn Thị Thu Ngà và PGS.TS Dương Văn Cường đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, cảm ơn các cán bộ phòng Sinh học phân tử & Công nghệ tế bào - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên, cảm ơn Công ty thuốc thú y Đức Hạnh Marphavet đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện các thí nghiệm của đề tài

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn đã động viên khuyến khích giúp đỡ trong quá trình làm đề tài

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Huyền Trang

MỤC LỤC

Trang

TRANG BÌA PHỤ

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG ĐỀ TÀI iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh viêm màng phổi ở lợn và vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae 3

1.1.1 Bệnh viêm màng phổi ở lợn 3

1.1.2 Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae 5

1.2 Độc tố Apx và cơ chế gây bệnh 7

1.2.1 Ngoại độc tố Apx 7

1.2.2 Các yếu độc lực khác 10

1.2.3 Cơ chế gây bệnh 11

1.2.4 Gen mã hóa protein ApxIA 12

1.3 Vaccine phòng bệnh viêm màng phổi do A pleuropneumoniae gây ra 12

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Vật liệu, địa điểm, thời gian nghiên cứu 14

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 14

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Nghiên cứu thông tin về gen và thiết kế cặp mồi nhân gen 15

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 15

2.2.3 Phương pháp PCR 16

2.2.4 Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng và biểu hiện 17

2.2.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 18

2.2.6 Phương pháp cắt kiểm tra 19

2.2.7 Phương pháp xác định và phân tích trình tự DNA 20

2.3 Hóa chất và trang thiết bị nghiên cứu 20

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

3.1 Kết quả tách dòng và xác định trình tự đoạn gen ApxIA của A.pleuropneumoniae 23

3.1.1 Kết quả PCR nhân đoạn gen ApxIA 23

3.1.2 Kết quả biến nạp đoạn gen ApxIA vào vector tách dòng pGEM 24

3.1.3 Phân tích trình tự đoạn gen ApxIA 25

3.2 Kết quả thiết kế vector biểu hiện đoạn gen mã hóa độc tố ApxIA 28

3.2.1 Kết quả sàng lọc các dòng plasmid mang vector biểu hiện chứa đoạn gen ApxIA 28

3.2.2 Kết quả chọn lọc vector pET– ApxIA bằng PCR và cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn 29

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

1 Kết luận 31

2 Đề nghị 31

01 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG ĐỀ TÀI

App Actinobacillus pleuropneumoniae

bp Base pair DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate

Kb Kilo base LPS Lipopolysaccharide

NAD Nicotinamide Adenine Dinucleotide

PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi TAE Tris - Acetate - EDTA

Taq Thermus aquaticus

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Tỷ lệ lợn bị viêm màng phổi ở một số nước châu Âu 3

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng 17

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector biểu hiện 17

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng BamHI và HindIII 19

Bảng 2.4 Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 20

Bảng 2.5 Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 3.1 Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen ApxIA của A.pleuropneumoniae serotype 5a và ApxIA (GQ369732.1) 28

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Phổi lợn bị nhiễm trùng Actinobacillus pleuropneumoniae 5

Hình 1.2 Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae 6

Hình 2.1 Sơ đồ vector pGEM®-T Easy của Promega 14

Hình 2.2 Sơ đồ vector biểu hiện pET-28a (+) 14

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector biểu hiện pET - ApxIA 22

Hình 3.1 Kết quả nhân gen ApxIA từ App serotype 5a 23

Hình 3.2 Khuẩn lạc mang plasmid trên môi trường chọn lọc 24

Hình 3.4 Kết quả cắt vector pGEM- ApxIA bằng enzyme BamHI và HindIII 25

Hình 3.5 Kết quả so sánh trình tự nucleotide ApxIA của A.pleuropneumoniae serotype 5a phân lập được và ApxIA (GQ369732.1) trên Genbank 26

Hình 3.6 Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ đoạn gen ApxIA của A pleuropneumoniae serotype 5a phân lập được và ApxIA (GQ369732.1) trên Genbank 27

