nghiên cứu phát triển bộ dữ liệu chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công tác giám sát chất lượng dược liệu và thuốc đông dược

Sử dụng Emodin tinh chế được làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lượng Emodin trong hai vị dược liệu: Đại hoàng, Cốt khí củ 67 3.7.1.. Một số thông số của các pic phụ trên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

  

-ĐỖ THỊ THANH THUỶ

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN EMODIN TỪ ĐẠI HOÀNG PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA

ĐỖ THỊ THANH THUỶ

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN EMODIN TỪ ĐẠI HOÀNG PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG THUỐC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Chuyên ngành : Kiểm nghiệm thuốc - độc chất

Mã số : 60 73 15

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS.Trịnh Văn Lẩu

2 ThS Phạm Thị Giảng

Hà Nội - 2008 LỜI CẢM ƠN

Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trungương.

PGS.TS Chu Đình Kính - Viện Hoá học- Viện Khoa học công nghệViệt Nam

Tiến sĩ Trần Việt Hùng – Khoa Vật lý đo lường - Viện Kiểmnghiệm thuốc Trung ương

Thạc sĩ Lê Thị Hường Hoa - Khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

Đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng quản

lý sau Đại học, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà nội, các bạn đồngnghiệp trong khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm, khoa Kiểm nghiệm Đông dược -Dược liệu, khoa Vật lý đo lường viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã tạođiều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi, gia đình và bạn bè đã động viên, khích lệtôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình thực hiện luận văn này

Hà nội, ngày tháng năm 2008Dược sĩ: Đỗ Thị Thanh Thuỷ

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Vài nét về chất đối chiếu (chất chuẩn) 3

1.2 Tổng quan về các vị dược liệu dùng trong nghiên cứu đề tài 3

1.2.1 Đại hoàng (Rhizoma Rhei) 4

1.2.2 Cốt khí củ (Radix Polygoni cuspidati) 5

1.3 Khái niệm chung về anthranoid 6

1.4 Emodin 6

1.4.1 Đặc điểm và tính chất của Emodin 6

1.4.2 Tác dụng dược lý của Emodin 8

1.5 Tổng quan về chiết xuất dược liệu, chiết xuất và tinh chế anthranoid 8

1.5.1 Chiết xuất dược liệu 8

1.5.2 Chiết xuất và tinh chế anthranoid 9

1.6 Tổng quan về một số phương pháp hoá lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài 10

1.6.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) 10

1.6.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 12

1.6.3 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 16

1.6.4 Phương pháp đo phổ hồng ngoại (phổ IR) 16

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 21

2.2.2 Hoá chất, dung môi 22

2.3 Nội dung nghiên cứu 22

2.4 Các phương pháp dùng để nghiên cứu 23

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25

3.1 Chiết xuất và tinh chế Emodin từ vị dược liệu Đại hoàng 25

3.1.1 Chiết xuất Emodin 25

3.1.2 Tinh chế Emodin 32

3.2 Định tính Emodin tinh chế được bằng SKLM, xác định nhiệt độ nóng chảy và đo phổ IR 41

3.2.1 Định tính Emodin tinh chế được bằng SKLM 41

3.2.2 Xác định nhiệt độ nóng chảy của Emodin tinh chế được 44

3.2.3 Đo phổ hồng ngoại của Emodin tinh chế được 45

3.3 Xác minh cấu trúc của Emodin tinh chế được 46

3.3.1 Phân tích khối phổ 46

3.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 46

3.4 Định tính, định lượng Emodin tinh chế được và xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được bằng HPLC 49

Emodin tinh chế được bằng phương pháp HPLC với detector UV 49

3.4.2 Định tính Emodin tinh chế được 52

3.4.3 Định lượng Emodin tinh chế được 55

3.4.4 Xác định giới hạn tổng cộng các tạp chất chất liên quan của Emodin tinh chế được 56

3.5 Thẩm định phương pháp HPLC đã sử dụng để định lượng Emodin tinh chế được 59

3.5.1 Tính chính xác 59

3.5.2 Tính tuyến tính 60

3.5.3 Tính đúng 61

3.5.4 Tính đặc hiệu 63

3.6 Xây dựng tiêu chuẩn dự thảo cho chất chuẩn phòng thí nghiệm Emodin 65

3.7 Sử dụng Emodin tinh chế được làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lượng Emodin trong hai vị dược liệu: Đại hoàng, Cốt khí củ 67

3.7.1 Định tính và định lượng Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng 67

3.7.2 Định tính và định lượng Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ 76

