(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu chuyển gen GmCHI vào giống đậu tương đt51

Theo Cục Quản lý Thực Phẩm và Dược phẩm và Tổ chức Y thế giới đánh giá về chất lượng protein cho trẻ em và người lớn thì protein đậu tương có chất lượng cao nhất, chứa nhiều amino acid c

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmCHI

VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmCHI

VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT51

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

THÁI NGUYÊN – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nội dung trình bày trong luận văn là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu, kết quả sử dụng trong luận văn là trung thực và được sự đồng ý của cán

bộ hướng dẫn và nhóm nghiên cứu

Tác giả luận văn

Phạm Hải Yến

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, người thầy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn thạc sĩ này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ của Đề tài cấp Bộ Giáo dục &

Đào tạo “Nghiên cứu nâng cao hàm lượng isoflavone trong cây đậu tương

bằng công nghệ gen”, mã số B2016-TNA-18 do TS Hoàng Phú Hiệp làm

chủ nhiệm

Tôi xin cảm ơn cô Trần Thị Hồng, nghiên cứu sinh Lê Thị Hồng Trang cùng toàn thể các thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đã tôi trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành bài luận văn này

Tác giả luận văn

Phạm Hải Yến

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan……… i

Lời cảm ơn……… ii

Mục lục……… iii

Danh mục bảng……… iv

Danh mục hình……… v

Danh mục chữ viết tắt……… vi

Mở đầu ……… 1

1 Đặt vấn đề ……… 1

2 Mục tiêu nghiên cứu ……… 2

3 Nội dung nghiên cứu……… 2

Chương 1 Tổng quan tài liệu……… 3

1.1 Cây đậu tương……… 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái cây đậu tương……… 3

1.1.2 Vai trò của đậu tương……… 4

1.2 Isoflavone và enzyme chìa khóa trong quá trình sinh tổng hợp isoflavone ……… 6

1.2.1 Isoflavone ……… 6

1.2.2 Con đường sinh tổng hợp isoflavone ở đậu tương…… 9

1.2.3 Enzyme chalcone isomerase (CHI) và gen GmCHI…… 10

1.3 Chuyển gen ở đậu tương nhờ Agrobacterium………….………… 13

1.3.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương 13

1.3.2 Nghiên cứu biểu hiện gen CHI……… ……… 17

Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 19

2.1 Vật liệu nghiên cứu……… 19

2.2 Hóa chất và thiết bị……… 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 21

2.3.1 Phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen……… 21

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử……… 24

2.4 Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn……… 27

Chương 3 Kết quả và thảo luận……… 28

3.1 Chuyển cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc vào giống đậu tương ĐT51 nhờ A.tumefaciens……… 28

3.1.1 Kết quả khử trùng hạt……… 28

3.1.2 Kết quả tạo nguyên liệu biến nạp……… 29

3.1.3 Kết quả lây nhiễm và tái sinh cây đậu tương ……… 30

3.2 Phân tích sự có mặt của gen chuyển GmCHI trong đậu tương chuyển gen thế hệ T0……… 35

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số……… 35

3.2.2.Kết quả phân tích khuếch đại gen chuyển GmCHI……… 36

3.3 Thảo luận kết quả nghiên cứu……… 38

Kết luận và đề nghị……… 42

1 Kết luận……… 42

2 Đề nghị……… 42

Công trình công bố liên quan đến luận văn……… 43

Tài liệu tham khảo……… 44

Phụ lục 1……… 50

Phụ lục 2……… 51

Bảng 2.4 Chu kì nhiệt của phản ứng PCR……… 26

Bảng 3.1 Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI nhờ vi khuẩn A.tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín……… 34

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử isoflavone ……… 7 Hình 1.1 Chu trình chuyển hóa isoflavone ……… 11 Hình 2.1 Giống đậu tương ĐT51……… 19

Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc 35S-GmCHi-cmyc trong vector chuyển gen pCB301_GmCHI trong vi khuẩn A.tumefaciens……… 20 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm……… 23 Hình 3.1 Khử trùng hạt bằng khí clo trong bình thủy tinh kín 29 Hình 3.2 Hình ảnh hạt đậu tương và hạt nảy mầm trong giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu cho biến nạp……… 30 Hình 3.3 Hình ảnh của đậu tương trong giai đoạn gây tổn thương nách lá mầm và biến nạp……… 31 Hình 3.4 Hình ảnh của đậu tương chuyển gen trong giai đoạn tạo chồi và kéo dài chồi……… 32 Hình 3.5 Hình ảnh của đậu tương chuyển gen trong giai đoạn ra

rễ và trồng cây đậu tương chuyển gen trên giá thể ……… 33 Hình 3.6 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách

từ lá các cây đậu tương chuyển gen và cây không chuyển gen 36 Hình 3.7 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại

đoạn gen GmCHI-cmyc-KDEL từ các cây đậu tương chuyển gen

và cây không chuyển gen với cặp mồi

GmCHI-NcoI-F/GmCHI-cmyc- SacI-R……… 37

DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

GmCHI Glycine max chalcone isomerase

CHI Chalcone isomerse

A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng áp suất cao)

ER Estrogens receptor (thụ thể estrogens)

