(LUẬN văn THẠC sĩ) xác định chỉ tiêu an toàn và hàm lượng kháng thể ở lợn được tiêm vacxin vô hoạt porcine circovirus type 2 sản xuất thử nghiệm từ chủng phân lập tại việt nam

Kết quả nghiên cứu so sánh hàm lượng kháng thể ở lợn được tiêm vacxin vô hoạt pcv2 thử nghiệm và vacxin thương mại .... TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Lương Thị Hồng Nhâm Tên Luận văn:

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LƯƠNG THỊ HỒNG NHÂM

XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU AN TOÀN VÀ HÀM LƯỢNG

KHÁNG THỂ Ở LỢN ĐƯỢC TIÊM VACXIN VÔ HOẠT

PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 SẢN XUẤT

THỬ NGHIỆM TỪ CHỦNG PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày… tháng… năm 2016

Tác giả luận văn

Lương Thị Hồng Nhâm

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ, Ban chủ nhiệm chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước “Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học”, Văn phòng các chương trình trọng điểm cấp Nhà nước, Cổ phần phát triển công nghệ nông thôn (RTD), các Tổ chức và Cá nhân đã giúp đỡ chúng tôi trong việc triển khai các nội dung của

đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Lương Thị Hồng Nhâm

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

Trích yếu luận văn 1

Thesis abstract 3

Phần 1 Mở đầu 5

Phần 2: Tổng quan tài liệu 7

2.1 Một số hiểu biết về căn bệnh (PCV2) 7

2.1.1 Hình thái, cấu trúc PCV2 7

2.1.2 Phân loại PCV2 7

2.1.3 Tính chất nuôi cấy 8

2.1.4 Sức đề kháng 8

2.1.5 Dịch tễ học mô tả về PCV2 9

2.2 Hiểu biết về hội chứng bệnh do PCV2 gây ra 11

2.3 Phòng bệnh PCVAd 13

2.3.1 Mối quan hệ giữa quản lý đàn và điều kiện chăn nuôi với quá trình nhiễm PCV2 13

2.3.2 Vệ sinh phòng bệnh 13

2.3.3 Đánh giá chất lượng và hiệu quả của vacxin phòng bệnh do PCV2 14

2.3.4 Điều trị 17

2.4 Tình hình nghiên cứu về PCV2 17

Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 21

3.1 Nội dung, địa điểm, đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu 21

3.1.1 Nội dung nghiên cứu 21

3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 21

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 21

3.1.4 Nguyên liệu nghiên cứu 21

3.2 Phương pháp nghiên cứu 24

3.2.1 Phương pháp tách, tinh sạch adn tổng số 24

3.2.2 Phương pháp tách, tinh sạch arn tổng số 25

3.2.3 Phương pháp pcr phát hiện các virus và mycoplasma tạp nhiễm 26

3.2.4 Phương pháp thực hiện phản ứng real-time pcr 27

3.2.5 Phương pháp cô đặc virus 27

3.2.6 Phương pháp tinh khiết virus 27

3.2.7 Phương pháp vô hoạt virus 28

3.2.8 Phương pháp kiểm tra vô trùng của vacxin PCV2 28

3.2.9 Phương pháp gây miễn dịch cho bản động vật và lấy mẫu huyết thanh 28

3.2.10 Phương pháp mổ khám 29

3.2.11 Phương pháp phát hiện kháng thể kháng PCV2 30

3.2.12 Phương pháp làm tiêu bản vi thể 31

3.2.13 Phương pháp xử lý số liệu 31

Phần 4 Kết quả và thảo luận 32

4.1 Kết quả chế tạo vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm 32

4.1.1 Kết quả xác định sự có mặt của PCV2 trong giống gốc để chế vacxin 32

4.1.2 Kết quả giám định độ thuần khiết của PCV2 32

4.1.3 Kết quả tinh khiết pcv2 dùng cho sản xuất vacxin thử nghiệm 33

4.1.4 Kết quả nghiên cứu vô hoạt PCV2 để chế vacxin 34

4.1.5 Kết quả kiểm tra vô trùng của vacxin vô hoạt PVC2 35

4.2 Kết quả đánh giá chất lượng vacxin vô hoạt pcv2 thử nghiệm 37

4.2.1 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin vô hoạt PCV2 khi tiêm thử nghiệm trên lợn 37

4.2.2 Kết quả nghiên cứu so sánh hàm lượng kháng thể ở lợn được tiêm vacxin vô hoạt pcv2 thử nghiệm và vacxin thương mại 45

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

Tài liệu tham khảo 48

Phụ lục 54

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Deoxyribose Nucleic Acid

CSFV : Classical Swine Fever Virus

DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

IFA : ImmunoFluoresecence Assay

MHP : Mycoplasma HyoPneumoniae

ORF : Open Reading Frame

PAdV : Porcine Adenovirus

PBS : Phosphate Buffered Saline

PCI : Phenol- Chloroform- Isoamyl alcohol

PCR : Polymerase Chain Reaction

PCV : Porcine CircoVirus

PCV1 : Porcine CircoVirus type 1

PCV2 : Porcine CircoVirus type 2

PCVAD : Porcine CircoVirus Associated Disease

PDNS : Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome

PEDV : Porcine Epidemic Diarrhea Virus

PK15 : Pig Kidney 15 cells

PMWS : Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome

PPV : Porcine ParvoVirus

PRDC : Porcine Respiratory Disease Complex

PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus PRV : porcine Pseudorabies Virus

RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction S/N : Sample-to-Negative value

TE : Tris-EDTA

TCID50 : Tissue Culture 50% Infectious Dose

TGEV : Transmissible GastroEnteritis Virus

BEI : Binary ethyleneimine

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Triệu chứng của bệnh liên quan đến PCV2 12

Bảng 3.1 Trình tự mồi dùng phát hiện và giám định genotype PCV2 22

Bảng 3.2 Trình tự mồi dùng xác định sự tạp nhiễm virus và mycoplasma 23

Bảng 3.3 Trình tự cặp mồi, đầu dò dùng xác định hiệu giá PCV2 24

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 26

Bảng 3.5 Chu trình nhiệt hai giai đoạn của phản ứng real-time PCR 27

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm tới khả năng tủa virus 33

Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra vô hoạt PCV2 35

Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra vô trùng của vacxin vô hoạt PCV2 36

Bảng 4.4 Khối lượng của lợn sau tiêm vacxin thương mại CircoFLEX 37

Bảng 4.5 Khối lượng của lợn sau tiêm vacxin thử nghiệm CircoVNUA 38

Bảng 4.6 Khối lượng của lợn đối chứng 39

Bảng 4.7 Mức sai khác về khối lượng giữa các công thức thí nghiệm 40

Bảng 4.8 Kết quả theo dõi mức đồng đều về khối lượng 41

Bảng 4.9 Tổng hợp biến đổi bệnh lý đại thể ở lợn tiêm vacxin PCV2 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Đường truyền lây của các genotype PCV2 10

Hình 4.1 Kết quả PCR xác định PCV2 trong giống gốc để chế vacxin 32

Hình 4.2 Kết quả giám định thuần khiết giống PCV2 33

Hình 4.3 Kết quả cô đặc và tinh khiết PCV2 34

Hình 4.4 Diễn biến tăng khối lượng của lợn sau tiêm vacxin 40

Hình 4.5 Biến đổi bệnh lý đại thể ở hạch lympho 42

Hình 4.6 Biến đổi bệnh lý đại thể ở phổi 43

Hình 4.7 Biến đổi bệnh lý vi thể ở hạch lympho (100X) 45

Hình 4.8 Đáp ứng miễn dịch của lợn được tiêm vacxin thử nghiệm và vacxin thương mại 46

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Lương Thị Hồng Nhâm

Tên Luận văn: “Xác định chỉ tiêu an toàn và hàm lượng kháng thể ở lợn được tiêm vacxin

vô hoạt Porcine Circovirus type 2 sản xuất thử nghiệm từ chủng phân lập tại Việt Nam”