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 88

4.1 Về chiết xuất và tinh chế 88

4.2 Về định tính Emodin tinh chế được bằng SKLM, xác định nhiệt độ nóng chảy và đo phổ IR 88

4.3 Về việc xác minh cấu trúc của Emodin tinh chế được 88

KẾT LUẬN 91 KIẾN NGHỊ 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 PHỤ LỤC

13C-NMR : Carbon (13) Nuclear magnetic resonance

C : Chuẩn

C + T : Chuẩn + Thử

1H-NMR : Proton nuclear magnetic resonance

DĐVN III : Dược điển Việt Nam III

DEPT : Distotionless enhancement by polarization transfer

ĐT : Định tính

GLP : Good laboratory practice

HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation

HMQC : Heteronuclear multiple quantum correlation

HPLC : High performance liquid chromatography

HQ : Huỳnh quang

HSQC : Heteronuclear single quantum correlation

IEC : International electrotechnical commission

Bảng 1.1 Độ tan của Emodin trong một số dung môi hữu cơ ở 25 C 7

Bảng 3.1 Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn 1 - Hệ I 29

Bảng 3.2 Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn 2 - Hệ I 30

Bảng 3.3 Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn 3 - Hệ I 31

Bảng 3.4 Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của các phân đoạn khi khảo sát với hệ dung môi I 35

Bảng 3.5 Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của phân đoạn 5 khi khảo sát với hệ dung môi II và III 39

Bảng 3.6 Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc ký của cắn Emodin khi khảo sát với hệ dung môi I, II và III 42

Bảng 3.7 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cắn Emodin 45

Bảng 3.8 Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của cắn Emodin 48

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi định lượng Emodin tinh chế được 50

Bảng 3.10 Kết quả định lượng Emodin tinh chế được 56

Bảng 3.11 Một số thông số của các pic phụ trên sắc ký đồ của dung dịch thử khi xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được 58

Bảng 3.12 Kết quả xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được 59

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 60

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 63

Bảng 3.15 Kết quả định tính Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng bằng SKLM 69

Bảng 3.20 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi

định lượng Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ 85Bảng 3.21 Kết quả định lượng Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ 86

Hình 1.1 Vị dược liệu Đại hoàng 4

Hình 1.2 Vị dược liệu Cốt khí củ 6

Hình 1.3 Cấu trúc hoá học của Emodin 7

Hình 1.4 Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng 12

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất Emodin bằng phương pháp đun nóng hồi lưu 27

Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát cắn 1-Hệ I 29

Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát cắn 2-Hệ I 30

Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát cắn 3-Hệ I 31

Hình 3.5 Hệ thống sắc ký cột tự tạo để tinh chế Emodin 34

Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 1- Hệ I 36

Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 2 - Hệ I 36

Hình 3.8 Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 3- Hệ I 37

Hình 3.9 Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 4- Hệ I 37

Hình 3.10 Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ I 38

Hình 3.11 Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ II 39

Hình 3.12 Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn 5 - Hệ III 40

Hình 3.13 Ảnh chụp cắn Emodin 41

Hình 3.14 Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ I 43

Hình 3.15 Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ II 43

Hình 3.16 Sắc ký đồ khảo sát cắn Emodin - Hệ III 44

Hình 3.17 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn khi định lượng Emodin tinh chế được 52

Hình 3.18 Sắc ký đồ dung dịch thử khi định lượng Emodin tinh chế được 52

chất liên quan của Emodin tinh chế được 57

Hình 3.23 Sắc ký đồ dung dịch thử khi xác định giới hạn tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được 57

Hình 3.24 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích của pic Emodin 61

Hình 3.25 Sắc ký đồ của mẫu trắng – Khảo sát độ đặc hiệu 64

Hình 3.26 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn-Khảo sát độ đặc hiệu 64

Hình 3.27 Sắc ký đồ của mẫu thử-Khảo sát độ đặc hiệu 64

Hình 3.28 Sắc ký đồ thu được khi định tính Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng bằng SKLM 69

Hình 3.29 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng bằng HPLC 70

Hình 3.30 Sắc ký đồ dung dịch thử khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng bằng HPLC 70

Hình 3.31 Phổ UV-VIS của dung dịch chuẩn và dung dịch thử khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng 71

Hình 3.32 Kết quả chồng phổ UV-VIS của pic Emodin thu được từ dung dịch thử và dung dịch chuẩn khi định lượng Emodin trong vị dược liệu Đại hoàng 71

Hình 3.34 Sắc ký đồ thu được khi định tính Emodin toàn

phần trong vị dược liệu Cốt khí củ bằng SKLM 80Hình 3.35 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn khi định lượng Emodin

trong vị dược liệu Cốt khí củ bằng HPLC 81Hình 3.36 Sắc ký đồ dung dịch thử khi định lượng Emodin trong

vị dược liệu Cốt khí củ bằng HPLC 81Hình 3.37 Phổ UV-VIS của dung dịch chuẩn và dung dịch thử khi