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] thuộc họ Đậu (Fabaceae) là loại

cây trồng quan trọng, đứng thứ sáu về sản lượng hạt có dầu được sản xuất rộng rãi, được trồng ở nhiều vùng khí hậu khác nhau trên thế giới [45] Đậu tương có hàm lượng dinh dưỡng cao hơn hẳn so với các thực phẩm khác Hạt đậu tương có hàm lượng protein là 40% khối lượng khô, lipid 12-25%, glucid 0-15% và nhiều hợp chất hữu cơ khác Theo Cục Quản lý Thực Phẩm và Dược phẩm và Tổ chức Y thế giới đánh giá về chất lượng protein cho trẻ em

và người lớn thì protein đậu tương có chất lượng cao nhất, chứa nhiều amino acid cần thiết cho người mà cơ thể không tổng hợp ra được, như metionin, tryptophan, lysine, isoleucine, leucine, phenylalanine, valine Đặc biệt, trong mầm đậu tương có một chất tương tự như kích thích tố nữ estrogen, đó là isoflavone Chất này có công thức hoá học gần giống như kích thích tố nữ estrogen Vì thế, nó được mệnh danh là estrogen thực vật (phyto - estrogen)

và có vai trò quan trọng đối với sức khoẻ phụ nữ, bảo vệ phụ nữ trước một số căn bệnh như: tim mạch, rối loạn tiền mãn kinh, ung thư và loãng xương [46] Isoflavone là một nhóm các chất chuyển hóa thứ cấp chủ yếu có ở loại cây họ Đậu và đặc biệt có nhiều trong mầm đậu tương Tuy nhiên, hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương thấp, trong khoảng từ 50 – 3000 µg/g và tồn tại ở hai dạng chính là glycoside và aglucone Dạng glycoside có trọng lượng phân tử lớn, chiếm tới trên 90% isoflavone tổng số và được cho là có sự hấp thụ hạn chế trong hệ tiêu hóa người, trong khi đó, dạng aglucone được hấp thụ nhanh hơn, nhưng hàm lượng lại rất thấp, chỉ chiếm từ 1% – 5% isoflavone tổng số [16] Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tăng hàm lượng isoflavone dạng

aglucone trong hạt đậu tương Chính vì vậy hướng tiếp cận nghiên cứu nâng cao hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương bằng công nghệ gen đang được quan tâm ứng dụng

Isoflavone được tổng hợp thông qua con đường phenylpropanoid từ hợp chất flavonoid trong thực vật bậc cao Quá trình chuyển hóa tổng hợp isoflavone là một chuỗi các phản ứng với sự tham gia của nhiều enzyme, trong đó có hai enzyme chìa khóa là isoflavone synthease (IFS) và chalcone isomerase (CHI) CHI xúc tác chuyển hóa chalcone thành flavanone và từ flavanone tạo thành isoflavone với sự tham gia của enzyme IFS Như vậy, nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzym chìa khóa trong quá trình sinh tổng hợp isoflavone ở cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen là một biện pháp công nghệ có hiệu quả nâng cao hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành

đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen GmCHI vào giống đậu tương ĐT51”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Chuyển được cấu trúc mang gen GmCHI vào giống đậu tương ĐT51

phục vụ tạo dòng đậu tương chuyển gen có hàm lượng isoflavone cao

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI qua nách lá mầm đậu tương nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và tạo cây đậu tương chuyển gen

3.2 Phân tích cây đậu tương chuyển gen thông qua xác định sự có mặt của

gen chuyển GmCHI bằng kỹ thuật PCR

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.1.1 Đặc diểm hình thái cây đậu tương

Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc chi Glycine, họ Đậu

(Fabaceae) có bộ nhiễm sắc thể là 2n = 40 Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh Đậu tương có nguồn gốc được thuần hóa ở Trung Quốc [8]

Cây đậu tương có rễ cọc gồm một rễ chính và nhiều rễ phụ, rễ chính ăn sâu trong lòng đất 30 – 50 cm, các rễ phụ có thế phát triển lan rộng 30 – 40

cm2 Trên rễ của đậu tương có nhiều nốt sần là do các vi khuẩn Rhizobium

Japonicum cộng sinh với rễ đậu tương Trong một nốt sần có khoảng 3 – 4 tỷ

vi sinh vật cố định đạm

Đậu tương là một loài cây thân thảo, cây trồng ngắn ngày Thân thường dài từ 14 – 15 lóng, mỗi lóng có chiều dài khoảng 3 – 10 cm, cây cao khoảng 0,3 - 1,0 m Toàn thân bao phủ bởi một lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn và cả cuống lá Những giống có mật độ lông to dày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn, chịu rét khỏe Ngược lại, những giống không có lông tơ thường sinh trưởng không bình thường, sức chống chịu kém Thân cây có lông dài ngắn, dày thưa, nhiều ít là đặc điểm để phân biệt các giống đậu tương với nhau Thân cây thường có màu xanh hoặc tím khi còn non, về già thì có màu nâu nhạt Nếu thân non màu xanh thì hoa màu trắng còn thân non màu tím thì hoa có màu tím đỏ

Lá đậu tương có 3 loại lá mọc ra tùy theo giai đoạn sinh trưởng, đó là:

lá mầm, lá nguyên và lá kép Lá thường mọc so le, có màu xanh tươi khi già thì chuyển thành màu vàng nâu Lá kép thường có 3 lá chét với hình dạng khác nhau tùy loài, thường có nhiều lông tơ

Hoa nhỏ, không mùi, thuộc loại cánh bướm Màu sắc hoa thay đổi tùy theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng Hoa phát sinh ở nách

lá, đầu cành và đầu thân Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có 1 - 10 hoa

1.1.2 Giá trị dinh dưỡng của hạt đậu tương

Hạt đậu tương chứa 8% nước, 5% chất vô cơ, 15 - 25% glucose, 20% chất béo, 35- 45% chất đạm với đủ các loại amino acid cần thiết và nhiều khoáng chất So với thịt động vật, đậu tương có nhiều chất dinh dưỡng hơn:

15-100 gr đậu tương có 411 calo; 34 gr đạm; 18 gr béo; 165mg calcium; 11mg sắt; trong khi đó thịt bò loại ngon chỉ có 165 calo, 21gr đạm; 9gr béo; 10mg calcium và 2,7 mg sắt Vì có nhiều đạm nên đậu tương đã được coi như “thịt không xương” ở nhiều quốc gia châu Á Tại Nhật Bản, Trung Quốc 60% hàm lượng đạm tiêu thụ hàng ngày đều do đậu tương cung cấp Đạm này rất tốt để thay thế cho thịt động vật vì có ít mỡ và cholesterol Đậu tương có nhiều đạm hơn thịt, nhiều calcium hơn sữa bò, nhiều lecithin hơn trứng Các amino acid cần thiết mà cơ thể không tạo ra được thì đều có trong đậu tương Khi đậu tương ăn chung với một số ngũ cốc như ngô thì đạu tương sẽ bổ sung một số amino acid mà ngô không có Với trẻ em, chất đạm của đậu tương là món ăn

quý giá cho các em bị dị ứng với sữa bò hoặc không tiêu thụ được đường lactose

Hàm lượng protein tổng số dao động trong hạt đậu tương từ 29,6 - 50,5%, trung bình là 36 - 40% Các nhóm protein đơn giản (% so với tổng số protein): albumin (6 - 8%), globulin (25 - 34%), glutelin(13 - 14%), prolamin chiếm lượng nhỏ không đáng kể Protein đậu tương dễ tan trong nước và chứa nhiều amino acid không thay thế đáp ứng nhu cầu của người và động vật, như valine, leucine, isoleucine, methionine, tryptophan, threonine, lysine, phenylalanine

Đậu tương được chế biến thành nhiều món ăn như đậu phụ, đậu phù chúc, sữa đậu nành, tào phớ, tương, Bên cạnh vai trò là một loại cây thực phẩm, đậu tương cũng có tác dụng chữa bệnh tim mạch và ung thư Theo các nghiên cứu từ trước tới nay, việc sử dụng đậu tương có thể làm giảm lượng cholesterol trong máu 10 - 15% Lượng cholesterol càng cao thì hiệu quả sử dụng đậu tương càng rõ Kể cả khi bệnh nhân đã ăn chế độ ít béo, ít cholesterol, nếu ăn thêm đậu tương vẫn có tác dụng hạ thấp hơn nữa lượng cholesterol trong máu Do vậy, ăn đậu tương được nhiều bác sĩ coi là cách chữa bệnh vừa hiệu quả, lại ít tốn kém và không độc Cholesterol chỉ gây tác hại cho mạch máu nếu bị oxy hóa Đậu tương không những làm giảm cholesterol mà còn ức chế khả năng oxy hóa của chất này Các nhà nghiên cứu Nhật Bản cho biết, đạm đậu tương hoạt động như một chất chống oxy hóa mạnh Ngoài ra, nó còn có khả năng ức chế sự kết hợp cholesterol thành các

tổ chức clot - bước quan trọng dẫn đến rối loạn hoạt động của tim, tạo nên các cơn đau tim

Năm 1990, Viện ung thư Quốc gia Mỹ đã xem xét vai trò của đậu tương trong phòng bệnh ung thư và xác định ở đậu tương có năm nhóm chất chống

ung thư Trong đó, người ta đặc biệt chú ý đến tác dụng chống ung thư của isoflavone, một nhóm hóa chất gần như không tồn tại trong các thực phẩm khác ngoài đỗ tương Tác dụng chống ung thư của đậu tương được giải thích

là do isoflavone của nó đã tác động như một anti-oestrogen, làm vô hiệu hóa tác động của oestrogen, giống như thuốc Tamoxifen đang được dùng rộng rãi

và có kết quả trong điều trị ung thư vú [49]

Một trong các isoflavone của đậu tương được nghiên cứu nhiều nhất trong 7 - 8 năm qua là genistein Các công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng genistein có khả năng ngăn chặn sự phát triển của khối u Bên cạnh việc ngăn cản sự hình thành các mạch máu mới (một điều kiện tiên quyết để khối

u phát triển), genistein còn ức chế các enzyme trong các loại tế bào ung thư,

và do đó, nó được coi là chất có khả năng phòng chống nhiều thể ung thư khác nhau [49]

1.2 ISOLAVONE VÀ ENZYME CHÌA KHÓA TRONG QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP ISOFLAVONE

1.2.1 Isoflavone

Đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương đã được quan tâm nhiều hơn trong những năm gần đây, vì đậu tương có vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người Đậu tương chứa daidzein, genistein, glycitein cùng với dạng glycosid của chúng, acetyl tương ứng và dẫn xuất malonyl [21] Vai trò trên chủ yếu là do một hợp chất trong đậu tương, đó là isoflavone

Isoflavone là các polyphenol không màu thuộc lớp flavonoid Trong khi

phần lớn flavonoid có vòng B gắn vào vị trí 2 của vòng tròn C, isoflavone có vòng B gắn vào vị trí số 3 của vòng C (Hình 1.1) Ngay cả khi chúng không phải là steroid, chúng có cấu trúc tương đồng với estrogen, đặc biệt là estradiol Điều này mang lại cho chúng tính chất giả hình, chẳng hạn như khả

năng gắn kết thụ thể estrogen; do đó, chúng được phân loại như phytoestrogens hoặc estrogen thực vật

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử isoflavone

(Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Isoflavone)