Ngành: Thú y Mã số: : 60 64 01 01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

- Xác định chỉ tiêu an toàn của vacxin vô hoạt PCV2 khi tiêm thử nghiệm trên lợn

- Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của lợn khi được tiêm thử nghiệm vacxin vô hoạt PCV2

Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu kiểm tra độ tinh khiết và vô trùng của vacxin PCV2

- Đánh giá chỉ tiêu an toàn của vacxin vô hoạt PCV2 khi tiêm thử nghiệm trên lợn

- Nghiên cứu đánh giá hàm lượng kháng thể ở lợn được tiêm vacxin vô hoạt

PCV2 sản xuất thử nghiệm và so sánh với vacxin thương mại khác

Đối tượng nghiên cứu

- Chủng virus PCV2 được lựa chọn

- Vacxin vô hoạt PCV2 được sản xuất từ chủng PCV2 phân lập tại Việt Nam

Phương pháp nghiên cứu

Dựa trên các phương pháp: tinh khiết virus, cô đặc virus, vô hoạt virus, kiểm tra

độ vô trùng của vacxin PCV2, gây miễn dịch cho bản động vật, thu thập mẫu, mổ khám, phát hiện kháng thể kháng PCV2, làm tiêu bản vi thể, kiểm tra độ an toàn và đáp ứng miễn dịch của vacxin và phương pháp xử lý số liệu chúng tôi đã tổng hợp được các kết

quả dưới đây

Kết quả:

 Kết quả chế tạo vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm

- 03 chủng PCV2 dùng sản xuất vacxin đều đạt tiêu chuẩn thuần khiết

- Trong quá trình tinh khiết, cô đặc PCV2 dùng cho sản xuất vacxin thử nghiệm cần cô đặc PCV2 ở huyễn dịch tế bào sau gây nhiễm ít nhất 35.000 vòng/phút

để đạt kết quả tốt nhất

- Dùng Binary ethyleneimine để bất hoạt virus trong 10h, kiểm tra bằng

phản ứng RT-PCR phát hiện virus đã bị bất hoạt hoàn toàn

- Kiểm tra vô trùng vacxin vô hoạt PCV2 theo TCVN 8684-2011 cho thấy vacxin hoàn toàn đạt tiêu chuẩn vô trùng

 Kết quả đánh giá vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm

- Vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm là an toàn:

 Lợn được tiêm vacxin không có sự sai khác về khối lượng so với lợn đối chứng từ thời điểm được tiêm vacxin đến thời điểm D28 Từ D42 đến D84 sự sai khác bắt đầu rõ rệt nhưng không có ý nghĩa thống kê

 Lợn được tiêm vacxin không có các triệu chứng đặc trưng của bệnh do PCV2 gây ra, thân nhiệt của lợn cũng ổn định dao động từ 39,3 ± 0,3 oC, đây là nhiệt độ thân nhiệt của lợn khỏe mạnh bình thường

 Khi mổ khám không phát hiện các bệnh tích đại thể nào đặc trưng của bệnh

do PCV2 gây ra Quan sát tiêu bản vi thể của hạch lympho không thấy hiện tượng thoái hóa và không phát hiện thấy tế bào khổng lồ

- Đánh giá về đáp ứng miễn dịch dịch thể: vacxin thử nghiệm kích thích lợn sản sinh đáp ứng miễn dịch với độ dài tương tự như vacxin thương mại khác, nhưng có mức kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch thấp hơn

Kết luận:

 Về chế vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm

- 03 chủng virus dùng sản xuất vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm đều đạt thuần khiết

- Thành công trong việc tinh khiết và cô đặc virus để chế vacxin và dùng BEI 0,2 % để bất hoàn hoàn toàn virus

- Vacxin thử nghiệm CircoVNUA đạt thuần khiết, vô trùng theo TCVN 8684-2011

 Về đánh giá vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm

- Vacxin thử nghiệm Circo VNUA là an toàn:

 Lợn được tiêm vacxin vô hoạt PCV2 thử nghiệm có sự tăng trọng không có

sự sai khác so với lợn được tiêm vacxin thương mại và lợn đối chứng

 Lợn được tiêm không có bất kì dấu hiệu, triệu chứng, bệnh tích đại thể và vi thể đặc trưng của bệnh do PCV2 gây ra

- Vacxin thử nghiệm CircoVNUA kích thích lợn sản sinh đáp ứng miễn dịch với

độ dài tương tự như vacxin thương mại CircoFLEX, nhưng có mức kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch thấp hơn

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Luong Thi Hong Nham

Thesis title: “Evaluation of the safety and antibody titre in pigs vaccinated with Porcine

Circovirus type 2 inactivated vaccine which was produced test from strains isolated in Viet Nam”

Major: Veterinary Code: 60 64 01 01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

- To determine the safety of inactivated vaccine Porcine Circovirus type 2 on pigs

- To evaluate the pig’s immune response when injected with inactivated vaccine

Porcine Circovirus type 2 trials

Research content

- Test the purity and sterility of inactivated vaccine Porcine Circovirus type 2

- Test the safety of Porcine Circovirus type 2 inactivated vaccine on pigs

- Evaluation of antibody titre of the pigs injected by inactivated vaccine Porcine

Circovirus type 2 and other commercial vaccines

Research object

- Selected PCV2 virus strains

- PCV2 inactivated vaccine produced from isolated PCV2 strains in Vietnam

Research methods

Virus purification, viral concentration determination, viral inactivation, sterility test of PCV2 vaccines, immunisation of laboratory animals, sampling, autopsy, detection of antibodies against PCV2, preparation of microscopic specimen, safety test and evaluation of the immune response to the vaccine and statistical analysis, the results are shown below

Results

Results of the trial PCV2 inactivated vaccine production

- Three strains of PCV2 have matched the eligibility of purification

- During the purification and concentration, PCV2 should be concentrated in cell suspensions by at least 35,000 cycles / minute after infecting to achieve the best efficiency

- - Virus is inactivated by Binary ethyleneimine in 10 hours The RT-PCR showed that the virus was inactivated completely

- Sterility test was based on TCVN 8684-2011 The PCV2 inactivated vaccine matched the eligibility of sterility

Results of the trial PCV2 inactivated vaccine evaluation

- The trial PCV2 inactivated vaccine is safe:

+ There was no difference between the body weight of the experimental (vaccination) and the control group (no vaccination) during the first 28 days There was difference (non significant) in the body weight between the two groups during 42 days

to 84 days

+ The vaccinated pigs did not show the typical symptoms of PCV2 associated diseases The body temperature was stable around 39,3 ± 0,3 oC, similar to the control pigs

+ There was not any typical macroscopic lesion of PCV2 associated diseases There was no degeneration or giant cell in the microscopic specimen

- Evaluation of humoral immune response: The length of the immunisation by PCV2 vaccine was similar to the commercial vaccine but the titre was lower

Conclusions

The trial PCV2 inactivated vaccine production

- Three strains of PCV2 have matched the eligibility of purification

- The virus was purified, concentrated successfully and inactivated completely

by BEI 0.2%

- The CircoVNUA vaccine achieved the purification and sterility test based on TCVN 8684-2011

The trial PCV2 inactivated vaccine evaluation

- The CircoVNUA vaccine is safe:

+ There was a not significant difference in body weight between the experimental (vaccination) and the control group (no vaccination)

+ The experimental pigs did not show any typical symptoms, macroscopic or microscopic lesions of PCV2 associated diseases

- The length of the immunisation by PCV2 vaccine was similar to the commercial vaccine but the titre was lower