định lượng Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ 82 Hình 3.38 Kết quả chồng phổ UV-VIS của pic Emodin thu được

từ dung dịch chuẩn và dung dịch thử khi định lượng

Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ 82

thuốc tân dược và thuốc đông dược, thuốc đơn thành phần và thuốc đa thànhphần, cùng một loại hoạt chất nhưng có nhiều biệt dược khác nhau, nhiềudạng bào chế khác nhau Trước một thị trường dược phẩm đa dạng như vậythì việc tăng cường quản lý Nhà nước để đảm bảo chất lượng thuốc cho nhândân luôn được coi là nhiệm vụ chiến lược của ngành Dược nói riêng và ngành

Y tế nói chung

Một trong những khâu quan trọng trong nhiệm vụ đảm bảo chất lượngthuốc cho nhân dân hiện nay là công tác kiểm tra chất lượng thuốc Trongcông tác này chất chuẩn đóng vai trò rất quan trọng vì nhiều phép thử nhưđịnh tính, định lượng, xác định tạp chất đều cần đến chất chuẩn Đến naychúng ta đã thiết lập được hàng trăm chất chuẩn, chủ yếu là chất chuẩn hoáhọc có nguồn gốc tổng hợp phục vụ đắc lực cho công tác kiểm tra chất lượngthuốc Tuy nhiên vẫn còn rất nhiều chất chuẩn đặc biệt là các chất chuẩn cónguồn gốc dược liệu chúng ta chưa thiết lập được để đáp ứng yêu cầu củacông tác kiểm nghiệm thuốc nói chung và thuốc đông dược, dược liệu nóiriêng Một trong số những chất chuẩn hiện nay chúng ta chưa thiết lập được là

Emodin, một hoạt chất có trong các vị dược liệu như Đại hoàng (Rhizoma Rhei), Hà thủ ô đỏ (Radix Polygoni multiflori), Cốt khí củ (Radix Polygoni cuspidati), Muồng trâu (Folium Cassiae alatae), Chút chít (Radix Rumicis) .

Xuất phát từ nhu cầu cần có chất chuẩn để phục vụ công tác kiểm trachất lượng thuốc chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thiết lập chất chuẩnEmodin từ Đại hoàng phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc”

Đề tài này là một phần trong đề tài cấp bộ “Nghiên cứu phát triển bộ dữliệu chuẩn của một số dược liệu thường dùng phục vụ công tác giám sát chấtlượng dược liệu và thuốc đông dược” của Khoa kiểm nghiệm Đông dược -Dược liệu - Việm kiểm nghiệm thuốc Trung ương Đề tài được thực hiện vớicác mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế Emodin từ vị dược liệu Đại hoàng

2 Định tính, xác minh cấu trúc, định lượng Emodin tinh chế được vàxác định giới hạn tổng cộng các tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được

3 Sử dụng Emodin tinh chế được làm chất chuẩn phòng thí nghiệm đểđịnh tính và định lượng Emodin trong hai vị dược liệu: Đại hoàng, Cốt khí củ

phép thử đó, các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chấtcủa chất cần thử Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích

sử dụng Chất đối chiếu được dùng trong các phép thử sau:

- Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại

- Định lượng bằng phương pháp quang phổ tử ngoại và khả kiến, quangphổ huỳnh quang

- Các phép thử định tính, tạp chất và định lượng bằng phương pháp sắcký

- Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật

- Các phép chuẩn độ thể tích, phân tích trọng lượng

- Các phép thử sinh học

- Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng [6] Ngoài ra các chất đối chiếu còn được dùng để:

- Thẩm định một phương pháp mới

- Chuẩn hoá các chất đối chiếu khác

- Khẳng định giá trị pháp lý của một phương pháp đã chuẩn hoá [28]

1.2 Tổng quan về các vị dược liệu dùng trong nghiên cứu đề tài

Hai vị dược liệu: Đại hoàng, Cốt khí củ mà chúng tôi sử dụng trongnghiên cứu đề tài đều là các vị dược liệu thuộc nhóm dược liệu chứa

anthranoid họ Rau răm (Polygonaceae) Các vị dược liệu này được sử dụng

khá phổ biến trong nhân dân cũng như thường xuất hiện trong các bài thuốc Yhọc cổ truyền [21], [22], [23], [24]

1.2.1 Đại hoàng (Rhizoma Rhei)

Dược liệu là thân rễ phơi hay sấy khô của nhiều loại đại hoàng như

chưởng diệp đại hoàng, Rheum palmatum L., đường cổ đặc đại hoàng Rheum tanguticum Maxim.ex Regel (Rheum palmatum L.var tanguticum Maxim, hoặc dược dụng đại hoàng, họ Rau răm Polygonaceae [4], [6], [15], [19],