Isoflavone là các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học tích tụ trong đậu tương trong quá trình phát triển Hàm lượng isoflavone có trong hạt đậu tương là thay đổi, phụ thuộc vào yếu tố di truyền và tác động của môi trường Các thí nghiệm được tiến hành để xác định liệu isoflavone được tổng hợp trong các mô hạt trong quá trình phát triển hay ở các cơ quan của thực vật và được vận chuyển đến các hạt nơi chúng tích lũy Phân tích sắc kí khối phổ (HPLC) phát hiện ra các hợp chất này có trong tất cả các cơ quan của đậu tương, nhưng hàm lượng isoflavone khác nhau tùy thuộc loại mô và giai đoạn phát triển Nồng độ lớn nhất là tìm thấy trong hạt nảy mầm và lá đậu tương [15]

Isoflavone là một lớp chất của isoflavonoid, hoạt động như kích tố nữ ở động vật có vú Isoflavone chủ yếu được tổng hợp trong các cây họ đậu Các chất isoflavone hoạt động như phytoestrogens để kích hoạt động giả bằng cách gắn kết các thụ thể estrogens (ER) ở động vật có vú [11], [36]

Các dẫn xuất chính của isoflavone là daidzein, genistein và glycitein [42] Các chất này chỉ khác nhau về nguyên tử hydro và các nhóm hydroxyl,

ví dụ như, genistein và daidzein là hai dạng chính trong họ isoflavone, genistein chỉ khác daidzein ở nhóm hydroxyl liên kết với carbon số 5 [44] Daidzein và genistein là những chất isoflavone phổ biến nhất, có cấu trúc hóa học đặc trưng [20]

Isoflavone được coi là chất chống oxy hóa, chống ung thư, kháng khuẩn

và có cả hoạt động chống viêm giống như các flavonoid khác Isoflavone gợi lên một hiệu ứng estrogens yếu (agonistic) hoặc chống estrogens (đối kháng), tùy thuộc vào mức độ estrogens nội sinh và ER [23] Isoflavone ngăn chặn sự liên kết của các estrogens mạnh hơn, có vai trò trong việc phòng ngừa ung thư

vú, ung thư cổ tử cung, tuyến tiền liệt hoặc ung thư tinh hoàn [33]

Khi lượng estrogen giảm trong thời kỳ mãn kinh, nhiều phụ nữ sử dụng liệu pháp hormone Liệu pháp hormone có thể giúp làm giảm triệu chứng mãn kinh nhưng nó cũng gây một số rủi ro Liệu pháp hormone có thể làm tăng nguy cơ đau tim, đột quỵ, ung thư vú và mất trí nhớ Isoflavone thì lại không gây những rủi ro này Nghiên cứu cho thấy isoflavone làm giảm nguy cơ u xơ tử cung và nội mạc tử cung Tỷ lệ người ung thư vú và tuyến tiền liệt ở người châu Á thấp hơn người ở phương Tây, điều này có thể liên quan đến mức độ tiêu thụ đáng kể isoflavone khác nhau trong chế độ ăn của người châu Á (15 – 4mg/ngày) [27] so với chế độ ăn của người phương Tây (0,15 – 1,7mg/ngày) [29]

Isoflavone có khả năng trung hòa các gốc tự do, trong số các isoflavone, genistein có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất [47] Trong những thập kỷ gần

đây, các nghiên cứu dịch tễ học mở rộng, cùng với các thí nghiệm in vivo, in

vitro đã chỉ ra rằng isoflavone có lợi cho bệnh nhân bị các bệnh tim mạch, ung

thư, loãng xương và mãn kinh [13], [30] Isoflavone đã được chứng minh thông qua các thử nghiệm lâm sàng với vai trò làm giảm nguy cơ tăng cholesteron máu, bệnh tim mạch và ung thư [14] Isoflavone có tầm quan trọng đối với các tương tác giữa thực vật và môi trường như: các chất ức chế nhiễm trùng gây bệnh (phytoalexins) và tín hiệu các phân tử để cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm [14]

1.2.2 Con đường sinh tổng hợp isoflavone ở đậu tương

Con đường phenylpropanoid tạo ra một loạt các sản phẩm khác nhau có nguồn gốc tự nhiên của thực vật Một nhánh của con đường này là nhánh flavonoids phổ biến hầu hết ở các loài thực vật, một nhánh khác của con đường phenylpropanoid mà hầu như chỉ họ Đậu (Fabaceae) mới có, hình thành nên isoflavonoid [14]

Trong đậu tương, isoflavone gồm daidzein, genistein và glycitein được

dự trữ trong không bào [38] Genistein, daidzein và glycitein được tổng hợp bởi một nhánh của con đường phenylpropanoid Trong con đường trao đổi chất này cũng có sự tổng hợp các hợp chất thực vật quan trọng khác như tannin, linhin, lignans, anthocyanins, flavone, flavonol, phytoalexin, glyceollin và pterocarpan có hoạt động kháng khuẩn [16],[18]

Con đường phenylpropanoid có nhiều nhánh với chất xuất phát ban đầu

là phenylalanine, kết quả tạo thành các chất như: glycitein, genistein, flavone, glyceollin, anthocyanin và tanin đặc (còn được gọi là proanthocyanidin) dưới tác dụng của hàng loại các enzyme chuyển hóa [17], [39], [40]

Một enzyme quan trọng khác trong con đường tổng hợp isoflavone là chalcone isomerase (CHI) chuyển đổi chalcone thành flavanone, và chalcone reductase (CHR), hình thành nên daidzein và glycitein Các chalcone được tổng hợp bởi CHS được chuyển đổi sang các naringenin flavone (5,7,4’-

trihydroxyflavone) bởi enzyme chalcone isomerase (CHI) [40]