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

Hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa (Postweaning multisystemic wasting syndrome-PMWS) chủ yếu do Porcine Circovirus (PCV) type 2gây ra Ngoài hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa, PCV2 cũng là nguyên nhân có liên quan đến Hội chứng viêm da và viêm thận (porcine dermatitis and nephropathy syndrome – PDNS), Hội chứng viêm đường hô hấp (porcine respiratory diseases complex), và Hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn (porcine reproductive disorders) Trong số các bệnh trên lợn có liên quan đến porcine circovirus gây ra ở trên thì hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa (PMWS) là bệnh phổ biến nhất và được coi là bệnh gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng nhất cho ngành chăn nuôi lợn trên toàn thế giới (Chae, 2012b)

Vacxin là yếu tố quyết định trong công tác phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm Năm 2004, 13 năm sau kể từ khi trường hợp PMWS đầu tiên được phát hiện tại Canada, vacxin phòng hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa lần đầu

tiên đã được phép sản xuất và tiêu thụ tại Đức và Pháp (Charreyre et al., 2005)

Trong những năm gần đây một số loại vacxin phòng PMWS đã được sản xuất và lưu hành trên thế giới Vacxin đã và đang được sử dụng phổ biến và được coi là

công cụ hữu hiệu nhất trong việc phòng chống PMWS do PCV2 gây ra (Cline et

al., 2008; Fachinger et al., 2008; Fort et al., 2008; Horlen et al., 2008; Kixmoller

et al., 2008; Segales et al., 2009) Hiện nay trong nước chưa có nghiên cứu nào

về vacxin phòng bệnh còi cọc ở lợn con được sản xuất từ các chủng lưu hành tại Việt Nam

Đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ của Huỳnh Thị Mỹ Lệ

và cộng sự về việc nghiên cứu chọn chủng virus Porcine circovirus type 2 (PCV2) để sản xuất vắc xin phòng bệnh còi cọc ở lợn con đã bước đầu thành công trong việc xây dựng ngân hàng giống virus PCV2 phân lập được, nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng PCV2 dùng làm giống gốc để sản xuất vacxin, nghiên cứu bảo quản và xác định các đặc tính của giống vacxin PCV2 sau bảo quản Việc tiếp theo là tiến hành nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin phòng bệnh còi cọc ở lợn con do PCV2 gây ra Vì vậy chúng tôi đã tiến hành thực hiện

đề tài: “Xác định chỉ tiêu an toàn và hàm lượng kháng thể ở lợn được tiêm

vacxin vô hoạt porcine circovirus type 2 sản xuất thử nghiệm từ chủng phân lập tại Việt Nam”

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định chỉ tiêu an toàn của vacxin vô hoạt PCV2 khi tiêm thử nghiệm trên lợn

Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của lợn khi đƣợc tiêm thử nghiệm vacxin vô hoạt PCV2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ CĂN BỆNH (PCV2)

Porcine circovirus (PCV) là một ADN virus thuộc họ Circoviridae, bao

gồm Porcine circovirus type 1 (PCV1) và Porcine circovirus type 2 (PCV2) Dựa trên kết quả giải trình tự gen thấy mức độ tương đồng trình tự

nucleotide giữa PCV1 và PCV2 là 68 – 76% (Hamel et al., 1998)

PCV1 lần đầu tiên được phân lập tại Đức vào năm 1974, là một virus tạp nhiễm trên môi trường tế bào thận lợn (PK15), không có khả năng gây bệnh ở lợn (nonpathogenic) Năm 1991 tại Canada, một loại virus mới phân lập được là PCV type 2 (PCV2) được xác định là nguyên nhân gây hội chứng còi cọc ở lợn sau cai sữa và sau đó được ghi nhận ở nhiều nước trên thế giới

2.1.1 Hình thái, cấu trúc PCV2

PCV2 là một virus trần không có vỏ bọc bên ngoài Với đường kính hạt virus trong khoảng 12 - 23 nm, PCV2 được biết đến là virus có kích thước nhỏ nhất gây bệnh ở động vật có vú

Bộ gen của virus PCV2 thường dài 1767-1768 nucleotide, có ít nhất 4 khung đọc mở (ORF1- ORF4) đã được chứng minh bằng thực nghiệm (

Nawagitgul et al., 2000) ORF1 mã hóa cho protein có bản chất là enzyme sao chép vật chất di truyền (replicases protein, rep và rep’) cần thiết cho sự nhân lên

của virus; ORF2, mã hóa cho capsid (Cap) protein, là protein cấu trúc của virus;

và ORF3 và ORF4 mã hóa các protein không cần thiết cho sự nhân lên của virus, nhưng có thể đóng vai trò trong độc lực của virus, được cho là có liên quan đến hiện tượng apoptosis ở tế bào nhiễm virus

2.1.2 Phân loại PCV2

Về phân loại virus, căn cứ vào kết quả giải trình tự gen và phân tích đặc điểm tiến hóa, trước năm 2014 PCV2 được chính thức công nhận gồm có 3

genotype, ký hiệu từ PCV2a, PCV2b và PCV2c (Segales et al., 2008) Trong đó

PCV2a chiếm ưu thế trước khi các vụ dịch chính xảy ra trên thế giới, sau đó PCV2b là genotype chiếm ưu thế PCV2a và PCV2b có mối tương quan gần về

trình tự nucleotide ở gen rep (97-100%) và cap gen (91-100%) và cũng tương

đương về trình tự amino acid, với tỷ lệ 97-100% với Rep và 89-100% với Cap

Nghiên cứu của (Guo et al., 2010) về sự lưu hành của PCV2 ở Trung

Quốc đã phát hiện một nhánh mới (được đặt tên là PCV2d) bao gồm các chủng được thu thập trong năm 2007 và 2008 ở lợn có biểu hiện lâm sàng của hội chứng PMWS Tuy nhiên, chỉ đến thời điểm hiện tại, trên cơ sở phân tích 1680

trình tự gen mã hóa capsid protein (ORF2), công bố của (Xiao et al., 2015) mới

đưa ra được bằng chứng khẳng định PCV2d thực sự là một genotype mới Genotype PCV2d hiện được xác định lưu hành rộng rãi ở châu Âu, châu Mỹ và châu Á, gồm các quốc gia như: Thụy Sỹ, Bỉ, Đức, Phần Lan, Romani, Serbia;

Mỹ, Uruguay; Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Việt Nam, Hàn Quốc (Xiao et al.,

2015, Ramos et al., 2015) Như vậy, cho tới năm 2015 PCV2 có 4 genotype

(PCV2a, PCV2b, PCV2c và PCV2d) và 8 nhánh di truyền (cluster) 2A-2E và

1A-1C (Olvera et al., 2007) được công nhận

2.1.3 Tính chất nuôi cấy

Môi trường tế bào thận lợn PK15 được xác định là thích hợp để nuôi cấy PCV2, virus nhân lên trong nhân tế bào, nhưng không gây bệnh tích tế bào Vì PCV2 chỉ mã hóa cho hai loại protein nên người ta cho rằng virus phải dựa vào protein của tế bào vật chủ để nhân lên, nghĩa là chúng nhân lên tốt trong tế bào

đang phân chia Tischer et al., (1987) cho biết tế bào PK15 được xử lý với

glucosamine sẽ giúp cho sự nhân lên của PCV2 tốt hơn

Phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15 thường mất rất nhiều công sức

và thời gian do đặc điểm nhân lên rất chậm và thấp của virus, thường chỉ áp dụng trong nghiên cứu để sản xuất vacxin phòng bệnh Vì không gây bệnh tích tế bào nên để khẳng định sự nhân lên của virus cần phải làm phản ứng miễn dịch huỳnh quang hoặc PCR

2.1.4 Sức đề kháng

Nghiên cứu in vitro cho thấy PCV2 có khả năng đề kháng tốt với nhiệt độ

Nhiệt độ > 75oC trong 1 giờ mới làm giảm hiệu giá virus Do đó PCV2 có khả năng tồn tại một thời gian dài trong điều kiện tại các trang trại