Hình 3.7 Kết quả tách plasmid các dòng có khả năng mang pET-ApxIA 29

Hình 3.8 Kết quả chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector pET-ApxIA bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu Apx 29

Hình 3.9 Kết quả chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector pET-ApxIA khi cắt bằng enzyme BamHI và HindIII 30

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Lợn là vật nuôi chiếm tỷ trọng cao trong ngành chăn nuôi ở Việt Nam Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi thì dịch bệnh cũng phát sinh, lây lan và gây thiệt hại lớn về kinh tế

Bệnh viêm màng phổi ở lợn là một trong số các bệnh thuộc hội chứng hô hấp phức hợp, được ghi nhận ở nhiều nước trên thế giới, nơi có ngành chăn nuôi lợn phát triển Bệnh có ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của đàn lợn với

tỷ lệ chết có thể lên đến 20% khi có dịch cấp tính xảy ra Tuy nhiên, các thiệt hại gián tiếp khi bệnh ở thể mãn tính gây ra như tăng trọng trên ngày giảm 50 gram và các chí phí thuốc cho điều trị cao hơn nhiều so với tỷ lệ chết

Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae từ lâu đã được nghiên cứu

nhiều và xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm màng phổi ở lợn Nhiều công bố đã cho thấy, mức độ độc lực khác nhau của các serotype vi

khuẩn A pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến ngoại độc tố (Apx) sản

sinh từ vi khuẩn đóng vai trò chính trong quá trình gây bệnh cho lợn Độc lực

của vi khuẩn A.pleuropneumoniae có liên quan đến bốn loại protein độc tố,

trong đó độc tố ApxI có độc lực cao, gây dung huyết và có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hướng đại thực bào phế nang và bạch cầu trung tính

Hiện nay để phòng bệnh viêm màng phổi do vi khuẩn A

pleuropneumoniae gây ra chủ yếu sử dụng vaccine nhược độc Đây đều là các

loại vaccine có giá thành khá cao, miễn dịch bảo hộ ở chuột hoặc lợn thí nghiệm cũng rất thất thường và không ổn định Trong những năm gần đây, việc ứng dụng kỹ thuật di truyền trong sản xuất vaccine đang được quan tâm, tạo ra vaccine thế hệ mới khắc phục được nhược điểm của các loại vaccine truyền thống như vaccine nhược độc

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Tách dòng và

thiết kế vector biểu hiện đoạn gen mã hóa độc tố Apx IA từ Actinobacillus pleuropneumoniae” nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu sản

xuất vaccine phòng bệnh sau này

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tách dòng được đoạn gen ApxIA mã độc tố ApxIA của vi khuẩn A.pleuropneumoniae

Thiết kế được vector biểu hiện protein tái tổ hợp Apx IA trên vi khuẩn

Escherichia coli

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Phân lập và tách dòng đoạn gen ApxIA mã hóa độc tố ApxIA của vi khuẩn A pleuropneumoniae

Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện pET-Apx IA mang đoạn gen mã

hóa độc tố Apx IA của vi khuẩn A pleuropneumoniae

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh viêm màng phổi ở lợn và vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae

1.1.1 Bệnh viêm màng phổi ở lợn

Bệnh viêm phổi hay còn gọi là bệnh viêm phổi màng phổi dính sườn trên

lợn là một trong số các bệnh thuộc hội chứng hô hấp phức hợp, bệnh có ảnh hưởng rất lớn đến năng suất đàn lợn Theo Jäger H C và đtg (2012) tổng hợp

dữ liệu từ 14 lò mổ tại Anh cho thấy trong 15.237 lô hàng giết mổ từ tháng 7 năm 2005 đến tháng 10 năm 2008, 80% bị ảnh hưởng bởi viêm màng phổi Các nghiên cứu ở các nước khác đã phát hiện thấy tỷ lệ viêm màng phổi tương tự

và thậm chí tăng lên ( Bảng 1.1 ) [9]

Bảng 1.1 Tỷ lệ lợn bị viêm màng phổi ở một số nước châu Âu

Vi khuẩn này xâm nhập vào lợn qua hệ thống hô hấp gồm miệng, phế quản, phế nang, thùy đỉnh và các thùy khác của phổi Thời gian ủ bệnh thường ngắn, khoảng 12 giờ đến 3 ngày [9]