Con đường phenylpropanoid bắt đầu với cơ chất đầu tiên là amino acid L – phenylalanine (Hình 2.1) Phản ứng đầu tiên của con đường này là khử nhóm amino (-NH3) của amino acid phenylalanine tạo thành acid cinnamic bởi phenylalanine amoni-lyase (PAL) Con đường này tiếp diễn thêm hai phản ứng khác nữa dẫn đến hình thành coumaroyl – CoA Hợp chất này được biến đổi thành hai dạng naringenin chalcone hoặc isoliquiritigenin bởi hai enzyme tương ứng là chalcone synthease (CHS) và reductase chalcone (CHR) Sau đó

từ hai chất trên, naringenin và liquiritigenin được tạo thành nhờ sự xúc tác của các enzyme chalcone isomerase (CHI)

Naringenin được sử dụng để tổng hợp flavonoid như flavones, flavonols, tanin cô đặc và anthcyanins, cũng như isoflavone, genistein Liquiritigenin trong con đường dẫn chất isoflavonoid của cây họ Đậu (Fabaceae) và được chuyển đổi thành glycitein và daidzein, tiền thân caue glyceollins, một nhóm phytoalexins quan trọng [14]

Sự tổng hợp daidzein và genistein từ liquiritigenin và naringenin là hoàn toàn được xúc tác bởi enzyme isoflavone synthease (IFS) và hydroxyl-hydroxan dehydratase Tổng hợp glycitein vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhưng theo giả thuyết có thể có nguồn gốc từ isoliquiritigenin [18]

1.2.3 Enzyme chalcone isomerase (CHI) và gen GmCHI

Con đường phenylpropanoid với sự tham gia của hàng loạt các enzyme chia thành hai nhánh tổng hợp, trong đó enzyme then chốt của một nhánh – chalcone isomerase, xúc tác các phản ứng flavone, là xương sống cho nhiều chất chuyển hóa như flavonoid và isoflavonoid Trong con đường tổng hợp này, phenylalanine thông qua sự xúc tác của nhiều loại enzyme để biến đổi thành naringenin chalcone Bắt đầu từ hợp chất này, con đường

phenylpropanoid được chia thành hai nhánh Trong cả hai nhánh, enzyme chalcone isomerase đều đóng vai trò “chìa khóa” Nếu vì một lý do nào đó,

gen CHI không hoạt động thì enzyme chalcone isomerase không được tổng

hợp, dẫn theo hàng loạt các dẫn xuất của isoflavone không đươc tạo thành, con đường phenylpropanoid bị dừng lại

Hình 1.2 Chu trình chuyển hóa isoflavone [18]

Chalcone isomerase (CHI) là enzyme chìa khóa xúc tác các phản ứng sản sinh ra flavonoid, là khung xương để chuyển hóa thành các chất như flavones

và isoflavone [20] Flavonoid là một loại chất có nhiều trong thực vật, là một loại chất chuyển hóa thứ cấp trong con đường phenylpropanoid Flavonoid có vai trò quan trọng trong việc giữ các hoạt động sinh lý bình thường trong cây trồng, ví dụ hình thành màu sắc trong thực vật, bảo vệ cây khỏi bức xạ tia cực tím, tăng sức đề kháng đối với mầm bệnh, kích thích sự phát triển của phấn hoa, vận chuyển hormone thực vật và tương tác giữa rễ cây và vi khuẩn

Rhizobium

Chalcone isomerase là enzyme có vai trò quan trọng trong việc xúc tác biến đổi chalcone thành (2S) flavanol hoặc (2S)-5-desoxidation flavanol Đã

xác định được hai dạng của gen CHI, loại I và loại II CHI loại I có thể xúc

tác 6-hydrox-chalcone vào flavonoid (2S)-flavonoid hoặc

(2S)-5-desoxidation CHI loại I được tìm thấy ở nhiều loài thực vật như lúa mạnh, lúa, cải dầu, và Arabidopsis CHI loại II chủ yếu được tìm thấy trong cây họ

Đậu (Fabaceae), có thể xúc tác cả 6-hydrox-chalcone và chalcone thành flavonoid (2S)-flavonoid hoặc (2S)-5-desoxidation flavonoid

6-deoxidation-[43] Gen CHI từ nhiều loài thực vật khác nhau như: ngô, đậu tương, lúa

mạch, cỏ cari, hoa cẩm chướng và Saussurea medusa đã được nhân bản thành

công [26] Mô hình biểu hiện gen CHI khác nhau ở các loài thực vật khác nhau Thông qua mô hình biểu hiện của gen CHI ở cà chua trong cây thuốc lá

ta thấy sự gia tăng mạnh mẽ của flavonoid trong vỏ và bột của cây cà chua chuyển gen mà không gây ra bất kì kiểu hình nào khiếm khuyết Ngăn chặn

con đường tổng hợp flavonoid bằng cách khử hoạt hóa gen CHI trong hành

tây dẫn đến sự tích tụ chalcone ở mức độ cao và làm giảm lượng flavonoid,

kết quả tạo ra ngô vàng Sử dụng RNAi ức chế biểu hiện của gen CHI làm

hàm lượng flavonoid giảm, phấn hoa và cánh hoa biến mất [26]

Gen CHI (cDNA) đã được nhân bản từ nhiều loài thực vật bậc cao, như đậu tương (G max), ngô (Z.mays), lạc (A hypogaea), P.hybrida và S medusa [22]