Khả năng đề kháng với chất sát trùng cũng được nhiều tác giả quan tâm

nghiên cứu trong điều kiện in vitro Trong khi potassium peroxymonosulfate

(KHSO5), sodium hydroxide (NaOH) khiến cho PCV2 bị bất hoạt trong thời gian ngắn thì hỗn dịch NH4/glutaraldehyde cần phải thời gian dài hơn mới bất hoạt

được virus này (Kim et al., 2009) Formaldehyde có hiệu quả kém hơn so với các

chế phẩm trong thành phần có iodine và phenol, mà không ảnh hưởng đến hiệu

giá của virus (Martin et al., 2008) Nhìn chung, việc giảm hiệu giá của PCV2 trong điều kiện in vitro khi sử dụng sản phẩm có chứa chất oxy hóa, halogen

hoặc NaOH là rõ rệt hơn so với các chế phẩm có iodine, alcohol, phenol hoặc

formaldehyde (Royer et al., 2001) Việc bất hoạt hoàn toàn PCV2 trong điều kiện

in vitro rất khó khăn và đòi hỏi thời gian dài (Yilmaz and Kaleta, 2004)

2.1.5 Dịch tễ học mô tả về PCV2

Mặc dù được phát hiện năm 1991 nhưng nhiều kết quả nghiên cứu hồi cứu với các mẫu bệnh phẩm cho thấy đã có sự lưu hành của PCV2 ở đàn lợn từ năm

1969 tại Bỉ, năm 1970 tại Anh, năm 1973 tại Ireland, năm 1983 tại Canada (trích

theo Gillespie et al., (2009)), và năm 1983 tại Tây Ban Nha (Rodriguez-Arrioja

et al., 2003) Hiện nay không có bằng chứng huyết thanh học cho thấy PCV2

nhiễm trên người, gia cầm, cừu, dê và ngựa

Dữ liệu hiện có cho thấy PCV2b đang chiếm ưu thế trên toàn thế giới Về đặc điểm dịch tễ học phân tử, các genotype khác nhau của PCV2 có mức độ lưu hành rất khác biệt Genotype PCV2c chỉ có ở mẫu bệnh phẩm thu thập những

năm 1989-1990 ở Đan Mạch (Dupont et al., 2008) Đối với genotype PCV2a và

PCV2b, các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện được sự chuyển dịch genotype lưu hành phổ biến (genotypic shift) từ PCV2a sang PCV2b diễn ra trên

phạm vi toàn cầu từ năm 2003 (Cortey et al., 2011, Dupont et al., 2008)

Trong một nghiên cứu vào năm 2008, 218 bộ gen đầy đủ của PCV2 được giải trình tự và đăng ký trên Genbank tháng 3 năm 2007 đã được phân tích và các tác giả cũng kết luận có sự dịch chuyển (shift) từ PCV2a sang PCV2b trên toàn

cầu trong giai đoạn năm 2003 (Dupont et al., 2008), và có thể cho thấy PCV2b

có độc lực cao hơn so với PCV2a mặc dù những kết quả nghiên cứu thực nghiệm chưa khẳng định giả thuyết này

Trong vài năm trở lại đây, người ta cho rằng có một sự dịch chuyển genotype lưu hành phổ biến sang PCV2d do sự phân bố rộng rãi của nó ở các nước chăn nuôi lợn và sự tăng về số lượng các trình tự gen PCV2d được công bố

(Xiao et al., 2015)

Kể từ khi được phát hiện, PCV2 và bệnh liên quan đến PCV2 (PCVAD) được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Nghiên cứu tập trung vào đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng bệnh liên quan và đặc biệt là nghiên cứu phát triển các loại vacxin để phòng bệnh PCV2 được ghi nhận ở rất nhiều nước trên thế giới

và bệnh PMWS đã đươc chẩn đoán ở cả 5 châu lục Con đường truyền lây của các

genotype PCV2 đã xây dựng lại (Vidigal et al., 2012) như mô tả ở hình 2.1

Hình 2.1 Đường truyền lây của các genotype PCV2

- Châu Á: vụ dịch gần giống PMWS được mô tả tại Đài Loan năm 1995 Từ

đó đến nay PCV2 và PCVAD được xác định lưu hành ở Nhật Bản (Takahagi et

al., 2008), Hàn Quốc (An et al., 2007), Thái Lan (Jantafong et al., 2011) và

Malaysia (Jaganathan et al., 2011)

Tại Trung Quốc, (Wang et al., 2009) đã giải trình tự 49 chủng thu thập từ

nhiều vùng khác nhau và cho thấy 34 chủng thu thập từ năm 2002-2006 thuộc genotype PCV2a, PCV2b, PCV2d và PCV2e, phổ biến nhất là PCV2b (18 chủng); 12 chủng thu thập trong giai đoạn 2007-2008 đều là PCV2b

Tại Hàn Quốc, khi sử dụng kỹ thuật PCR kiểm tra 29 mẫu lợn mắc PCVAD

và 9 mẫu lợn không mắc PCVAD phát hiện được sự lưu hành của PCV2a và PCV2b; trong đó cả 29 chủng có nguồn gốc từ lợn mắc PCVAD và 4 chủng từ lợn không mắc PCVAD là PCV2b (Chae and Choi, 2010)

Tại Nhật Bản với 150 mẫu huyết thanh thu thập từ lợn 2-4 tháng tuổi nuôi tại 10 trang trại (15 mẫu/trại) chỉ phát hiện được PCV2a và PCV2b (Takahagi

et al., 2008), trong khi đó tại Thái Lan phát hiện được PCV2b và PCV2e

(Jantafong et al., 2011)

- Châu Âu: hầu hết các nước xác định sự có mặt của PCV2b, là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế do PCVAD PCV2a còn được phát hiện ở đàn lợn nuôi tại Ireland từ các mẫu bệnh phẩm lợn mắc PCVAD thu thập từ năm 1997-2003 (trong 5/6 trại xét nghiệm) Trại còn lại phân lập được PCV2b có tỷ lệ chết rất cao (35%) so với 5 trại còn lại Tất cả mẫu thu được sau năm 2003 từ trại mắc hoặc không mắc PCVAD đều chỉ phát hiện được PCV2b

- Bắc Mỹ: hiện tượng đột biến chủng khiến cho PCV2b lưu hành phổ biến được nhiều người quan tâm nghiên cứu Lần đầu tiên PCV2b được xác nhận ở Canada vào năm 2005; sau đó là các công bố về PCV2 tại Kansas, North Carolina và Iowa Các nghiên cứu sau này đã cho thấy sự lưu hành của PCV2a và

PCV2b trong khu vực (Gagnon et al., 2007, Olvera et al., 2007)

- Nam Mỹ: không có nhiều nghiên cứu về PCV2, đã xác định genotype phổ

biến là PCV2b (Chiarelli-Neto et al., 2009) cần có các nghiên cứu tiếp theo để khẳng định sự có mặt của genotype PCV1/2a (Gagnon et al., 2010)

- Châu Đại Dương: hiện tại có một số công bố của (Muhling et al., 2006) về

sự lưu hành PCV2 tại Úc; nghiên cứu của (O'Dea et al., 2011) về PCVAD tại Úc; nghiên cứu của (Neumann et al., 2007) về PCV2 phân lập được tại New Zealand

Hiện nay nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ học phân tử cho thấy các

genotype khác nhau của PCV2 có mức độ lưu hành rất khác biệt (Vidigal et

al., 2012) khi nghiên cứu 420 trình tự gen PCV2 công bố trên ngân hàng

Genbank cho biết có 102 chủng PCV2a (24,3%), 317 chủng PCV2b (75,5%)

và 1 chủng PCV2c (0,2%)

2.2 HIỂU BIẾT VỀ HỘI CHỨNG BỆNH DO PCV2 GÂY RA

PCV2 là căn nguyên gây bệnh cần thiết và được gọi là PCV disease (PCVD) Bên cạnh đó còn có một số yếu tố khác kết hợp gây bệnh nhưng chưa được làm rõ