[22], [26]

Đặc điểm dược liệu: Dược liệu là những miếng hình trụ hoặc mặtphẳng hơi lồi Mặt ngoài màu vàng nâu Trên mặt đôi chỗ thấy rõ một mạnglưới màu trắng, mắt hình quả trám và những ngôi sao nhỏ Vết bẻ màu đỏ

cam có hạt lổn nhổn [6], [15], [22], [25], [26], [27] (Hình 1.1)

Thành phần hoá học: Anthraglycosid, anthraquinon tự do (emodin,chrysophanol, physcion, aloe-emodin, rhein), canxi oxalat, tinh bột, pectin,chất nhựa [3], [4], [15], [19], [22], [26]

Công dụng: Dùng chữa hạ lỵ, ứ huyết, kinh bế thuỷ thũng, thấp nhiệtgây vàng da, ung thũng đinh độc Dùng liều nhẹ làm thuốc giúp sự tiêu hoá,chữa kém ăn, ăn không tiêu, đau bụng, da vàng Dùng với liều cao làm thuốctẩy nhẹ, dùng cho người đầy bụng, đi lỵ, hoàng đản (da và mắt vàng) [3], [4],[9], [25], [26]

Hình 1.1 Vị dược liệu Đại hoàng

0,5 – 1,5 cm, được cắt thành miếng dày khoảng 1-2 cm Mặt ngoài màu nâuxám, sần sùi, nhăn nheo theo chiều dọc, có các mấu đốt lồi lên chia củ thànhtừng gióng Mặt cắt ngang màu vàng bẩn, hầu hết phần lõi ở giữa rỗng hoặcnếu không rỗng thì có màu nâu sẫm, thể chất nhẹ, hơi cứng [15], [16], [17],

[22], [26], [27] (Hình 1.2)

Thành phần hoá học: Trong rễ Cốt khí củ có chứa các dẫn chấtanthranoid ở dạng tự do và dạng kết hợp glycosid hàm lượng 0,1- 0,5 % Cácthành phần đã xác định: chrysophanol, emodin, physcion, emodin 8--glucosid Ngoài các dẫn chất anthranoid, trong rễ cốt khí củ còn có polydatin

là một stilben glucosid khi thuỷ phân cho resveratrol, trong rễ còn có tanin[4], [11], [15], [16], [19], [26]

Công dụng: Cốt khí củ được dùng chữa phong thấp tê bại, đau nhức gânxương, chấn thương, ngã sưng đau ứ huyết, kinh nguyệt bế tắc, sau khi đẻhuyết hôi bị tích trong tử cung, bụng chướng, đái rắt, đái buốt, đái ra máu.Còn dùng trị mụn nhọt, lở ngứa và dùng làm thuốc cầm máu trong trường hợpvết thương chảy máu [4], [9], [11], [16], [19], [22], [26]

Hình 1.2 Vị dược liệu Cốt khí củ

1.3 Khái niệm chung về anthranoid

Anthranoid hay anthraquinon là những hợp chất nằm trong nhóm lớnhydroxyquinon Những hợp chất quinon là những sắc tố, được tìm thấy chủyếu trong ngành nấm, địa y, thực vật bậc cao nhưng cũng còn tìm thấy trongđộng vật Căn cứ vào số vòng thơm đính thêm vào nhân quinon mà người taxếp thành benzoquinon, naphtoquinon, anthraquinon và naphtacenquinon haycòn gọi là anthracyclinon (4 vòng)

Các anthraquinon hay anthranoid khi tồn tại dưới dạng glycosid thì đượcgọi là anthraglycosid hay anthracenosid Cũng như các loại glycosid khác,anthraglycosid khi bị thuỷ phân thì giải phóng ra phần aglycon và phầnđường Các dẫn chất anthraquinon trong tự nhiên chủ yếu là các dẫn chất 9,10-anthracendion, được phân bố trong khoảng 30 họ thực vật khác nhau chủ

chủ yếu là những cây hai lá mầm và trong các họ Caesalpiniaceae, Rhamnaceae, Rubiaceae, Polygonaceae [12], [13], [26], [30]

1.4 Emodin

1.4.1 Đặc điểm và tính chất của Emodin

Emodin là một anthraquinon tự do có trong một số vị dược liệu như đạihoàng, cốt khí củ, hà thủ ô đỏ, muồng trâu, chút chít [3], [4], [19], [25]

O

Hình 1.3 Cấu trúc hoá học của Emodin

Tên khoa học: 1,3,8-tri hydroxy-6-methyl-9,10-anthracenedione

Tính chất:

- Bột kết tinh hoặc tinh thể hình kim màu vàng cam

- Nhiệt độ nóng chảy khoảng 256oC – 257oC

- Không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ (ether,ether dầu hoả, cloroform, benzen, aceton, acid acetic băng) Tantrong dung dịch kiềm, dung dịch natri carbonat, dung dịchamoniac [26], [42]

- Độ tan của Emodin trong một số dung môi hữu cơ ở 250C (tínhtheo g/100 ml dung môi) được thể hiện ở bảng 1.1 [42]

Bảng 1.1 Độ tan của Emodin trong một số dung môi hữu cơ ở 25 0C

TT Dung môi hữu cơ Độ tan của Emodin

Emodin có 4 cực đại hấp thụ trong vùng tử ngoại là: 223 nm, 254

nm, 267 nm, 290 nm và 1 cực đại hấp thụ trong vùng khả kiến là 440 nm[25], [26], [42]

1.4.2 Tác dụng dược lý của emodin

Emodin có tác dụng lợi niệu do ức chế Na+K+ATPase [4] Thử nghiệmtrên chuột cho thấy Emodin có khả năng bảo vệ tế bào gan, phục hồi hoạtđộng của tế bào gan nhiễm mỡ, cải thiện tuần hoàn gan, giảm các biểu hiệnbệnh lý của gan [50] Với liều 75 mg/kg có tác dụng ức chế ung thư vú ởchuột [4], [25] Emodin cũng có khả năng chống ung thư phổi, ung thư gan,ung thư cổ ở người do tác dụng ức chế hiện tượng đột biến gen, gây độc với tếbào ung thư [35], [37], [39], [40], [51], [52] Emodin có tác dụng lên màngsinh học, có ái lực cao với các màng phospholipid vì thế có khả năng khángvirus, vi khuẩn [36] Ngoài ra Emodin còn có khả năng chống loãng xương[46]

1.5 Tổng quan về chiết xuất dược liệu, chiết xuất và tinh chế anthranoid

1.5.1 Chiết xuất dược liệu [29]

Chiết xuất dược liệu có vai trò rất quan trọng trước hết là để lấy đượccác chất có trong dược liệu dưới dạng cần thiết (dung dịch, bột) toàn phầnhoặc tinh khiết hơn cho mục đích nghiên cứu hoặc điều trị Phương pháp chiếtxuất dược liệu bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và phương phápchiết Có nhiều cách phân loại phương pháp chiết xuất dựa vào các yếu tốkhác nhau:

- Căn cứ vào nhiệt độ:

+ Chiết nóng+ Chiết nguội

- Căn cứ vào chế độ làm việc:

+ Phương pháp chiết gián đoạn

+ Phương pháp chiết chéo dòng

- Căn cứ vào áp suất làm việc:

+ Phương pháp chiết ở áp suất thường (áp suất khí quyển)+ Phương pháp chiết ở áp suất giảm (áp suất chân không)+ Phương pháp chiết ở áp suất cao (chế độ làm việc có áp lực)

- Căn cứ vào trạng thái làm việc của 2 pha:

+ Phương pháp ngâm+ Phương pháp ngấm kiệt

- Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt:

+ Phương pháp dùng siêu âm+ Phương pháp khí hoá lỏng+ Phương pháp tạo dòng xoáy+ Phương pháp mạch nhịp

1.5.2 Chiết xuất và tinh chế anthranoid [26]

Muốn chiết xuất glycosid dùng cồn ethylic hoặc cồn methylic hoặc hỗnhợp cồn - nước Muốn chiết phần aglycon, thuỷ phân bằng acid sau đó chiếtbằng ether hoặc cloroform

Để tách các dẫn chất anthraquinon có thể sử dụng độ hoà tan khác nhautrong môi trường kiềm khác nhau, tuy nhiên sự phân chia không tách bạch màthường còn lẫn chất này với một ít chất khác Trong nghiên cứu, người ta haydùng sắc ký cột với silicagel, kieselghur, bột cellulose Có thể dùng calcicarbonat, magnesi carbonat, dicalci phosphat, calci sulfat, magnesi oxyd, calci

oxyd Để triển khai, nếu tách các glycosid thì dùng ethanol hoặc methanol vớicác nồng độ cồn khác nhau, còn tách aglycon thì dùng các dung môi hữu cơtheo độ phân cực tăng dần, tăng dần lượng cồn từ 1-5 %, theo dõi các phânđoạn bằng đèn tử ngoại.