Gen CHI có kích thước dao động 0,6 kb - 2,1 kb đã được nghiên cứu từ

nhiều loại cây như bông, đại mạch, cà chua, ích mẫu, cỏ linh lăng, lúa, dã yên thảo, cam thảo, quýt, bòng, đậu xanh, đậu đỏ, sắn dây [23] Hai mươi tám gen

CHI và 7 FAP được tìm thấy từ 6 mẫu thực vật, trong đó cây họ đậu có nhiều

gen CHI hơn các loài thực vật khác Các nhà khoa học đã xác định được 12 gen

GmCHI chia thành bốn phân họ: GmCHI 1A, GmCHI 2, GmCHI 3 và FAP

[23] trong đó trong hai phân họ đầu tiên gồm GmCHI1A, GmCHI1B1,

GmCHI1B2 và GmCHI 2 mã hóa enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển

hóa chalcone thành flavones [14] Ở cây đậu tương, gen CHI được xác định

nằm trên nhiễm sắc thể số 20 [26]

1.3 CHUYỂN GEN Ở ĐẬU TƯƠNG NHỜ AGROBACTERIUM

1.3.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương

Hiện nay có rất nhiều các nghiên cứu khoa học được thực hiện trên đối tượng nghiên cứu là đậu tương ở thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng Đậu tương là cây biến đổi gen chiếm diện tích lớn nhất trên toàn thế giới (60%), sau đó là ngô (22%) và bông vải (11%) Năm 2015, diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới đạt 179,7 triệu ha Trong đó, đậu tương biến đổi gen được áp dụng rộng rãi nhất, chiếm 83% tổng diện tích trồng đậu tương trên thế giới (48) Việc tìm kiếm và phát hiện các gen chức năng trong

hệ gen của đậu tương, phân lập, tách dòng, chuyển gen tạo giống, dòng đậu tương đã thu được nhiều thành tựu Hiện có tất cả 36 công trình chuyển gen được công bố, chủ yếu liên quan đến tính trạng kháng sâu và thuốc diệt cỏ, một số ít liên quan đến tính chịu hạn và tăng hàm lượng các hoạt chất có vai trò quan trọng

Thứ nhất là tạo các dòng đậu tương chuyển gen có khả năng kháng sâu, bệnh hại Nghiên cứu chọn tạo các giống đậu tương biến đổi gen kháng ruồi đục thân, sâu đục quả, đã thiết kế được bốn vector mới mang gen kháng sâu

cry2Aa, cry4A, cry2Aa + soycy1Ac, cry4A + soycry1Ac; tạo được các dòng

biến đổi gen từ giống William đến thế hệ T2 được xác định qua phân tích

Southern blot mang gen soycry1Ac hoặc vip3A [48]

Thứ hai là tạo các dòng đậu tương chịu các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như hạn, nóng, lạnh Nghiên cứu chuyển gen chịu hạn Hahb-4 (có nguồn gốc

từ cây hoa hướng dương) đã được công bố và phê duyệt áp dụng tại Argentina năm 2015 Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn tiếp tục nghiên cứu

các gen khác liên quan đến tính trạng chịu hạn, đặc biệt là nhóm gen NAC

Tại Việt Nam, mỗi năm phải nhập khẩu 2,5 triệu tấn đậu tương, sản lượng đậu tương hàng năm thu được chỉ đáp ứng 18% nhu cầu trong nước do năng suất thấp mà chủ yếu là kết quả của stress phi sinh học trong đó hạn hán là hạn chế lớn Do vậy, việc nghiên cứu, phát triển các giống đậu tương ưu tú có thể đối phó với tình trạng khan hiếm nước được xem là một mục tiêu quan trọng của các nhà khoa học trong nước [48]

Thứ ba là chọn tạo giống đậu tương nhằm tăng hàm lượng các chất hoạt tính có trong đậu tương có vai trò quan trọng như genistein, daidzein, flavonoid

Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long đã nghiên cứu tạo chọn dòng đậu tương chịu hạn (vector pPTN-rd29A-drebIA), kết quả phân tích PCR của 8 dòng T0 kháng thuốc diệt cỏ có 5 dòng có sự hiện diện của gen chịu hạn

drebIA

Năm 2014, Henry Nguyen và cs đã nghiên cứu chuyển gen GmNAC003

và GmNAC004 sử dụng promoter 35S vào cây Arabidopsis Kết quả cho thấy

cây chuyển gen GmNAC004 so với cây đối chứng có sự gia tăng số lượng và

chiều dài rễ trong điều kiện thường và tăng cao trong điều kiện hạn [31] Theo nghiên cứu mới nhất của Reem Hussain và cs (Trường Đại học

Nông Nghiệp Huazhong, 2017), đã xác định được 139 gen GmNAC, phân tích biểu hiện 28 gen GmNAC, kết quả cho thấy biểu hiện gen GmNAC phụ thuộc vào kiểu gen; 8 trong số 28 gen chọn lọc (GmNAC004, GmNAC021,

GmNAC065, GmNAC066, GmNAC073, GmNAC082, GmNAC083 và GmNAC087) đã được phát hiện có mức độ biểu hiện cao ở các giống đậu

tương chịu hạn Nghiên cứu này xác định gen GmNAC có thể được xem là

trọng tâm trong các nghiên cứu trong tương lai trong việc phát triển đậu tương chịu hạn cao [19]