Thông thường, dấu hiệu đầu tiên để nhận biết lợn mắc PCVAD là lợn còi cọc do mắc chứng còi cọc sau cai sữa (postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS) Lợn bị sưng hạch lympho, giảm tăng trọng và có các triệu chứng không đặc trưng như khó thở, ỉa chảy, da và niêm mạc nhợt nhạt và chứng hoàng đản Một số con có triệu chứng ho, sốt, có triệu chứng thần kinh Những triệu chứng này không chỉ quan sát được ở lợn sau cai sữa mà còn thấy cả ở lợn trưởng thành

Bệnh đường hô hấp ở lợn là một biểu hiện trong nhóm triệu chứng của PCVAD, thường được gọi là bệnh đường hô hấp phức hợp ở lợn (porcine respiratory disease complex, PRDC) PRDC thường xảy ra ở lợn 12 đến 24 tuần tuổi Triệu chứng lâm sàng của lợn bệnh gồm: sốt, hắt hơi, ho, chảy nước mũi ở các mức độ khác nhau, khó thở và giảm khả năng tăng trọng

PCVAD cũng có biểu hiện bệnh ở đường tiêu hóa như viêm ruột kết giống

bệnh do Lawsonia intracellularis gây ra hoặc viêm ruột do vi khuẩn Salmonella

gây ra Bệnh đường tiêu hóa ở lợn thường xảy ra ở lợn thịt nuôi giai đoạn cuối Hội chứng viêm da viêm thận (porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS) liên quan đến PCV2 được ghi nhận ở những đàn lợn không được sử dụng vacxin phòng bệnh do PCV2 Tuy nhiên, PDNS được xác định do nhiều nguyên nhân khác PDNS có triệu chứng đặc trưng là hiện tượng viêm da cấp tính (hình thành các nốt tím, dần dần thành sẹo tròn đỏ, giữa màu đen, tập trung nhiều nhất ở gần chân), sốt, bỏ ăn và thường bị chết

Hội chứng rối loạn sinh sản liên quan đến PCV2 được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1999 tại Canada, sau đó một số nước cũng ghi nhận Triệu chứng thường thấy ở lợn bệnh là tăng hiện tượng sảy thai, chết non, thai gỗ và tăng tỷ lệ chết trước cai sữa

Triệu chứng lâm sàng có liên quan đến PCV2 được tóm tắt ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Triệu chứng của bệnh liên quan đến PCV2

Hội chứng

hô hấp

Hội chứng tiêu chảy

Hội chứng viêm da viêm thận

Hội chứng rối loạn sinh sản

Tất cả các triệu chứng của PCVAD mô tả ở trên có ảnh hưởng đến một hoặc một số cơ quan khác nhau trong cơ thể Bằng cách gây bệnh thực nghiệm, không phụ thuộc vào triệu chứng lâm sàng có/ không biểu hiện, lượng virus trong huyết thanh đạt tối đa sau gây nhiễm khoảng 14 ngày

Từ các kết quả nghiên cứu trên thế giới người ta thấy rằng PCV2 có nhiều trong dịch tiết của mũi, phân, cũng như trong huyết thanh trong một thời gian dài Virus còn có thể bài thải qua nhiều đường khác nhau trong một thời gian dài; trong đó bài thải qua tinh dịch đóng vai trò quan trọng trong việc truyền dọc của bệnh, hoặc lợn con bú sữa mẹ bị bệnh cũng có nguy cơ nhiễm virus Hơn nữa, lượng virus bài thải ở động vật có biểu hiện triệu chứng lâm sàng liên quan đến PCV2 thường cao hơn rõ rệt so với lợn không có biểu hiện triệu chứng bệnh

năng phát sinh dịch PCVAD (Cook, 2001, Dewey et al., 2006, Lopez-Soria et

al., 2005, Rose et al., 2009, Woodbine et al., 2007) Trong nghiên cứu này tác

giả cũng khuyến cáo quy mô đàn khi cai sữa và sự ghép đàn trong chăn nuôi công nghiệp có ảnh hưởng rất lớn đến tuổi nhiễm PCV2 Do đó gợi ý các kĩ thuật thực hành trang trại giúp hạn chế, thay đổi quá trình nhiễm PCV2, khiến cho lợn

nhiễm PCV2 sớm và do đó nguy cơ mắc PCVD cao hơn (Andraud et al., 2009)

Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy sự truyền lây PCV2 giữa các chuồng là thấp và

do đó nguy cơ lây lan PCV2 giữa các trại không có tiếp xúc trực tiếp với lợn bệnh là rất ít khi xảy ra Kết hợp với thông tin lứa tuổi nhiễm và nguy cơ mắc PCVAD, người ta cho rằng hiện tượng chia tách lợn từ nhiều nguồn khác nhau được thực hiện cho đến khi nguy cơ giảm xuống (khoảng hơn 7 tuần) cũng sẽ

làm giảm nguy cơ mới mắc các bệnh liên quan đến PCV2 (Rose et al., 2012)

2.3.2 Vệ sinh phòng bệnh

PCVAD được coi là do nhiều nguyên nhân kết hợp gây ra, trong đó có vai trò của các yếu tố môi trường, ngoài ra còn phải kể đến vai trò của một số vi khuẩn và virus đồng nhiễm khác Việc bổ sung vitamin E và Se vào thức ăn có thể giúp trang trại phòng PMWS có hiệu quả Cách phòng ngừa hợp lý và hữu

hiệu nhất được khuyến cáo để phòng bệnh do PCV2 gây ra là:

- Hạn chế sự thăm quan chuồng trại nhằm giảm thiểu nguy cơ làm lây bệnh cho đàn lợn; khi vào chuồng nái bắt buộc phải thay ủng và quần áo

- Thực hiện biện pháp chăn nuôi cùng vào - cùng ra, chăn nuôi với mật độ hợp lý

- Định kỳ phun tiêu độc khử trùng chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi bằng các loại thuốc sát trùng Phân, nước tiểu, chất thải trong chăn nuôi phải được thu gom

xử lý bằng các phương pháp thích hợp Kiểm soát tốt các nguồn nguyên vật liệu

khi đưa vào trang trại, v.v Các thí nghiệm in vitro cho thấy hiệu giá PCV2 giảm

khi sử dụng NaOH, Virkon S, Roccal D plus, Clorox, 1-Stroke, Environ, Fulsan

2.3.3 Đánh giá chất lượng và hiệu quả của vacxin phòng bệnh do PCV2

Hiện nay sử dụng vacxin được coi là hiệu quả nhất trong các biện pháp phòng PCVAD Tại Mỹ, có khoảng 99% lợn được sử dụng vacxin phòng bệnh do PCV2 gây ra Hiện nay có nhiều loại vacxin được sản xuất từ các chủng PCV2a Loại vacxin đầu tiên là CIRCOVAC (Merial), một vacxin vô hoạt có bổ trợ dầu Tiếp theo đó là vacxin Circumvent PCV/Porcilis (Intervet-Schering Plough), một vacxin tái tổ hợp ORF2 của PCV2 vào baculovirus, phải tiêm 2 liều Một loại vacxin tái tổ hợp khác là Ingelvac CircoFLEX (Boehringer), chỉ cần tiêm 1 liều Loại vacxin thứ tư là vacxin tạo ra từ virus bất hoạt tái tổ hợp (PCV1 mang ORF2 của PCV2), được gọi là vacxin Suvaxyn PCV2 One Dose (Fort Dodge/Pfizer), chỉ cần tiêm 1 liều duy nhất

Bằng thực nghiệm người ta thấy rằng việc kích hoạt hệ miễn dịch của cơ thể khi tiêm phòng vacxin PCV2 là một yếu tố rất quan trọng thúc đẩy khiến cho PMWS xảy ra ở nhiều trang trại Vì vậy cần xác định thời điểm lợn có nguy cơ bị

nhiễm circovirus để xây dựng lịch sử dụng vacxin thích hợp Vacxin sẽ giúp giảm tỷ lệ chết và cải thiện khả năng tăng trọng của đàn lợn Khi tiêm vacxin cho lợn sẽ sản sinh kháng thể trung hòa, giúp giảm số lượng PCV2 trong cơ thể, từ đó giảm được lượng virus bài thải ra ngoài môi trường và hạn chế được bệnh truyền

ngang (Segales et al., 2009)