Triệu chứng

Bệnh viêm màng phổi ở lợn có các triệu chứng lâm sàng khác nhau tùy thuộc vào nhiều yếu tốp như tuổi của lợn, tình trạng miễn dịch, điều kiện môi trường và mức độ cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh Tiến triển lâm sàng có thể

là quá cấp tính, cấp tính hoặc mãn tính

Bệnh viêm màng phổi thể quá cấp tính có đặc điểm lợn mắc bệnh sốt 41,5oC, mệt mỏi, bỏ ăn, có thể nôn mửa và tiêu chảy Thời gian ngắn trước khi chết, thường có những biểu hiện khó thở dữ dội, thở bằng mồm, lợn ở tư thế ngồi thở, nhiệt độ giảm nhanh Ngay trước khi chết, có chảy nhiều dịch bọt lẫn máu ở miệng và mũi, nhịp tim tăng; phần da ở mũi, tai, chân và sau cùng toàn

bộ cơ thể trở nên tím tái, lợn mắc bệnh thường chết sau 24 - 36 giờ [1], [21]

Bệnh viêm màng phổi thể cấp tính có đặc điểm lợn bệnh sốt từ 40,5oC -

41oC, da đỏ, mệt mỏi, nằm không muốn dậy, không muốn uống, bỏ ăn Các dấu hiệu hô hấp nặng như khó thở, ho và đôi khi thở bằng miệng rất rõ Bệnh diễn biến khác nhau tùy thuộc vào từng cá thể, phụ thuộc vào mức độ tổn thương ở phổi và thời điểm bắt đầu điều trị Lợn thường sống sót nếu qua được 4 ngày đầu của bệnh [1], [21]

Bệnh viêm màng phổi thể bán cấp tính có đặc điểm xuất hiện sau khi các dấu hiệu cấp tính mất đi; lợn bệnh không sốt hoặc sốt nhẹ, xuất hiện ho tự phát, với các cường độ khác nhau, con vật kém ăn, giảm tăng trọng [1], [6]

Bệnh viêm màng phổi thể mãn tính có đặc điểm lợn mắc bệnh không có biểu hiện rõ ràng trên lâm sàng Những con vật mắc bệnh thể mãn tính là nhân

tố truyền bệnh cho những lợn khác Những dấu hiệu viêm phổi sẽ biểu hiện rõ

hơn nếu có nhiễm trùng kế phát các vi sinh vật đường hô hấp khác như

Mycoplasma, Pasteurella, hay các nhân tố stress

Bệnh tích

Lợn bị nhiễm A pleuropneumoniae có những tổn thương chủ yếu ở đường

hô hấp Phần lớn các trường hợp lợn bị viêm hai bên phổi với tổn thương ở các thùy đỉnh, thùy tim và một phần các thùy trên vòm hoành Viêm màng phổi tơ huyết và fibrin thường rất rõ ở những lợn chết trong giai đoạn cấp tính của bệnh Những trường hợp lợn bị tử vong nhanh chóng như thể cấp tính thường quan sát thấy khí quản và các phế quản bị lấp đầy bởi các chất tiết nhày, bọt nhuốm máu, phổi trở nên sẫm màu, có rất nhiều máu ở lồng ngực và nhiều tơ huyết gắn giữa phổi, thành ngực, cơ hoành và màng ngoài tim (hình 1.1) [1] [21]

Hình 1.1 Phổi lợn bị nhiễm trùng Actinobacillus pleuropneumoniae [21]

1.1.2 Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae

Phân loại, hình thái

Vi khuẩn A pleuropneumoniae hay Haemophilus parahaemolyticus hoặc

Haemophilus pleuropneumoniae thuộc ngành Proteobacteria, lớp Gammaproteobacteria, bộ Pasteurellales, họ Pasteurellaceae, chi

Actinobacillus đã được xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi

- màng phổi truyền nhiễm ở lợn [4]