Trong nghiên cứu của Qu và cs (2016), các tác giả đã thực hiện quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium trên đối tượng nghiên cứu là đậu tương bằng cách sử dụng một vector biểu hiện RNAi chứa gen β tiểu đơn vị của globulin 7S Phân tích PCR và Southern blot đã được sử dụng để xác nhận việc gắn của vec tơ vào bộ gen đậu nành có thành công hay không Trong nghiên cứu này, việc chuyển đổi cây đậu nành bằng cách sử dụng một vector biểu hiện RNAi chứa tiểu đơn vị β ở globulin 7S đã thành công Tổng cộng có

10 cây đậu tương chuyển gen dương tính ở thế hệ T0, 6 cây chuyển gen dương tính ở thế hệ T1 và 13 cây chuyển gen dương tính ở thế hệ T2 Các mức độ giao thoa biểu hiện của tiểu đơn vị β trong 7S thay đổi trong mỗi cây biến đổi gen và cao nhất mức độ can thiệp đạt 77,5% Do đó, một dòng đậu tương mới chứa hàm lượng thấp chất gây dị ứng thu được, có chứa vector biểu hiện RNAi [34]

Yếu tố phiên mã MYB là một trong những họ lớn nhất trong thực vật, đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự phát triển của cây trồng và

sự chuyển hóa sinh lý Yang và cs (2009) đã nghiên cứu biểu hiện và chức

năng của gen nhân tố phiên mã MYB GMMYBJ6 (GenBank No DQ902863)

được phân lập từ đậu tương (Glycine max L Merrill) Mô hình biểu hiện của

GmMYBJ6 trong các cơ quan khác nhau đã được kiểm tra bằng cách sử dụng

phương pháp phân tích thấm nước của Northern Sự biểu hiện của GmMYBJ6

chỉ được phát hiện trong lá Khả năng hoạt hóa phiên mã của protein GmMYBJ6 đã được xác nhận bởi hệ thống xét nghiệm hoạt tính của beta-galactosidase là 28,48 U/mL Phân tích bán định lượng RT-PCR chỉ ra rằng

GmMYBJ6 đã cải thiện sự biểu hiện của một số gen sinh tổng hợp flavonoid,

như CHN (Phenylalanine ammoni ligase), C4H (cinnamate-4-hydroxylase), 4CL (4-coumaroyl-CoA ligase), CHS (Chalcone synthase), CHI (Chalcone isomerase ), F3H (Flavanone 3-hydroxylase) và FLS (Flavonol synthase), kết quả là sự gia tăng hàm lượng flavonoid trong các chất chuyển hóa thuốc lá dương tính Thêm vào đó, sự biểu hiện ngày càng tăng của GMMYBJ6 trong cây đậu tương Zhongdou 27 do bức xạ UV-B, hạn hán và xử lý muối cao cho

thấy GmMYBJ6 có liên quan đến phản ứng đối với các áp lực abiotic [41].

Trong những năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở cây đậu tương và tập trung vào hướng cải thiện, nâng cao khả năng chịu hạn, kháng sâu của cây đậu tương Trần Thị Cúc Hòa đã tối ưu hóa quy trình chuyển gen ở đậu tương để làm cơ sở cho công tác tạo chọn các dòng đậu tương biến đổi gen ở Việt Nam Nghiên cứu được

thực hiện với phương pháp nách lá mầm qua trung gian A tumefaciens và

chọn lọc bằng glufosinate trên giống đậu tương nhập nội Maverick Tối ưu

hóa đạt được bằng cải tiến khâu lây nhiễm với A.tumefaciens qua thử

nghiệm bốn phương pháp lây nhiễm khác nhau Kết quả qua phân tích Southern blot cho thấy cách lây nhiễm thông qua gây tổn thương nách lá

mầm trong dung dịch chứa A.tumefaciens, duy trì ở nhiệt độ 21 độ C trong

thời gian đồng nuôi cấy (co-cultivation) 5 ngày cho hiệu quả chuyển nạp gen

cao hơn so với các phương pháp lây nhiễm khác, với tần suất chuyển nạp gen đạt từ 2-6% Phương pháp lây nhiễm này được đưa vào quy trình chuyển nạp gen ở đậu tương để nâng cao hiệu quả chuyển nạp gen phục vụ cho công tác chọn tạo giống đậu tương biến đổi gen ở Việt Nam [8] Các nghiên cứu

của Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) chuyển gen P5CSm vào giống đậu

tương DT84 [6], Nguyễn Thu Hiền (2011) biến nạp cấu trúc chứa đoạn gen

HA1 của virus H5N1 vào giống đậu tương ĐT12 [7], Lò Thị Mai Thu (2014)

chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào hai giống đậu tương ĐT12 và DT2008 [4], nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào giống đậu tương DT84 của Lò Thanh Sơn (2015) [3] biến nạp cấu trúc GmDREB2 vào giống đậu tương DT84 của Đào Xuân Tân (2016) [1] đều được thực hiện

qua nách lá mầm nhờ lây nhiễm A.tumefaciens và đạt hiệu suất trong khoảng

từ 2% đến 5%

1.3.2 Nghiên cứu biểu hiện gen CHI

Có nhiều công trình khoa học nghiên cứu về gen CHI trên các đối

tượng khác nhau thu được nhiều thành công Năm 2012 Yue Zhang và cs đã

nhân dòng và biểu hiện gen CHI ở lạc thành công, kết quả chỉ ra rằng đó là gen CHI loại I mã hóa 1 peptide cho 255 amino acid [43] Năm 2005 Lyle