Một nghiên cứu tại Pháp khi so sánh giữa hai lô lợn nái được tiêm và không tiêm vacxin Circovac thì tỷ lệ sảy thai giảm từ 7,3% xuống còn 3,6%; tỷ lệ thụ thai tăng gần 7% (90,5% so với 83,9 %) (The pigsite.com, 2012)

Khi thử nghiệm vacxin vô hoạt PCV2 cho lợn con 28 ngày tuổi cho thấy

tỷ lệ lợn có bệnh tích đã giảm rõ rệt so với lợn không tiêm vacxin Việc tiêm vacxin sẽ giúp giảm khả năng nhiễm virus cũng như nguy có mắc chứng còi cọc

sau cai sữa (Yang et al., 2012)

Nghiên cứu ảnh hưởng của việc tiêm vacxin PCV2 cho thấy tiêm vacxin đã làm giảm số lượng virus huyết khi công cường độc bằng virus PCV2a hoặc PCV2b, giúp giảm nguy cơ mắc PCVAD Khi công cường độc thì những lợn tiêm vacxin có số lượng ADN của PCV2 cũng như bệnh tích liên quan đến PCV2

ở hạch lympho đều giảm rõ rệt (Seo et al., 2014)

Nếu sử dụng vacxin vô hoạt phòng bệnh PCVAD dùng cho lợn nái và lợn hậu bị sẽ giúp giảm tỷ lệ mắc PMWS; lợn con bú sữa đầu có kháng thể thụ động

giúp phòng bệnh Trong thực tế (O'Neill et al., 2012) cho biết nếu dùng vacxin cho

lợn nái sẽ giúp giảm lượng virus huyết ở lợn con, giúp bảo vệ lợn con đến 8 tuần tuổi sau khi sinh Tuy nhiên do đây là phương pháp miễn dịch thụ động, lợn con khi mới đẻ bú sữa đầu sẽ được nhận kháng thể từ sữa mẹ nên cần phải chăm sóc thật tốt lợn trong quá trình sinh đẻ, cho lợn con bú sữa đầu càng sớm càng tốt

Sno et al., (2016) đã đánh giá về chỉ tiêu an toàn và hiệu lực của vaccine Porcilis® PCV ID trên lợn và cho biết vaccine có khả năng làm giảm virus huyết, giảm tỷ lệ chết và bệnh tích ở phổi lợn được tiêm lúc 3 tuần tuổi Ngoài ra vaccine

có tác động tích cực đến tăng trọng trung bình của lợn (từ 44 đến 59 g / ngày)

Feng et al., (2016) đã đánh giá sự ảnh hưởng của kháng thể do mẹ truyền sang đối với hoạt động của virus PCV2 và những đặc điểm của lợn con được tiêm phòng vacxin PCV2 trong điều kiện thực địa Kết quả cho biết sự tác động này gần như không đáng kể ở hầu hết các trang trại được thí nghiệm

Park et al., (2016) đã thử nghiệm vacxin đa giá PCV2 và suyễn lợn (FosteraTM PCV MH) dưới điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả cho thấy vaccin tạo ra kháng thể trung hòa cao và có khả năng bảo vệ lợn với PCV2 và suyễn

Jeong et al., (2016) đã so sánh hiệu quả phòng bệnh khi tiêm đồng thời vacxin PCV2 và PRRS cho lợn Kết quả cho thấy khi tiêm đồng thời vacxin Fostera PCV và Fostera PRRS, hiệu quả phòng bệnh cũng tương tự như tiêm độc lập

Martelli et al., (2016) đã nghiên cứu ảnh hưởng của kháng thể từ lợn mẹ đến đáp ứng miễn dịch của lợn con với PCV2 và cho biết sự kết hợp giữa việc tiêm phòng cho lợn nái mang thai và tiêm phòng cho lợn con lúc 6 tuần tuổi giúp gia tăng hiệu quả trong phòng bệnh do PCV2 gây ra

Thời gian bán hủy của kháng thể thụ động ở lợn là 19 ngày, và lượng kháng thể thụ động này sẽ không còn ở các độ tuổi lợn khác nhau tùy thuộc vào lượng kháng thể thụ động từ mẹ (từ 4 – 6 tuần tuổi nếu ít kháng thể thụ động; từ 6 – 10 tuần nếu lượng kháng thể thụ động ở mức trung bình và 8,5 – 13,5 tuần nếu nhiều kháng thể thụ động) Lợn con theo mẹ (< 4 tuần tuổi) thường không có

triệu chứng lâm sàng do được bảo hộ bởi kháng thể thụ động (Gillespie et al.,

2009) Bằng thực nghiệm người ta đã chứng minh được khả năng bảo hộ phụ thuộc vào lượng kháng thể thụ động Khi lượng kháng thể thụ động cao thì mức bảo hộ tốt hơn khi mức kháng thể thấp, tuy nhiên không hoàn toàn bảo vệ lợn chống lại bệnh do PCV2 gây ra; nhưng nếu hiệu giá kháng thể thụ động thấp thì

chắc chắn không bảo hộ được lợn (McKeown et al., 2005)

Tại Việt Nam, một số loại vacxin được phép lưu hành dùng để phòng bệnh

do PCV2 đều là ngoại nhập, sản xuất từ chủng virus thuộc genotype PCV2a Có thể thống kê một số loại vacxin phòng bệnh do PCV2 gây ra như :

- Vacxin Circovac (Merial

- Vacxin Circumvet PCV (Intervet

- Vacxin Ingelvac CircoFlex (Boehringer Ingelheim)

- Vacxin Suvaxyn PCV2 One Dose (Fort Dodge Animal Health

- Pro-vac Circomaster Vac (Komipharm international

- Circo Pig Vac (Daesung Microbiological Lab

2.3.4 Điều trị

Vì là bệnh do virus nên không có thuốc điều trị đặc hiệu Theo thử nghiệm

của (Ferreira et al., 2001) dùng kháng huyết thanh để điều trị cho hiệu quả rất

khác nhau Một khi hội chứng phát sinh trên một nhóm lợn thì điều trị thường không có hiệu quả cao Lợn khoảng 15 - 40 kg điều trị bằng chlotetracycline trộn vào thức ăn có thể giảm mức độ trầm trọng của hội chứng, do có liên quan tới sự suy yếu của các vi khuẩn kế phát gây bệnh

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ PCV2

PCV2 được phát hiện ở một số tỉnh thành phía Nam từ năm 2000 với tỷ lệ nhiễm 38,97% nhưng đến 2006 tỷ lệ nhiễm đã tăng đến 96,47%, chứng tỏ PCV2

đang lưu hành phổ biến trong chăn nuôi lợn (Nguyễn Thị Thu Hồng và cs., 2006)

và là một trong những nguyên nhân gây còi cọc lợn con cai sữa ở một số trại lợn tại thành phố Hồ Chí Minh Một số nghiên cứu của tác giả như (Lam và Dương, 2006) đều cho thấy có sự lưu hành của PCV2 ở đàn lợn nuôi tại thành phố Hồ Chí Minh