1.6 Tổng quan về một số phương pháp hoá lý sử dụng trong nghiên cứu

Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếucác chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm,

366 nm hoặc phun thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết

bị densitometer, một thiết bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khảkiến của chất cần phân tích Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta

có thể sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất tronghỗn hợp cần phân tích

1.6.1.2 Các đại lượng đặc trưng

a Hệ số lưu giữ Rf:

Đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ

số lưu giữ Rf Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyểncủa chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

(đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1

b Hệ số lưu giữ tương đối Rr:

d

d R

c R,

x R,

r  (1.2)

Trong đó: dR,x : là đường đi của chất phân tích (cm)

DR,c : là đường đi của chất chuẩn (cm)

(Giá trị R r càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất)

1.6.1.3 Ứng dụng

a Định tính:

Thường dựa vào trị số Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký trongcùng điều kiện Đôi khi do sắc ký không liên tục không xác định được tuyếndung môi pha động, người ta dùng hệ số lưu giữ tương đối Rr để đặc trưngcho chất phân tích

 Cách 2: Định lượng trực tiếp trên bản mỏng:

Đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký Hiện nay dùng 2 kỹthuật:

- Densitometer: Chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ huỳnhquang

- Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: Quét bản mỏng với hệ thống phântích hình ảnh, nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhậnhình ảnh của vết sắc ký Xử lý dữ liệu bằng máy tính

1.6.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [8], [10], [13], [18],

[20], [28], [29]

1.6.2.1 Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp sắc ký tách các chất rakhỏi hỗn hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trongcột là một chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chấtmang rắn, hay một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ.Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặcphân loại theo kích cỡ

1.6.2.2 Một số thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

Hình 1.4 Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng

 tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0

(Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định).

 W : là chiều rộng đáy pic

 W1/2 : là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic

t

t t

t k'

0

R 0

0 R 0

' R

Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức

là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tạithời điểm cân bằng Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thờiđiểm bơm mẫu do đó làm giảm khả năng tách, nếu k’ lớn quá thì sẽ dẫn đếndoãng pic, độ nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài Trong thực tế k’ nằm trongkhoảng 2-5 là tốt nhất

c Hệ số chọn lọc :

t t

t

t k

k α

0 A R,

0 B R, '

A

' B

d Hiệu lực cột:

Hiệu lực cột được đánh giá thông qua 2 thông số: số đĩa lý thuyết (N) vàchiều cao đĩa lý thuyết (H) Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ởmỗi tầng sự phân bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng.Mỗi tầng được giả định như một pha tĩnh có chiều cao H

e Hệ số bất đối AF (tailing factor):

Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ

(1.8)

Trong đó:

W1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

a : là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic

Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9  AF  2

Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối

f Độ phân giải (resolution):

Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên mộtđiều kiện sắc ký Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:

2a

W



Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4 %

RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau

độ các chất có trong mẫu thử

- Phương pháp chuẩn nội: Là phương pháp cho thêm những lượng giốngnhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống vớithời gian lưu và đáp ứng của chất cần phân tích Chất chuẩn thứ hai gọi

là chất chuẩn nội Từ những dữ kiện về diện tích (hoặc chiều cao ) pic

của chuẩn, chuẩn nội, mẫu thử và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn,chuẩn nội sẽ tính ra nồng độ các chất có trong mẫu thử.

- Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành

xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện Nồng độ chưa biết của mẫuthử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêmvào) và sự tăng của diện tích (hoặc chiều cao pic)

- Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Dựa trên nguyên tắc hàm lượng phầntrăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệphần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các picthành phần trên sắc ký đồ Phương pháp này yêu cầu tất cả các thànhphần đều được rửa giải và được phát hiện; tất cả các thành phần đều cóđáp ứng detector như nhau

1.6.3 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy [13]

- Mỗi chất khác nhau có nhiệt độ nóng chảy khác nhau

- Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất quantrọng Điểm chảy là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của mộtchất Nếu điểm chảy của 2 loại tinh thể thu được qua 2 lần kết tinh chỉchênh lệch nhau 0,5oC thì có thể xem sản phẩm kết tinh đã tinh khiết

- Nếu một hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp xa hơn so với điểmchảy lý thuyết chứng tỏ sản phẩm thu được chưa tinh khiết còn phải tiếptục kết tinh và tinh chế lại

- Có hai cách xác định điểm chảy:

+ Đo điểm chảy bằng ống mao quản

+ Đo điểm chảy bằng dụng cụ điện có lắp kính hiển vi hoặc kính lúp

1.6.4 Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) [5], [10], [13], [28], [29].