Ralston và cs tái lập một phần của flavonoid và isoflavonoid sinh tổng hợp trong nấm men sử dụng CHI I và CHI II ở đậu tương [25] Cheng và cs (2011) đã phân lập được trình tự gen mã hóa enzyme chalcone isomerase từ

lá của cây bạch thảo (Ginkgo biloba L.) được gọi là GbCHI Gen GbCHI

chứa hai intron và ba exon, mã hóa một peptide gồm 244 amino

acid RQPCR cho thấy GbCHI đã được biểu hiện theo mô cụ thể trong G biloba Protein tái tổ hợp được biểu hiện thành công trong một dòng E.coli với vector pET-28a Hoạt tính enzyme in vitro, được khảo sát bởi phân tích HPLC, chỉ ra rằng protein GbCHI tái tổ hợp có thể xúc tác sự hình thành của

naringenin từ 6'-hydroxychalcone Phân tích RQPCR cho thấy hoạt động CHI tương quan với sự thay đổi mức độ sao chép của gen CHI, hoạt động của

GbCHI cũng tương quan dương với nồng độ flavonoid trong lá cây bạch

thảo, cho thấy CHI là một gen chính điều chỉnh sự tích tụ flavonoid trong lá

cây bạch thảo [12]

Wang và cs (2012) đã tiến hành phân lập cDNA CHI từ cây nho (Vitis

vinifera L.), tạo protein tái tổ hợp được tinh chế và đã được tạo ra kháng thể

polyclonal Sử dụng các công cụ, biểu hiện và mô địa hoá của CHI trong việc

phát triển quả nho đã được phân tích bằng kỹ thuật RT-PCR, gel blot và kỹ

thuật miễn dịch hóa học Nghiên cứu cho thấy rằng sự biểu hiện của CHI phụ thuộc vào giai đoạn phát triển, và protein CHI phân bố chủ yếu trong các bó

mạch trên tất cả các giai đoạn phát triển của quả nho [39]

Wang và cs (2018) đã tiến hành phân tích trình tự và kết quả liên kết

đồng đẳng cho thấy chuỗi protein CnCHI có độ tương đồng cao với các chuỗi protein khác của CHI Protein CnCHI có một miền bảo thủ Chalcone 3, được bảo tồn trong quá trình tiến hóa, cho thấy rằng CnCHI là một thành viên của

họ gen CHI Kết quả phân tích cho thấy biểu hiện CnCHI trong hoa cao hơn nhiều so với rễ, thân, lá của Chamaemelum nobile, cho thấy gen CnCHI là

một gen biểu hiện khác biệt, là một loại enzyme chủ chốt trong con đường

tổng hợp flavonoid trong C.nobile [37]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Giống đậu tương ĐT51 được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện cây Lương thực và Thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Hình 2.1 thể hiện hình thái hạt của giống đậu tương ĐT51 được sử dụng trong nghiên cứu này

Hình 2.1 Hạt của giống đậu tương ĐT51

Giống đậu tương ĐT51 được chọn tạo bằng con đường lai hữu tính Giống được công nhận tạm thời, và hiện đang được đưa vào sản xuất thử nghiệm trong vùng đồng bằng, trung du Bắc Bộ trong 3 vụ hè, đông và xuân Giống đậu tương ĐT51 có hoa màu tím, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chín có màu vàng Chiều cao cây 45 - 55cm, phân cành khá, hơn 2 cành/cây, số quả chắc cao, tỷ lệ quả 3 hạt đạt 25 - 30 % Khối lượng 100 hạt khoảng từ 17,5 - 20,0 g Thời gian sinh trưởng trung bình 90 - 95 ngày, năng suất 20 - 29 tạ/ha,

tuỳ thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh ĐT51 có khả năng gieo trên chân đất vừa mới thu hoạch mạ, đất ướt nhưng tỷ lệ nảy mầm vẫn đạt rất cao Ngoài ra, trong giai đoạn sinh trưởng phát triển nếu có bị ngập 4 - 5 ngày, giống này vẫn có khả năng sống được, lá không bị héo, rễ không bị thối Theo thông tin của nhóm nghiên cứu năm 2016, hàm lượng isoflavone trong hạt nảy mầm 3 ngày tuổi của giống đậu tương ĐT51 (41,28 mg/100g) cao hơn hẳn so với 3 giống đậu tương còn lại là DT90 (30,62 mg/100g), DT2008 (26,17 mg/100g) và ĐT84 (29,43 mg/100g) [2]

Chủng vi khuẩn A.tumefaciens chứa cấu trúc mang gen GmCHI do Bộ

môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, trường Đại học

Sư phạm – Đại học Thái Nguyên cung cấp

Vector chuyển gen pCB301_GmCHI chứa mang gen chuyển GmCHI có

cấu trúc được trình bày ở hình 2.2 Trong cấu trúc chuyển gen này, gen

GmCHI được phân lập từ giống đậu tương ĐT26 có hàm lượng isoflavone

cao Vi khuẩn A.tumefaciens tái tổ hợp chứa vector pCB301 mang cấu trúc

35S-GmCHI-cmyc-KDEL được làm mới bằng nuôi trên môi trường chọn lọc

chứa kanarmycine và nuôi phục hồi khi mật độ tế bào đạt giá trị OD600nm là 0,8 tạo dịch huyền phù phục vụ cho lây nhiễm

Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc 35S-GmCHI-cmyc trong vector chuyển gen

pCB301_GmCHI trong vi khuẩn A.tumefaciens nptII: gen kháng kanamycin; CaMV35S: promoter 35S; GmCHI: gene mã hóa chalcone isomerase phân lập

từ cây đậu tương; cmyc: trình tự nucleotde mã hóa peptid cmyc; KDEL: trình

tự nucleotde mã hóa peptide KDEL