A pleuropneumoniae thuộc loại trực cầu khuẩn, kích thước nhỏ, thuộc

nhóm gram âm, kích thước khoảng 0,3 - 0,5 x 0,6 - 1,4 pm Vi khuẩn A

pleuropneumoniae không di động, không sinh nha bào, có khả năng hình thành

giáp mô, trừ một số chủng không có giáp mô Vi khuẩn có nhung mao với kích thước 0,5 - 2 x 60 - 450 nm Loại có vỏ (capsule) là polysaccharide được tìm

thấy ở hầu hết các serotype của vi khuẩn App, loại không có vỏ ít tìm thấy hơn

[4]

Đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn A pleuropneumoniae có khả năng lên men đường glucose,

xylose, mannitol, mannose và không lên men đường arabinose, lactose,

raffinose, sorbitol A pleuropneumoniae dương tính với các phản ứng urease,

oxidase, âm tính với phản ứng sinh Indol và không mọc trên thạch MacConkey [5]

Phân loại A pleuropneumoniae

Căn cứ vào nhu cầu cần sử dụng NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) hay còn gọi là yếu tố V cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn,

A pleuropneumoniae được chia thành 2 biotype chính Biotype 1 cần có NAD,

còn biotype 2 thì không cần NAD trong quá trình nuôi cấy, nhưng vẫn cần có các pyridine nucleotid đặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine nucleotid cho quá trình tổng hợp NAD [4] Biotype 1 có độc lực cao hơn biotype 2 [10] Biotype 1 có 12 serotype khác nhau dựa trên sự khác nhau của capsule polysaccharide (CPS) và của lipopolysaccharide (LPS) thành tế bào [7] Ở biotype 2 có serotype 2; 4; 7 và 9 có chung nhóm quyết định kháng nguyên như biotype 1 Trong những năm gần đây, serotype 13 và 14 thuộc biotype 2 được phát hiện và được mô tả có kháng nguyên khác với biotype 1 [16] Năm 2002,

Blackall P.J và đồng tác giả đã đề xuất một serotype mới của App - serotye 15

với HS143 là chủng tham chiếu cho serotype mới [5] Các serotype phân bố khác nhau giữa các quốc gia Ví dụ, các serotype 1 và 5 chiếm ưu thế ở Bắc

Mỹ, serotype 2 chủ yếu được tìm thấy ở châu Âu, serotype 15 chủ yếu ở Úc và serotype 2, 1 và 5 ở Nhật Bản Ở Việt Nam, serotype 2 và 5 rất phổ biến Serotype 1, 2, 5, 9 và 11 thường được tìm thấy có độc lực hơn các serotype khác [11]

1.2 Độc tố Apx và cơ chế gây bệnh

1.2.1 Ngoại độc tố Apx

Vai trò của ngoại độc tố (Exotoxin)

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mức độ độc lực khác nhau của các serotype

vi khuẩn A pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến ngoại độc tố (Apx)

sản sinh từ vi khuẩn và đóng vai trò chính trong quá trình gây bệnh cho lợn [15], [19], [21] Các nhà khoa học đã xác định độc lực của vi khuẩn

A.pleuropneumoniae có liên quan đến bốn loại protein độc tố Các độc tố này

được xếp vào nhóm RTX - toxin và đặt tên là độc tố Apx, bao gồm ApxI, ApxII, ApxIII Tính độc của mỗi loại độc tố này có thể thay đổi và phụ thuộc vào các

serotype khác nhau của vi khuẩn A pleuropneumoniae [14]