1.6.4.1 Nguyên tắc:

1.6.4.2 Ứng dụng:

Cường độ của các đỉnh trên phổ hồng ngoại không chi tiết như trongphổ UV-VIS mà chỉ có tính chất tương đối nên ít được sử dụng để địnhlượng Vì thế quang phổ hồng ngoại chủ yếu được ứng dụng cho định tính cáchợp chất Có 2 ứng dụng chính của phổ hồng ngoại như một công cụ phântích là nhận ra các nhóm chức đặc

biệt trong phân tử và định tính các chất bằng cách so sánh với phổ chuẩn

1.6.5 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [5], [13], [28]

1.6.5.1 Nguyên tắc

Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi thay đổi từ trường sẽ dẫn đến hấp thụ năng lượng của sóng vô tuyến và xuấthiện phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhânnguyên tử có khối lượng là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì cómomen từ và cho tín hiệu NMR

Các hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự nguyên tử là những sốchẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR

Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vàomật độ điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó

1.6.5.2 Các đại lượng đặc trưng

a Độ chuyển dịch hoá học:

Sự khác nhau về vị trí hấp thụ giữa proton của mẫu phân tích và của chấtchuẩn được gọi là độ chuyển dịch hoá học ()

ppm

Trong đó:

 : là độ dịch chuyển hoá học

mau : tần số của mẫu phân tích

may : là tần số làm việc của máy

b Hằng số tương tác spin: 

Khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội được biểu hiện bằng Hz, đặc trưng cho sự tương tác spin gọi là hằng số tương tác spin (J) Trị số J phụthuộc vào tương quan không gian và mật độ điện tử ở vùng lân cận của 2proton tương tác

c Diện tích dưới tín hiệu:

Diện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho tín hiệu đó Đường cong tích phân diện tích dưới tín hiệu cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu

1.6.5.3 Ứng dụng của phổ NMR

Bằng cách xác định độ dịch chuyển hoá học , hằng số tương tác J và diệntích dưới tín hiệu người ta có thể biện giải phổ và kết hợp với các thông tincủa các loại phổ khác như IR, MS từ đó xác định cấu trúc của các hợp chấthữu cơ

1.6.6 Phương pháp phân tích khối phổ (MS) [5], [13], [28]

1.6.6.1 Nguyên tắc

một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồhoặc phổ khối

1.6.6.2 Ứng dụng của MS

a Xác định các đồng vị

Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện tích hạtnhân chỉ khác nhau về số neutron trong nhân đó nên khối lượng nguyên tửkhác nhau Có thể dùng MS để xác định thành phần các đồng vị của cácnguyên tố trong mẫu

b Định tính

- Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân

tử M+, (M+1)+, (M+2)+, đây là các đặc trưng quan trọng của hợpchất hoá học Bên cạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ sốcường độ của chúng cùng với khối lượng của các mảnh ion có thểxác định công thức nguyên của chất phân tích

- Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặcphổ nghiên cứu với phổ chất đối chiếu để khẳng định thành phầnđịnh tính

của mẫu

c Xác định công thức cấu tạo

Để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu cần dùng kỹ thuật ionhoá thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để làm rõ cấu

tạo ghép nối của chúng Việc biện giải phổ nên phối hợp với phổ NMR vàphổ IR.

d Định lượng

Phân tích định lượng khối phổ tương tự như các kỹ thuật khác dùng cáchthiết lập đường chuẩn hoặc thêm đường chuẩn cùng với đo cường độ vạchphổ để xác định nồng độ

1.7 Nhận xét chung

Hiện nay vì chưa có chất chuẩn Emodin nên một số tài liệu trong nước[15], [16], [25] chỉ định tính dược liệu chứa Emodin bằng các phản ứng ốngnghiệm hoặc bằng SKLM nhưng chưa tiến hành song song với dung dịchchuẩn Trong chuyên luận “Rhubarb” của dược điển Anh 2008 [47] và dượcđiển Châu Âu 2002 [34] đều qui định dùng Emodin để pha dung dịch đốichiếu khi định tính bằng SKLM Chuyên luận “Đại hoàng” trong DĐVN III[6], cũng qui định tiến hành định tính Đại hoàng bằng SKLM, dùng dung dịchđối chiếu là dung dịch Emodin chuẩn nồng độ 1 mg/ml hoặc chiết song songdược liệu chuẩn Đại hoàng làm dung dịch đối chiếu, nhưng thực tế hiện nay

vì chưa có chất chuẩn Emodin nên chỉ có thể thực hiện theo cách chiết songsong với dược liệu Đại hoàng chuẩn phức tạp hơn Cũng một phần vì chưa cóchất chuẩn Emodin nên một số tài liệu trong nước [6], [16], [25] chưa địnhlượng riêng Emodin mà mới chỉ định lượng anthranoid nói chung trong dượcliệu có chứa Emodin bằng phương pháp tạo màu đo quang với việc xây dựngđường chuẩn là Coban clorid khá phức tạp Mặt khác trong nước chưa cócông trình nào nghiên cứu về chiết xuất và tinh chế Emodin làm chất chuẩn

và hiện tại chúng ta chưa thiết lập được chất chuẩn Emodin để sử dụng trongcông tác kiểm nghiệm Xuất phát từ nhu cầu cần có chất chuẩn Emodin chúngtôi thực hiện đề tài này để phục vụ công tác kiểm tra chất lượng một số dượcliệu

