Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
- Loài Cryptolestes pusillus (Coleoptera: Cucujidae) hại trên sắn.
Địa điểm, thời gian nghiên cứu
- Các kho bảo quản nông sản sử dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi tại khu vực Hà Nội và phụ cận:
+ Công ty cổ phần thức ăn chăn nuôi Trung ương Địa chỉ: Km 14, quốc lộ 1A Ngọc Hồi, Thanh Trì, Hà Nội
+ Công ty Cổ phần Việt Pháp sản xuất thức ăn gia súc Proconco Địa chỉ: Cảng Khuyến Lương, quận Hoàng Mai, Hà Nội
+ Công ty TNHH New hope Hà Nội Địa chỉ: Khu công nghiệp Sài Đồng, phường Sài Đồng, quận Long Biên, Hà Nội
+Nhà máy sản xuất thức ăn chăn nuôi CP Xuân Mai – Hà Nội Địa chỉ:
KM 38, quốc lộ 6, thị trấn Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội
+ Công ty cổ phần dinh dưỡng Việt Tín Địa chỉ: thôn Xuân Sơn, xã Trung Giã, Sóc Sơn, Hà Nội
- Phòng thí nghiệm của Chi cục KDTV vùng V, Cục BVTV
Vật liệu, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
- Sắn lát, sắn vụn, sắn cắt khúc đã được khử trùng
3.3.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
- Bộ rây sàng côn trùng (đường kính mắt sàng từ 1 – 2,5 mm)
- Xiên lấy mẫu đối với hàng bảo quản đóng bao
- Lọ đựng côn trùng thu thập có nắp lưới thông thoáng
- Bình nhựa có vòi, pipet nhựa, găng tay
- Panh, ống nghiệm, bút lông, kim côn trùng, lam, la men, cốc đong…
- Đĩa petri (đường kính 5cm, 10cm), đĩa lõm, hộp nhựa to (hình trụ, đường kính 20cm, cao 30cm), hộp nhựa nhỏ (đường kính 15cm, cao 15cm)
- Kính lúp soi nổi (có bộ phận chụp ảnh) quan sát các đặc điểm hình thái, có thước đo kích thước côn trùng
- Tủ định ôn theo dõi thí nghiệm côn trùng
- Tủ sấy thức ăn nuôi côn trùng
- Bàn gia nhiệt để sấy khô tiêu bản lam
Hình 3.1 Các loại dụng cụ thiết bị nghiên cứu 3.3.3 Hóa chất nghiên cứu
- Cồn tuyệt đối, glycerol, nước cất
Nội dung nghiên cứu
- Điều tra thành phần côn trùng trên sắn được dự trữ trong các kho bảo quản thức ăn gia súc tại khu vực Hà Nội năm 2016 – 2017
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của loài Cryptolestes pusillus, phân biệt trưởng thành 2 loài C pusillus và C ferrugineus
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, sinh thái của loài C pusillus.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Điều tra thành phần côn trùng trên sắn bảo quản ở Hà Nội
Tiến hành điều tra và thu thập côn trùng trên sắn bảo quản tại Hà Nội được thực hiện theo QCVN 01 – 141: 2013/BNNPTNT, quy chuẩn quốc gia về phương pháp lấy mẫu KDTV của Bộ NN và PTNT Mẫu được lấy định kỳ mỗi 7 ngày một lần.
Khi lấy mẫu ban đầu, cần đảm bảo các điểm lấy mẫu phân bố đều trong lô hàng Mẫu được lấy theo phương pháp đường chéo góc của các mặt quy ước, tính theo độ cao của khối hàng Khối lượng mẫu ban đầu phải phù hợp với khối lượng hàng hóa, với yêu cầu tối thiểu là 5 mẫu cho mỗi khối hàng.
Lấy mẫu trung bình (TB): Trộn đều tất cả các mẫu ban đầu, phân tách mẫu theo nguyên tắc đường chéo để lấy mẫu TB
Lấy mẫu bổ sung: Điều tra bằng mắt thường để thu thập trực tiếp sâu mọt gây hại
Phương pháp thu thập, định loại mẫu côn trùng:
Tiến hành sàng lọc bằng các ngăn khác nhau nhằm tách biệt côn trùng từ mẫu hàng hóa, đồng thời phân loại các loài côn trùng kho và mọt Cryptolestes spp vào lọ thu mẫu Mẫu thu được từ từng địa điểm sẽ được bảo quản riêng trong túi nilon có nhãn theo quy định.
Hình 3.2 Điều tra côn trùng trên sắn bảo quản năm 2016 – 2017 Định loại côn trùng theo tài liệu của Gorham (1991); Haines (1991)
- Tính độ thường gặp (%) để đánh giá mức độ phổ biến của loài côn trùng theo không gian điều tra:
Số điểm điều tra có chứa loài a ĐBG (%) = x 100
Tổng số điểm điều tra
-: Gặp rất ít (ĐBG < 25%) +: Gặp ít (ĐBG từ 25 – 50%) ++: Thường gặp (ĐBG từ 50 – 75%) +++: Gặp nhiều (ĐBG > 75%) 3.5.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của loài Cryptolestes pusillus
3.5.2.1 Phương pháp làm tiêu bản giám định
- Chuẩn bị hóa chất thí nghiệm
Để pha chế, bạn cần cho Gum Arabic vào một lọ thủy tinh và đổ nước cất vào Sau đó, hãy để lọ trong tủ ấm qua đêm để Gum tan hoàn toàn Tiếp theo, thêm Chloral hydrate vào và khuấy đều Cuối cùng, rót dung dịch glycerol vào lọ để hoàn tất quá trình.
+ KOH: cân 10g tinh thể KOH đổ vào lọ thủy tinh có nắp Đổ vào lọ 90 ml nước cất, đóng nắp lọ rồi lắc đều để KOH tan hết
+ Đặt 1 vài cá thể trưởng thành trong đĩa lõm, đổ dung dịch KOH 10% vào ngâm ở nhiệt độ phòng từ 12- 24h
+ Rửa sạch mẫu bằng nước cất sau đó rửa lại bằng cồn tuyệt đối để loại bỏ nước
Để tiến hành thí nghiệm, nhỏ 1 giọt dung dịch Hoyer’s lên lam kính Sử dụng kim côn trùng, lấy 1 cá thể trưởng thành và đặt nó vào giữa giọt dung dịch, đảm bảo mặt bụng hướng lên trên Căng cánh của cá thể ra hai bên để không che khuất các đốt bụng.
+ Đậy lam kính lên trên, tránh tạo bọt khí Đặt mẫu tiêu bản lên bàn sấy ở nhiệt độ 40 o C, sấy trong vòng 2 – 3 ngày.
3.5.2.2 Đo kích thước, mô tả đặc điểm hình thái của mọt Cryptolestes pusillus và Cryptolestes ferrugineus
Sử dụng kính NIKON SMZ 18 có kết nối Camera, nối với máy tính có cài đặt phần mềm NIS Element D 4.500.00 để chụp ảnh và đo kích thước các pha:
- Pha trứng: đo chiều dài và chiều rộng
- Pha sâu non, nhộng: đo chiều dài và phần rộng nhất của cơ thể
- Trưởng thành đo các chỉ tiêu sau:
+ Chiều dài: Đo từ mép trên của đầu (ngoại trừ miệng và phần phụ miệng) đến hết cánh cứng
+ Chiều rộng: đo khoảng cách rộng nhất trên cánh cứng
+ Râu đầu: đo chiều dài râu từ đốt 1 – 11
+ Chiều dài đầu + MLN: Đo từ mép trên của đầu đến mép dưới MLN
Hình 3.3 Đo kích thước Cryptolestes bằng phần mềm NIS Element D
- Kích thước trung bình tính theo công thức: n
Xi: Giá trị kích thước cá thể thứ i n: Số cá thể theo dõi
- Tính sai số theo công thức: t: tra bảng Student - Fisher, độ tin cậy P = 95%, độ tự do v=n-1; δ: độ lệch chuẩn; n: số cá thể theo dõi
3.5.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của loài Cryptolestes pusillus
Nghiên cứu thời gian phát dục các pha của loài Cryptolestes pusillus trên thức ăn là sắn lát khô ở 2 mức nhiệt độ khác nhau:
Để chuẩn bị thức ăn cho mọt, sắn lát cần được khử trùng nhằm loại bỏ hoàn toàn nấm và sâu bệnh Sau đó, sử dụng máy đo độ ẩm để đảm bảo sắn đạt mức ≥ 12% trước khi tiến hành nhân nuôi mọt.
-Nghiên cứu sinh học loài mọt Cryptolestes pusillus: Thí nghiệm tiến hành ở 2 mức nhiệt độ 25 o C và 30 o C, độ ẩm 70 - 75% Mỗi mức nhiệt độ tiến hành quan sát 30 cặp cá thể
Sử dụng hộp nhựa nhỏ có đường kính 10cm và cao 10cm với nắp đậy để ngăn côn trùng Cho thức ăn đã được làm sạch và khử trùng vào các hộp, sau đó thả một cặp mọt vào mỗi hộp Hãy kiểm tra và tìm trứng, đồng thời thay thức ăn hàng ngày để đảm bảo sự phát triển của mọt.
Kiểm tra trứng hàng ngày và ghi lại ngày, tháng Khi phát hiện trứng, tách riêng từng quả cho vào hộp petri (mỗi hộp chứa 1 quả) có thức ăn Tiếp tục theo dõi và quan sát thời điểm trứng nở.
Pha sâu non là giai đoạn quan trọng trong quá trình phát triển của sâu, khi trứng nở thành sâu non Cần theo dõi sự phát triển của từng tuổi sâu bằng cách quan sát hàng ngày và ghi lại thời gian khi phát hiện xác sâu non trong hộp petri Thời gian phát dục của mỗi tuổi được tính từ lần lột xác trước đến lần lột xác tiếp theo.
Theo dõi quá trình hóa nhộng hàng ngày, ghi lại thời điểm sâu non tuổi cuối bắt đầu hóa nhộng và thời điểm nhộng vũ hóa trưởng thành.
Khi phát hiện nhộng đã vũ hóa trưởng thành, hãy chọn 10 cặp đực – cái để ghép đôi và nuôi trong hộp petri có thức ăn Theo dõi chúng hàng ngày cho đến khi phát hiện quả trứng đầu tiên và ghi chép lại ngày phát hiện.
- Vòng đời của mọt được tính từ giai đoạn trứng đến khi mọt trưởng thành đẻ quả trứng đầu tiên
- Thời gian phát dục trung bình được tính theo công thức:
Thời gian phát dục tế bào (TB) trong từng pha được xác định bởi Xi, là thời gian phát dục của cá thể thứ i Ni đại diện cho số cá thể lột xác trong ngày thứ i, trong khi N là tổng số cá thể được theo dõi.
Nghiên cứu sức sinh sản của trưởng thành Cryptolestes pusillus ở 2 mức nhiệt độ khác nhau:
Mọt râu dài được nuôi trong môi trường thức ăn là sắn lát, với mỗi hộp nhựa chứa 50g thức ăn và 1 cặp trưởng thành 1 ngày tuổi Quá trình nuôi được thực hiện ở hai mức nhiệt độ là 25°C và 30°C, cùng với độ ẩm từ 70% đến 75% Số lượng mẫu thí nghiệm là n = 30.
Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng trứng đẻ, số trứng đẻ trung bình/ngày, thời gian đẻ trứng trung bình và tỷ lệ trứng nở
Sức sinh sản (quả/con cái)
Tổng số con cái theo dõi
Số trứng đẻ TB/ngày/1 cá thể cái (quả/ngày/con)
Số trứng đẻ TB/1 cá thể cái
Tỷ lệ nở của trứng (%) Tổng số trứng nở x 100 Tổng số trứng theo dõi
Nghiên cứu ảnh hưởng của thủy phần sắn lát đến khả năng gia tăng mật độ của loài mọt Cryptolestes pusillus
Thả 10 cặp cá thể trưởng thành mới vũ hoá vào hộp nhựa chứa 1 kg sắn lát khô để tạo độ ẩm, sau đó sử dụng máy đo thủy phần để kiểm tra khi đạt các mức 10%, 12% và 14% Đo nhiệt độ và độ ẩm tại thời điểm kiểm tra thủy phần sắn, sau đó thiết lập chế độ tủ sinh thái ở nhiệt độ 30°C và độ ẩm 70-75% Cuối cùng, đặt các hộp chứa sắn lát và mọt vào tủ sinh thái để mọt phát triển, lặp lại mỗi công thức 3 lần.
Phương pháp theo dõi: theo dõi mật độ mọt (con/kg) sau thời gian thả mọt
Trong thí nghiệm kéo dài 30, 45, 60, 75 và 90 ngày, chúng tôi tiến hành kiểm tra mật độ mọt trưởng thành (con/kg) bằng cách sử dụng rây để sàng lọc mọt ra khỏi thức ăn Sau mỗi lần kiểm tra, toàn bộ số mọt sẽ được trả lại vào hộp ban đầu để tiếp tục theo dõi trong các lần kiểm tra tiếp theo.
Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại sắn nguyên liệu khác nhau đến khả năng gia tăng mật độ của của loài mọt Cryptolestes pusillus:
Thả trưởng thành mới vũ hoá (10 cặp đực – cái) vào các hộp nhựa đựng 1 kg các loại sắn khác nhau Thức ăn đã được khử trùng (có thủy phần 12%)
Thí nghiệm với 3 công thức:
- Công thức 3: Sắn cắt khúc
Mỗi công thức nhắc lại 3 lần