Độc tố ApxI

ApxI là một protein có trọng lượng phân tử từ 105 - 110 kDa, có độc lực cao, gây dung huyết và có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hướng đại thực bào phế nang và bạch cầu trung tính ApxI đầu tiên phát hiện và được đặt tên là

haemolysin I (HlyI) hay cytolysin I (ClyI) [5] ApxI được tiết ra bởi các A

pleuropneumoniae serotype 1; 5; 9; 10; 11 thuộc biotype 1 và serotype 14 của

biotype 2 Operon mã hóa cho protein ApxI được xác định là gen apxI và gồm

4 cistron được sắp xếp theo thứ tự là apxIC, apxIA, apxIB, và apxID, trong đó

C là chức năng tạo ra protein hoạt hóa, A là gen quy định cấu trúc độc tố và B cùng D là hai gen mã hóa cho các protein kết hợp với màng liên quan đến sự tiết độc tố qua cả hai màng Ion Canxi (Ca2+) cần thiết cho các hoạt động sinh

học của độc tố dung huyết A pleuropneumoniae [8] Phân tích protein của độc

tố ApxI cho thấy 56% tương đồng với HlyA- độc tố làm dung huyết của vi

khuẩn E coli [6] Các chủng sản sinh ra ApxI thường có độc lực cao, điều này cho thấy độc tố có liên quan đến độc lực của A pleuropneumoniae

Độc tố ApxII

ApxII là loại độc tố làm tan huyết, gây dung giải tế bào ở mức độ trung bình, trọng lượng phân tử khoảng 103 -105 kDa [7] Đầu tiên ApxII được gọi

là HlyII, ClyII hay CytII Tất cả các serotype của A pleuropneumoniae đều

tiết loại độc tố ApxII, ngoại trừ serotype 10 và 14 [6]

Operon mã hóa ApxII chỉ chứa các cistron apxIICA và thiếu các cistron bài tiết tương ứng Sự tiết ApxII phụ thuộc vào cistron apxIBD và gen này được tìm thấy ở tất cả các serotype của A pleuropneumoniae , ngoại trừ serotype 3

[19]

Độc tố ApxIII

ApxIII là loại độc tố không làm tan huyết, nhưng có khả năng gây dung giải tế bào mạnhk, trọng lượng phân tử 120 kDa [15] Đầu tiên, ApxIII được đặt tên là cytolysin III (ClyIII), độc tố viêm màng phổi - pleurotoxin (Ptx), hay

độc tố chống đại thực bào - macrophage toxin (Mat) [15] ApxIII được phân biệt với 2 độc tố ApxI và ApxII do không gây dung huyết, nhưng có khả năng gây dung giải mạnh các tế bào khác Cấu trúc của ApxIII giống 50% với cấu

trúc của ApxI và HlyI của vi khuẩn E coli Vùng operon mã hóa cho ApxIII chứa các gen apxIIICABD và giống với vùng operon mã hóa cho ApxI Protein độc tố ApxIII được tiết ra bởi các serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 của A

pleuropneumoniae [12], [19]

Độc tố Apx IV

ApxIV (ApxIVA) là độc tố RTX thứ 4 của A pleuropneumoniae đã được

phát hiện và đề xuất đặt tên là ApxIVA [6] Gen ApxIVA được phát hiện thấy

ở tất cả các serotype của A pleuropneumoniae và điều này chứng tỏ nó có tính

chất đặc trưng cho loài Chưa có nghiên cứu cụ thể về vai trò của độc tố ApxIV với vật chủ như thế nào trong quá trình gây bệnh, song đã có một số công trình nghiên cứu chứng minh sự tồn tại của ApxIVA trong cơ thể sống và được tạo

ra từ gen độc tố của vi khuẩn A pleuropneumoniae [6]

Không có serotype nào của A pleuropneumoniae có khả năng sản sinh ra

cả ba loại độc tố Apx, phần lớn chỉ có khả năng tạo ra 2 độc tố Các serotype 1; 5; 9; 11 và 13 sản sinh ra 2 loại độc tố là ApxI và ApxII; các serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 sản sinh ra ApxII và ApxIII Một số serotype chỉ tiết ra một loại độc tố Apx như serotype 10 chỉ tiết ApxI; serotype 7 và serotype 12 chỉ tiết

ApxII [11] Độc lực của các serotype A pleuropneumoniae thay đổi mạnh hay

yếu tùy thuộc vào loại độc tố mà mỗi serotype tiết ra Những serotype sản sinh

ra một hoặc hai độc tố thường có độc lực mạnh hơn những serotype không sản

sinh ra độc tố Theo Inzana và đồng tác giả (1991), A pleuropneumoniae

serotype 5 thể đột biến không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII đã không còn độc lực đối với lợn hoặc chuột thí nghiệm Điều này cho thấy độc tố là yếu tố quan

trọng xác định độc lực của vi khuẩn A pleuropneumoniae serotype 5 [11]

Đồng thời chủng A pleuropneumoniae này được dùng làm giống gốc sản xuất

vaccine và cho thấy động vật thí nghiệm không có khả năng bảo hộ đối với các chủng tự nhiên Kết quả nghiên cứu chứng minh các độc tố là cần thiết để kích

thích đáp ứng miễn dịch chống lại khả năng gây bệnh của các chủng A

pleuropneumoniae serotype 5 [1], [2], [3], [19]

1.2.2 Các yếu độc lực khác

Protein màng ngoài

Protein màng ngoài khác nhau giữa các chủng vi khuẩn A

pleuropneumoniae nhưng có một số loại protein màng ngoài có mặt ở hầu hết

các chủng Protein màng ngoài đóng vai trò như một thụ thể thu nhận sắt (iron)

và sắt là một yếu tố quan trọng trong sự tăng trưởng của A pleuropneumoniae

[4]

Kháng nguyên O

Kháng nguyên O hay Lipopolysaccharides (LPS) là thành phần chính

của màng ngoài tế bào vi khuẩn A pleuropneumoniae, liên quan nhiều đến

quá trình gây độc và có khả năng gây tổn thương đối với mô LPS có vai trò

quan trọng trong quá trình bám dính của vi khuẩn A pleuropneumoniae lên tế

bào biểu mô và lớp nhầy khí quản của lợn Bám dính là hoạt động ban đầu

giúp cho sự xâm nhập của vi khuẩn, rồi từ đó gây bệnh [4]

Kháng nguyên K

` Kháng nguyên K hay Polysaccharides vỏ vi khuẩn là yếu tố xác định

đặc trưng của hiện tượng phát ánh ngũ sắc trên bề mặt khuẩn lạc trong môi

trường nuôi cấy Lớp vỏ này của A pleuropneumoniae có độ dày từ 80 –

230 nm tùy thuộc vào các chủng khác nhau Các chủng A pleuropneumoniae

độc lực cao có lớp vỏ dày, trong khi một số chủng không độc có lớp vỏ mỏng hoặc dễ dàng bị phá vỡ LPS có vai trò quan trọng trong sự bám dính của vi

khuẩn lên tế bào biểu mô và lớp màng nhày khí quản của lợn [4]

Các protein thu nhận sắt

Khả năng cạnh tranh hấp thụ sắt được xem là một trong những yếu tố độc

lực quan trọng của A pleuropneumoniae giúp vi khuẩn tồn tại trong cơ thể vật chủ Chính protein gắn thụ thể vận chuyển đã giúp cho A pleuropneumoniae

được cung cấp đầy đủ sắt trong một thời gian ngắn sau quá trình xâm nhập gây nhiễm trùng [4]

1.2.3 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn A pleuropneumoniae sau khi xâm nhập vào cơ thể lợn sẽ gắn

vào các tế bào biểu mô trên bề mặt, sau đó tiến sâu vào bên trong các hốc của

hạch amidan, vi khuẩn A pleuropneumoniae di chuyển xuống đường hô hấp

dưới và tồn tại trong các phế nang, ở đây nó gây ra phần lớn các tổn thương Khi vi khuẩn tăng số lượng sẽ giải phóng các độc tố Apx từ lớp màng ngoài của vi khuẩn có chứa lipopolysaccharides (LPS) (kháng nguyên O) LPS và độc

tố Apx vừa giúp các vi khuẩn gây hại cho các tế bào vật chủ vừa ngăn chặn vi khuẩn bị phá hủy bởi thực bào LPS thu hút bạch cầu trung tính đến khởi đầu quá trình viêm và sau đó bạch cầu trung tính bị phá hủy bởi các độc tố cytotoxins sản sinh ra lysozymes gây tổn hại mô lân cận Các tổn thương mô

có thể tiến triển nhanh chóng, lợn bị nhiễm A pleuropneumoniae sẽ chết trong

vòng 4-12 giờ tiếp xúc [4]

A pleuropneumoniae không lây nhiễm sang người và không gây ảnh

hưởng đến sức khoẻ cộng đồng Đường lây lan chính là lây trực tiếp từ lợn bệnh sang lợn khỏe

Vi khuẩn A pleuropneumoniae có sức đề kháng kém, chỉ tồn tại trong môi trường tự nhiên trong thời gian ngắn Vi k h u ẩ n A pleuropneumoniae k h i

s ố n g t rong niêm dịch và môi trường có nhiều chất hữu cơ thì có thể sống sót trong vài ngày; trong nước sạch ở nhiệt độ 4oC, vi khuẩn có thể sống được

30 ngày Ngoài ra, trong khí dung vi khuẩn có thể sống sót trong nhiều ngày

Ở mô phổi và chất thải ở nhiệt độ phòng, vi khuẩn có thể tồn tại được trong 4 ngày Vi khuẩn bị diệt nhanh chóng ở điều kiện khô và các chất sát trùng thông thường [1], [3]

1.2.4 Gen mã hóa protein ApxIA

Protein ApxIA là protein quy định cấu trúc của độc tố ApxI [15]

Gen mã hóa độc tố ApxIA của A pleuropneumoniae dài 3069 bp, mã hóa

cho 1022 amino acid Từ vị trí amino acid 8 đến 652 tạo nên vùng RTX terminal domain, từ acid amin 729 đến 845 là vùng gắn Ca2+ (Ca2+-binding protein), từ amino acid 739 đến 749 là vùng peptidase_M10_C, từ amino acid

N-874 đến 1020 là vùng RTX C-terminal domain [11] Khối lượng phân tử của protein ApxIA tái tổ hợp khoảng 29 kDa [11]

Theo Shin Min-Kyoung và đtg (2011), vùng RTX C-terminal domain

thuộc ApxIA của App có thể tạo ra tính kháng nguyên và gây đáp ứng miễn

cerevisiae 2805 và được xác định bởi SDS-PAGE và Western blot [20]

1.3 Vaccine phòng bệnh viêm màng phổi do A pleuropneumoniae gây ra

Bảo vệ lợn bằng cách tiêm phòng chống A pleuropneumoniae, tác nhân gây bệnh viêm màng phổi gặp khó khăn bởi A pleuropneumoniae có 15 loại

serotype khác nhau [17]

Vaccine thương mại chống nhiễm trùng A pleuropneumoniae chủ yếu

bao gồm toàn bộ tế bào vi khuẩn – vaccine nhược độc Mặc dù giảm tỷ lệ tử vong, nhưng miễn dịch bảo hộ thường thất thường hoặc không ổn định Một số

chủng A pleuropneumoniae được sử dụng chế tạo các vaccine sống (vaccine nhược độc) phòng ngừa A pleuropneumoniae như Serotype 1 chủng 4074,

ATCC 27088, HS25; Serotype 7 chủng AP76, HS93; Serotype 2 chủng C5934; Serotype10 chủng D13039, Serotype 5 chủng J45 [17], [20]

Để khắc phục những hạn chế này, các vaccin tiểu đơn vị chống A

pleuropneumoniae đã được phát triển, mỗi loại vaccine chứa một hoặc một tập

hợp các kháng nguyên của vi khuẩn Các kháng nguyên này tạo nên tính miễn dịch trong cơ thể và được bảo đảm ổn với các chủng khác nhau Các loại

vaccine tiểu phần phòng ngừa A pleuropneumoniae đã được phát triển như

vaccine chứa protein màng ngoài, chứa kháng nguyên K, chứa độc tố Apx I, Apx II, ApxIII kết hợp protein màng ngoài OMP, chứa ApxI N- terminal, [17] Mặc dù tất cả các nghiên cứu và thử nghiệm đã được thực hiện với tiêm

chủng A pleuropneumoniae tuy nhiên một loại vaccine bảo vệ hoàn toàn chống

lại tất cả các serotype chưa đạt được thị trường [13], [14]