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi sử dụng các thiết bị, dụng cụ

đã được hiệu chuẩn theo ISO/IEC 17025 và GLP của Viện Kiểm nghiệmthuốc trung ương và Viện Hoá học- Viện Khoa học công nghệ Việt nam gồm:

- Buồng soi tử ngoại DESAGA HP-UVIS

- Cân phân tích DENVER AA-200 có độ chính xác 0,1 mg

- Cân phân tích METTLER AG 245 có độ chính xác 0,01 mg

- Cột sắc ký Apollo C18 ( 250 4,6 mm; 5 m)

- Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR-BRUKER-500MHz

- Máy đo điểm chảy BUCHI 535

- Máy đo phổ hồng ngoại Nicolet NEXUS 670FT-IR

- Máy lắc siêu âm ELMASONIC S100

- Các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết cho quá trình thực nghiệm

2.2.2 Hoá chất, dung môi

Các hoá chất, dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinhkhiết phân tích (PA) và loại tinh khiết dùng cho HPLC

- Dung dịch acid hydrocloric 10 % được pha từ acid hydrocloric PA

- Dung dịch acid phosphoric 0,1 % được pha từ acid phosphoric PA

- Dung dịch acid sulfuric 10 % được pha từ acid sulfuric PA

2.3.3 Xác minh cấu trúc của Emodin tinh chế được

2.3.4 Định lượng Emodin tinh chế được

2.3.5 Xác định giới hạn tổng cộng các tạp chất liên quan của Emodin tinh chếđược

2.3.6 Thẩm định phương pháp HPLC đã sử dụng để định lượng Emodin tinhchế được về các mặt

- Định tính và định lượng Emodin trong vị được liệu Đại hoàng

- Định tính và định lượng Emodin trong vị dược liệu Cốt khí củ

2.4 Các phương pháp dùng để nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp chiết xuất anthranoid từ dược liệu để chiết xuất Emodin

từ vị dược liệu Đại hoàng

2.4.2 Phương pháp tinh chế anthranoid để tinh chế Emodin chiết xuất được.2.4.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng để định tính Emodin

2.4.4 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy để định tính và nhận xét sơ bộ mức

độ tinh khiết của Emodin

2.4.5 Phương pháp đo phổ hồng ngoại để định tính Emodin

2.4.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định tính, định lượngEmodin và xác định tạp chất liên quan của Emodin tinh chế được

2.4.7 Phương pháp phân tích khối phổ để xác minh cấu trúc của Emodin tinhchế được

2.4.8 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác minh cấu trúc củaEmodin tinh chế được

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Chiết xuất và tinh chế Emodin từ vị dược liệu Đại hoàng

3.1.1 Chiết xuất Emodin

Emodin là một anthraquinon tồn tại trong vị dược liệu Đại hoàng dướidạng tự do và cả dạng glycosid do liên kết với đường Chúng tôi tiến hànhchiết xuất Emodin theo nguyên tắc chung về chiết xuất anthranoid [26]

3.1.1.1 Chuẩn bị dược liệu

Dược liệu Đại hoàng đã được sấy ở 600C trong 24 giờ rồi nghiền thànhbột thô

3.1.1.2 Lựa chọn phương pháp chiết

Sử dụng phương pháp chiết hồi lưu cách thuỷ Đây là phương pháp chiếtnóng để tăng khả năng hoà tan của hoạt chất trong dung môi chiết, phươngpháp này tiến hành đơn giản và có thể chiết được lượng dược liệu lớn hơn sovới phương pháp chiết bằng Shoxlet

3.1.1.3 Lựa chọn dung môi chiết

Trước hết chúng tôi chọn methanol làm dung môi chiết vì methanol hoàtan được cả Emodin tự do và Emodin liên kết với đường Sau giai đoạn thuỷphân bằng acid để đưa toàn bộ Emodin dạng liên kết về dạng tự do sẽ chọncloroform làm dung môi chiết ở giai đoạn tiếp theo Theo nguyên tắc chungthì có thể dùng cloroform hoặc ether để chiết phần aglycon [26] nhưng chúngtôi chọn cloroform vì cloroform nặng hơn nước sẽ nằm ở lớp dưới của hỗn