Trong một số nghiên cứu gần đây nhất (Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs., 2012a)

thực hiện tại một số trại lợn nuôi tại 4 tỉnh ở miền Bắc như Hà Nội, Hòa Bình, Bắc Giang, và Hải Dương cho thấy 43/48 (89,58%) trại lợn được điều tra cho kết quả huyết thanh học dương tính với PCV2 Cụ thể số trại lợn được khảo sát cho kết quả huyết thanh học dương tính với PCV2 tại Hà Nội là 13/15 trại, chiếm (86,67); tại Hải Dương là 14/16 trại, chiếm 87,5%; tại Bắc Giang là 8/8 trại, chiếm 100%; và tại Hòa Bình là 8/9 trại, chiếm 88,89% Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự sai khác về tỷ lệ trại lợn cho kết quả huyết thanh học dương tính với PCV2 giữa 4 tỉnh được khảo sát (p>0,05) Với tổng số 513 mẫu huyết thanh được kiểm tra, tỷ lệ mẫu huyết thanh cho kết quả dương tính với PCV2 trung bình là 70,57% Kết quả khảo sát huyết thanh học theo quy mô chăn nuôi cho thấy các đàn lợn nuôi có quy mô khác nhau thì tỷ lệ mẫu huyết thanh dương tính với PCV2 là khác nhau Những đàn lợn nuôi có quy mô từ 100 - 500 con và

từ 500 – 1000 con cho kết quả huyết thanh học dương tính với PCV2 cao nhất, tỷ

lệ mẫu huyết thanh học dương tính tương ứng là 86,86% và 80,21% Kết quả điều tra theo lứa tuổi cho thấy lợn thịt cho kết quả huyết thanh học dương tính với PCV2 là 61,27%, thấp nhất trong các lứa tuổi lợn được khảo sát Lợn nái cho kết quả huyết thanh học dương tính với PCV2 cao nhất (92,31%), tiếp đến là lợn

con theo mẹ (88,24%) (Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs., 2012a)

Nghiên cứu biểu hiện lâm sàng của lợn nghi mắc PMWS thu thập được tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam cho thấy lợn có các triệu chứng và bệnh tích

giống như các kết quả đã được công bố trước đây (Plana-Duran et al., 1999)

Triệu chứng lâm sàng chủ yếu đối với lợn nghi mắc PMWS là còi cọc, lông khô

và xơ xác (100%), đặc biệt có đến 89,74% lợn nghi mắc PMWS có có triệu chứng hô hấp Bệnh tích đại thể đặc trưng gồm hiện tượng xác gầy và sưng, xuất huyết ở các hạch lympho, viêm phổi Những biến đổi vi thể đặc trưng đối với lợn nghi PMWS có liên quan đến PCV2 được tìm thấy tại các cơ quan nội tạng của lợn bệnh bao gồm viêm mãn tính và phá hủy các mạch máu (ở phổi, hạch lympho, thận, gan), viêm dạng hạt với sự hình thành các tế bào khổng lồ đa nhân (ở phổi, hạch lympho), biến đổi miền vỏ và miền dưới vỏ hạch lympho làm vỡ cấu trúc hai miền vỏ-tủy của hạch, thoái hóa các quai henle ở thận (Huỳnh Thị

Mỹ Lệ và cs., 2012b)

Kết quả giải mã genome đối với 30 chủng PCV2 thu nhận được từ các mẫu huyết thanh, mẫu mô (gan, phổi, lách, và hạch) của lợn nghi mắc PMWS cho thấy các chủng PCV2 đang lưu hành và gây bệnh trên đàn lợn nuôi tại Việt Nam thuộc genotype PCV2b với 4 nhóm (cluster) khác nhau là 1A, 1B, 1C và dạng tái tổ hợp (recombinant form) Kết quả phân tích về trình tự gen cho thấy genome của chúng gồm 1.767 nucleotide và giống nhau 96 – 100%

(Huynh et al., 2014)

Vacxin là yếu tố quyết định trong công tác phòng chống hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa và vacxin sẽ chỉ cho hiệu quả phòng bệnh cao nhất khi chủng virus vacxin được phân lập từ thực địa Trên thế giới, một số vacxin

vô hoạt đã được sản xuất thành công trên môi trường tế bào PK15 và cho thấy hiệu quả cao trong phòng chống hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa xảy ra

(Lyoo et al., 2011, Opriessnig et al., 2009a, Chae, 2012a, Yang et al., 2012)

Đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ của Huỳnh Thị Mỹ Lệ

và cộng sự về việc nghiên cứu chọn chủng virus Porcine circovirus type 2 (PCV2)

để sản xuất vắc xin phòng bệnh còi cọc ở lợn con đã bước đầu thành công trong việc xây dựng ngân hàng giống virus PCV2 phân lập được, nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng PCV2 dùng làm giống gốc để sản xuất vacxin, nghiên cứu bảo quản và xác định các đặc tính của giống vacxin PCV2 sau bảo quản

Kết quả nghiên cứu đã tìm ra 3 chủng có hiệu giá ≥ 105 TCID50/ml là chủng

03, 04 và 07 sau các lần tiếp đời lần lượt là 14, 20 và 16 Kết quả chuẩn độ PCV2 bằng phản ứng IFA để xác định hiệu giá virus ở các lần tiếp đời đối với các chủng virus này cho thấy hiệu giá ổn định (biến động không vượt quá 1 log) trong phạm vi: (i) đời 18 ÷ đời 26 (chủng 03), (ii) đời 20 ÷ đời 26 (chủng 04) và (iii) đời 16 ÷ đời 26 (chủng 07) Kết quả trên phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy PCV2 có sự tăng hiệu giá qua các lần tiếp đời và ổn định sau

khoảng 16 đến 25 lần tiếp đời (Shuai et al., 2011), đạt hiệu giá 105,6 TCID50/ml ở

lần tiếp đời thứ 35 (Liu et al., 2006a) Như vậy, thí nghiệm nghiên cứu biến động

hiệu giá virus qua các lần tiếp đời cho phép kết luận:

(1) Đã xác định được 3 chủng virus có hiệu giá ≥ 105 TCID50/ 0,1 ml là:

Chủng phân lập 03: 106,33 TCID50/ 0,1 ml ở đời 18

Chủng phân lập 04: 106,18 TCID50/ 0,1 ml ở đời 20

Chủng phân lập 07: 105,73 TCID50/ 0,1 ml ở đời 16

(2) Cả 3 chủng phân lập kể trên có hiệu giá ổn định trong phạm vi đời 18 ÷ đời 26 (chủng 03), đời 20 ÷ đời 26 (chủng 04) và đời 16 ÷ đời 26 (chủng 07) Có thể chọn virus từ đời 18 (chủng 03), từ đời 20 (chủng 04) và từ đời 16 (chủng 07)

để tiếp tục nghiên cứu

Bằng phương pháp xây dựng cây phát sinh loài dựa vào trình tự genome hoặc gen mã hóa capsid protein cho thấy 3 chủng PCV2 này thuộc về nhóm 1C (chủng phân lập 07), 1A/1B (chủng phân lập 04) và nhóm tái tổ hợp (CRF) lưu hành phổ biến ở Việt Nam (chủng phân lập 03)

Nghiên cứu tính ổn định di truyền của các chủng virus qua các lần tiếp đời, chúng tôi phân tích trình tự gen ORF2 ở 4 vùng mã hóa protein đóng vai trò quan trọng trong kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch của vật chủ (Trible và cs., 2011): vùng A (nucleotide 151- 252), vùng B (nucleotide 337 – 393), vùng C (nuleotide 481- 621), vùng D (nucleotide 682- 699) Dựa vào kết quả nghiên cứu

ổn định hiệu giá virus chúng tôi lựa chọn một số đời để so sánh trình tự gen giữa các lần tiếp đời của mỗi chủng với virus ở mẫu bệnh phẩm (P0) tương ứng Kết quả phân tích cho thấy trình tự gen 4 vùng quyết định kháng nguyên A- D ở các lần tiếp đời khác nhau được xác định không có sự sai khác với virus có trong mẫu bệnh phẩm ban đầu (P0) Nói cách khác, 3 chủng PCV2 ổn định về mặt di truyền

Một chủng virus được lựa chọn để làm giống sản xuất vacxin cần phải có

tính sinh miễn dịch Trước khi tiến hành trên bản động vật chúng tôi kiểm tra khả năng sản sinh đáp ứng miễn dịch của thỏ sau khi được gây miễn dịch bằng PCV2

ở các đời khác nhau Kết quả phân tích biến động hàm lượng kháng thể kháng PCV2 của thỏ được gây miễn dịch cho thấy 3 chủng PCV2 ở các lần tiếp đời đều

có khả năng kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu Hiện tượng chuyển dương tính huyết thanh học xảy ra trong khoảng 7 đến 14 ngày sau khi gây miễn dịch và độ dài miễn dịch ít nhất đến 56 ngày sau tiêm kháng nguyên Kết quả cho thấy chủng PCV2 số 03, 04 và 07 đều có khả năng kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu trên thỏ Cùng một chủng virus, khi gây miễn dịch cho thỏ ở các đời khác nhau, không phát hiện thấy có khác biệt về quy luật hình thành kháng thể

Dùng virus ở các lần tiếp đời khác nhau, đã được bất hoạt để gây miễn dịch cho lợn âm tính PCV2 và âm tính với kháng thể kháng PCV2 Tiến hành theo dõi biểu hiện lâm sàng của lợn sau gây miễn dịch chúng tôi không phát hiện thấy dấu hiệu bất thường của lợn thí nghiệm tại vị trí tiêm cũng như phản ứng toàn thân

Với các kết quả đặc tính sinh học của ngân hàng giống, nghiên cứu này chúng tôi đã chọn được 3 chủng PCV2 (chủng 03, 04 và 07) có hiệu giá lớn hơn 105

TCID50/ml, có tính ổn định về: hiệu giá, đặc điểm di truyền và đặc tính sinh miễn dịch để sản xuất vacxin thử nghiệm

Việc tiếp theo là tiến hành nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin phòng bệnh còi cọc ở lợn con do PCV2 gây ra Như vậy, hướng nghiên cứu tự sản xuất vacxin vô hoạt từ chính những chủng PCV2 đang lưu hành tại Việt Nam là rất cần thiết, là một nghiên cứu mới, có tính ứng dụng cao

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 3.1.1 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu kiểm tra độ tinh khiết và vô trùng của vacxin PCV2

- Đánh giá chỉ tiêu an toàn của vacxin vô hoạt PCV2 khi tiêm thử nghiệm trên lợn

- Nghiên cứu đánh giá hàm lượng kháng thể ở lợn được tiêm vacxin vô

hoạt PCV2 sản xuất thử nghiệm và so sánh với vacxin thương mại khác

3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, bộ môn Giải phẫu – Tổ chức, bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Thời gian: Từ 04/2015 đến 09/2016

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Chủng virus PCV2 được lựa chọn

- Vacxin vô hoạt PCV2 được sản xuất từ chủng PCV2 phân lập tại Việt Nam

3.1.4 Nguyên liệu nghiên cứu

- Mẫu nghiên cứu: huyết thanh của lợn, động vật thí nghiệm

- Chủng PCV2 phân lập tại Việt Nam, vacxin PCV2 thương mại

- Tế bào PK15 và môi trường nuôi cấy (DMEM + 5% FBS),

- Kit PCR i-StarMaster (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc)

- ADN chuẩn của PCV2a và PCV2b do phòng thí nghiệm virus học, Trường đại học Thú y, Đại học Quốc gia Seoul (Hàn Quốc) cung cấp

- Kít tổng hợp cDNA

- Hóa chất dùng tách chiết ADN tổng số gồm: (1) dung dịch ly giải mẫu

có chứa 27% sucrose, 15 mM trisodium citrate, 0,15 M NaCl, 1 mM ethylene diaminetetraacetic acid, 1% sodium dodecyl sulphate, 200 µg/ml proteinase K;

(2) phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1); (3) isopropyl; (4) cồn 70%; (5)

dung dịch đệm TE (pH=8)

- Kít SERELISA PCV2 Ab Mono Blocking (Synbiotics),

- Kít IFA đặc hiệu cho PCV2: VDPro PCV2 FA Reagent (Median Diagnostics, Hàn Quốc)

- Các cặp mồi đặc hiệu dùng trong nghiên cứu này được lựa chọn dựa theo các nghiên cứu đã công bố trước đây, bao gồm: mồi đặc hiệu chung và đặc hiệu genotype PCV2 (bảng 2.1), mồi đặc hiệu dùng cho phát hiện một số virus và

Mycoplasma hyopneumoniae (MHP) tạp nhiễm (bảng 2.2) Các virus được xét

nghiệm trong kiểm tra tạp nhiễm gồm: virus gây bệnh dịch tả lợn (Classical swine fever virus – CSFV), virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus – PRRSV), Porcine parvovirus (PPV), virus gây bệnh tiêu chảy thành dịch (Porcine epidemic diarrhea virus – PEDV), virus gây bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (Transmissible gastro-enteritis virus – TGEV), virus gây bệnh giả dại (Porcine pseudorabies Virus – PRV), Porcine adenovirus (PadV), và Porcine circovirus

c (bp)

Vị trí nucleotid

e

Tài liệu tham khảo

CV1/CV2

PCV2a

, PCV2b

CV3/CV4

PCV2a

, PCV2b

GAAGAATGGAAGAAGCGG

360

62-79 (Yang

và cs., 2003) CTCACAGCAGTAGACAGGT 403-421

* Sự kết hợp mồi dùng xác định genotype của PCV2 được điều chỉnh bằng cách sử dụng mồi ngược VR2 có trình tự phù hợp với các chủng PCV2 lưu hành ở Việt Nam

Cặp mồi để chẩn đoán (CV1/CV2; VF2/VR2); cặp mồi để định type (2aF/VR2 và 2bF/VR2); cặp mồi để giải trình tự (CV1/CV2; CV3/CV4)

Bảng 3.2 Trình tự mồi dùng xác định sự tạp nhiễm virus và mycoplasma

Virus Mồi Trình tự mồi (5 ’ - 3 ’ )

Kích thướ

c (bp)

Vị trí nucleotid

17483 PAdV PALN TACTGCMAGTTYCACATCCAG 344 20711- (Hundes

GT 20733 a và cs.,

2006) PARN GGAATGGAGATGGGCAGGTT 21035-

oR AAATTACGGGCCCACTGGCT

1350-1369

- Kit real-time PCR: TaqMan Universal PCR master mix (Invitrogen)

Bộ kit bao gồm các loại sinh phẩm sau:

+) AmpliTaq Gold® DNA Polymerase

+) Uracil‐N glycosylase

+) dNTPs with dUTP

+) ROX Passive Reference Dye

- Cặp mồi và đầu dò (probe) đặc hiệu dùng xác định hiệu giá TCID50/ml của PCV2 được lựa chọn dựa theo nghiên cứu đã công bố trước đây (Olvera và cs., 2004) và được trình bày trong bảng 2.3

Bảng 3.3 Trình tự cặp mồi, đầu dò dùng xác định hiệu giá PCV2

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Phương pháp tách, tinh sạch ADN tổng số

Các bước tinh sạch ADN tổng số từ mẫu được thực hiện như sau:

(1) Ly giải mẫu

- 250 µl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm được trộn đều trong 500 µl dung dịch sucrose/proteinase K,

- Ủ ở 56oC/90 phút hoặc 37oC/12giờ,

(2) Tách pha ADN bằng phenol-chloroform-isoamyl (25:24:1)

- Bổ sung 200 µl dung dịch PCI vào ống mẫu sau khi ly giải

(4) Rửa tủa ADN

- Rửa mẫu bằng 1ml cồn 70% (pha trong nước cất đã xử lý DEPC)

- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC

- Loại bỏ hết cồn Hong khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

(5) Hòa tan tủa ADN

- Tủa ADN được hòa tan trong 30 µl dung dịch đệm TE (pH = 8,0)

3.2.2 Phương pháp tách, tinh sạch ARN tổng số

Các bước chiết tách ARN tổng số được thực hiện như sau: